L. PICHAT - Chef du Service des Molécules Marquées C.E.N.-SACLAY - B.P. No 2 - F GIF SUR YVETTE (FRANCE)

—«*r-\ v 13. Rencontres internationales de chimie thera-

v peutique . Nantes, France. 7-9 septembre 1977 CEÀ-CONF...

SWTHESES DE MOLECULES MARQUEES A ACTIVITES THERAPEUTIQUES EN VUE D'IÎUDES METABOLIQUES ET PHARMACOCINETIQUES

PROBLEfES DE SYNTHESE, CONSERVATION, PURETE RADIOCHIflIQUE

L. PICHAT - Chef du Service des Molécules Marquées

C.E.N.-SACLAY - B.P. No 2 - F-91190 GIF SUR YVETTE (FRANCE)

Les molécules marquées sont devenues un outil indispensable pour les études métaboliques et pharmacocinétiques. Leur importance justifie que les

organisateurs des "13èmes Rencontres Internationales de Chimie Thérapeutique" leur consacrent une journée complète. Fort logiquement celle-ci commence par un exposé sur les problèmes de synthèses des molécules marquées.

Les isotopes radioactifs et stables le plus souvent utilisés pour le marquage de molécules thérapeutiques sont rappelés dans le tableau 1 qui donne

les propriétés les plus importantes ainsi que les activités spécifiques maximales et les enrichissemnts isotopes que l'on peut facilement atteindre.

CHOIX DE L'ELEMENT TRACEUR

Lorsque la formule brute de la molécule que Ton se propose de marquer permet un choix de l'élément traceur, celui-ci est f a i t en tenant compte de divers facteurs qui sont :

- La stabilité de l'atome marqué dans les conditions biologiques - La facilité ou difficulté de la synthèse de la molécules marquée - La période de l'Isotope

- L'activité totale - L'activité spécifique - Les questions d'éthique

CHOIX DE L'ISOTOPE ET STABILITE DE LA POSITION DE MARQUAGE

Une position chimiquement stable n'est pas nécessairement biologique-

ment stable. Ainsi dans la ZOXAZOLAMINE

H-4,6 , le tritium n'est pas échangé

en milieu basique ou acide (Fig. 1) ; par contre une hydroxylase microscmique (1)

provoquera l'élimination sous forme d'eau t r l t l é e , du tritium. Cet Inconvénient

sera d'ailleurs transformé en avantage puisque par cette technique de mesure de

l'activité de l'eau trltlée produite, on pourra mesurer l'activité d'hydroxylases.

- 2 -

RESUME

L. PICHAT

"Synthèses de molécules marquées 2 activités thérapeutiques en vue d'études métaboliques et pharmacocinétiques.

Problèmes de synthèses, conservation, pureté radiochimique."

Les molécules marquées par les isotopes radioactifs sont certainement un outil indispensable pour les études métaboliques et pharmacocinétiques. Le carbone 14 est souvent préféré au tritium car il permet de mieux suivre le devenir des structures carbonées.

Le fait que 'Ion soit limité au ^CO? comme matière première est la caractéristique la plus remarquable qui place & part les synthèses avec le carbone isotopique. Il est fréquent que les schémas de synthèse de substances médicamenteuses marquées diffèrent notablement ou totale- ment des routes habituelles pour la synthèse du produit non marqué. Le plus souvent, i l est nécessaire àe travailler sur des microquantités pour conserver des activités spécifiques élevées. Ceci entraine l ' u t i l i - sation de techniques spéciales de synthèses et l'emploi des méthodes chromatographiques d'isolement et de purification. Les contrôles de pureté radiochimique feront appel i la chromatographic en couche mince, sur colonnes et en phase gazeuse. La spectrometrye de masse, la RMN du 13c et du proton complètent les contrôles de pureté et d'identité.

Par interaction d'espèces excitées avec les molécules du composé, les produits marqués se radiolysent. Ce phénomène est beaucoup plus rapide avec les molécules tritiêes qu'avec les molécules marquées au l^C. Les vitesses de radiolyse peuvent être diminuées en diluant les molécules.

Pour des raisons d'éthique les molécules 1*C ne sont pas commodément utilisées dans l'expérimentation sur l'homme. Les molécules marquées par les isotopes stables (

C,

N, D) sont susceptibles tie combler cette lacune.

ft paraître en brochure dans le cadre du "XlIIème Rencontres Internatio-

nales de Chimie Thérapeutique - Nantes". 7/9 Sept. 1977

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I S O T O P E S L E S P L U S C O U R A M M E N T U T I L I S E S

P O U R L E M A R Q U A G E D E M O L E C U L E S T H E R A P E U T I Q U E S

PERIODE

lie l ¥ 20 MINUTES

•

«c f ¥ 5800 ANNÉES

1 M

1

1*C o o

35

_{87 JOURS} 3H

2

15N

12 ANNÉES

EMETTEUR

A*

y

A"

A"

ENERGIE MAXIMUM

MEV

ACTIVITE SPECIFIQUE MAX.

OU

ENRICHISSEMENT ISOTOPIQUE MAX.

0,39

0,155

-

90 X

0,167

0,017

-

99,8 X

*

99Z

SSàiraw

TABLEAU I

- 3 -

3&>

ZOXAZOLAMINE V 4 - 6

NHj Hydroxylase Microsoaique

ft»».,!

