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IDIS2000

médecine/sciences 2000; 16 : 722-31

Les protéines du cytosquelette d'actine :

bien placées pour la motilité

... Les cellules d'un organisme sont animées par une très grande variété de mouvements, qui nécessitent la coordination d'un réseau complexe de protéines formant le cytosquelette d'actine. Au centre de ce réseau se trouve l'actine, qui possède des

propriétés dynamiques

intrinsèques, grâce à sa capacité de former un long polymère à partir de monomères. Dans cette revue, nous discuterons trois systèmes différents qui règlent l'organisation du cytosquelette d'actine. Deux d'entre eux sont importants pour le contrôle de la polymérisation de l'actine dans des structures cellulaires différentes : l'un dépend du complexe Arp2/3, l'autre de la zyxine. Le troisième est

représenté par la protéine ezrine qui, par son interaction avec les protéines membranaires et les filaments d'actine, peut régler l'organisation du cortex cellulaire en affectant la motilité et la survie . ...

722 n °6-7, vol. 16, juin-juil/el 2000 fil/S2000

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' o b s e rv a t i o n des c e l l u l es vivantes permet d'apprécier la dynam ique du cytosque­ l ette d'actine. En effet, les cel l u les se dépl acent dans p l u s i eurs d i rections, émetten t d es p roj ect i o n s pu i s l e s rét r a c t e n t , s'applatissent e t parfois s'arrondissent et se séparent pour donner deux cel-1 u les fi l i es . Tou s ces mouve m ents nécessitent l ' i ntervention du cytos­ quelette d'actine. A l ' i ntérieur de l a cel l u l e, ce cytosquelette p e u t être visual isé grâce à l a pha l loidine (cou­ p l ée à la r h od a m i ne), une petite molécule qui se fixe sur les fi laments d'actine (ou acti ne-F) (figure 1). Deux types de fi laments d'actine sont appa­ rents : l 'acti ne-F forme un réseau dense sous l a membrane plasm ique, mais elle est aussi présente sous l a forme de câbles très structurés appe­ lés câbles de stress, qui traversent le cytoplasme et s'ancrent à la mem­ brane plasmique dans des structures spécialisées, les poi nts focaux. La for­ mation de ces différentes structures d'actine-F doit être coordonnée par des mécan i sm es de régu lation qui

Roy M.

Golsteyn

�onique Arpin

Evelyne Friederich

Daniel Louvard

R.M. Golsteyn, M. Arpin, E. Friederich, D. Louva rd : I nstitut Curie, Cnrs UMR 1 44, Morphogenèse et signalisation cel l ulaires, 26, rue d' U l m , 75248 Paris Cedex 05, France .

dyna-Figure 1 . Fibroblaste de souris fixé, marqué avec une drogue fluorescente se fixant sur /'actine-F. Les structures les plus importantes d'actine-F sont observées dans le front de migration (correspondant aux projections sur le côté droit des cellules) et dans les faisceaux épais d'actine-F qui traversent la cellule. Ces différentes structures sont produites par différents types de pro­ téines, particulièrement le complexe Arp2/3 au front de migration, et les pro­ téines de la famille de la zyxine présentes dans les points focaux.

mique aux fi laments d'actine car elle p e r m et à un même f i l a m e n t d e s'a l longer à l'extrémité (+) et d e se raccourci r à l'extrémité{-), cela pour une concentration donnée d'actine. Les cel l u les uti l isent ces propriétés pour créer de nouveaux fi laments par différentes méthodes : soit la polymé­ risation se fait à partir de fi laments préexistants par addition de mono­ mères aux extrémités (+) (ces extrémi­ tés doivent être décoiffées dans la cellule), soit de nouvelles extrémités de fi laments sont créées par coupure d'un fi lament (processus de fragmen­ tation). Enfi n, une polymérisation de fi laments de nova ou une nucléation à part i r de deux ou trois monomères d'actine peuvent exister. La polyméri­ sation d'actine est aussi modulée par des protéi nes col lectivement appelées « protéi nes de liaison à l 'actine » qui i nteragissent avec l 'acti ne-G et/ou l 'actine-F. L'activité de ces protéi nes est réglée par d i fférentes voies de signal isation, par phosphory l ati on, par de petites molécules (Ca2+, phos­ pho-i nositides . . . ) ou par leur

concen-tration à des sites précis de la cel l u le. L'ensemble de ces processus est res­ p o n sa b l e du mouv e m e n t i nt e n se observé dans u ne cel lule vivante. B ien que le cytosquelette d'act i n e s o i t u n e e n t i té i m p l i q u é e d a n s d iverses fonctions cel l u l a i res, pour l a clarté de cet exposé nous d iscuterons ses p ro p r i étés en fo n c t i o n de sa l o c a l i s a t i o n i ntrace l l u l a i re . N o u s concentrerons cet exposé sur ( 1 ) l a polymérisation des filaments d'actine présents dans le front de m i gration ; ( 2 ) l ' o r ga n i sa t i o n d es fi l a m e n ts d'actine dans des complexes d'adhé­ rence des ce l iu les en mouvement ; (3) l ' i nteraction des fi laments d'actine a v e c l a m e m b r a n e d a n s d e s structu res dy n a m i ques du cortex cel lula i re.

