Infections nosocomiales :

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ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE

Option : Analyses Biomédicales (ABM)

RAPPORT DE STAGE DE FIN DE FORMATION POUR L’OBTENTION

DU DIPLOME DE LICENCE PROFESSIONNELLE

THEME

PRESENTE ET SOUTENU PAR : KISSIRA Sètondji Islamiath SOUS L’ENCADREMENT DE :

Infections nosocomiales : évaluation de risques dans les services de la Néonatologie, de la CUGO et de la Pédiatrie

du Centre National Hospitalier Universitaire (CNHU HKM) de Cotonou

ANNEE ACADEMIQUE : 2013-2014 7^ème promotion de Licence Professionnelle Soutenu publiquement le 07 Novembre 2014

Devant le jury composé de

Présidente : Prof. BANKOLE Honoré, Enseignant - Chercheur à l’EPAC

Rapporteur: Docteur AHOYO Théodora Angèle, Enseignante - Chercheur à l’EPAC Examinateur : Docteur KLOTOE Jean Robert, Enseignant- Chercheur à l’EPAC

TUTEUR : M. Léopold FASSINOU Inspecteur d’action sanitaire

CNHU HKM

SUPERVISEUR : Dr. Angèle Théodora AHOYO Microbiologiste – Hygiéniste hospitalier

Enseignant- Chercheur à l’EPAC

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ii Réalisé par KISSIRA Sètondji Islamiath

REPUBLIQUE DU BENIN

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MINISTERE D’ETAT CHARGE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

*******

UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI

*******

ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI

DIRECTEUR :

Pr. Félicien AVLESSI

CHEF DE DEPARTEMENT :

Dr. Julien A.G. SEGBO

DIRECTEUR ADJOINT :

Prof. Clément BONOU

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iii Réalisé par KISSIRA Sètondji Islamiath

ANNEES ACADEMIQUES 2011 – 2014 ENSEIGNANTS PERMANENTS N° NOM et Prénoms Matières enseignées 01 AHOYO Théodora Angèle Microbiologie Générale

Microbiologie Médicale 02 AIKOU Nicolas Biochimie

Microbiologie

03 AKPOVI D. Casimir Physiologie humaine et Biochimie

04 ANAGO Eugénie Biochimie Structurale et Métabolique Biologie Moléculaire

05 ATCHADE Pascal Parasitologie

06 BANKOLE Honoré Bactériologie Appliquée

07 LOKO S. Frédéric Biochimie Clinique

08 LOZES Evelyne Immunologie Générale

09 SECLONDE Hospice Immuno-Hématologie et Transfusion Sanguine

10 SEGBO A. G. Julien Biologie Générale, Biochimie Structurale, Biochimie Métabolique et Biologie Moléculaire

11 TOPANOU Adolphe Hématologie Générale Hémostase

12 YOVO K. S. Paulin Physiologie Humaine, Pharmacologie et Toxicologie

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iv Réalisé par KISSIRA Sètondji Islamiath

ENSEIGNANTS VACATAIRES N° NOM et Prénoms Matières enseignées 01 ABLEY Sylvestre Déontologie Médicale 02 ADISSODA Cyrille Anglais

03 ADOMOU Alain Physique

04 AGBANGLA Clément Génétique Moléculaire

05 AGOSSOU Gilles Législation et Droit du Travail 06 AKOGBETO Martin Entomologie Médicale

07 ALITONOU Guy Chimie Organique

08 ANAGONOU Sylvère Education Physique et Sportive 09 AVLESSI Félicien Chimie Générale

10 AVOGNON I. K. Jérôme Anglais

11 BINAZON Claude César Soins Infirmiers et Phlébotomie 12 DARBOUX Raphaël Histologie

13 DESSOUASSI Noël Biophysique

14 DOSSEVI Lordson Techniques Instrumentales 15 DOSSOU Cyriaque TEMC

16 FOURN Léonard Santé Publique 17 HOUNNON Hyppolite Mathématiques

18 HOUNSOSSOU Hubert Biométrie et Anatomie Générale 19 MASLOKONON Vincent Histologie Générale

20 SENOU Maximin Histologie

21 SOCLO Henri Chimie Organique 22 YANDJOU Gabriel TEMC

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v Réalisé par KISSIRA Sètondji Islamiath

Dédicace

Remerciements Hommages

Liste des sigles et abréviations Liste des tableaux et figures Résumé

Abstract Introduction

1. Synthèse de littérature 2. Matériel et méthode 3. Résultats et discussion Conclusion

Annexes

Table des matières

SOMMAIRE

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vi Réalisé par KISSIRA Sètondji Islamiath

A Mon feu grand frère Moubarack KISSIRA, In memoriam.

Reposes en paix DEDICACE

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vii Réalisé par KISSIRA Sètondji Islamiath

Je dois satisfaire à un agréable devoir, celui de témoigner ma gratitude à tous ceux qui de près ou de loin ont participé à l’élaboration de cette œuvre :

 A mon père Issah KISSIRA et ma mère Rita Marthe SINSIN,

Pour qu’ils y voient la consécration de tous les efforts consentis à mon égard depuis tant d’années.

Puisse le Seigneur vous donner la longévité et la santé afin de me voir plus haut.

 A mes frères Relewane, Fahad et Amour-Hadil et ma sœur Nadiath KISSIRA,

Votre soutien et vos prières ont fait de moi ce que je suis aujourd’hui.

Recevez ici mes sincères remerciements.

 Au Professeur Augustin Brice SINSIN,

Profondes gratitudes et sincères remerciements. Sans toi ce rêve ne serait jamais réalité.

 A mon superviseur, Dr AHOYO Théodora Angèle,

Vous avez bien voulu diriger mes travaux de recherche malgré vos multiples occupations. C’est le moment pour moi de vous témoigner toute ma gratitude pour l’effort consenti.

 Au Professeur Achille MASSOUGBODJI, Chef Service du laboratoire de Microbiologie du CNHU HKM de Cotonou.

Vos conseils ne nous ont pas manqué dans la réalisation de ce travail.

Votre calme, votre abord facile et votre simplicité sont autant de qualités qui forcent l’admiration.