^ - N H j i ^ O

CHOIX DE L'ISOTOPE ET FACILITE DE SYNTHESE

Les molécules marquées par le tritium sont souvent beaucoup plus facilement accessibles que les molécules marquées au C. En effet, 11 est plus facile de créer une liaison CH* que C - C. De plus» les préparation par de simples réactions d'échange avec le tritium ou Veai tritiée sont souvent possibles comme nous le décrirons plus loin.

Néanmoins pour les études de métabolismes» choisir le tritium comme Isotope n'est souvent qu'une solution de facilité» valable pour des études pré- liminaires, car fréquemment on a S faire face fi des problèmes de stabilité de marquage.

CHOIX DE L'ISOTOPE ET SA PERIODE

11,

Mi

Pour le carbone, on a les cas extremes du C « 20 minutes et du 5.800 années.

Les avantages du C sont : activités spécifiques très élevées, 11, exploration externe, très courte période et les expérimentations sur l'homme sont possibles.

Par contre, les désavantages du C sont : une trop courte période pour pouvoir réaliser des synthèses très complexes ; son emploi est confiné S un nombre limité d'instituts de recherche ; le coût élevé du fonctionnement du cyclotron produisant le C et l'investissement Important a prévoir pour son utilisation (caméra a positrons).

CHOIX DE L'ISOTOPE ET ACTIVITE SPECIFIQUE

L'activité spécifique maximum théorique du

C:62,4 mCi/mAt est Insuf- fisante pour l'étude de substances b1ologiquement actives a très faibles doses telles que : hormones peptidldes - neurohormones - etc...

La recherche de récepteurs biologiques : acetylcholine, a et $-

adrénerglques, toxines, exige des substances marquées au tritium a activités

4 -

spécifiques 5 -100 Curies/mMole.

Les molécules marquées employées dans les rad1o1mmunoessa1s doivent être t r i t i é e s ( 5 - 1 0 0 Curies/mMole) ou Iodées ( I ) .

CHOIX DE L'ISOTOPE ET QUESTIONS D'ETHIQUE

En France, l ' u t i l i s a t i o n sur Vhomme de substances marquées au C, et/ou au tritium est très strictement réglementée. Pour les études métaboliques sur l'homme, un développement de l ' u t i l i s a t i o n des molécules marquées aux Isotopes stables (^{1 3}C , deuterium, azote 15) est prévisible grâce a la commercialisation des techniques de : spectrometry de masse couplée avec la 6.L.C., R.N.N. du C,

méthodes spectrophotométrlques de mesure de N. 15

AUTRES FACTEURS A CONSIDERER POUR LE MARQUAGE D'UNE DROGUE 1 " U.BriS.SBB§rJS9§Q$-lî§ït.^yDS.drogue.farguée est dû:

- S la main d'oeuvre hautement qualifiée nécessaire;

- aux charges d'exploitation élevées de laboratoires spécialisés ; - â des travaux de recherche développement presque toujours nécessaires

pour transposer la synthèse "froide" i la synthèse radioactive ; - au coût de contrôles de qualité rigoureux ;

- à une quantité minimale fixée par le laboratoire producteur.

Ce prix est relativement très peu élevé si l'on rapproche la richesse et la rapidité des informations obtenues grâce aux molécules marquées, de l ' i n - vestissement nécessaire pour le développement d'une drogue nouvelle : travaux de synthèse organique, screening pharmacologlque, essais toxicité, essais cliniques, e t c . . .

2

* !ftîi§rsi-BCS5i§c§s_i2b§Mîy§ll§5-B9yc_yD-2

9§Di£!êD

Les synthèses chimiques de molécules marquées utilisent les méthodes générales de la chimie organique classique mais se distinguent de cette dernière par des particularités dont la plus importante est le choix des matières premières radioactives«

Le carbone 14 est produit dans les réacteurs nucléaires par la réaction 14,

14

14,

_CO,

La cible étant : NjAI (n,p) " C

Le C est fourni à l'organiden sous forme de Ba CO

Ba^{1 4}C0³ 3 (^{1 4}W²) - Le tritium est produit par la réaction : °L1 (n,o) 3H

Le tritium est fourni i l'organiden sous forme de tritium gaz (enrichissement 97 %) e t d'eau t r i t i é e .

•i

! I!

I

C

1

tCESSITE DE TRAVAILLER SUR DES HICROQUANTITES

/

L'obtention de fortes activités spécifques exige de manipuler des

«icroquantitês.

Si une drogue C doit être préparée è l ' a c t i v i t é spécifique de 50 mCi/mMole, la suite de réactions sera commencée sur 5 - 1 0 «Moles de C0

s o i t au total 250 à 500 «Ci de CO^Ba. S'il est nécessaire de synthétiser une 14 drogue t r i t i é e à l'activité spécifique de 1-100 Ci/«Mole, cette synthèse ne peut guère être conduite sur une quantité «oindre que 0 , 1 - 0 , 5 «Mole soit lu total 5 - 3 0 0 curies de tritium.

De telles synthèses ne sont réalisables dans l e «onde que dans un très petit nombre de laboratoire spécialisés dont ceux du CEN-Saclay.

La situation est encore plus difficile pour l e carbone 11. Les synthèses de molécules «arquées au C sont conduites sur quelques micromoles.

Dans tous les cas, la "chimie des microquantités diffère notablement de la chimie organique classique.

MOLECULES A ACTIVITES THERAPEUTIQUES MARQUEES AU CARBONE 14

* • §î5^si-pri53ire5-d§_!5.synîb§s§-^§-59llÊyl§§.!!!§wy§ê§-5ï.-.Ç

Le carbonate de baryum C peut être transformé directement en matières

de base a un carbone (*CNNa) ou â deux atomes de carbone (Ca*C,) ainsi qu'il est

14 • indiqué dans le tableau I. L'acétylène C résultant de l'hydrolyse de Ca C

peut

être trimérisé en benzène C-U avec un rendement de 85 %.