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En avant

-Le complexe Arp2/3 Les cel l u les mobi les forment dans les fronts de m igration des structures spé­ c i a l i sées, a p p e l ées l a m e l l i podes. Cette région d'une épaisseur

d'envi-ron 2j..tm, d'où sont exclus les orga­ n i tes, c o n t i e n t de l ' a c t i n e - F q u i, observée e n m i c roscop i e é lectro­ nique, apparaît organ isée en réseaux formés de courts fi laments ramifiés. D a n s cette rég i o n de l a c e l l u l e, l 'actine-F incorpore des monomères d'actine p lus rapidement que dans d'autres régions de l a cellule pour former de nouveaux fi laments. Des études réa l isées grâce à des mono­ mères d'actine m a rqués avec des composés fluorescents i ndiquent que les nouveaux fi l aments se forment près de la membrane plasm ique [ 1 ] . L a polymérisation d e l 'actine c rée une force suffisante pour fai re avan­ cer la membrane plasmique et, avec d'autres régions de la cel l ul e, pro­ mouvo i r la mot i l i té cel l u la i re. Les fi laments anciennement formés qui se trouvent à l'arrière du front de m igra­ tion se dépolymérisent, relarguent des monomères d'actine qui seront ré­ i ncorporés dans de nouveaux fi la­ ments p rès de l a membra n e p las­ mique. Ce phénomène est strictement contrôlé et contribue à la production de forces qui permettent la mot i l ité cel lula i re.

En 1 999, les mécanismes mis en jeu dans la polymérisation de l'acti ne des lamel l i podes ont pu être m i eux com­ p r i s, grâce à la convergence des études de reconstitution du mouve­ ment, uti l isant des bactéries et des extraits d'œufs de xénopes [2] . Ces études ont montré qu'un élément clé dans la production d'actine-F est le complexe Arp2/3 (pour actin related proteins). Ce complexe constitué de 7 protéi nes a été à l'origine isolé à partir d'un orga n isme unicellulaire,

Acanthamoeba castellanii, et fut iden­ tifié plus tard dans toutes les espèces eucaryotes depuis la levure j usqu'à l ' h o m m e . Le c o m p l e x e A rp 2 /3 humain est composé de 7 protéi nes :

Arp2 et Arp3, p41 arc, p34arc, p2 1 -a rc, p2 0--arc et p 1 6--arc [3 ] . I l est local isé dans le front de m igration des cel l u les, qui est la région où l 'on observe le taux le plus élevé de poly­ mérisation de l'actine. Même chez la levure, dont la périphérie de la cel­ l u le est l i mitée par une paroi, le com­ plexe Arp2/3 est associé avec des structures corticales d'actine qui sont les régions les plus dynamiques.

La première i nformation sur le rôle essentiel du complexe Arp2/3 dans la polymérisation de l'actine a été

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nue par des études réalisées avec la bactérie L isteria monocytogenes [4] (figure 2). Les Listeria sont des bacté­ ries à G ram positif, parfois présentes dans les produits laitiers non pasteuri­ sés. Après i ngestion, l es bacté r i es pénètrent et se déplacent dans les cel­ lules j usqu'à ce qu'elles atteignent la m e m br a n e p l a s m i q ue, et s o i e n t englouties par la cel lule adjacente [5] . L'intérêt d u modèle de Listeria dans l'étude de la polymérisation de l 'actine a été reconnu pour la première fois par Lew Tilney et Dan Portnoy en 1 989 [6] . En exa m i nant par m icroscopie électronique des macrophages i nfectés p a r des L i ster i a , ces a u te u rs o n t observé la présence d e « comètes » d'actine derrière les bactéries. L'orga­ nisation de l'actine-F dans les comètes et dans le front de migration des cel­ lules en mouvement est simi laire ; on observe beaucoup de petits fi laments en réseaux, avec leurs extrémités (+) proches de l a bacté r i e (figure 3). Lorsque les cel lules i nfectées par Liste­ ria sont traitées par la toxine cytochala­ sine D, qui se fixe à l'extrémité (+) des fi laments d'actine et bloque la polymé­ risation, les bactéries ne bougent plus. De plus, l'uti l isation d'actine fluores­ cente i nd i que que les monomères d'acti ne s'accumu lent préférentiel le­ m e n t à l ' extré m i té des f i l a m e nts proche de la bactérie, indiquant a i nsi que le mouvement des Listeria est pro­ duit par la polymérisation de l'actine à l'extrém ité (+), tout comme dans le front de migration. L'identité des méca­ nismes biochimiques impl iqués dans le mouvement des Listeria et dans celui des cel l ules eucaryotes a été confirmée par l'isolement de protéines extraites de plaquettes, capables de restaurer le mouvement des bactéries. Ainsi, le mouvement des Listeria a été reconsti­ tué dans un système défini avec des protéi nes purifiées parmi lesquel les le complexe Arp2/3 est un composant essentiel [7] .

L'analyse biochimique et cinétique de l ' interaction du complexe Arp2/3 avec l 'actine i n d i q u e que le com p l exe se fixe à l 'extrémité (-) des fi laments d ' acti n e et pou rra i t sta b i l i se r les d i m è res e t les t r i m è res d ' a c t i n e nécessai res pour déclencher d e nou­ vel les polymérisations [8] . Cela sug­ gère que le complexe Arp2/3 possède

une activité de « nucléation », c'est-à­ d i re l a c a p a c ité d ' a sse m b l e r des monomères d'actine, à partir desquels 724 n°6-7, vol. 16, juin-juillel 2000 1Jl!S2000

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,. · -. . ., • _• � Figure 2. Cellules en culture infectées par la bactérie Listeria m o n ocytogenes (en rouge). Ces bactéries expriment, à leur sur­ face, la protéine ActA qui leur permet de recruter des pro ­ téines du cytosque­ lette de la cellule hôte. La polymérisa­ tion de /'actine par les protéines de la cellule hôte entraÎne la fo rmation d'une comète d'actine-F (en vert) capable de pro­ m o u voir le mouve­ ment de la bactérie. Ce type de mouve­ ment est en fait une version simplifiée de

p h é n o m è n e s plus complexes observés lors du mouvement des cellules. L 'analyse moléculaire du mouvement des Listeria, réalisée par différents laboratoires, a été déter­ minante pour l'élucidation du rôle du complexe Arp2/3 et zyxine dans la polymérisation de l'actine dans les cellules humaines. (Photo produite par le Pr P. Gossart, Institut Pasteur, Paris, France.)

