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Étude de la compétition entre les populations
sulfato-réductrices et méthanogènes dans des réacteurs
de méthanisation d’effluents d’élevage
Christophe Vroland
To cite this version:
Christophe Vroland. Étude de la compétition entre les populations sulfato-réductrices et méthanogènes dans des réacteurs de méthanisation d’effluents d’élevage. Sciences de l’environnement. 2009. �hal-02595604�
Étude de la compétition entre les populations
sulfato-réductrices et méthanogènes dans des réacteurs de
méthanisation d’effluents d’élevage.
Rapport de stage de M1
Etudiant : VROLAND Christophe
M1 MFA (microbiologie Fondamentale et Appliquée) à l’université de Rennes1 responsable de stage : PEU Pascal
Laboratoire d’accueil : CEMAGREF (Centre National Machinisme Agricole Génie Rural Eaux et Forêt/Science Eau et Forêt) : 17, Avenue Cucille, 35000 Rennes - 02 23 48 21 21 -
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Table des matières
I.Introduction... 3
A.Contexte ... 3
B.La digestion anaérobie... 3
II.Matériels et Méthodes ... 7
A.Test batch... 7
B.Mesures chimiques ... 8
1.Demande chimique en oxygène (DCO) ... 9
2.MS ... 9
3.MO... 9
4.Sulfures totaux... 10
C.Microbiologie moléculaire ... 10
1.Extraction de l’ADN à partir des échantillons... 10
2.PCR nichée (N-PCR)... 10
3.SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)... 11
III.Résultats et Discussion... 12
A.Essai avec les substrats seul ... 12
1.Suivi de la production de biogaz et détermination du potentiel maximum de méthanogénèse... 12
B.Essai avec substrat plus inhibiteurs ... 15
1.Suivi de la production de biogaz et analyses physicochimie... 15
2.Suivi des populations microbiennes ... 17
IV.Conclusion... 19
V.Bibliographie ... 20
Index des figures
Figure 1: Réseau trophique de la digestion anaérobie (Garcia et al. 2000) ... 4Figure 2: Formes ioniques des sulfures en fonction du pH... 4
Figure 3: Essai batch et matériels nécessaire ... 8
Figure 4: suivi de la production cumulé de biogaz par tonne de matière au cours du temps pour une expérimentation(rouge) et de l'inculum seul (bleu)... 14
Figure 5: profil SSCP de la région V3 A : des Archaea du substrat (rose) et de l’inoculum (bleu), B : des bactéries du substrat et de l’inoculum... 15
Illustration 6: Effet de l’ajout de sulfure sur la production de méthane exprimé en % d’augmentation de la production par rapport à l’essai sans ajout ... 17
Illustration 7: Profils SSCP des différents essais au début et à la fin des expérimentations pour les deux domaines microbiens explorés : archaea (A) et bactérie (B) ... 18
Index des tableaux
Tableau 1: Seuils de toxicité aux sulfures en g.L-1 retrouvés dans la littérature... 5Tableau 2: Listes de PCR réalisées ... 11
Tableau 3: Caractéristiques physicochimiques des substrats et des inocula ... 12
Tableau 4: Récapitulatif des mélanges (substrats, inoculum), de la DCO entrante et sortante et de la production de biogaz pour le premier essai... 14
Tableau 5: Récapitulatif des mélanges (substrats, inoculum), de la DCO entrante et sortante et de la production de biogaz pour le premier essai... 16
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Liste des abréviations
AGV : (angl. : VFA), acide gras volatile : l’acétate le propionate, le butyrate, l’isobutyrate, l’acide valérique, l’acide isovalerique, le lactate en sont les principaux représentants.
CG : Chromatographie en phase Gazeuse
DCO : (angl. : COD) demande chimique en Oxygène
Eau Ppi : eau prêt pour injection
MES : matière en suspension
MO : matière organique
MPB : terme angl.,bactéries Méthanogènes (autre terme trouvé dans la littérature : MPA pour archaea méthanongène)
MS : matière sèche
N-PCR : terme angl., PCR nichée
SRB : terme angl., bactéries Sulfato-Reductrice
TS : sulfure total CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref
I. Introduction
A. Contexte
Dans un contexte ou la protection de l’environnement est importante, la production de méthane par digestion anaérobie des déchets agricoles (animal ou végétale) et industriels est une possible source d’énergie renouvelable. Dans le contexte agricole, ce procédé permet, de valoriser les effluents afin de les stabiliser et d’en réduire leur volume. Mais il est aussi possible d’utiliser ce procédé dans d’autre contexte ou il y a une production de déchets organiques (déchets des ménages, par exemple).