• Ca

Ba

C0

I L

Ca*C,

H*C « *CH

L

trimerisation cavalytique

* 1

N

o '

• NH³ . Na ^m

* - * B a N - * C » N > Na*CN

• *C0*

A., 2

R - *C0

H

•• "CH

0H

1

*CH,0

•* *CH

I

iikitiv..!

- 6 -

Le

C0

réduit par L1A1H

dome

GH30H * partir duquel on a accès

au formaldehyde

C et à l'iodure de méthyle

C. La carbonatatlon d'un organo- mtta'lique (RMgX, RL1) est une méthode de choix pour l'introduction du carbone

Isotopique. Nous donnons i d quelques exemples récents de l'utilisation de ces matières de base pour la synthèse de drogues ft activités thérapeutiques.

14

Il paraît opportun Ici de souligner que les synthèses de drogues mar- quées au C :

• ne sont seulement pas une simple Miniaturisation des procédés classiques ;

• fréquemment des routes différentes doivent être mises au point ;

• les proportions de réactifs doivent être Inversées quand le réactif employé en excès est marqué ;

+ les techniques d'Isolement et purification sont chromatographiques.

3 - iï«iB!S5-!^SD*l_9^-§yJ!$bl5§S_S§_^ro9y§5_f§E9ylS5-5M Ç 14 Voir Figures 2 , 3 , 4 .

La synthèse du SL-72.340 -

C (fig. 2) diffère notablement pour les premiers stades de la synthèse de la molécule non marquée (2). Elle est basée sur la carbonatatlon du bromure de p-trif1uorométhylth1ophêny1magnês1uni qui n'avait pas encore été décrit. La réduction de l'acide p-tr1fluoromêthy1thiobenzoTque en alcool benzyl 1 que correspondant n'a donné de bons résultats qu'avec le complexe BH» - MepS - BOgMe^.

La synthèse du LD-3098 (fig. 3) utilise également la carbonatatlon d'un magnésien pour la préparation de l'acide benzoTque (carboxyl- C) et diffère

(3) de la synthèse "froide" jusqu'au stade phenylcyclopropane (6).

La synthèse du SL-73.033 (Anthraphénlne, stakane) marqué sur la position 4 du noyau quinoléine (fig. 4) emploi la carbonatatlon avec CO? du dérivé lithien 14 de l'acétate d'êthyle pour obtenir le malonate d'éthyle C-l (3). Bien que dans cette synthèse la moitié de la radioactivité seulement soit Introduite dans la

14

molécule, (au stade (6) la moitié du CO, est récupéré mais avec une activité 14

spécifique deux fols plus faible que celle du C0

de départ), cette vole a été finalement plus Intéressante (4) que celle utilisant le malonate d'éthyle C-2

14

dont la préparation exige 8 opérations au départ de C 0

(5).

Le SL-73.033 (Anthraphénlne, Stakane) est le type même de molécule où,

pour une étude métabolique complète 11 peut être nécessaire de marquer la même

molécule en divers sites. La figure S montre le schéma réactionnel mis au point

pour marquer cette molécule dans le noyau pipérazine. 11 est apparent que la

- 7 -

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SYNTHESE DU L D - 3 0 9 8

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SYNTHESE DU S L - 7 3 . 0 3 3 (ANTHRAPHENINE - STAKANE) MARQUÉ SUR LE NOYAU PIPÉRAZINE Figure 5

'i'îà .^in^riitrÂ'^

route suivie est très différente (6) de la précédente (fig. 5). On utilise dans ce cas canoë intermédiaire l'oxyde d'ethylene C-1,2 lui-Mème obtenu via

l'acétylène-

C.

La Miniaturisation de la synthèse "froide" du 804 CB (acide bucloxi- que-esfar) (fig. 6) a conduit 2 un Marquage en positions 1 et 4 de la chaîne.

Cette voie de synthèse a présenté les inconvénients suivants (7) :

4- la chloruration n'étant pas rigoureusement régiospéctfique, conduit i un Mélange de dérivés chlorés qu'il est difficile de séparer ;

+ Le Marquage sur le carboxyle donne lieu lune decarboxylation rapide lors de la mêtabolisatlon. Cela nous a conduit a Mettre au point la nouvelle Méthode schématisée (fig. 6) qui met en oeuvre un organomagnésien portant le chlore en bonne position et utilise une nouvelle Méthode de préparation d'acides y-cétoniques par l'intermédiaire du dérivé lithié de l'étnane- tricarboxylate-1,1,2 de triméthylsilyle.

La fig. 7 montre la comparaison de la synthèse du 30.038 CB- C-3 par Miniaturisation du procédé classique (8) et celle du 30.038 CB- C-6 par 14 une vole nouvelle utilisant a nouveau la méthode de préparation d'un acide

y-cétonique par condensation du chlorure de benzoyie ( CO) sur le dérivé lithié 14 du propane-tricarboxylate-1,1,2 de triméthylsilyle.

Dans un autre domaine, la synthèse de la "chlorophacinone" (fig. 8) (9) comporte, par le procédé classique 6 opérations au départ de C0 14

. La nouvelle synthèse mise au point n'en comporte plus que 4 et met en jeu un organollthien nouveau dérivé du (p-chlorophényl)-phénylmëthane et, pour la préparation de la (p-chlorophényl)-l phenyl-l-propanone-2 C-2 le dérivé lithié du malonate de triméthylsilyle, comme agent de synthèse de méthylcétones.