Merci pour votre disponibilité.

REMERCIEMENTS

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viii Réalisé par KISSIRA Sètondji Islamiath

 Au Professeur Sévérin ANAGONOU, Responsable du service de Bactériologie du CNHU HKM de Cotonou.

Merci de nous avoir ouvert les portes du laboratoire de Bactériologie et de nous avoir accompagnés dans la réalisation de ce travail.

Merci pour votre disponibilité.

 A M. Charles Hornel KOUDOKPON,

En nous embarquant dans cette aventure, je n’avais aucun souci quant à l’heureux aboutissement des événements. Merci pour tout !

 A mon ami Gervais TOKPOHOZIN

Malgré la distance tu m’as soutenue moralement pendant les moments les plus difficiles de ma formation, reçois ici l’expression de ma profonde gratitude.

 A M. Lauris FAH, M. Brice FANOU,

Vos conseils et votre sollicitude m’ont fait du bien. Sans votre aide, je ne serai pas là. Sincères remerciements à vous

 Aux Docteurs Jean Robert KLOTOE et Victorien T. DOUGNON Pour l’aide précieuse que vous m’avez apportée dans la réalisation de ce travail, merci pour tout.

 A M. Pascal GBAYI et son épouse

Pour votre assistance précieuse et votre amitié, trouvez ici le témoignage de ma reconnaissance et la sincère affection portée à votre famille.

 A mes tantes Mauricette T. et Joséphine SINSIN

Pour votre précieuse contribution durant toute ma formation.

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ix Réalisé par KISSIRA Sètondji Islamiath

 Au personnel du laboratoire de microbiologie du C.N.H.U.-HKM de Cotonou

Pour votre accueil, aide, conseils et la mise à disposition des ressources matérielles et humaines dans le cadre de la réalisation de ce travail.

Merci pour tout.

 Aux Mmes Gloria LIGAN, Zeynabou YEHOUENOU et aux sieurs Gislain DENAKPO, IBRAHIM Boussari, Rock DOSSOU-DJOSSOU.

En souvenir des nombreuses heures studieuses et de nos moments de détente passés ensemble, je vous souhaite une brillante carrière et une réussite sociale.

 A tous ceux qui m’ont aidée de loin ou de près dans la réalisation de ce travail,

Merci pour tout.

 A tous mes camarades de promotion,

Nous avons passé ensemble les bons et les mauvais moments de cette formation. C’est le moment pour moi de vous témoigner ma profonde gratitude pour tous ces moments.

Sincères remerciements.

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x Réalisé par KISSIRA Sètondji Islamiath

 A mon superviseur, Dr AHOYO Théodora Angèle, Maitre Assistante des Universités du CAMES, Microbiologiste, Hygiéniste hospitalier.

Vous avez bien voulu diriger mes travaux de recherche malgré vos multiples occupations. Recevez-ici un hommage mérité.

 A son Excellence Monsieur le Président du Jury

Je vous exprime mes vives gratitudes pour l’honneur que vous me faites en acceptant de présider le jury de ma soutenance.

Hommages respectueux.

 Aux Honorables Membres de Jury,

C’est un grand honneur que vous me faites en acceptant de juger mon travail. Je suis persuadée que vos critiques et suggestions me permettront d’améliorer la qualité de ce travail.

Hommages respectueux.

HOMMAGES

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xi Réalisé par KISSIRA Sètondji Islamiath

ARN : Acide ribonucléique

Cm : Centimètre

OC : Degré celsius CNHU HKM

CUGO

: Centre National Hospitalier et Universitaire Hubert K, MAGA : Centre Universitaire de Gynécologie Obstétrique

ECBU EMB EPAC G

: Examen Cytobacteriologique des Urines : Eosine Bleu de Méthylène

: Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi : Gramme

GBH IN L

: Génie de Biologie Humaine : Infections Nosocomiales : Litre

µ : Micro

mm : Millimètre

mL : Millilitre

N : Négatif

NaCl ORL P

: Chlorure de Sodium

: Ortho-Rhyno Laryngologie : Positif

pH : Potentiel Hydrogène Qsp : Quantité suffisante pour

SCN : Staphylocoques à coagulase Négative PDA : Potato Dextrose Agar

UAC : Université d’Abomey-Calavi OMS : Organisation Mondiale de la Santé

 : Pourcentage

LISTE DES SIGLES ET ACRONIMES

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xii Réalisé par KISSIRA Sètondji Islamiath

N° de Figure

Titre des Figures Pages

Figure 1 Schéma de culture des moisissures sur les milieux

Sabouraud et PDA………... 29

Figure 2 Préparation des lames pour examens microscopiques 30 Figure 3 Aspects des thalles des « Penicillia » et des

« Aspergillia » ……….

31 Figure 4 Distribution des prélèvements effectués……….. 33 Figure 5 Répartition des souches isolées à la CUGO en

fonction des prélèvements………... 34 Figure 6 Répartition des germes isolés à la Pédiatrie en fonction

des prélèvements……….. 35

Figure 7a Aspergillus sp. isolés (colonies su PDA et aspect des

thalles à l’objectif x40) ..………. 36 Figure 7b Aspergillus sp., Cladosporium sp., Pénicillium sp.,

Fusarium sp. isolés (colonies sur PDA et aspect des

thalles à l’objectif x40) ..………. 37 LISTE DES FIGURES

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xiii Réalisé par KISSIRA Sètondji Islamiath

N° de Tableau Titre des Tableaux Pages

Tableau I Répartition des prélèvements selon leur origine et la

positivité………... 33

Tableau II Fréquences des germes isolés au service de la

néonatologie………. 36

Tableau III Présentation de la sensibilité des souches E coli

isolées………... 38

Tableau IV Présentation de la sensibilité des souches

Staphylococcus……… 38

Tableau V Présentation de la sensibilité des souches

Pseudomonas sp………... 39

Tableau VI Présentation de la sensibilité des souches

Acinetobacter………... 40

Tableau VII Répartition des profils de résistance selon l’espèce et

selon les différents prélèvements………. 41 LISTE DES TABLEAUX

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xiv Réalisé par KISSIRA Sètondji Islamiath

Les infections nosocomiales constituent de nos jours un véritable problème de santé publique. Cette étude de type transversale et prospective a eu pour but d’évaluer le risque d’infection nosocomiale dans les services de la CUGO, de la Néonatologie et de la pédiatrie du CNHU HKM de Cotonou. Au cours de cette étude, ont été prélevé les urines les patients hospitalisés dans le service de la CUGO, écouvillonné les parties de peau sous cathéter des enfants hospitalisés en Pédiatrie. En néonatologie, des écouvillons de couveuse ainsi que des prélèvements d’environnement ont été effectué. Les clenches de porte de ces différents services ont été également écouvillonnées. Ces différents prélèvements ont objet d’analyses bactériologique et mycologique.