B. La digestion anaérobie
La digestion anaérobie en condition mésophile fait appel a un réseau trophique ou plusieurs groupes de micro-organismes sont impliqués (figure 1). Tout d’abord, les composés organiques complexes et les polymères sont pris en charge par les bactéries hydrolytiques et fermentatives. Il en résulte de nombreux produits dont les majeurs sont : du dioxyde de carbone (CO2), de l’hydrogène (l’H2), des acides gras volatils (AGVs). Suite à cette première étape, ces
produits sont ensuite consommés par les des micro-organismes acétogènes « Obligated Producing Hydrogens Bacteria » (OPHA) qui produisent de l’acétate, du CO2 et de l’H2. Le CO2
et l’H2 peuvent être utilisés par des acétogènes stricto sensu qui en passant par la voix de Wood
produisent aussi de l’acétate. Le CO2 et l’H2 sont consommés par les archaea methnaogènes dites
hydrogènophiles pour produire du méthane alors que les dites archaea methnaogènes acétoclastiques consomment l’acétate pour produire du méthane et du CO2. D’autres substrats
peuvent être utilisés par les méthanogènes tels que le formate, l’éthanol ou des méthylamines. Les méthanogènes appartiennent toutes au domaine des archaea et sont anaérobies strictes.
Cependant, le réseau trophique de la digestion anaérobie peut être soumis à la pression de différents inhibiteurs physico-chimiques et impacter les différents groupes microbiens en place. Une revue de littérature proposée par Chen et al. en 2008, recense les différents inhibiteurs chimiques tels que l’amoniac, les sulfures, les métaux légers (Na, Mg, Ca et Al), les métaux lourds, différents composés organique tel que le chlorophénol, les dérivés halogènes aliphatiques, les composés aromatiques N-substituées, les acides gras a longues chaînes et la lignine et ces dérivés. De cette liste, les sulfures, particulièrement le sulfure d’hydrogène pose de gros problèmes dans les procédés de méthanisation.
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Le sulfure d’hydrogène est un diacide qui peut se présenter sous 3 formes : l’ion sulfure S 2-, l'ion hydrosulfure HS- et le sulfure d’hydrogène H2S. Le couple H2S/HS- possède un pKa de 7.0
et le couple HS-/S2- un pKa de 12.3 (figure 2). Sous la forme H2S, le sulfure d’hydrogène est
présent dans le liquide sous une forme dissoute mais aussi dans le gaz au dessus de ce liquide. Le transfert entre la forme liquide et gazeuse est géré par la loi d’Henry qui défini l’équilibre entre les pressions partielles liquides et gazeuses.
Les sulfures, sont en général produit biologiquement par des bactéries appelées Sulfato-Réductrices (SRB). Ces dernières font parties d’un groupe phylogénétiquement complexe et varié, elles sont souvent anaérobies ou micro-aérophiles, sont capables d’utiliser une grande variété de source de carbone et utilisent les sulfates présents dans le milieu comme accepteur final d’électron. D’autres micro-organismes sont capables de produire ces sulfures, il s’agit de bactéries capables de fermenter les acides aminés soufrés tels que la métionine et la cystéine. Le sulfure d’hydrogène est particulièrement problématique, en plus d’une odeur désagréable d’odeur d’œuf pourri à très faible concentration (la limite de perception olfactive est de 0.02 à 0.13ppm selon les personnes), d’être inflammable, il est particulièrement corrosif en présence
Figure 1: Réseau trophique de la digestion anaérobie (Garcia et al. 2000)
Figure 2: Formes ioniques des sulfures en fonction du pH
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d’oxygène, il est aussi très toxique et dangereux pour les êtres vivants, avec une concentration supérieure à 1000ppm un homme s’évanouit et meurt dans la minute mais il reste très dangereux à des concentrations bien inférieures, notamment une exposition prolongée à 100-150ppm engendre une perte de l’odorat par destruction du nerf olfactif, rendant impossible la détection de ce gaz (L. Oesterhelweg et al., 2008).
Pour les procédés de biométhanisation, la toxicité liée au H2S est double. Une inhibition
directe par la molécule d’H2S et une inhibition indirecte liée à la compétition des microflores
productrices de H2S avec celle méthanogène. La toxicité directe du H2S est liée à la
perméabilisation des membranes cellulaires et l’établissement de ponts di-sulfures entre les chaînes polypeptidiques dénaturant les protéines cytoplasmiques. Des seuils d’inhibition du H2S
sur les archées méthanogènes relevés dans la littérature sont présentés dans le Tableau 1. Ces seuils d’inhibition s’établissent, pour différents substrats, entre 30 et 1000 mg.L-1. Le plus souvent dans la littérature ces seuils d’inhibition sont calculés à partir de doses inhibant 50% de la production de biogaz et sont mesurées à différents pH.
En plus de l’inhibition liée au H2S, les bactéries sulfato-réductrices (SRB) sont également
en compétition avec les archaea méthanogènes pour les substrats (acétate et H2). Deux groupes
de BSR sont alors répertoriés en fonction du substrat métabolisé.
-Le groupe I utilise le lactate et les sulfates avec le H2 mais ne peut pas se développer en
présence d’acétate, de propionate ou de butyrate.
-Le groupe II peut utiliser d’autres sources carbonées (les AGV, le benzoate, l’acide formique) ainsi que le CO2 comme accepteur d’électrons.