La fig. 9 Illustre la complexité de certrlnes synthèses. Les dérivés du benzimidazole (benz-

C-U) : Delalande 71-0010 et Delalande 73-0442, ont

nécessité pour leur construction 14 étapes au départ de carbonate de baryum C.

Fort heureusement, les synthèses de ces deux produits ont un Intermédiaire com-

mun le benzimldazole }$ , ce qui a réduit le coût de ces préparations. Dans ce

cas, le schéma de synthèse des produits "froids" a été suivi a partir de Tortho-

phony lênedi ami ne C-U mais cette dernière a été obtenue elle-même en 10 étapes

a partir de

C0,Ba via l'aniline

C-U.

j » i » n r i- i i ••"•—'" " •*'•« ^-" <f^

MMMMWtoMlfei

+ SYNTHÈSE FROIDE MINIATURISEE APPLIQUEE AU MARQUAGE

O O ^{+ CH}

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Cl

8 0 4 CB

(ACIDE BUCLOXIQUE - ESFAR) + NOUVELLE SYNTHÈSE POUR LE MARQUAGE MONOSPÉCIFIQUE

Cl

1) Mg + CH³I

2)

C 0

CI

COgH S0C1.

i. ^{H Cl}

C0²S1Me³

• L1CH-GH²-C02S1Me³ C0²S1Me^{3 ft}

RCO

C0²SiMe³ C - Rg C0²R³_

H-0

* \ ^ ) " ' ^ ^ "

-

2 ^ . 2 - C 0

H

Cl

SYNTHESE DU 8 M - C B -

C (7)

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I

SYNTHESE DU 30.038 CB-%-3 PAR MINIATURISATION DU PROCEDE CLASSIQUE

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1) CNK ft CHj-CH-CH-COgCgHg ^ » CH

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H

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HgHCH^ N ^ j

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+ NOUVELLE SYNTHESE DU 30.038 CB-^C-6

C02SiMe3

t 1) LÇC-C<

(12)

1) C0« » t CûTciite, CO2SIH8,

C

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+ NOUVELLE SYNTHESE

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CO-CK(COjS1H»

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CHLGROPHACINONE ( L I P H A )

• SYNTHÈSE " F R O I D E *

CO,

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SYNTHESES DE LA CHLOROPHACINONE -

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SYNTHESES DE : DELALANDE 71-0010 ET DELALANDE 7 3 - C M 2 Figurt 9

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16 -

MOLECULES MARQUEES AU TRITIUM

Un grand nombre de produits organiques peut être Marqué, en des posl- oû l'Isotope est stable chimiquement et blologlquement, par de s i d l e s réactions d'échanges.

I - TRITIATIONS PAR CONTACT AVEC LA GAZ TRITIUM PUR SELON LA TECHNIQUE DE WILZBACH Le produit a marquer est Incubé avec le tritium pur a la température ambiante pendant 1-15 jours. Le mécanisme suivant serait opérant :

( T³* ) * •

T

A A A / ^

,T + RH

A* A / W ~ * RH* + T

RT RT RT

La méthode n'est qu'apparemment simple. Elle présente les nombreux inconvénients suivants : faibles activités spécifiques, faibles rendements, formation d'Impuretés difficiles â éliminer.

Elle est a envisager seulement lorsque toutes les autres ne sont pas applicables.

II - TRITIATIONS PAR ECHANGES CATALYTIQUES AVEC L'EAU TR1TIEE

La substance a marquer est chauffée a 70 -125° C dans un mélange HTO + AcOT en présence de platine, palladium ou rhodium.

Cette méthode présente les avantages suivants sur la méthode de Wllzbach activité spécifiques plus élevées mais souvent encore Insuffisantes, meilleurs rendements. Les Inconvénients majeurs sont : purifications délicates ; elle est Inapplicable aux substance fragiles dans les conditions de l'échange ; elle com- porte les dangers Inhérents a la manipulation d'eau trltlée de fortes activités spécifiques.

III - TRITIATIONS PAR ECHANGES CATALYTIQUES EN SOLUTION AVEC LE TRITIUM 6AZ (11) La substance a marquer (10-50 mg) en solution dans une solution tampon phosphate (pH > 7 ; 1-5 ml) et un catalyseur Pd/BaS0

(50-250 mg) est agitée sous du tritium gaz (10-25 curies) pendant 5 mn -20 heures.

Les avantages de la méthode sont : marquages spécifiques (hydrogênes benzylIques, sucres en C - l , purines en C-8Nucleosides, nucleosides)), activi- tés spécifiques élevées, bons rendements. L'Inconvénient majeur du procédé est

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; 1 M

1

i

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X.

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>11 est U n i t é aux classes de produits cl-dessus.

IV - TRITIATIONS PAR REDUCTIONS CATALYTIQUES AVEC LE TRITIUM DE PRECURSEURS INSATURES ET PAR HYDR06EN0LYSES

C'est la Méthode la plus efficace pour l'obtention de très hautes activités spécifiques. Schématiquêtent, en présence de catalyseurs appropriés

(Pt, Pd, Rh, Ni) on réalise les réactions suivantes : - CHT - CHT -

- m - - C B N

- C» 0

- cr -

Iwln

OH - CH²T - CH²T

Les avantages de cette technique sont : activités spécifiques voisines de la théorie, bons rendements, possibilités de réductions sélectives, possibi- l i t é s de réductions stéréospéclflques. Elle n'est pas sans Inconvénients : le Marquage n'est pas toujours rigoureusement spécifique, les précurseurs Insaturés peuvent être difficilement accessibles, 11 est nécessaire d'employer un solvant aprotique ou d'opérer dans des conditions telles que la vitesse d'hydrogénation soit supérieure â la vitesse de la réaction d'échange avec le solvant.