Il ressort de cette étude que les clenches de porte des services étudiés sont presque tous contaminés et surtout à la CUGO où E. coli était le germe le plus isolé que ce soit sur les clenches de porte que dans les urines des patients suivi des Staphylocoques (S. aureus + SCN) et des Pseudomonas. Dans le service de la pédiatrie les germes les plus isolés étaient Acinetobacter et Pseudomonas. Sur les couveuses du service de la néonatologie le germe le plus isolé des couveuses est Acinetobacter.

L’étude mycologique de l’environnement de la néonatologie a montré la présence d’Aspegillus Sp, de Cladosporium Sp et de Fusarium Sp.

Concernant l’étude du profil de résistance, les germes isolés ont été pour la plupart multi-résistants. Des bactéries de mêmes profils de résistance avaient été retrouvées tant sur les clenches de porte que dans les autres prélèvements.

Ceci confirme le risque d’infection nosocomiale dans ces services. Il s’avère alors nécessaire de mettre en place un comité de contrôle et de surveillance des infections nosocomiales dans le but de réduire ce risque.

Mots clés : Infections nosocomiales- Risques- CNHU- Germes multi-résistants.

RESUME

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xv Réalisé par KISSIRA Sètondji Islamiath

Nowadays, nosocomial infections (NI) constitute a true problem of public health. We undertook a study of type transverse and prospective with an aim of evaluating the risk of NI in the services of the CUGO, Neonatology and the pediatry of CNHU HKM of Cotonou. During this study we took the urines of the patients hospitalized in the service of the CUGO, cleaned the parts of skin under catheter of the children hospitalized in Pediatry. In the service of the neonatology, taking into account the fragile state of the children, we cleaned the incubators containing of new born and carried out taking away from environment. The latches of door of these various services were also cleaned.

This various sampling has object of analyses bacteriological and mycologic.

It comes out from this study that the latches of door of the studied services all are almost contaminated and especially, in with the CUGO where E coli was the germ more insulated that it on the latches of door that in the urines of the patients is followed of the Staphilococca (S. aureus + SNC) and of Pseudomonas. In the service of pediatry, the most insulated germs were Acinetobacter and Pseudomonas. On the incubators of the service of the neonatology the germ more isolated from the incubators is Acinetobacter.

The mycologic study of the environment of the neonatology showed the presence of Aspegillus sp, Cladosporium sp and Fusarium sp.

Concerning the study of the profile of resistance, the insulated germs were for the majority multi-resistant. Bacteria of same profiles of resistance had been found as well on the latches of door as in the other taking away. This confirms the risk of NI in these services. It then proves necessary to set up a committee of control and monitoring of the NI with an aim of reducing this risk.

Key words: Nosocomial infections – Risks- CNHU- Multi-resistant Germs.

ABSTRACT

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1 Réalisé par KISSIRA Sètondji Islamiath

Les infections nosocomiales constituent depuis un certain temps un réel problème de santé publique (Saha, 2010 ; OMS, 2002). Selon l’OMS, elles peuvent se définir comme une infection acquise à l’hôpital par un patient qui y est admis pour une raison autre que cette infection (Ducel, 1984) ou plus spécifiquement une infection survenant chez un patient à l’hôpital ou dans un autre Etablissement de prise en charge des soins de santé et chez qui cette infection n’était ni présente ni en incubation au moment de l’admission. Cette définition inclut les infections contractées à l’hôpital mais qui se déclarent après la sortie, et également les infections professionnelles parmi le personnel de l’Etablissement (Benenson, 1995). Des études réalisées à travers le monde montrent qu’elles constituent une cause majeure de mortalité et de morbidité avec des prévalences variables de pays en pays, pouvant aller jusqu’à 21% de la population de certains pays. (Mayon-White et al., 1988 ; Orrett et al., 1998).

Les études réalisées au Bénin en 2012, dans trente-neuf (39) structures publiques sur les quarante cinq (45) qu’il comporte, donnent une prévalence de 19,1% avec une prédominance d’infections du tractus urinaire (Ahoyo et al., 2014). Ceci témoigne de la qualité d’hygiène sanitaire encore embryonnaire dans notre pays. Ce manque d’hygiène passe par la qualité de l’hygiène des mains, de l’hygiène de l’environnement et des mauvaises habitudes qui concourent à des risques d’infection (OMS, 2014). Des études réalisées au Laboratoire National de Cotonou et au CHD Ouémé/Plateau ont révélé que les clenches de porte constituent une véritable source de contamination bactérienne dans les structures sanitaires (Affiomè, 2012 ; Bada et Bossou, 2013)

Aussi, pendant notre période de stage, nous avons remarqué une prédominance de certains germes dont notamment Escherichia coli isolé de manière répétitive chez les patients hospitalisés et quelque soit le type de prélèvement. Cet état de chose nous a poussée à entreprendre ce travail intitulé :

INTRODUCTION

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« Infections nosocomiales : évaluation de risques dans les services de la Néonatologie, la CUGO et de la Pédiatrie du CNHU de Cotonou » afin de rechercher l’existence d’un lien entre les germes présents dans l’environnement (clenches de porte notamment) et les germes isolés chez les patients hospitalisés.

Pour y parvenir nous nous sommes assigné les objectifs ci-après :

Objectif général

Evaluer le risque d’infection nosocomiale dans les services de la CUGO, de la Néonatologie et de la pédiatrie du CNHU HKM de Cotonou.