Tableau 1: Seuils de toxicité aux sulfures en g.L-1 retrouvés dans la littérature
Souche ou type de boues
6,8-7,2 7,6-8,0 8,5 H2/CO2 300 (120) 900 (90) 1000 (20) H2/CO3 400 (160) 1000 (120) 980 (40) 150 (60) 450 (45) 690 (15) acétate 300 (110) 800 (80) 880 (17) 07/07/02 Boues digesteur industriel Distillerie déchets 500 (250)
6,4-7,2 07/08/08 Boues digesteur pilote Déchet de moules 500 (250) 900 (90)
6,35-6,40 7,10-7,20 7,95-8 Boues digesteur pilote (55°C) Acétate 81 (54) 338 (75) 450 (24)
Acétate 33 (18) 78 (18) 400 (21)
6,4-6,6 7,0-7,2 07/08/08 Boues digesteur industriel (patates) Acétate 357 (246) 810 (252) 841 (90)
TS (H2S/HS-/S--) Publication
pH
Methanosarcina barkeri V O'Flaherty et al. 1998
Methanospirillum hungatei V O'Flaherty et al. 1998
Methanosarcina mazei acétate V O'Flaherty et al. 1998
Methanotrix soehngenii V O'Flaherty et al. 1998
pH PP Karhadkar et al. 1987 pH M Soto et al. 1991 pH Visser et al, 1993 Visser et al, 1993 pH I W Koster et al; 1986 CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref
D’un point de vue thermodynamique, la réduction des sulfates avec le H2 et avec les acides
gras volatils est en faveur des BSR par rapport aux archées méthanogènes. La compétition entre les BSR et les méthanogènes dépend des conditions de l’écosystème et l’inhibition de la méthanogenèse est appréhendée au travers du ratio DCO/SO42-.
Cependant l’effet des sulfures sur la digestion anaérobie est très ambigu, les sulfures sont ainsi capable de précipiter les métaux qui sont aussi des inhibiteurs de la méthanogénèse, ils sont aussi des nutriments nécessaire au méthanogènes. A ceci s’ajoute un probable effet toxique de la forme S2- à pH très élevé (Chen et al., 2008).
Mon stage s’intéresse à l’inhibition de la méthanogénèse en présence de différentes concentrations de sulfure sur la production de biogaz et sur les populations microbiennes en présence. En effet, dans la bibliographie, qui date bien souvent de la fin des années 1980 début 1990, il n’a jamais était encore utilisé de technique de biologie-moléculaire afin de caractériser les populations bactériennes. Il a donc pour objectif d’évaluer la toxicité de l’inhibiteur sulfure sur les flores en présence avant et après une exposition au sulfure d’hydrogène, afin de connaître plus précisément les effets de ce dernier. Cependant, mon sujet s’inscrivant dans une période de 4mois, je ne pourrais vous présenter que des résultats partiels.
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II. Matériels et Méthodes
A. Test batch
Pour cette étude, un inoculum issu d’un digesteur anaérobie de lisier a été utilisé. A cet inoculum un substrat composé de lisier et d’un co-substrat (60 g.L-1 de lisier) a été utilisé (co-substrat : aliment complexe pour le bétail, ayant la composition physico-chimique suivante : 26% gluten feed de blé, 20% paille de blé, 19% avoine, 11% tourteau de tournesol, 8.5% mélasse de canne à sucre, 6% orge, 5% luzerne déhysdratée, carbonate de calcium, chlorure de sodium, pellicule de soja, prémélange oligo-vitaminique.
L’innoculum est prélevé sous agitation puis déposé dans le flacon (figure 3), ensuite est ajouté le substrat et l’inhibiteur. Après avoir fermé la bouteille, un renouvellement de l’atmosphère de l’espace de tête est effectué au moyen d’une circulation d’azote et de dioxyde de carbone à raison d’un mélange (N2/CO2, 70/30). La teneur en oxygène est ainsi inférieure à 0,1%
dès le début de l’incubation. Les flacons sont ensuite placés dans des conditions définies de température (38°C°. L’incubation peut débuter. Les productions gazeuses sont suivies avec des fréquences journalières à hebdomadaires en fonction de la production. Le suivi quantitatif est déterminé via les variations de pression dans le volume d’espace de tête au moyen d’un manomètre Digitron 2000®. La gamme de mesure de la pression absolue par le manomètre s’étend de 0 à 2000 mbar avec une précision à 1 mbar. Lorsque la surpression est suffisante (1200 mbar), cette mesure est associée une analyse de l’atmosphère gazeuse VH. Le suivi
qualitatif de la composition du biogaz est réalisé par chromatographie gazeuse. Pour cela, un échantillon de 15 mL de ciel gazeux de chaque flacon est prélevé, au moyen d’une seringue à gaz, au travers du bouchon en caoutchouc. Cet échantillon est aliquoté dans un tube de 2mL puis est analysé en chromatographie gazeuse. Le méthane, le dioxyde de carbone sont les paramètres analysés. Le chromatographe est constitué d’un injecteur (à une température de 100°C) et d’un four (à une température de 70°C) renfermant une précolonne Porapak N 0,9N et une colonne remplie Porapak Q 4M. L’échantillon gazeux est orienté vers un détecteur à ionisation de flamme pour la détection et la quantification du méthane et du dioxyde de carbone. La conversion du CO2 en CH4 est effectuée au moyen d’un méthaniseur (à 375°C avec un catalyseur au Nickel)
nécessitant du H2 produit par un générateur d’hydrogène.