Elle a une limitation dans le f a i t que l'on ne peut effectuer que les réductions S la pression de 1 atmosphère, pour des mesures de sécurité.

Nous Illustrerons l'application de cette technique par quelques exemples récents. I l est opportun de citer comme premier exemple de t r i t i a t i o n par satu- ration catalytlque avec le tritium de précurseurs êthylénlques, celui de la préparation de dérivés dlhydro-Vg.lO de l'ergot de seigle ( f i g . 10).

Pd / BaS0

il

::

«

R » - CH(CH

)

: Ergocomine Dihydroergocomine - TÏ-9,10 R « - Ct^C^ : Ergocristine Dihydroergocristine - H-9,10 R • - 01201(0)3)2 : Ergocryptine Dihydroergocryptine - Ti-9,10 Activités spécifiques = < 20 Ci/mMole

SYNTHESES DE DERIVES DIHYDR06ENES DE L'ERGOT DE SEIGLE (12) Figure 10

i s m t s s i i

Pour la préparation du A

- et du A

-Tétrahydrocannabinol-T1 de très haute activité spécifique (fig. 11) on a procédé i la tritiation régiosélective des précurseurs diethyléniques en présence de catalyseur en phase homogène, qui permet la saturation de la double liaison la moins encombrée (13).

T

/Ph

PRhCl AcOEt

(CH²)³CH-CH²

(CH²)³CHT-CH²T

A» THC

Activité spécifique : 50 Ci/mMole

OH Tg/PhgPRhCl AcOEt

(CHgJ.jCH^CHg

AMHC

Activité spécifique : 56 Ci/mMole

SYNTHESES DE

ET

(13)

Eisy£t„U

(clyJCHT-CHgT

L'hydrogénolyse de peptides iodés sur la partie tyrosine a été saintes f o i s u t i l i s é e pour la préparation d'hormones peptidiques t r i t i é e s . La désiodu- ration catalytique de la diiodo-3,5 tyrosine a 23

corticotropine en tyrosine

3H - 2 , 5 -2 3O H

corticotropine pernet d'illustrer l'influence du solvant sur l ' a c t i v i t é spécifique (14). Celle-ci n'est que de 8 Ci/mMole (10-20 % de la théorie) lorsque l'hydrogénolyse est conduite dans l'acide acétique 0,1 M par suite de l'échange du tritium avec ce dernier. Par contre dans l e mélange 0,1 M AcOH : HMPT : DMF

(1 : 10 : 90). l'activité spécifique obtenue : 46 Ci/mMole correspond & 80 X de l a valeur théorique.

?3

Diiodo-3,5 tyrosine " a » corti cotropi ne

3„

» {*H-Z,5) Tyrosine OH Cortlcotropine

P d

"

Activité spécifique : 8 Ci/mMole 0.1M AcOH

3

H ,

10-20 % théorie

PdO-CaCOj 0.1M AcOH:HMPT:DMF

(1:10:90)

3 23

•+ ( H-2,5) Tyrosine O H Cortlcotropine

Activité spécifique : 46 Ci/mMole 80 t théorie

HYDROGENOLYSE DE PEPTIDES IODES Figure 12

• « ( • • « n u

De manière routinière, nous préparons des a d des aminés tri tiés opti-

quement actifs par la deshalogénation catalytique des acides aminés chlorés

obtenus par chloration d'acides aminés en milieu sif.furique. La figure (12)

donne l'exemple de la préparation (15) de l'acide L-glutamique H-4.

- 20 -

ft-CH-CH²CH²C0²H NU»

Cl,

HJSOJ

COgH-CH-CHg-CHCl-COgH

Pd/C

COgH-CH- CHjCHT-COjH NHo

Activité spécifique : 15 Ci/«Mole PREPARATION DE L'ACIDE 1 (+)-SLUTAHIQUE ^ - 4 PAR HYDR06EN0LYSE DE L'ACIDE

l(+)-ttUTAMIQUE-³H-4 Figure 12

• n n a s a a

V - TRITIATIONS PAR REDUCTIONS DE COMPOSES CARBONYLES AVEC LES BOROHYDRURES TRITIES

Les borohydrures t r l t l é s sont obtenus par chauffage avec du tritium gaz S des températures voisines de celles de leur équilibre de décomposition :

BK⁴Na BH⁴L1 BHJC

+ T,

tt 250° C

B*H⁴Na B*H⁴L1

Ces borohydrures permettent la réduction f a c i l e , de fonctions carbo- nylées. On a donc un moyen simple d'Introduire avec de fortes activités spéci- fiques du tritium en positions stables et de manière régiospéclfique lorsqu'on dispose de précurseurs carbonylês. La figure 13 présente l'exemple de la prépa- ration du p-nltrophényl a-D-ga1actopyranos1de H-6 par réduction avec B*tMla de l'aldéhyde correspondant obtenu par oxydation enzymatique du galactoslde que l'on se proposait de marquer (16).