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Actine (monomère)

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Coiffe -Lamellipode Cofiline _... Profiline

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Figure 4. Localisation du complexe Arp2/3 dans les lamellipodes (a-c et e-g). Les cellules sont des kératinocytes (a-c) ou des fibroblastes de xénope (e-g). L 'actine est en rouge et le complexe Arp2/3 en vert. (D) et (H) représentent la visualisation en microscopie électronique des complexes Arp2/3 (jaune) dans un kératocyte (DJ ou un fibroblaste (H). (Photo reproduite avec la permission de G. G. Borisy du site web : http://borisy.bocklabs. wisc.edu.)

de nouveaux fi laments seront formés (in vitro, i l s'agit d'une étape l i m i ­ tante). Cependant, le système présente plusieurs contraintes : i 1 doit être activé par une autre protéine, son activité est maximale lorsqu' i l est fixé sur le côté d'un fi lament préexistant, et i l reste attaché aux fi laments dont i l a induit

l a « n u c l éa t i o n » . B i en q u e ces contrai ntes a ient conduit à une rééva­ l uation de notre compréhension des mécanismes de nucléation de l'actine dans le front de migration, les résu ltats sont en parfait accord avec les obser­ vations de microscopie électronique. A l'aide d'une série de micrographies

spectaculaires, Svitki na et Borisy ont montré que le complexe Arp2/3 est présent là où de nouveaux fi l aments se sont formés [9] (figure 4). De pl us, ces branchements forment un angle de 70° définissant un réseau orthogonal, qui ressemble à ceux décrits dans le front de migration des cel lu les et dans la comète de Listeria.

En dépit de ces propriétés très intéres­ s a n tes, l e c o m p l exe A rp 2 /3 n ' a qu'une très fa ible activité d e « nucléa­ tion » lorsqu' i l est ajouté à des solu­ tions d'actine-G, ce q u i suggère que d'autres composants sont nécessai res. Parm i ceux-ci, un candidat a été pro­ posé : i l s'agit de ActA, une protéine bactérienne présente à la surface des L i steria. L'addition de ActA à une sol ution d'actine contenant le com­ plexe Arp2/3 augmente considérable­ ment le taux de polymérisation de l 'acti ne- F par rapport a u taux observé en l'absence du complexe Arp2/3 ou de ActA. Les cel l u les eucaryotes ne contenant normalement pas ActA, i l a été proposé q u ' u ne a utre protéi ne, coopérant avec le complexe Arp2/3 deva i t exister, afi n de sti m u ler l a polymérisation d e l 'actine. E n effet, les travaux de Roghatgi et al. ont démontré que les protéi nes de l a fam i l l e WASP activent également l e complexe Arp2/3 [ 1 0 ] .

L'identification de WASP et des pro­ téi nes apparentées a permis d'établ i r u n l ien entre certai nes maladies et la polymérisation de l 'acti ne dans l e front d e migration. WASP est le pro­ d u it du gène WAS, qui existe sous forme mutée chez les patients souf­ fra n t d u s y n d ro m e de W i s kott­ A i d r i c h . Ce syndrome, qui affecte quatre enfants mâles sur un m i l l ion, est l ié au chromosome X et se carac­ térise par de sévères thrombocytopé­ nies, de l'eczéma et un déficit immu­ nitai re (mis 1 998, n° 1 1, p. 1 280 ; mis 1 996, n° 1 0, p. 1 1 73).

Le rôle de WASP dans l'organisation

des fi laments d'actine a d'abord été suggéré lorsque son association avec cdc42, une petite GTPase ayant un rôle régu lateu r dans l a polymérisation de l'acti ne, a été m ise en évidence [ 1 1 ] (mis 1 996, n° 1 2, p. 1 42 1 -3). L'analyse de la structure primai re de WASP a révélé que, outre le site de l iaison aux petites GTPases, cette pro­ t é i n e c o n t i e n t d ' a u t res d o m a i nes d ' i nterac t i o n tels q u ' u n d om a i ne W.H 1 présent également parmi l es

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membres de la fam i l le VASP/ena, un domai ne riche en pra l i ne q u i permet la liaison aux domai nes SH3. Dans la partie carboxy-termi nale, u n domaine W H 2 /VCA c o n t i e n t d e c o u rtes séquences d'acides a m i nés trouvés dans la verprol ine (V) et la cofi l i ne (C) deux protéines qui interagissent avec l'acti ne-G et l'acti ne-F, a i nsi qu'une séquence nécessaire à la l iaison du complexe Arp2/3 .

Tout comme le complexe Arp2/3 , la fa m ill e d e p roté i n e s W A S P est conservée depuis l a l evure j usqu'à l'homme, et contient a u moins trois sous-fa m i l l es : VASP/ena, les pro­ téines Scar, et WASP. La confi rmation du rôle de WASP dans la production de forces créées par la polymérisation d'actine a été apportée par une expé­ rience uti lisant des m icrob i l les recou­ vertes de la protéine WASP. Lorsque ces billes sont placées dans un extrait cel l u l a i re, el les recrutent de l'actine, forment des comètes, se déplacent et ce mouvement est dépe n d a n t d u complexe Arp2/3 [ 1 2 ] .