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Suite au prélèvement, la pression du flacon est équilibrée avec la pression atmosphérique à l’aide d’une aiguille permettant l’échappement du surplus de gaz.
Ainsi, les pressions et les teneurs en méthane, et en dioxyde de carbone, du ciel gazeux lors de deux suivis successifs permettent de dresser :
Enfin, le volume de méthane produit en condition précise de température et de pression entre les deux points de prélèvements est :
Y P RT j N j V x CH CH =∆ ⋅ ∆ 4() 4()
Les tests batchs sont réalisés sur une période assez longues jusqu’à l’obtention du palier de production de biogaz normalement plus de 30jours.
B. Mesures chimiques
Les inocula, les substrats et les mélanges contenus dans les flacons au début et a la de l’expérimentation subissent un ensemble de mesures.
1. Demande chimique en oxygène (DCO)
La détermination de ce paramètre global de la matière organique est effectuée selon la
Figure 3: Essai batch et matériels nécessaire
NCH4 le nombre de moles de méthane produites depuis le dernier
prélèvement
[
(
) (
)
]
R T V j CH j P j CH j P N H CH ⋅ ⋅ ⋅ − + ⋅ + = ∆ 4 ( 1) 4( 1) ( ) 4( )P(j) la pression dans le flacon au jour j
CH4 (j) la teneur en méthane du biogaz au jour j
VCH4 le volume de méthane produit depuis le dernier prélèvement
R la constante des gaz parfaits (8,314 J.mol-1.K)
T la température d’incubation (et de relevé des pressions) en K
VH le volume fixe de l’espace de tête du flacon.
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norme NF T90-101. Le principe réside en une oxydation des composés organiques avec une quantité connue et en excès de dichromate de potassium, dans des conditions d’ébullition à reflux pendant 2 heures à pH acide. La DCO est déterminée par le dosage de l’excès de dichromate à l’aide d’une solution titrée de sel de Mohr (fer ferreux et ammonium) en présence de ferroïne (indicateur coloré). Le dosage de la DCO est opéré à pH acide, néanmoins la perte des AGV par volatilisation est considérée comme nulle grâce aux condenseurs retenant les vapeurs de DCO.
Ce dosage est effectué sur l’inoculum avant mise en bouteille, et sur le substrat, il permet de rendre compte de l’évolution du stock de matière organique et d’évaluer entre le début et la fin des expérimentations la consommation de cette matière organique.
2. MS
La matière sèche (MS) correspond aux composés résiduels après une étape de séchage à 105°C . Après homogénéisation, environ 100mL de lisier sont déposés dans un ramequin propre préalablement séché et taré. L’ensemble est mis à sécher à 105°C jusqu’à l’obtention d’une masse constante, puis refroidi en dessiccateur et pesé. Le calcul des pourcentages de MS, en g.g
-1
, s’obtient selon la relation :
3. MO
La matière minérale correspond aux composés résiduels après une étape de crémation à 550°C. Après séchage à 105°C, les échantillons sont ensuite calcinés à 550°C pendant 2h puis refroidi et pesé. La teneur en matière organique est calculé en prenant le complémentaire entre la teneur en matière sèche calculé ci-dessus et la teneur en matière minérale. Le calcul des pourcentages de MO, en g.g-1, s’obtient selon la relation :
M0 masse, en grammes, du ramequin vide
(
)
(
1 0)
0 2 M M M M MS − − =M1 masse, en grammes, du ramequin et de la prise d’essai
M2 masse, en grammes, du ramequin et du résidu sec
M0 masse, en grammes, du ramequin vide
(
)
(
1 0)
0 2 M M M M MS − − =M1 masse, en grammes, du ramequin et de la prise d’essai préalable
M2 masse, en grammes, du ramequin et du résidu calciné
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4. Sulfures totaux
L’analyse des sulfures totaux à été déterminés par chromatographie en phase gazeuse. Ce chromatographe est équipé d’un injecteur spli/splitless permettant d’introduire l’échantillon, cet injecteur est connecté à une colonne DB5 (Varian) de 30m placée dans un four maintenue en condition isotherme à 40°C. Les composées soufrés sont alors préférentiellement retenus avant de sortir de la colonne et d’entrer dans un détecteur spécifique (PFPD, pulsed flame photometric detector). Le sulfure d’hydrogène est alors détecté sous forme d’un pic qui est intégré et comparé avec les aires obtenues avec une gamme étalon.
C. Microbiologie moléculaire
Des échantillons d'inoculum, de substrat et de sortie de batch sont prélevés afin de réaliser les études de biologie moléculaire.
1. Extraction de l’ADN à partir des échantillons
Les échantillons sont mélangés à une solution de lyse (tampon ASL) contenant des détergents et des inhibiteurs des réactions enzymatiques. Les cellules sont lysées par chauffage à 95°C et action des détergents. Les débris cellulaires et les matières solides en suspensions sont éliminés par centrifugation. Les substances capable d’endommager l’ADN et les inhibiteurs de la PCR sont retenus par l’InibitEx et retiré par centrifugation. Les protéines sont éliminées par traitement à la protéinase K dans du tampon AL. Les acides nucléiques sont ensuite purifiés par chromatographie sur une mini colonne d’hydroxy-apatithe et lavé par le tampon AW1 puis AW2. Après purification, les acides nucléiques sont élués avec de l’eau Ppi (Prête pour injection) dans un microtube à vis de 2ml. Deux élutions sont réalisées afin de récupérer le maximum d’acide nucléique. Une troisième élution est réalisé afin d’être sûr d’avoir le maximum d’ADN
La quantité et la qualité de notre extraction est testé a l’aides du spectrophotomètre ND-1000 de la société Nanodrop et une électrophorèse sur gel d’agarose 0,7%. L’ADN est marqué avec du gel red, un équivalent du BET, qui permet la révélation des bandes d’ADN sous UV après migration.