OH

HO A 0 . Galactose oxydase

B*H⁴Na

\

• i

» 4

Etan..H

y

y

ci,

COgH- CH - CH

CH

C0

H

NH, HgSO, C O ^ - CH - CH

- CHC1 - C0

H Pd/C »2

C O ^ - C H - C^CHT-CO^

NHo

Activité spécifique : 15 Ci/mNole

PREPARATION DE L'ACIDE 1(+)-GLUTAMIQUE ^ - 4 PAR HYDR06EN0LYSE DE L'ACIDE

l(+)-ttuTAMIQUE-

H-4

Figure 12

V - TRITIATIONS PAR REDUCTIONS DE COMPOSES CARBONYLES AVEC LES BOROHYDRURES TRITIES

Les borohydrures trities sont obtenus par chauffage avec du tritium gaz a des températures voisines de celles de leur équilibre de décomposition :

BH⁴Na

BH⁴Li + T²

BH⁴K

H 250° C

B*H⁴Na B*H⁴L1

B\K

Ces borohydrures permettent la réduction facile, de fonctions carbo- nylées. On à donc un moyen simple d'introduire avec de fortes activités spéci- fiques du tritium en positions stables et de manière réglospécifique lorsqu'on dispose de précurseurs carbonylés. La figure 13 présente l'exemple de la prépa- ration du p-nitrophényl a-D-ga1actopyranos1de H-6 par réduction avec B*H

Na de l'aldéhyde correspondant obtenu par oxydation enzymatlque du galactoslde que l'on se proposait de marquer (16).

OH

HO A 0 ^ Galactose oxydase

B*H⁴Na

lMu.ll

La figure 14 donne un exemple emprunté à D.C. BAKER, T.H. HASKELL (17) de drogue t r l t l é e sélectivement i l'aide de borohydrure de sodium T l . L'arabi- nosyladenine ("ARA-A") est une substance antivirale. L'échange catalytique avec l e tritium introduit l e tritium en positions 8 et 2 du noyau adenine. Le tritium de la position 8 est semi labile : i l est éliminé par échange avec 1'eau par chauffage à reflux. Le tritium de l'ARA-A-T-2 ainsi obtenu est stable en milieu acide et a l c a l i n , mais i l est biologiquement instable : sur le chien, en 1/2 heure l ' a c t i v i t é est éliminée sous forme d'eau t r l t l é e . Par dégradation chimique appropriée la fonction alcool en - 5 ' de VARA-A est transformée en fonction aldéhydique dont la réduction par BT^ANa fournit 1 "ARA-A-T-5'" qui est biologi- quement stable dans des expériences sur l e chien même au bout de 24 heures.

VI - MESURES QUALITATIVE ET QUANTITATIVE DE LA DISTRIBUTION DU TRITIUM PANS LES PRODUITS TRITIEC PAR R.M.N. DU TRITIUM

Pour de nombreuses utilisations, i l n'est pas nécessaire de connaître de manière précise la localisation des atomes du tritium dans une molécule. Par contre, pour un nombre croissant d'applications, 11 est important de connaître les positions et la stéréochimie des atomes de tritium d'une molécule. La R.H.N. H permet en routine la détermination de la position et configuration des atomes de tritium dans une molécule.

La figure 15 donne un exemple emprunté i J.A. ELVIDGE et collaborateurs (17) de mesure de la distribution du tritium dans la Vinblastine par RMN du

tritium. Le service des molécules marquées du C.E.N.-Saclay contrôle également depuis peu de temps, en routine, la distribution quantitative du tritium dans les substances t r i t i é e s qu'il produit.

ISOLEMENT ET PURIFICATION DES MOLECULES MARQUEES RADIOACTIVES

Les techniques classiques (cristallisations, distillations) sont rarement utilisables.

Les techniques chromatographiques permettent avantageusement la sépa- ration des produits secondaires. On opère : sur colonnes (échangeurs d'Ions, S W c a g e l , alumine, "Séphadex", "Amberlite XAD 2 " , "Llpidex") ; sur plaques preparatives ; sur papier ; en phase vapeur.

CONTROLES DE LA PURETE RADIOCHIMIQUE DES MOLECULES MARQUEES

On associe les techniques chromatographiques aux mesures de radioac- t i v i t é . Les techniques les plus employées sont :

, ^ . - * sr- -î-

•nmmwh iiiniin

-s-»»»'*»»*», " i n nrpcr —~*v .-.^"r—T«--"f- — »~» — - * -»-

tMI^MMMtriUH

NH,

HO

OH

*ARA - A"

CATALYSEUR YSEUR T^IT^N^T

HOT/O

I 1

OH

l ) BT

N»

NH<

H?0 , REFLUX

N

ol—

OH

"ARA - A - T - I"

- T STABLE MILIEUX ALCALIN ET ACIDE - T BIOLOGIGUEMENT INSTABLE—» HTO

0/5 HEURE/CHIEN

"ARA - A - T - 5* * - T BIOLOGIQUEMENT STABLE

24 HEURES/CHIEN

ARABINOSYLADENINE -

H (17)

gjk?*> * A « < & . - " > v ^àùî^y^iM-

- e-i -

Ï A VINBLASTINE <

H-G) EST PREPAREE PAR ECHANGE AVEC CF3CO2T ACTIVITE SPECIFIQUE : 8,2 CI/MMOLE

r

VUXtf OAc

• SPECTRE DE RMN DU TRITIUM : (20 MCI)

LU

• •

DISTRIBUTION DU TRITIUM DANS LA VINBLASTINE

H-G

6 (p.p.M.) POSITIONS MARQUAGE RELATIF (<) 6,45

7,25 7,40 7,72

17 12 M3' 11 • 14

44 46 8 2

MESURE QUANTITATIVE DE LA DISTRIBUTION DU TRITIUM DANS VINBLASTINE PAR R.ÎI.N, DU TRITIUM (17)

. • \

i

ï

« -

M

1. (

f !