L'identification d u complexe Arp2/3 et de WASP a enfi n permi s d'expli­ quer les mécan ismes de polymérisa­ tion de l'actine cel l u la i re. Ces études ont montré que ces mécanismes peu­ vent être plus d ivers que ce qui avait été ant icipé, tout en étant prévisibles par s i mple observation de la cel l u le.

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Juste derrière - La zyxine En dehors du front de migration, les poi nts focaux représentent d'autres struct u res r i c hes en acti ne-F. Ces poi nts d'ancrage à la matrice extra­ cel l u l a i re n'ont pas seu lement u ne fonction mécan ique mais sont aussi de véritables « centres » de signal isa­ tion. Tout comme dans le front de m i grati o n , ce sont les propr i étés dynamiques de l 'actine associée aux p o i nts foca u x q u i j o uent un rô l e essentiel lors de la migration cel lu­ l a i re. En revanche, dans les poi nts focaux, l'organ isation de l 'acti ne-F est très d ifférente de cel le observée dans le front de migration. Contra i rement à ceux des lamel l ipodes, les microfi la­ ments ne sont pas organisés en réseau orthogonal, m a i s en fai scea u x q u i sont attachés à l a membrane pl as­ m ique. Les extrémités (+) des m icrofi­ laments sont orientées vers la mem­ brane p l a s m i q u e et sont en étroit

contact avec un complexe protéique 726 11 ° 6· 7, vu/. 16, jnin:iui/M 21100 lllJS2000

cytoplasm ique associé aux intégrines, ces récepteurs transmembranaires qui ancrent la cel lule à la matrice extra­ cel l u la i re. L'organ isation de l 'actine-F des poi nts focaux étant très différente de cel le du front de m igration, i l n'est peut être pas surp renant qu' i ls ne contiennent pas le complexe Arp2/3, et qu'un autre mode de polymérisa­ t i o n de l ' a c t i n e e x i ste d a n s ces structures.

Il est bien établi que l'activation des i ntég r i n es , de c o n c e rt avec d e s s i g n a u x provenant d e s récepteurs tyrosi ne kinase, déclenche la cascade des évenements qui mènent à la for­ m a t i o n d ' u n com p l exe p roté i q u e ancré aux microfi laments. Ces voies de signal isation activent les petites GTPases de la fam i l le de rho, de véri­ tables « i nterrupteurs » molécu l a i res qui jouent un rôle primordial dans l e c o n t r ô l e d e l a d y n a m i q u e e t d e l 'organ isation du cytosquelette [ 1 3 ] . Ainsi, une des fonctions d e Rho est d'activer la myosine Il en contrôlant l'état de phosphoryl ation de l a sous­ u n i té régu l atri ce de la myosi ne I l

[ 1 4] . Sous sa forme activée, l a myo­ sine Il forme des dimères bipola i res q u i s'assoc i en t à d e u x fi l a ments d'acti ne, favorisant a i nsi leur organ i­ sation en faisceaux [ 1 5 ] . Si l'i mpor­ tance de la myosine Il dans l'assem­ b l a g e des c â b l e s d e stress e s t i ndéni able, le mécan isme p a r lequel l 'acti ne polymérisée est formée au n iveau des poi nts focaux demeu re mal compris. L'étude de l'assemblage des câbles de stress par vidéomicro­ scopie suggère l'existence d'un pré­ curseur cytoplasmique comportant de l'actine polymérisée [ 1 6] . De même, l ' i njection de la petite GTPase rho dans des cel l u les en cu lture i nduit la formation de câbles de stress dans le cytoplasme, en l'absence de com­ plexes d'adhérence [ 1 7 ] . Des fai s­ ceaux d'actine pourraient donc être assemblés dans le cytoplasme, avant d 'être a n c rés a u x i n tégr i n es p a r l'i ntermédiaire d e protéines tel les que la tal ine ou l'a-actini ne, qui interagis­ sent d i rectement avec la partie cyto­ plasmique des intégri nes. Cependant, des données expéri mentales suggè­ rent éga lement q u e des fi l a ments d'actine sont formés de nova aux poi nts focaux. En effet, l'actine mono­ mérique est rapidement i ncorporée au niveau de ces structures dans des

modèles de cel l u les perméabilisées,

suggérant l a p résence de s ites de nucléation de l a polymérisation de l 'actine.

Si le complexe Arp2/3 est absent des poi nts focaux, i l est i mportant de noter la présence de la zyxi ne, i nitia­ lement décou verte par Mary Bec­ kerl e, à l ' U n i vers ité d ' U ta h ( U SA) [1 8]. De façon comparable à l'identi­ fication de WASP, c'est de nouveau le modèle de Listeria qui a prouvé la fonction de cette protéine dans le contrô l e de l a polymérisation de l 'actine. La zyx ine est la prem i ère protéine de mammifère pour laquelle des propriétés structura les et fonc­ tionnel les comm unes avec ActA de Listeria ont été m i ses en évidence [ 1 9 ] . La zyx i n e appartient à u n e fam i l le d e protéi nes local i sées dans les lame l l i podes, les jonctions adhé­ rentes et dans les poi nts focaux. E l le interagit avec des protéines du cytos­ quelette, l 'a-act i n i ne, l es protéi nes VASP/Mena, a i nsi qu'avec Vav, u n facteur d'échange des petites GTPase

Rac (mis 1 995, no 7, p. 1 045) et de

Rho (mis 1 996, n ° 1 7, p. 1235-40). Sa part i e ca rboxy-term i nale, riche en résidus cystéine et histidine comporte trois dom a i nes LIM. Ces domai nes fo r m e n t d es s t r u ct u re s a p p e l ées « doigts de zinc » qui sont impl iquées d a n s l e s i n te r a c t i o n s proté i ne­ protéine.