2. PCR nichée (N-PCR)
.La N-PCR consiste a amplifié par PCR une première fois une région de l’ADN codant pour la sous unité 16S de l’ARN ribosomique, puis une seconde fois une région variable V3 de cette ADN16S des eubactéries et des archaea. Cette région de 270 pb environ est suffisamment
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variable pour se prêter à un typage. Elle est plus sensible qu’une PCR classique, elle permet d’amplifier des régions difficiles voir impossible à amplifier avec une PCR classique, elle est aussi plus spécifique. Elle est utilisé ici car les archaea peuvent être présentent en faible quantité par rapport au nombre total de micro-organiqmes mais son intérêt repose surtout sur le fait qu’un clonage-séquencage des fragments d’ADN extraits soit plus facilement réalisable avec des fragments de grandes longueurs
Des expériences préliminaires nous ont permis de sélection les couples d'amorce (Tableau 2) et d’établir un protocole à partir des protocoles usuellement utilisé dans le laboratoire pour l’amplification par PCR classique.
3. SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)
La SSCP est une technique qui permet de séparer selon leur structure secondaire des fragments d’ADN simple brin de même taille mais de séquence différente. Appliquée à la région V3 de l’ADNr 16S, elle permet d’obtenir une empreinte moléculaire des écosystèmes microbiens. Elle se base sur une identification de chaque bactérie d’après la séquence de son ADNr 16S. 1µL de produit de la N-PCR (seconde PCR) est mélangé à 18.8µL de formamide déionisé (Genescan-Applied Biosystems) et à 0.2µL de GS 400 Rox (Genescan-Applied Biosystems), un étalon interne. Les fragment d’ADN sont dénaturés par chauffage (5 min. à 95°C) puis refroidis rapidement (10 min. dans l’eau glacée). Au cours de la migration, les molécules simples brins prennent une conformation secondaire stable par appariement au niveau de zones de séquences complémentaires. Les différentes molécules sont séparées par électrophorèse capillaire et détectées grâce au marquage de l’amorce W104. L’électrophorèse se fait dans un séquenceur automatique Abi prims 310 Perkin Elmer Applied Biosystems, et le traitement des résultats se fait avec le logiciel GeneMapper. Les résultats une fois aligné sont repris avec Excel.
Tableau 2: Listes de PCR réalisées
séquence sens cible référence
1ère PCR
Eubactérie GE01 GAGTTTGATCMTGGCTCAG F 9 16 S Bactéries Godon, 1997
GE03 GNTACCTTGTTACGACTT R 1509 16 S Universelles Weisburg, 1991
Archaea GE02 ATTCYGGTTGATCCYGSCRG F 6 Godon, 1997
GE14 GTGCTCCCCCGCCAATTCCT R 915 Probe base
2nde PCR
Eubactérie GE04 ACGGTCCAGACTCCTACGGG F 330 16 S V3 Bactéries Delbes, 2001
GE06* TTACCGCGGCTGCTGGCAC R 500 16 S V3 Universelles Delbes, 2001
Archaea GE13 TCCAGGCCCTACGGGG F 333 Delbes, 2001
GE06* TTACCGCGGCTGCTGGCAC R 500 16 S V3 Universelles Delbes, 2001 Nom de l'amorce E.coli position 16 S Archaea 16 S Archaea 16 S V3 Archaea CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref
III. Résultats et Discussion
A. Essai avec les substrats seul
Dans un premier temps afin de tester le protocole expérimental et afin de valider les mélanges réactionnels une première expérimentation a été réalisée avec de l’inoculum et différentes quantité de substrat. Ces tests ont été réalisés sur une période de 50 jours. Cette première expérimentation nous permettra aussi de tester le suivi micro-biologique par la technique SSCP.
1. Suivi de la production de biogaz et détermination du potentiel
maximum de méthanogénèse
Le tableau 3 ci-dessous présente les caractéristiques physicochimiques des substrats et des inocula utilisés pour les deux expérimentations. Le substrat présente des concentrations en matières organiques (exprimé par la DCO ou la MO) plus élevé que l’inoculum, cette matière organique est principalement issu du co-substrat ajouté au lisier.
Pour cette première expérimentation, nous avons préparé des triplicatas de flacons avec un mélange de 150 ml d’inoculum auxquels ont été ajouté différentes quantités de substrat : 3g, 6g et 9g, afin faire varier la quantité matière organique ajouté soit respectivement 1.72g.L-1, 3.44g.L-1, 5.17g.L-1 de DCO ajouté.