! i

- 24 -

4 chromatographic sur couche mince ou la chromatographic sur papier Pour que le résultat soit significatif, plusieurs "systèmes de solvants*

de développement doivent être utilisés.

b) La H.P.L.C.

Pour que le résultat soit significatif, plusieurs "systèmes de solvants*, plusieurs colonnes et éventuellement plusieurs programmes de sovants d'élu- tien doivent être utilisés.

c) La chromatographic gazeuse

Lorsque les produits ont des tensions de vapeur suffisamment élevées ou lorsqu'on peut préparer facilement des dérivés volatiles.

d) La chromatographic sur résines êchangeuses d'ion

est particulièrement bien adoptée au cas des acides aminés.

La localisation des taches radioactives sur les "radlochroaatogrammes"

(CCM ou papier) peut se faire par autoradiographie sur fila photographique ou plus rapidement (mais de manière souvent moins rigoureuse) sur un lecteur de chromatogramme. Le type commercial le plus usité repose sur le déplacement lent du chromatogramme sous un compteur Geiger-MQller muni d'une fente diaphragme.

Un nouveau lecteur de radiochromatogramme a été commercialisé récemment (Numélec). Cet appareil opère sans balayage, et emploie un détecteur à localisa- tion. On obtient une visualisation constante en cours de mesure de l'ensemble du radiochromatogramme. Les informations sont stockées en mémoire, en fonction de la répartition radioactive. La figure 16 donne le schéma de principe de l'ensemble.

GAZ Compteur S localisation et 3 amplificateurs

llMîAÎ

h

Codeur temps/amplitude Codeur analogique/digital

Enregistreur

Alimentation Haute tension

Analyseur

Multicanaux

Visualisation I

La figure 17 donne le schéma de principe de fonctionnement du détecteur il-d est un compteur proportionnel au gaz d'argon méthane (10 ou 20 t) ou au

£ z naturel. Une ligne de retard est placée parallèlement 3 l'anode et capte les /signaux produits par celle-ci. Les signaux captés sont recueillis aux deux extrê- mités de la ligne i retard de façon 2 mettre en route et è arrêter un convertis- seur de temps-amplitude. Cet appareil a une grande sensibilité pour le C et le tritium ainsi qu'une excellente résolution. Il permet un gain de temps considé- rable sur les appareils conventionnels. Avec une activité de 0,1 yCi ( C) en CCH, le temps de lecture est de 3-5 minutes alors que, avec un appareil classique celui-ci est de 30-60 minutes.

anode

ligne S retard

anode 6AZ ligne a retard

1 ' ' '

I

'

I

'

1 1

'

l

'

256 mm

(Détecteur Type CHARPAK)

PRINCIPE 0E FONCTIONNEMENT DU DETECTEUR TYPE CHARPAK

AUTODECOHPOSITION DES MOLECULES MARQUEES RADIOACTIVES

Sous leur propre rayonnement, les produits marqués se radlolysent et

donnent naissance a des Impuretés dont la structure chimique est, dans la majo-

rité des cas, inconnue.

«S-**- *. 5S»*. . ** ?*"X#"*'r f ,*', , ,^*J V' **

>»w>mi**<wm»ii iii^»<(»^îàaM>hh<ww>wiaÉiaMiwwww

MODE

D'AUTODÉCOMPOSITION CAUSE MOYEN DE RALENTIR LA

DÉCOMPOSITION PRIMAIRE (INTERNE)

PRIMAIRE (EXTERNE)

SECONDAIRE

CHIMIQUE ET MICROBIOLO- GIQUE

DÉCROISSANCE ISOTOPIQUE NORMALE

INTERACTION DIRECTE DE L'ÉMISSION («,* OU y) AVEC LES MOLÉCULES DU COMPOSÉ

INTERACTION D*ESPÈCES EXCITÉES AVEC LES MOLÉCULES DE COMPOSÉ

INSTABILITÉ THERMODYNAMIQUE PRÉSENCE DE MICROORGANISMES

AUCUN (POUR UNE ACTIVITÉ SPÉCIFI- QUE DONNÉE)

DISPERSION DES MOLÉCULES MARQUÉES

DISPERSION DES MOLÉCULES REFROIDISSEMENT

ADDITION DE CAPTEURS DE RADICAUX LIBRES

REFROIDISSEMENT STÉRILISATION

\

MODES DE DECOMPOSITION DES MOLECULES MARQUEES RADIOACTIVES

.. ,:.,:• f^, J .,^J; v* ; f e i ^ s ^ * ^

r

ANP 3 6 2 4 (ACIDE TIENILIQUE) ci ci

o^

ACTIVITÉ SPÉCIFIQUE MCI / MMOLE

50,6 24 24

STOCKAGE TEMPS

Z DÉCOMPOSITION OBSERVÉE ^

LYOPHILISE, - 25°C 6 SEMAINES 8Z LYOPHILISE, - 25

C 5 MOIS 10 X SOLUTION HEOH (0,5 MCI/ML) 5 MOIS 3 Z - 2 5 * C

C l C l

(*) IMPURETÉ IDENTIFIÉE : O » ^ ^OH

EXEMPLE DE L'INFLUENCE DE MODE DE STOCKAGE ET DE L'ACTIVITE SPECIFIQUE SUR LA VITESSE D'AUTORADIOLYSE D'UNE DROGUE

C ( 1 9 )

ammm>ùm»em £fô3&^¥*ï**Vj*iï!:> t t. \ - ' <&>&,* • ,m&- **• ifcAi* t & ^«as ***&»*«- ⁱ>^^â^^^Bi^^Mi>êèiU:m^^^^w^mm^^^. Mfryfe •^•mm*®,.*-. K- «*&**<

Bally et Wei gel (18) ont donné une classification des nodes de déconposi- ion des Molécules Marquées radioactives (fig. 18). C'est le node d'auto-décon- posltlon secondaire qui est le plus Important par Interaction d'espèces excitées avec les Molécules du conposé.