Objectifs Spécifiques

 Déterminer la prévalence des infections chez les hospitalisées des services de la CUGO, de la Néonatologie et de la pédiatrie du CNHU HKM de Cotonou.

 Evaluer la contamination des clenches de porte de ses différents services.

 Déterminer le profil de résistance des germes isolés.

Le présent document est structuré en trois parties essentielles :

- la première partie est consacrée aux généralités sur les infections nosocomiales.

- la deuxième partie aborde les cadres d’études et la méthodologie utilisée. Enfin,

- la dernière partie présente les résultats et le commentaire que suscite le présent travail.

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1.1. Infections nosocomiales 1.1.1. Définition et épidémiologie

Selon les premières définitions de l’OMS, une infection nosocomiale peut se définir comme une infection acquise à l’hôpital par un patient admis pour une raison autre que cette infection (Ducel, 1984). Cette définition ne prenait pas en compte les cas d’infections qui se déclarent après l’hospitalisation et qui sont dues au séjour à l’hôpital et les cas d’infection qui survenaient chez le personnel soignant ainsi que les visiteurs. Depuis 1995 une définition plus globale propose qu’une infection nosocomiale est une infection survenant chez un patient à l’hôpital ou dans un autre établissement de santé et chez qui cette infection n’était ni présente ni en incubation au moment de l’admission. Cette dernière inclut les infections contractées à l’hôpital mais qui se déclarent après la sortie, et également les infections professionnelles parmi le personnel de l’établissement (Benenson, 1995).

Des études réalisées à travers le monde montrent qu’elles constituent une cause majeur de mortalité et de morbidité avec des prévalences variable de pays en pays, pouvant aller jusqu’à 21% de la population de certain pays. (Mayon- White et al., 1988 ; Orrett et al., 1998). Elles touchent aussi bien les pays développés que les pays en voie de développement (OMS, 2002). La prévalence maximale des infections nosocomiales s’observe dans les unités de soins intensifs et dans les services de chirurgie d’urgence et d’orthopédie. Les taux d’infection sont aussi plus élevés chez des patients rendus plus vulnérables par l’âge, une maladie sous-jacente ou une chimiothérapie (OMS, 2002). Elles génèrent un coût économique important du fait de la prolongation de la durée d’hospitalisation (Wenzel, 1995 ; Plowman et al., 1999). Cette augmentation de la durée d’hospitalisation augmente non seulement les coûts directs, pour les patients ou les organismes qui prennent en charge le paiement mais aussi les

1. SYNTHESE DE LITTERATURE

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coûts indirects dus à la perte de journées de travail, les médicaments supplémentaires, les impératifs d’isolement et la nécessité d’examens de laboratoire et de tests de diagnostic (OMS, 2002).

Les études réalisées au Bénin en 2012 dans 39 structures publiques sur les 45 dont il dispose, ont montré une prévalence de 19,1% avec une prédominance d’infections du tractus urinaire (Ahoyo et al., 2014).

1.1.2. Différents types d’infections nosocomiales rencontrés (OMS, 2002) 1.1.2.1. Infections urinaires

Ce sont les infections nosocomiales les plus courantes ; 80 % des infections sont liées à un sondage vésical à demeure (SPILF et AFU, 2002). Les infections urinaires sont associées à une plus faible morbidité que les autres infections nosocomiales, mais peuvent dans certains cas provoquer une bactériémie potentiellement mortelle. Ces infections sont habituellement définies selon des critères microbiologiques : uroculture quantitative positive (≥105 micro-organismes/ ml, avec au maximum deux espèces microbiennes isolées). Les bactéries responsables proviennent de la flore intestinale du patient, normale (Escherichia coli) ou acquise à l’hôpital (Klebsiella multi résistantes).

1.1.2.2. Infections du site opératoire

La définition de ces infections est essentiellement clinique. En effet, il s’agit d’écoulement purulent autour de la plaie ou du site d’insertion du drain, ou cellulite extensive à partir de la plaie. Les infections de la plaie opératoire (au-dessus ou au-dessous de l’aponévrose) et les infections profondes des organes ou des espaces sont identifiées séparément. L’infection est en général acquise pendant l’intervention elle-même, avec une origine soit exogène (air, matériel médical, chirurgiens et autres soignants), soit endogène (flore cutanée ou flore présente sur le site opératoire ou, dans de rares cas, sang utilisé en préopératoire). Les micro-organismes infectieux sont divers, et dépendent du type et de la localisation de l’intervention et des anti-infectieux reçus par le

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patient. Le principal facteur de risque est l’étendue de la contamination préopératoire (chirurgie propre, propre-contaminée, contaminée, sale), elle- même conditionnée par la durée de l’intervention et l’état général du patient. Les autres facteurs en jeu sont la qualité de la technique chirurgicale, la présence de corps étrangers (drains compris), la virulence des micro-organismes, la présence d’une infection concomitante sur un autre site, la pratique du rasage préopératoire et l’expérience de l’équipe chirurgicale. Les infections du site opératoire sont également fréquentes : leur incidence va de 0,5 % à 15 % selon le type d’intervention et l’état général du patient Il s’agit d’un problème important qui limite le bénéfice potentiel des interventions chirurgicales.

L’impact sur les couts hospitaliers et la durée du séjour postopératoire (3 à 20 jours de plus) est considérable.

1.1.2.3. Pneumopathies nosocomiales

Les pneumopathies nosocomiales s’observent chez plusieurs catégories de patients, principalement les patients sous ventilation artificielle dans les unités de soins intensifs, ou leur taux atteint 3 % par jour. La pneumopathie associée a la ventilation assistée possède un taux de létalité élève, bien que le risque attribuable soit difficile a déterminer du fait de l’importance des co-morbidités.

Les microorganismes colonisent l’estomac, les voies respiratoires supérieures et les bronches, et provoquent une infection pulmonaire (pneumopathie) ; ils sont souvent endogènes (appareil digestif ou rhinopharynx) mais peuvent être exogènes, souvent à partir d’un appareil respiratoire contaminé.