Avec cette première expérimentation nous souhaitons déterminer les ratios optimaux entre l’inoculum et le substrat. Pendant 50 jours, la production de biogaz de chacun des essais a été suivie ainsi que la détermination des teneurs en CH4 et CO2 du biogaz produit. Le tableau 4
présente ces différents résultats. Plus la quantité du substrat initiale est importante plus la production de biogaz semble importante, et s’échelonne entre 1.6 et presque 2L de production cumulée. Il est intéressant de noter que les flacons n’ayant reçus que de l’inoculum produisent aussi une quantité non négligeable de biogaz (1.5L), ceci est lié au fait que l’inoculum utilisé est issu d’un digesteur anaérobie fonctionnant en continu, cette inoculum n’est pas seulement constitué de micro-organismes mais, il reste beaucoup de substrats bio-disponible qui se
Tableau 3: Caractéristiques physicochimiques des substrats et des
inocula DCO (gO2/L) MS (g/Kg) MO (g/Kg) Substrat 1 111,09 84,23 66,56 7,53 47,02 67,4 44,39 7,69 Substrat 2 111.00 82,75 65,58 7,53 60.90 56.88 38,99 7,69 pH Inoculum 1 Inoculum 2 CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref
dégradent avec le temps. Pour vérifier notre système expérimental, nous avons aussi ajouté a la série, un triplicata contenant de l’inoculum supplémenté a avec un substrat plus simple composé exclusivement d’acides gras volatils (acétate à 1g.L-1, de butyrate à 0.5g.L-1 et propionate à 0.5g.L-1) et ayant une demande chimique en oxygène de 110gO2.L-1.
Au bout de 50 jours, les expérimentations ont été arrêtées, la matière organique résiduelle a été analysée notamment grâce à l’analyse de la DCO. Entre le début et la fin de l’expérimentation, l’évolution de la quantité de DCO présente dans les flacons a diminuée, entre 0.7g et 2g de DCO ont été transformés. Ces résultats montrent que de la matière organique a été consommée durant l’essai mais ne permettent pas de réaliser un réel bilan, ceci peut être expliqué par l’incertitude de la mesure réalisée. Par contre pour le suivi de la production de biogaz, des données intéressantes peuvent être extraites. Un ratio entre la production de méthane finale et la quantité de DCO introduite dans chacun des essais permet de déterminer le rendement de production. En 50 jours, ce rendement s’échelonne entre 0.234 et 0.350L de CH4.g-1DCO, ce
rendement exprime le taux de conversion de la matière organique en méthane. Le taux de conversion retrouvé pour le témoin est bon, plus de 95 % de la matière organique ajoutée est transformée en méthane. Ce taux conversion est plus faible pour nos essais car en moyenne ce taux s'établit à 0.262L de CH4.g-1DCO. Ce taux de conversion est plus couramment retrouvé
dans la littérature sous le nom de potentiel maximum de méthanogénèse. Une explication évidente peut-être avancée : pour les témoins l’ajout de matière organiques facilement biodégradable (AGV) sollicite seulement les voies de l’acétogénèse et de la méthanogénèse par contre l’ajout d’un substrat plus complexe (lisier mélangé a un co-substrat) sollicite l’ensemble du réseau trophique de digestion anaérobie ce qui réduit le taux de conversion. Les molécules complexes, contenues dans ce substrat, telles que les sucres, la cellulose, les protéines etc. sollicitent dans un premier temps les voies hautes de la digestion anaérobie (hydrolyse et acidogénèse) avant que les produits de ces premières réactions soient consommées par les acétogènes et les méthanogènes. De plus certaines molécules contenues en quantités non négligeable dans le substrat telles que les lignines ne seront dégradées que très lentement en conditions anaérobie. Des résultats comparables à ceux que nous avons trouvés sont rencontrés dans la littérature (Veves et al., 2008).
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La figure ci-dessous (Figure 4) présente la production cumulée de biogaz pour l’essai avec ajout de 9ml de substrat (courbe rouge) ainsi que celle obtenue avec l’inoculum seul (blanc, courbe bleue) pour les 50 j de suivi. Cette production n’est pas constante en fonction du temps, la vitesse de production semble plus rapide sur les premier jours (5jours) diminue ensuite jusqu’au jour 30 pour ensuite devenir très faible (plateau de production entre 30-40jours). Cette cinétique particulière de production peut être expliquée par la consommation des différents substrats présents. Dans un premier temps les substrats facilement biodégradables sont utilisés, puis les plus lentement biodégradables et enfin les très lentement biodégradable. Pour le substrat ajouté qui est composé d’un mélange de lisier et d’aliment pour le bétail, il semblerait que ces différentes fractions soient retrouvées dans la formulation de l’aliment (facilement biodégradables : mélasse, avoine ; lentement biodégradables : gluten feed, cellulose et les très lentement biodégradables : huiles et les pailles. Concernant les cinétiques de production, celles obtenues avec des faibles ajouts donnent les mêmes renseignements (données non montrées) que celles obtenues avec de forts ajouts, cependant l’écart entre les cinétiques avec ajouts et celle obtenues avec l’inoculum seul est plus significatif pour l’ajout de 6 et 9mL de substrat. Pour ces raisons dans la deuxième partie des expérimentations, essais avec ajout d’inhibiteur, nous retiendrons un ajout de 6 ml de substrat.