Les propriétés biochimiques et biolo­ giques de la zyx i ne suggèrent qu'el le est impliquée dans le contrôle de la dynamique de l 'actine. D'une part, le ciblage de cette protéine à la face i nterne de la membrane plasmique grâce à une séquence CAAX, induit la formation d'extensions membranaires riches en acti ne ; d'autre part, la par­ tie ami no-term i nale de la zyxi ne est riche en pral i n e et comporte des motifs « FPPPP » (consensus : E/D F PPPPXD/E). Ces motifs, i n itialement identifiés et caractérisés dans ActA de

Motifs riches

en praline Domaines LIM Figure 5. Représentation schématique des caractéristiques structurales de la zyxine et des protéines apparentées. La zyxine contient deux domaines : un domaine riche en praline et un domaine LIM. Ils contiennent tous deux de nombreux sites d'interaction avec d'autres protéines, dont certaines inter­ agissent avec le cytosquelette d'actine. Nous décrivons ici l'interaction avec VASP, mais d'autres partenaires tels que CRP (cystei ne-rich protein), VA V, l'a-actinine interagissent aussi avec la zyxine. La liste complète des protéines liant la zyxine n'est pas connue. Néanmoins, il est clair que la zyxine et les protéines apparentées ont un rôle de régulation du cytosquelette d'actine.

(Schéma réalisé par Julie Fradelizi, Institut Curie, Paris, France.)

Les motifs « FPPPP » sont des unités m od u l a i re s c a p a b l es d e l i e r l e s membres d e l a fam i l l e VASP/Mena, dont on pense qu'ils jouent un rôle essentiel dans le contrôle de la dyna­ mique du cytosquelette. VASP a été d'abord décrit comme un substrat de ki nases dépendantes de l 'AM Pc et du GMPc, activées lors de l ' i n h ibition de l a réaction d ' agréga t i o n des p l a ­ quettes sangui nes. L a protéine Mena, un autre membre de cette fam i l le, est détectée exc l usivement dans le cer­ veau [22 ] . Ces protéi nes sont appa­ r e n tées à WAS P et c o n t i e n n e n t comme cel l e-ci u n domai ne EVH 1 a i nsi que des séquences riches en pral i ne q u i sont i m portantes pour l'interaction avec l a profi l i ne [23 ] . Depu is l a détection de l a protéine VASP à la surface de Listeria monocy­ togenes, sa participation au contrôle de la polymérisation de l 'actine a été proposée [2 4 ] . La vitesse du mouve­ ment de bactéries qui produ isent des m u ta nts d ' ActA, t ro n q u és des séq u e n ces r i c hes e n p ra l i ne, est réduite de trois à six fois. Des expé­ riences de reconstitution in vitro du mouvement de L isteria monocyto­ genes ont récem ment confi rmé u n

rôle d e cette protéine dans l'accéléra­ tion du mouvement de la bactérie [7] . Cependant, contra i rement a u com­ plexe Arp 2/3, l a protéine VASP n'est pas cruciale pour le mouvement de l a bactérie, m a i s en s o n a bsence, l a vitesse est rédu ite d'un facteur 1 O. Le mécan isme moléculaire par lequel VASP affecte l a dynamique du cytos­ quelette n'est pas encore élucidé, car elle se lie à d ifférents composants du cytosquelette d' acti ne. V ASP i nteragit di rectement avec l 'actine F par son domai ne EVH 2 . Par sa l iaison avec la p rofi l i n e, e l l e i nteragit aussi avec l'acti ne G. VASP/Mena pourrait, en r e c r u t a n t le c o m p l exe p rofi l i n e­ a c t i n e , a u g m e n t e r l oc a l em e n t l a concentration en monomères d'actine et donc l a vitesse de polymérisation. L'i nactivation génique de Mena chez la souris provoque des perturbations du développement cérébral qui sont accrues par l ' i nactivation du gène codant pour la profi l i ne Il [2 5 ] . Nous avons v u qu'au niveau cel l u­ laire, la polymérisation de l 'acti ne est strictement contrôlée dans l'espace et dans le temps. Cela i mpl ique que le contrôle de la d istribution spatiale et celu i de l'activité des protéi nes

néces-saire à la polymérisation de l 'actine sont étroitement l iés. Ainsi, l a zyxine ou d'autres protéi nes comportant des motifs « FPPPP » seraient capables de m od u l er l ' a ct i v i té des proté i n e s VASP/Mena en recrutant ces protéi nes à des sites dynamiques de la cel l u le. L'observation que la LPP, apparentée à la zyxine, recrute VASP lorsqu'elle est c i blée à une local isation ecto­ pique, est en faveur d'un tel méca­ n isme [2 1 ] . De p l us, des pepti des c o m porta n t l e mot i f c o n s e n s u s d'i nteraction avec VASP/Mena sont capables de déplacer VASP hors des points focaux lorsqu'ils sont i ntrodu its dans des cel lu les en culture [20] . S'il est donc probable que le recrutement de VASP/Mena au niveau des poi nts d'adhérence à la matrice extrace l l u­ l a i re dépende majorita i rement des p roté i n es c o m po r t a n t des m o t i fs « F P P P P » , i l n ' est pas exc l u q u e VASP/Mena soit éga lement d i recte­

ment recrutée aux sites d' i ncorpora­ tion de l'actine à la face i nterne de la membrane plasm ique [26] .