La définition de la pneumopathie peut reposer sur des critères cliniques et radiologiques faciles à établi mais non spécifiques : opacités radiologique récentes et progressives au niveau du parenchyme pulmonaire, expectorations purulentes et fièvre d’apparition récente. Le diagnostic est plus spécifique lorsqu’on peut obtenir des échantillons microbiologiques quantitatifs par

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bronchoscopie spécialisée et protégée. Parmi les facteurs de risque connus figurent le type et la durée de la ventilation, la qualité des soins respiratoires, la gravité de l’état du patient (insuffisances organiques) et les antécédents d’antibiothérapie.

A part les pneumopathies associées à la ventilation, les patients atteints de convulsions ou dont le niveau de conscience est altéré sont exposés au risque d’infection nosocomiale même en l’absence d’intubation. Les bronchiolites virales (virus respiratoire syncytial) sont fréquentes dans les services de pédiatrie, et la grippe et les pneumopathies par surinfection bactérienne peuvent toucher les établissements pour personnes âgées. Chez les patients gravement immunodéprimés, une pneumopathie à Legionella spp. et à Aspergillus peut survenir. Dans les pays à forte prévalence de la tuberculose et en particulier de ses souches résistantes, la transmission dans les établissements de santé peut constituer un grave problème.

1.1.2.4. Bactériémies nosocomiales

Les bactériémies ne représentent qu’une faible proportion des infections nosocomiales (environs 5 %) mais possèdent un taux de létalité élevé de plus de 50 % pour certains micro-organismes. Leur incidence est en augmentation, en particulier pour certains micro-organismes comme Staphylococcus à coagulase- négatif multi résistants et Candida spp.. L’infection peut se développer au point d’insertion cutané d’un dispositif intra-vasculaire ou sur le trajet sous-cutané d’un cathéter (infection du tunnel). Les micro-organismes qui colonisent le cathéter à l’intérieur du vaisseau peuvent provoquer une bactériémie sans infection externe visible. Elle prend sa source dans la flore cutanée résiduelle ou temporaire. Les principaux facteurs de risque sont la durée du cathétérisme, le niveau d’asepsie lors de l’insertion.

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1.1.2.5. Autres infections nosocomiales

Il existe de nombreux autres sites potentiels d’infection mais moins fréquentes que ceux précédemment décrits, par exemple :

 Les infections de la peau et des tissus mous : les plaies ouvertes (ulcères, brûlures, escarres) favorisent la colonisation bactérienne et peuvent conduire à une infection généralisée.

 La gastro-entérite est l’infection nosocomiale la plus fréquente chez l’enfant, avec un rota virus comme principal agent pathogène. Dans les pays développes, Clostridium difficile est la cause principale des gastro- entérites nosocomiales chez l’adulte.

 Les sinusites et autres infections de la sphère ORL (infections de l’œil et de la conjonctive).

 L’endométrite et autres infections de l’appareil génital après l’accouchement.

1.1.3. Germes fréquents dans les infections nosocomiales 1.1.3.1. Bactéries (OMS, 2002)

Ce sont les plus courants des agents pathogènes responsables d’infections nosocomiales. On peut distinguer :

 Les bactéries commensales

Présentes dans la flore normale des sujets en bonne santé et des sujets malades.

Elles jouent un rôle protecteur significatif en empêchant la colonisation par des micro-organismes pathogènes. Certaines bactéries commensales peuvent provoquer une infection si les défenses immunitaires de l’hôte sont affaiblies.

Par exemple, les staphylocoques cutanés coagulase-négatif provoquent des infections sur cathéter vasculaire et Escherichia coli présente dans l’intestin sont la cause la plus courante d’infections urinaires.

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 Les bactéries pathogènes

Elles ont une virulence plus élevée et provoquent des infections (sporadiques ou épidémiques) quel que soit l’état immunitaire de l’hôte. Par exemple :

- Les bacilles anaérobies à Gram positif (par exemple Clostridium difficile) provoquent la gangrène.

- Les bactéries à Gram positif : Staphylococcus aureus (bactérie cutanée qui colonise la peau et le nez du personnel hospitalier et des patients) provoque une grande variété d’infections pulmonaires, osseuses, cardiaques et sanguines et résiste fréquemment aux antibiotiques. Les streptocoques bêta- hémolytiques sont également des agents pathogènes importants.

- Les bactéries à Gram négatif : les entérobactéries (par exemple Escherichia coli, Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Serratia marcescens) peuvent coloniser certains sites lorsque les défenses immunitaires de l’hôte sont affaiblies (site d’insertion d’un cathéter, d’une canule, sonde urinaire) et provoquer des infections graves (infection du site opératoire, infection pulmonaire, bactériémie, infection du péritoine). Elles peuvent également être hautement résistantes. Les Pseudomonas spp sont souvent isolés dans l’eau et les milieux humides. Ils peuvent coloniser les voies digestives des patients hospitalisés.

- Plusieurs autres bactéries représentent un risque spécifiquement hospitalier. C’est le cas de diverses espèces de Legionella qui peuvent provoquer des pneumopathies (sporadiques endémiques) par inhalation d’aérosols impliquant de l’eau contaminée (climatisation, douches, aérosols à visée thérapeutique).

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1.1.3.2. Virus (Boy et Sow, 2007)

Plusieurs virus peuvent être transmis en milieux hospitaliers, les principaux sont par ordre :

 Les Rotavirus : De transmission féco-orale par les aliments et les eaux souillés, et par contact humain, ils sont responsables de diarrhées infantiles.

 Le virus respiratoire syncytial (VRS) : Responsables des atteintes ORL et pulmonaires chez l’enfant, il est transmis par voie aérienne.

 Le virus de la grippe : Il atteint surtout les sujets âgés dans les centres médicalisés ; il se transmet par voie aérienne et entraîne des atteintes du rhinopharynx, de la trachée et des bronches.

 Les Virus de l’hépatite B (VHB), de l’hépatite C (VHC), de l’immunodéficience humaine (VIH), des fièvres hémorragiques

Ils sont incriminés dans les services d’hémodialyse, lors de la transfusion sanguine et greffes d’organes.