Les vitesses de décomposition sont parfois Inattendues. L'ANP 3624 ("Acide tiénlllque") non Marqué est un conposé stable sans précaution spéciale.

L'ANP 3624-

C, d'activité spécifique : 50,6 nCi/mNole, stocké à - 25° C, lyophi- lisé, a un taux de decomposition de 8 % en 6 semaines (19) (fig. 19). Sur cette figure, on volt l'Influence du Mode de stockage et de l'activité spécifique sur la vitesse d'autoradlolyse de cette drogue.

La figure 20 donne les variations de la pureté rad1ochim1que de divers lots d ' e s t r a d l o l - ^ . M J (activité spécifique : 100 C1/afto1e) en fonction du temps de stockage (20). Ce diagramme Illustre un phénomène relativement général : la pureté radlochlnlque varie peu dans les toutes premières semaines de stockage puis la vitesse de décomposition s'accélère rapidement.

100 •

V s

er

•r-

90

T -E

•C

S

t -

•o m

3

p

80

«

%

oV

préparatlpns 1 A 2 • 3 • 4 O

5 •

\ \

• * >

* t * *

4 8 12 15 20

Durée du stockage en semaines

Les vitesses d'auto-décomposition peuvent varier dans de grandes

limites pour un même produit, d'une préparation 8 l'autre. La figure 21 due

S 6. Sheppard (21) donne un diagramme de fréquence d'auto-décomposition de

divers préparations d'uridlne H-5. chaque trait vertical représente le nombre

de préparations dont la vitesse moyenne de composition se trouve dans l'inter-

valle donné. On peut afflmer sans erreur que la conservation d'un produit marqué

radioactif sera d'autant meilleure que sa pureté chimique sera bonne.

/ /

6 .

4

U

0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 X Décomposition par semaine

2,4

I l est difficile d'émettre des règles rigoureuses pour diminuer la Vitesse de radiolyse des molécules marquées radioactives. Tout au plus peut-on émettre quelques recommendations pour leur stockage.

Molécules

C :

- Diminuer l'activité spécifique si possible ;

- Conserver le produit i - 35° C sous azote ou sous vide, soit lyophilisé, soit en solution dans un solvant, a déterminer par l'expérience ; - Contrôler la pureté radlochlmlque tous les trois mois.

Molécules ^ é hautes activités spécifiques : - Ne jamais lyophiliser ;

- Conserver à + 4° C en solution aqueuse stérile ;

• Conserver 8 - 35° C en solution dans un solvant organique ; - Contrôler la pureté radlochlmlque tous les mois.

CONTROLES DE LA PURETE CHIMIQUE DES MOLECULES MARQUEES

On compare la molécule marquée radioactive avec son analogue non

marqué. Pour cela, on opère par spectrophotometries : U.V. et visible, I.R.,

R.M.N. (proton, C), S.M.. Les titrations colorlmétrlques spécifiques sont

également employées fréquemment. La H.P.L.C. donne une Indication rigoureuse de

la pureté chimique et de 1'Identité.

%

- .dlPARAISONS ENTRE SYNTHESES MOLECULES

Ç CT MOLECULES

C

M

C 1 3

MATIERES PREMIERES IDENTIQUES EN PRINCIPE

STADE PRIMAIRE % 2 * C 0

QUANTITES PONDERALES 1-lOmOLES (50-500 MG)

5 0 0 M 6 - 1 K G

> K 6 POUR SUBSTANCES BASE METHODES D'ISOLEMENT,

DE PURIFICATION

CHROMATOGRAPHIES CRISTALLISATIONS DISTILLATIONS

AVANTAGES SENSIBILITE DE PAS DE PROTECTION LA RADIOACTIVITE RADIOACTIVE

APPAREILLAGE CLASSIQUE LABORATOIRES CLASSIQUES DESAVANTAGES PROTECTIONS CONTRE

CONTAMINATIONS DECHETS RADIOACTIFS

INSTALLATIONS SPECIALES

W 1 i K i b i A i

AUTODECOMPOSITION INEVITABLE

PRIX DANS LES DEUX CAS FORT % MAIN D'OEUVRE QUALIFIEE CONTROLES ANALYTIQUES

MOINS SENSIBLES

MULTIMARQUAGES SOUVENT NECESSAIRES

PAS DE RADIOLYSE

tlmuM

.CULES MARQUEES PAR LES ISOTOPES STABLES

Au début de cet exposé, 11 a été Indiqué que, pour des raisons d'éthi- ques, il est prévisible que l'utilisation de molécules marquees par les isotopes

14 13

stables se développera. Les molécules marquées au C et au C présentent cer- taines analogies (matières premières) mais aussi certaines différences, ainsi que certains avantages et désavantages respectifs qui sont résumés dans la figure 22.

!i6»iQ§S*&y*i

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+ + + + + + + •