Tableau 4: Récapitulatif des mélanges (substrats, inoculum), de la DCO entrante et sortante et de la production de biogaz pour le premier
essai Test Blanc 0 0 150,4 7,1 4,8 4,8 1,5 0,7 0,4 -3,2 0,4 154,7 7,6 5,5 5,5 1,6 0,8 0,5 0,29 6,2 0,7 152.4 7,7 7 0.7 1,7 0,9 0,6 0,23 9,1 1 150.8 7,9 7,2 0.7 1,9 1 0,6 0,26 Témoin 10 1,1 150.3 8,2 6 2,2 1,9 1,1 0,6 0,35 Qté de substrat (ml) Qté initiale de DCO substrat ajoutée (g) Qté inoculum (ml) DCO initiale (g) DCO final (g) delta DCO (g) Volume gaz cumulé (L) V CH4 (L) V CO2 (L) Rapport VCH4/DCO substrat* +3ml de substrat +6ml de substrat +9ml de substrat 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 0 10 20 30 40 50 60 jours N m 3 b io g a z / t m é l. Figure 4: suivi de la
production cumulé de biogaz par tonne de matière au
cours du temps pour une expérimentation(rouge) et de l'inoculum seul (bleu)
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Concernant la caractérisation des communautés microbiennes (bactérie et archaea), seuls les échantillons au départ de l’expérimentation ont été analysés (substrat et inoculum) et sont présentés figure 5.
Les profils SSCP de l’inoculum et du substrat sont assez différents, l’inoculum présente une plus large diversité bactérienne visible, représentée par les pics sur la courbe, aussi bien archaea que bactérie. L’inoculum possède 12 pics majoritaires pour les archaea et le substrat seulement 6, dont 3 semblent avoir la même mobilité électrophorétique. L’inoculum présente aussi 9 pics bactériens majoritaires contre 6 pour le substrat dont 2 semblent similaires. Il semble normale de ne pas retrouver les mêmes micro-organismes dans l’inoculum et le substrat pour deux raisons : les micro-organismes ajoutés par le substrat sont en faible quantité et donc indétectables ensuite par la SSCP (non détection de brin d’ADN dont la concentration est inférieur à 1% des ADN totaux) et parce que l’inoculum est issu d’un digesteur anaérobie de lisier qui a certainement développé une flore spécifique.
B. Essai avec substrat plus inhibiteurs
1. Suivi de la production de biogaz et analyses physicochimie
Une seconde expérimentation a été réalisée dans les mêmes conditions que les expérimentations précédentes (mêmes substrats et inoculum), un seul paramètre a été modifié, la concentration initiale en sulfure et le temps d’expérimentation qui a été réduit à 28 jours.
Les résultats présenté dans le tableau 5 montre que les productions de biogaz sur 28 jours sont en moyenne 30 % inférieures à celles obtenues pour la première expérimentation, ce qui est normale puisque la première à été réalisée sur 50 jours. Les ratios de conversion de la matière organique en méthane sont donc, de fait, plus faibles et s’échelonnent entre 0.13 et 0.2L CH4.g -1
DCO pour les essais avec ajouts de sulfures et 0.24L CH4.g-1DCO pour le témoin. Les
A B
A B
Figure 5: profil SSCP de la région V3 A : des Archaea du substrat (rose) et de l’inoculum (bleu),
B : des bactéries du substrat et de l’inoculum
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cinétiques de production (données non montrées sont semblables à celles obtenues sans incorporations de sulfures. Par contre il est intéressant de noter que la production semble stimulée par l’ajout de sulfure comme le présente la figure 6. Sur cette figure est représentée l’augmentation de la production de méthane en fonction des concentrations initiales de sulfures de chaque essai, cette augmentation est calculée par rapport à celle obtenue avec les flacons dans lesquels seul le substrat a été ajouté (S0). Pour les concentrations basses comprises entre 5 et 20 mg/L de S2-, la production est équivalente au bout de 28 jours à celle de S0, par contre elle est significativement augmentée, pour atteindre plus de 58 % de production en plus que celle de S0 pour l’essai avec une concentration initiale de 50 mg/L. Il semblerait que contrairement à l’effet inhibiteur envisagé au départ, l’ajout de sulfure aurait un effet activateur sur le processus de méthanisation. Ce résultat a déjà été observé dans la littérature notamment par Karhadkar et al. (1987). L’auteur expliquait ce résultat avec deux hypothèses, soit que les méthanogènes, qui ne peuvent assimiler les sulfates, soient obligés d’assimiler le soufre sous la formes sulfures qui peut être limitant ou soit que les sulfures diminueraient la pression exercée par d’autres inhibiteurs tels que le les métaux lourds. Cette deuxième hypothèse semblerait la plus probable car les concentrations en sulfures retrouvées à la fin des essais s’établissaient autour de 15 mg/L quels que soient les ajouts initiaux.