 Autres (varicelle, rougeole) : Ils sont aussi incriminés chez les PVVIH.

1.1.3.3. Parasites

Certains parasites (par exemple Giardia lamblia) se transmettent facilement chez l’adulte et l’enfant. Il n’est pas rare en effet, en zone d’endémie, de constater la survenue d’un paludisme chez un malade hospitalisé, dont la contamination s’est très probablement faite lors de son séjour dans l’établissement de soins (Boy et Sow, 2007). Sarcoptes scabies (agent de la gale) est un ectoparasite qui provoque régulièrement des flambées épidémiques dans les établissements de santé.

(25)

1.1.3.4. Champions

Ils sont de regroupés en trois (03) catégories à savoir : les champignons levuriformes, les champignons filamenteux et les dimorphismes.

 Les levures :

Leur responsabilité est en régulière progression, et leur fréquence a été multipliée par 15 en 15 ans (Kacet et al., 1999 ). Elles sont en cause dans à peu près 9% des septicémies (Lachassinne et al., 2004). Il s’agit surtout de Candida albicans, germe ubiquitaire infectant les muqueuses. Les signes cliniques sont polymorphes et non spécifiques. Notons qu’au cours des septicémies candidosiques, les localisations secondaires sont fréquentes avec, par ordre décroissant, des localisations digestives, urinaires, pulmonaires, oculaires, méningées, ostéo-articulaire, cutanées et endocardiques (Habzi et Benomar, 2001).

 Les moisissures environnementales (champignons filamenteux)

Elles peuvent être à l’origine d’infections redoutables à l’hôpital en dépit de l’évolution récente des stratégies thérapeutiques. Le risque d’acquisition de ces infections et leur pronostic varient selon le niveau d’exposition d’un individu aux sources de spores fongiques et de ses capacités à mettre en place une réponse anti-infectieuse efficace. Les infections à Aspergillus figurent au premier rang en terme de gravité, puisque le taux de mortalité lié aux aspergilloses est proche de 50% dans les pays développés (Lortholary et al., 2011). Aspergillus fumigatus est responsable de la grande majorité des infections fongiques invasives (Garcia-Vidal et al., 2008; Thornton 2010). En effet, certaines espèces de moisissures sont capables de coloniser et d’obstruer les voies respiratoires (Kawamura et al., 2000, Fleming et al., 2002), source constante d’irritants ou d’allergènes, mais aussi de complications pouvant parfois mettre en jeu le pronostic vital.

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De plus, de nombreux champignons présentent des résistances aux antifongiques conventionnels (amphotéricine B et/ou voriconazole). Les patients hébergés en établissement de santé peuvent acquérir une infection fongique invasive associée aux soins, notamment les patients fortement immunodéprimés (Gangneux et al., 2010). Les vecteurs de ces spores fongiques sont multiples : l’air, les surfaces, l’eau ou encore l’alimentation (Warris et Verweij 2005).

L’ensemble des activités autour du patient, d’ordre médical, paramédical, ou encore les visites de la famille, sont des situations pouvant générer un risque d’infection. Ainsi, des mesures d’hygiène et le traitement de l'air sont mis en place dans les services à risque, permettant de limiter l’exposition de ces patients aux spores fongiques et de réduire en conséquence la morbidité et la mortalité de ces maladies et aussi réduire les dépenses liées aux soins (frais d’hospitalisation, examens complémentaires et consommation d’antifongiques).

1.1.4. Facteurs de risques des infections nosocomiales dans les services

Ils sont multiples et varient en fonction des facteurs intrinsèques (propre au propre au patient) et des facteurs extrinsèques (environnement).

1.1.4.1. Facteurs de risque intrinsèques

Au nombre de ces facteurs figurent le poids, le sexe et l’âge du patient.

Ainsi, il existe par exemple une corrélation étroite entre l’incidence des IN, l’âge gestationnel et le poids de naissance. Plus l’enfant est immature, plus le risque d’infections nosocomiales est grand (Kacet et al., 1999 ; Clark et al., 2004a).

L’état dans lequel se situent le patient (immunité affaiblie ou compétente) joue aussi un important rôle dans l’installation d’une infection nosocomiale.

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1.1.4.2. Facteurs de risque extrinsèques

 Durée d’hospitalisation

La durée d’hospitalisation constitue un facteur de risque non négligeable puisque 75 % des IN surviennent après le 6^ème jour d’hospitalisation (Habzi et Benomar, 2001).

 Utilisation de dispositifs invasifs

La présence d’un cathéter intra vasculaire central et la durée de leur maintien majore le risque d’IN. En effet, le risque est 2 fois plus élevé en cas de cathéter épicutanéocave qu’en cas de cathéter posé chirurgicalement et 3.8 fois plus élevé que celui du cathéter veineux ombilical (Lachassinne et al., 2004). Il s’agit du principal facteur de risque de bactériémie, dont l’incidence est variable en fonction des modalités d’utilisation et du type de cathéter (Habzi et Benomar, 2001).

Le recours à la ventilation assistée risque d’IN est alors multiplié par 2,4 à 5 (Lachassinne et al., 2004). L’incidence des pneumopathies nosocomiales augmente de 6 à 20% par rapport aux patients non ventilés, avec un risque cumulatif de 1% par jour d’hospitalisation (Habzi et Benomar, 2001). On note une corrélation étroite entre l’incidence des pneumopathies et la durée de l’intubation (Kacet et al., 1999 ). Le risque est majeur au-delà de 10 jours de ventilation (Lachassinne et al., 2004).

En outre, il existe des risques particulièrement liés aux services d’accueil. Ainsi en de pédiatrie, diverses études ont montré que les facteurs tels que le séjour long, les anomalies congénitales ou neuromusculaires la réintubations et déplacements en dehors du service (surinfection pulmonaire chez les enfants ventilés), les visites de la famille (surtout le risque d’infection virale) et les interventions chirurgicales semblent prédisposer à la survenue d’une infection nosocomiale (Didier, 2011). A la maternité, les endométrites (après accouchement par voie basse : 0,2 % a 0,7 %, ou après césarienne environs3 %,

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risques liés à la rupture prématurée des membranes et la durée du travail, les dystocies), les infections urinaires (3 à 4% des cas) dont le risque augmente avec le sondage vésical à demeure, l’existence de pathologies rénales maternelles, d’un diabète), les infections de site opératoire (césariennes :1 % a 11 % ou accouchées par voie basse, l’épisiotomie : 0,2 %).