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Et au-dessus - L'ezrine

Nous avons décrit les deux types de structure d'actine, visibles dans la cel­ l u le, comme deux entités i ndépen­ dantes, mais en réal ité el les ne le sont p a s . A i n s i , l o rsq u ' u ne c e l l u l e se déplace et crée un front de m igration, elle doit établ i r de nouveaux points de contact. Cela requiert un n iveau supérieur d'organisation tout comme « la décision » d'une cel lule de se dif­ férencier, de se diviser ou de se dépla­ cer de nouveau, voi re de mouri r. Tous ces processus nécessitent le cytosque­ l ette d'acti ne et vont dépendre de l'action coordonnée de la polymérisa­ tion/dépolymérisation des fi la ments d'acti ne, mais aussi de leur associa­ tion avec la membrane plasm ique. Le mode d'interaction des fi laments d'actine avec la membrane peut être très varié, mais nous l i mi terons cette discussion à une fam i l le de protéi nes, les ERM (ezri ne, radixi ne, moési ne). L'ez r i ne a été i solée en 1 983 par A. B retscher de l ' U n iversité Cornell, à New York (USA) (d'où son nom en hommage à son fondateur, Ezra Cor­ n e l l ) c o m m e u n c o m posa n t des m i c rov i l los i tés des cel l u l es i ntesti ­ nales [2 7] , tandis que l a moési ne e t l a rad i x i ne ont été caractérisées p l u s tard par des approches d e biologie

ffi/S

2000

moléculaire. Les ERM présentent un fort degré d'homologie (75 % d' iden­ tité). En outre, leur domaine ami no­ terminal est conservé dans un grand n o m b re de p roté i n es, regrou pées dans une superfami l le dont le proto­ type est l a protéine 4 . 1 [2 8 ] . Cette superfam i l le contient éga l ement l a merl i ne/schwa n n o m i ne, l e p rod u i t d ' u n gène suppresseur d e tumeurs responsable de la neurofibromatose de type I l .

Dans les cel l ules e n culture, les ERM sont présentes dans des structu res dynam iques de la membrane riches en actine tel les que les m icrov i l losi­ tés, les fi lopodes et lamel l i podes, tan­ dis que dans les or_ganes, elles pré­ s e n t e n t u n e s p é c i fi c i té t i ss u l a i re d'expression, l 'ezrine et l a moésine étan t présentes respecti vement a u pôle apical des cel lu les épithéliales et endothél iales [29].

Sur la base de l 'homologie des ERM avec la protéi ne 4 . 1 , une fonction de l ia ison des fi l aments d'actine à l a membrane a été proposée pour les ERM. Cependant, il a fal l u attendre plus de dix ans avant que les pre­ m i ères i nformations sur l es méca­ n ismes moléculaires impl iqués dans l ' i nteraction des ERM avec leurs par­ tenai res soient obtenues, et avant que des fonctions soient assignées à ces protéi nes.

Comment les ERM contrôlent-el l es l 'orga n i sation du cortex cel l u l a i re ? Les prem ières i nformations ont été obten ues par l ' i nactivation de ces p rotéi nes, ou la s u rexpress i o n de leurs formes tronquées. La technique de MicroCAL I (chromophore-assisted laser inactivation) a m o n t ré q u e l ' i nactivation des E R M provoque l a rétraction des extensions d e l a mem­ brane p l asmique [30] . L ' u t i l isation d ' o l i go n u c l éo t i des a n t i se n s des A R N m codant pour ces tro i s pro­ téines con d u i t à la d i sparition de m icrovil losités et à des modifications de l 'adhérence de cel l u l es épithé­ liales [3 1]. La surproduction des pro­ téi nes tronquées est souvent morpho­ gène et i nd u it des p rolongements membra n a i res [3 2 ] , a lors que ces effets m o r p h ogènes ne s o n t p a s observés avec l a protéine entière. Comment expliq uer cette observa­ tion ? Les ERM sont constituées de deux domai nes : un domaine globu­ l a i re a m i no-term i n a l q u i i nteragi t avec l a membrane plasmique, et un 728 n • 6- 7, vol. 16, juin-juillet 2000 IJliS2000

1

dom a i n e ca rboxy-te rm i n a l assoc 1 e a u x fi laments d'actine [3 3 ] . L e site de l i a i son à l 'acti n e fi l a menteuse est local i sé dans les 35 dern iers acides aminés du domaine carboxy-term i nal [34] . Deux autres sites potentiels de l i aison à l 'actine G et F, respective­ ment, ont été récemment local i sés dans la partie a m i no-term inale des

ERM [3 5 ] .

L'i nteraction avec les protéi nes mem­ branaires peut être di recte : c'est le cas de l 'association des ERM avec les protéi nes membra n a i res i ntégra les i m p l iquées dans l'adhérence cel l u­ l a i re tel les que CD44, CD43 et les

ICAM (intercellular adhesion mole­

cule). En revanche, l ' i nteraction des ERM avec des proté i nes membra­ naires tels que le CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regula­ tor) ou l'échangeur Na+/H+ est indi­ recte et rel ayée par des phosphopro­ téi nes à domaines PDZ, les protéi nes N H E-RF/EB P50.

L ' i dentification des partenai res des E RMs a révélé des propriétés impor­

tantes de ces protéi nes. E l l es sont capables de former des i nteractions i ntra- et i ntermoléc u l a i res via leurs domai nes ami no- et carboxy-termi­ naux, N-ERMAD et C-ERMAD (ezrin radixin moesin association domains).