Tableau 5: Récapitulatif des mélanges (substrats, inoculum), de la DCO entrante et sortante et de la production de biogaz pour le premier
essai Test Blanc 0 0 150,8 9,18 5,2 3,98 0,87 0,44 0,28 -6,05 0,67 144,17 9,45 6,32 3,13 0,98 0,52 0,32 0,13 6 0,67 143,37 9,4 5,13 4,27 0,99 0,53 0,33 0,14 6,05 0,67 142,97 9,38 5,59 3,79 1 0,54 0,32 0,15 6,04 0,67 141,07 9,26 5,34 3,92 0,88 0,53 0,29 0,13 6,01 0,67 138,57 9,11 4,43 4,67 0,95 0,55 0,31 0,17 6,11 0,68 134,33 8,86 5,83 3,03 1,04 0,57 0,34 0,2 Tém oin 3,01 0,33 147,13 9,29 5,33 3,96 0,76 0,52 0,24 0,24 Qté de substrat (m l) Qté initiale de DCO substrat ajouté (g) Qté inoculum (m l) DCO initiale (g) DCO final (g) delta DCO (g) Volum e gaz cum ulé (L) V CH4 (L) V CO2 (L) Rapport VCH4/DCO substrat* Flacon 0m g de S--/L Flacon 5m g de S--/L Flacon 10m g de S--/L Flacon 20m g de S--/L Flacon 30m g de S--/L Flacon 50m g de S--/L CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref
2. Suivi des populations microbiennes
Concernant la caractérisation des populations bactériennes dans cet essai plusieurs profils sont à comparer, ceux obtenus au départ (inoculum) pour les deux domaines microbiens explorés (Archaea et bactérie) et ceux obtenus au bout de 28 jours d’exposition au sulfures. Ces profils sont présentés figure 7. Pour les archaea, le profil de l’inoculum est caractéristique avec la présence de 7 à 8 pics dominants. Ces pics sont retrouvés au bout de 28 jours dans les essais ou seul l’inoculum a été mis. Par contre dans les autres essais, ceux ou du substrat a été ajouté, il semblerait que le profil se simplifie, seulement 5 pics initialement présents dominent l’ensemble de l’écosystème, pour le témoin positif (Tm) seulement 3 pics sont retrouvés comme étant majoritaire. Il semblerait que la simplification des profils archaea soit dépendante du substrat ajouté. En comparant les profils des différents essais exposés au sulfure, il semblerait que la concentration d’exposition n’ait aucun impact sur cette communauté.
Pour les profils bactéries, l’analyse est plus sommaire car aucune modification des profils n’est mesurée avec notre technique SSCP. Les profils sont identiques entre le début et la fin des expérimentations, une quinzaine de pics sont clairement identifiables, avec une présence fortement marquée de 4 majoritaires. L’ajout de substrat et/ou de sulfures ne semble avoir aucun impact sur l’écosystème bactérien suivi. Ces résultats montrent que les concentrations testées dans cette expérimentation ne sont en aucun cas inhibitrices car aucune modification du profil bactérien n’est mesurée..
90 100 110 120 130 140 150 160 0 10 20 30 40 50 60
Teneur en sulfures total mg/l
% d 'a u g m e n ta ti o n d e l a p ro d u c ti io n d e C H 4 /S 0 Illustration 6: Effet de l’ajout de sulfure sur la production de méthane exprimé en %
d’augmentation de la production par rapport à l’essai sans ajout
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tm Archaea S50 Archaea S30 Archaea S20 Archaea S10 Archaea S5 Archaea S0 Archaea Bl Archaea Inoculum Archaea tm Archaea S50 Archaea S30 Archaea S20 Archaea S10 Archaea S5 Archaea S0 Archaea Bl Archaea Inoculum Archaea A
Illustration 7: Profils SSCP des différents essais au début et à la fin des expérimentations pour les deux domaines microbiens explorés : archaea (A) et bactérie (B)
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IV. Conclusion
Ce stage de Master 1, initialement prévu de 4 mois, doit se poursuivre encore un mois et demi. Dans ce rapport ne sont présentés que des résultats partiels qui seront complétés au cours de la période à venir.
Cependant plusieurs conclusions peuvent être tirées de ces essais. Contrairement à ce qui est mentionnée dans la littérature l’ajout d’inhibiteur potentiel comme le sulfure peut jouer un rôle inverse celui d’activateur de la production, ce résultat assez surprenant doit être confirmé et des essais avec des concentrations supérieures doivent être réalisées afin d’arriver à un seuil d’inhibition. Le suivi de communauté microbienne avec la technique SSCP nous permettent de caractériser moins de dix archaea et une quinzaine de bactérie dominants le système. Ces pics doivent maintenant être assigné et identifié par les techniques de clonage-séquençage. Par ailleurs, il semblerait intéressant de quantifier les archaea méthanogènes présentent dans les essais ou des sulfures ont été ajouté afin de voir si cet ajout les a impacté. Enfin, les techniques moléculaires utilisées au CEMAGREF de Rennes sont souvent des techniques basée sur l’ADN (SSCP, Q-PCR…), ces techniques nous permettent de suivre les communautés dans leur ensemble quelles soient vivantes ou mortes. Afin de mieux préciser nos analyses, il serait intéressant de pouvoir cibler directement les ARN qui reflètent réellement l’activité des micro-organismes présents. D’autres techniques basées notamment sur la RT-PCR pourraient être misent en œuvre. CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref
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