1.4. Prévention des infections nosocomiales

Selon les recommandations de l’OMS, (2002) la prévention des infections nosocomiales nécessite un programme intégré, contrôlé, dont les éléments clés sont les suivants :

 limiter la transmission d’agents microbiens de patient à patient pendant les activités de soins directs par le lavage adéquat des mains et le port de gants, et en observant des pratiques et stratégies d’asepsie, d’isolement, de stérilisation, de désinfection et de blanchisserie appropriées

 maîtriser les risques infectieux liés à l’environnement

 protéger les patients par l’usage approprié d’anti infectieux à titre prophylactique, par l’alimentation et par les vaccinations

 limiter le risque d’infection endogène par la réduction des gestes invasifs et par la promotion d’un usage optimal des anti-infectieux

 surveiller les infections, identifier et maîtriser les flambées

 assurer la prévention des infections chez les membres du personnel

 renforcer les pratiques de soins et assurer la formation continue du personnel.

Ceci passe par la réduction de la transmission de personne à personne par hygiène des mains, hygiène personnelle, tenue vestimentaire, port de masques, port de gants, pratiques d’injection sans risque. Pour ce qui est de la prévention de la transmission par l’environnement, l’accent devra être mis sur le nettoyage de l’environnement hospitalier, l’utilisation d’eau chaude/surchauffée pour les

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décontaminations, la désinfection du matériel utilisé par le patient et la stérilisation.

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2.1. Cadre d’étude

Cette étude a été réalisée dans les services suivant :

 Laboratoire de Microbiologie du Centre National Hospitalier et Universitaire (CNHU-HKM) de Cotonou.

 Les services de la CUGO, la Pédiatrie et de la Néonatologie du Centre National Hospitalier et Universitaire (CNHU-HKM) de Cotonou.

 Laboratoire de Microbiologie du département de Génie de Biologie Humaine de l’Ecole Polytechnique d’Abomey Calavi (EPAC) de l’Université d’Abomey Calavi (UAC).

2.1.1. Laboratoire de Bactériologie du Centre National Hospitalier et Universitaire (CNHU-HKM) de Cotonou.

2.1.1.1. Description du laboratoire

Le laboratoire de bactériologie est constitué de 3 salles de manipulation dont :

 1 salle de réception et de traitement des échantillons,

 1 salle de préparation et de conservation des milieux,

 1 laverie pour la stérilisation du matériel, des milieux de culture préparés et la destruction du matériel usagé.

Il dispose également de deux (02) bureaux (dont l’un pour le chef de service et l’autre pour le secrétariat, d’une salle de garde et d’une salle de prélèvements génito-urinaires.

2.1.1.2. Ressources matérielles du laboratoire Le laboratoire dispose de :

- 3 étuves de marque JOUAN,

- 2 fours poupinels de marque JOUAN, - 1 centrifugeuse,

- 2 réfrigérateurs pour la conservation des réactifs (+ 8 degrés Celsius), 2. Matériel et Méthodes d’étude

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- 2 microscopes optiques de marque Olympus, - 1 microscope à fluorescence

- 1 hotte 0de bactériologie à flux laminaire de marque FLUFRANCE,

- 1 réfrigérateur pour la conservation des milieux de culture préparés (+8 degrés Celsius),

- 2 autoclaves dont l’un pour la stérilisation de la verrerie (tube, lames), et l’autre pour la préparation des milieux de culture.

2.1.1.3. Ressources humaines du laboratoire Le personnel est composé de :

- un (01) professeur titulaire de bactériologie-virologie (chef de service), - un (01) médecin hygiéniste en santé publique,

- un (01) médecin biologiste,

- cinq (05) ingénieurs des travaux de biologie humaine, - quatre (04) techniciens de laboratoire,

- un (01) secrétaire,

- deux (02) aides-soignants.

2.1.1.4. Activités déroulées dans le laboratoire

 Les activités techniques

Le laboratoire réalise les examens suivants et autres activités - l’examen cytobactériologique des urines,

- l’examen cytobactériologique des prélèvements génitaux, - l’examen cytobactériologique des pus de diverses origines,

- l’examen cytobactériologique des liquides de ponctions (LCR, liquide pleural, liquide d’ascite, autres),

- l’examen cytobactériologique des prélèvements tels que gorge, colostrum, crachats, peau, conjonctive, langue, sperme,

- le spermogramme, spermocytogramme, - la préparation des milieux de culture.

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 Activités de formation

Le laboratoire participe à l’encadrement des étudiants de diverses formations médicales par des stages pratiques.

 Activités de recherche

Le laboratoire participe à l’encadrement de plusieurs thèses de médecine, de pharmacie, de Biologie ainsi que des mémoires de master et de licence couronnés souvent par des publications.

2.1.2. Laboratoire de Microbiologie du Département de Génie de Biologie Humaine de l’Ecole Polytechnique d’Abomey Calavi.

Le Département de Génie de Biologie Humaine est l’un des premier département de l’EPAC et compte à ce jour une seule option qu’est l’option Analyses Biomédicales. L’objectif de ce département est de développer chez les diplômés l’aptitude de prélever les échantillons biologiques au regard de l’environnement socio-culturel ; de les analyser ; et de délivrer des résultats en vue du diagnosticdes pathologies. Elle compte à ce jour onze (11) enseignants dont trois de rang magistral (un Professeur Titulaire et deux Maîtres de Conférences), six (6) maîtres Assistant et deux (2) professeurs Assistants.

Nos manipulations se sont déroulées dans la salle C-1399 servant actuellement de salle de préparation de travaux pratiques de microbiologie de ce département. Elle dispose de deux (2) paillasses latérales de manipulation.