Ces i nteractions masquent les s i tes d ' i n teractions des E RM avec l e u rs p a rte n a i re s . P a r e xe m p l e, N H E ­ R F/ E B P 5 0 est i n c a p a b l e d e 1 i e r l 'ezri ne sauvage, alors que l ' inactiva­ tion du domaine C-ERMAD permet cette association [3 6] . L'association de ces protéi nes avec l a membrane et le cytosquelette d'actine devrait donc être réglée par des changements de conformation de ces protéi nes, et cette hypothèse est confirmée par dif­ férentes observations. Les ERM exis­ tent dans le cytopl asme sous u n e forme i nactive, e t l 'activation des ERM conduit à l'oligomérisation de ces protéines, à leur recrutement à la membrane et à leur i nteraction avec les fi l aments d'actine. Cependant, ces différentes étapes n'ont pas été for­ mel lement démontrées, et des expé­ r i e n ces de reco n st i tution in vitro

devra i e n t permettre d ' a n a l yser l es séquences i ntervenant dans l'activa­ tion des ERM (figure 6).

L'identification des signaux permet­ tant l 'activation des E RM demeure un point majeur à él ucider afi n de com­ prendre leur mode d'action. Les ERM

étant les substrats de diverses tyrosi ne et thréonine/sérine kinases, la phos­ phorylation pourrait être un moyen d'activer ces protéines. En effet, dans plusieurs cas, une corrélation entre le niveau de phosphorylation des E RM et leur association avec des structures membranai res formées en réponse à des sti m u l i a été observée. Inverse­ ment, la déphosphorylation des pro­ téi nes condu it à la dissociation des

ERM de la membrane plasmique [3 7] . La phosphorylation d'un résidu th réo­ n i ne localisé dans le site de l iaison à l 'actine F semb l e être d i rectement impliquée dans l ' i nteraction des ERM

avec l'act i n e F in vivo a ussi bien

qu'in vitro [38] . De pl us, la phospho­

rylation de cette thréon ine empêche l ' i nteraction du N-E RMAD avec le C­ E RMAD, suggérant que cette phos­ phorylation mai ntient les E RM dans une conformation active.

La phosphorylation des ERM sur des résidus tyrosine est également néces­ sai re pour l'activité des ERM. Des cel­ l u l es ré n a l es c u l t i vées d a n s u n e matrice d e col lagène de type 1 en pré­ sence d'HGF (hepatocyte growth fac­

tor) forment des structures rappelant

des tubu les rénaux. Cette tubuloge­ nèse dépend de la phosphoryl ation de l 'ezrine sur l es tyrosi ne 1 45 et 353, pu isque la substi tution de ces résidus par des phénylalanines inh ibe complètement l a morphogenèse en réponse à I ' H G F [39] . Enfi n, les phos­ phoi nositides pourraient avo i r un rôle dans l 'activation des E RM puisque, in vitro, le Pi P2 augmente l'affin ité des ERM pour les protéines membranaires et l 'actine.

//

Actine-F

•

EBP50

Figure 6. Modèle d'activation de l'ezrine. Dans le cytoplasme, les mono­

mères d'ezrine sont dans une conformation inactive, en raison d'une interac­ tion intramoléculaire entre le domaine amino-terminal et le domaine car­ boxy-terminal. L 'ouverture conformationnelle permettrait de démasquer les sites cryptiques de liaison aux protéines membranaires et aux filaments d'actine. La liaison aux protéines membranaires peut être directe ou relayée par une phosphoprotéine, NHERF/EBP50. Les signaux qui conduisent à l'acti­ vation de l'ezrine ne sont pas connus.

semble donc exister une boucle de régulation entre la GTPase Rho et les E R M . Cepen d a nt, l 'activation des ERM par un effecteur de Rho n'a pas été mise en évidence.

Les travaux effectués au cours de ces cinq dernières a nnées ont montré que les E RM i nteragissent avec divers par­ tenai res membranaires et différentes voies de signal i sation. Peu d'i nforma­ tions sur le rôle des E RM dans le

contrôle de l 'orga n i sation des fi la­ ments d'actine ont été obtenues à ce jour. En revanche, l'impl ication des E RM dans d i verses fonctions cel l u ­ laires a déjà été proposée. Ainsi, les E R M l i ées a u x fi l a m ents d'act i n e pourrai ent régler l 'activité d e p ro­ téines transmembranaires tels que le CFTR ou l 'é c h a n g e u r N a+fH+, en recrutant des protéi nes de régul ation [42, 43], ou tels que le récepteur �2-adrénergique en réglant son endocy­ tose [44] .

U n rôle d i rect de l 'ezrine dans l a transmission d e signaux d e survie des cel l ules épithéliales a récemment été établ i . Des cel l u l es produ isant de

l'ezrine dont le résidu tyrosine 3 53 a été m uté en phénylalanine ne sont plus capables de former des tubu les dans u ne matrice de col lagène et entrent en apoptose. Le mécanisme par lequel l'ezrine transmet un signal de survie a été identifié. L'i nteraction de la tyrosine 353 phosphorylée avec le domaine C-SH2 de la Pl3-ki nase conduit à l'activation de la PI3-K et donc d' Akt (mis 1 999, no 6/7, p. 897),

une kinase nécessaire à la survie des cel lu les. L'apoptose observée dans les cel lules exprimant l'ezri ne mutée est donc due à un défaut d'activation de la voie PI3-K!Akt [45 ] . Ainsi, cette expérience fournit un exemple de l a régu lation d e la survie des cel l u les par une protéine l iant l 'actine. L'ezrine est u n exemple de protéine capable d'i ntégrer des s ignaux q u i contrôlent la dynamique d e l'acti ne-F et des événements majeurs tels que la motil ité ou la survie. En raison des problèmes i nhérents à l'étude de sys­ tèmes d y n a m i q ues, i l est pa rfo i s nécessai re d'étudier les mécanismes de polymérisation de l'actine, et les

processus cel l u l a i res qui en décou­ lent de man ière indépendante. B ien que nous ayons décrit l 'ezri ne, le complexe Arp2/3, la zyxine et les sys­ tèmes qu'ils représentent comme des entités isolées, ces protéi nes jouent également un rôle i m portant dans la transm ission de signaux et dans l a production d'acti ne-F. L a complexité est l'une des caractéristiques com­ mu nes aux protéi nes qui règlent le cytosquelette d'actine et le mouve­ ment cel l u l a i re. Le complexe Arp2/3 est composé de 7 protéi nes dont 5 ont u n e fonction i nc o n n ue, et l a zyxine et l'ezrine forment des com­ p l ex es m u l t i p roté i q u e s avec u n nombre i ndéterminé de partenai res. I l faut ajouter à cette complexité struc­ turale une d i mension spatiale, que l'on peut observer dans d i fférents compartiments d'une cel l u le. Ainsi, la compréhension a u n i veau molécu­ laire de la manière dont l e cytosque­ lette d'actine contrôle le mouvement cel l u la i re peut semb l e r u ne tâche i mpossible. Cependant, l'observation d'un orga n isme en dével oppement, de la formation de tissus, ou de la réparation de blessures, montre que ces mouvements sont parfa itement contrôlés. Peut-être est-ce j ustement l'élégance du mouvement cel l u l a i re q u i nous pousse à comprendre l a machi nerie qui le sous-tend • Remerciements

Nous remercions tous nos col l ègues de

l'« Unité de morphogenèse et signalisation cel­ lulaires >> pour leurs discussions et commen­ taires sur ce travail. Nous regrettons de n'avoir pas cité de nombreux travaux de nos collègues, en raison ·des normes éditoriales. Ce travai l a été financé par l'ARC (Contrats no 1 3 1 2 ; 9622).

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TIRÉS À PART

IWS2000

Su rn

mary

The proteins of the actin

cytoskeleton : weil placed

for motility

The cel l s of our body are capable of a tremendous variety of move­ ments that req u i re the coord i na­ tion of the actin cytoskeleton, a complex network of proteins. At the heart of this network, actin is attributed with the dynamic pro­ pert i es of a l ternati ng between a m o n o m e r a n d a l o n g p o l y m e r cha i n . One o f the major problems in biology has been to u nderstand how the s i mple process of actin polymerisation and depolymerisa­ tion can orchestrate the complex ce l ! m o v e m e n t n ec e s s a ry for embryogenesis, immune response, and wound repai r. ln this review, we focus on three d i fferent, but related systems that play a major role in regulating the act i n cytos­ ke l eto n . Two of these systems, represented by the Arp2/3 com­ p l ex a n d zyx i n , a p p e a r to be important in contro l l i ng acti n poly­ m e r i sation by d i fferent mecha­

nisms acting at different locations

in the cel ! . A thi rd major system is

represented by ezrin, wh ich, i n

addition to i ts d i rect i nteraction

with acti n, can re_gu late the actin

cytoskeleton and affect cel! move­ ment and survival. To unravel the complexities of cel! movement and

the actin cytoskeleton has been a

major cha llenge, but the use of

many different experi menta l sys­ tems has now given us an integra­

ted view of cel! motil ity.

.----* ABRÉVIATIONS "' ----.,

WASP : Wiskott-Aldrich syndrome pro­

tein.

VASP : vasodilator stirnulated phos­ phoprotein.

WH2/VCA. : WASP homology 2/ver­

prolin, cofilin, acidic.

Will : WASP homology 1.

CFI'R : cystic fibmsis transmernbrane

conductance regulator. UM : (Lin-1 1, lslet 1, Mec-3). /CAM : intercellular adhesion mole­

cule.

APPEL D 'OFFRES

Fondation Bayer Santé

Attribution de bourses à « une équipe hospitalière »

Pour que les équi pes médicales exerçant dans un service hospital ier ou une structure extra-hospitalière puissent bénéficier d'un soutien financier, la Fondation Bayer Santé a décidé de distribuer trois bourses d'un montant annuel de 1 00 000 F chacunes (deux bourses

à une équipe hospitalière et une bourse à une équipe para-médi­ cale) pour soutenir

un projet original visant

à

améliorer :

• l ' accès aux soins

• la prise en charge de malades atteints de pathologies chroniques

Peuvent postuler :

• Tous les médecins et professionnels de santé membres d'une équipe

n' apprutenant pas ou ne travaillant pas dans un CHU ou CHR.

• Le médecins ou chercheurs n' appartenant pas à un organisme de

recherche comme l ' INSERM ou le CNRS.

Les équipes intéressées doivent faire parvenir à la Fondation

Bayer Santé en 10 exemplaires :

• Le curriculum vitae du chef du projet.

• Un résumé du projet en 3 pages dactylographiées (double inter­ l igne) maxi mum. Celui-ci peut concerner une seule équipe ou asso­

cier 2 ou 3 équipes de disciplines identiques ou complémentaires.

Ce résumé doit comporter : Prérequis Hypothèse de travail Population étudiée Méthodes Résultats attendus Faisabilité -Calendrier - Modalités d' évaluation.

• Une justification des dépenses engagées.

Les projets soumi s seront examinés par les membres du Conseil d' Administration.

Une évaluation du travail réalisé sera effectuée par le Conseil d ' Administration de la Fondation Bayer Santé, 1 2 moi s après l ' attribution effective de la bourse de recherche.

L'excellence d ' un travail en cours, mais non terminé, peut justifier le renouvellement de la bourse pur une deuxième année.

Date limite de réception des demandes de subvention : 30 novembre 2000

Pour tout renseignement complémentaire et

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