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2.2. Matériel d’étude 2.2.1. Matériel biologique

Le matériel biologique est constitué de divers prélèvements pathologiques recueillis lors de nos collectes. Il s’agit de :

 Prélèvements d’urines recueillis chez les hospitalisés de la CUGO.

 Prélèvements des clenches de porte réalisés dans les divers services pris en compte dans notre étude.

 Prélèvements de peaux sous bandage chez les enfants hospitalisés à la pédiatrie

 Prélèvements de l’orifice supérieur et des parties manuelles des couveuses de la néonatologie

 Prélèvements de l’environnement au service de Néonatologie renouvelés deux fois pendant trois (03) semaines.

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2.2.2. Milieux de culture et réactifs

Produits Rôles

Réactifs

Plasma de lapin Recherche de la staphylocoagulase chez S. aureus Sérum humain Test de filamentation des levures

Disque O.X (Oxydase) Recherche d’oxydase chez les Gram -

Réactif de Kovac’s Révélation de la production d’indole par les entérobactéries

Bleu de toludine à 1% Révélation DNase Colorants pour Gram Coloration de Gram

Eau Oxygénée Mise en évidence de la catalase chez les bactéries Galerie Api 20E Identification des entérobactéries

Milieux de Culture

Gélose EMB Identification des B- (Entérobactéries) Gélose Mac Conkey Identification des B- (Entérobactéries) Gélose Chapman isolement des cocci+ (Staphylocoques) Gélose au sang frais Identification des cocci+ (Streptocoques) Muller Hinton MH Isolement, antibiogramme, Repiquage Gélose Sabouraud Identification des levures

Gélose DNase Identification de S. aureus

Eau peptonnée exempte Pour revivifier les germes et pour la recherche de d’indole production d’indole.

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2.2.3. Equipements et consommables 2.2.3.1. Equipements

- Centrifugeuse - Réfrigérateur

- Cellule de Malassez - Microscope

- Glacière réfrigérante - Autoclave

- Burette graduée - Balance de précision - Etuve à 37°

- Poupinel - Portoir

2.2.3.2. Consommables - Gaz

- Pots ECBU et Ecouvillons - Marqueurs

- Glacière

- Lames et Lamelles - Boite de pétri

- Ensemenceurs stériles et anse de platine - Tubes à hémolyse stérile de 10ml et de 5ml - Ensemenceurs

- Pipettes Pasteur - Huile de paraffine - Bec Bunsen

- Eau distillée

- Eau physiologique

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2.3. Méthodes 2.3.1. Type d’étude

Il s’agit d’une étude transversale prospective à visé analytique effectuée au CNHU-HKM.

2.3.2. Echantillonnage

2.3.2.1. Critères d’inclusion

Sont inclus dans notre étude les patients hospitalisés au CNHU-HKM de Cotonou dans les services de CUGO et de la Pédiatrie sans distinction d’âge et de race. Pour ce qui est du service de Néonatologie compte tenu de la fragilité des nouveau-nés aucun prélèvement n’a été effectué sur eux mais nous avons écouvillonné dans le cadre de la présente étude, toutes les couveuses contenant des nouveau-nés.

2.3.2.2. Critères d’exclusion

Dans les services de CUGO seules les femmes ont été prélevées. Au service de Néonatologie, les couveuses ne contenant pas de nouveau-nés ont été exclues.

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2.3.3. Méthodologie

2.3.3.1 Obtention de consentement et administration de questionnaire Au cours de notre étude des fiches de consentement éclairé et des fiches d’enquête qui se trouvent en annexe ont été établies. Avant tout prélèvement nous adressons une fiche de consentement au patient qui la lit et la signe, puis à l’aide du questionnaire nous recueillons les informations nécessaires à notre étude.

2.3.3.2. Prélèvements

 Urines

Pour l’examen cytobactériologique des urines, la veille du prélèvement, un pot d’urine stérile est remis à la patiente avec la consigne de ne l’ouvrir que le matin lorsqu’elle sera prête pour uriner. Elle devra avant d’émettre les urines, faire une soigneuse toilette intime (pourtour urinaire, grandes et petites lèvres chez la femme). Nous leur avons recommandé de recueillir l’urine au milieu du jet.

 Clenches de portes

A l’aide d’écouvillons stériles imbibés d’eau physiologique stérile nous avons écouvillonné séparément les clenches externes et internes de chaque porte.

 Recueil des spores de champignons

Quatre (04) géloses PDA coulées dans des boites de pétri ont été laissées ouvertes dans le service de Néonatologie du CNHU-HKM pendant quatre (4) jours pour recueillir les spores de champignons.

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 Ecouvillonnage de couveuse

Les orifices supérieurs et les parties manuelles des couveuses contenant des nouveau-nés en Néonatologie ont été écouvillonnés à l’aide d’écouvillons stériles imbibés d’eau physiologique stérile.

Tous ces divers prélèvements ont été acheminés vers l’EPAC dans une glacière réfrigérante.

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2.3.3.3. Phase analytique 2.3.3.3.1. Examen direct

Avant tout examen, les échantillons d’urines ont été centrifugés à 3500 tours/min pendant 15 min. En ce qui concerne les écouvillons, ils ont été déchargés dans 1ml d’eau peptonnée avant le début des manipulations.

 Examen macroscopique

Il permet de déterminer l’aspect des prélèvements (la couleur, la turbidité, l’odeur et l’abondance du culot urinaire pour les prélèvements d’urines).

 Examen microscopique

L’examen microscopique permet de faire une étude quantitative et qualitative.

 Examen cytologique - Urines

La leucocyturie a été faite sur l’urine totale. L’urine est montée dans la chambre à numération de la cellule de Malassez puis les leucocytes sont comptés dans toute la chambre.

Le culot urinaire a été examiné entre lame et lamelle au microscope au grossissement 400 (x40). Nous avons ainsi apprécié les éléments figurés de l’urine (cellules épithéliales, trichomonas, spermatozoïdes, levures, œufs de bilharzie, cristaux, cylindres…) et de voir s’il y a présence ou non de germe.

- Ecouvillons

A l’aide des écouvillons émulsionnés dans de l’eau peptonnée un étalement entre lame et lamelle a été réalisé puis observé au microscope à l’objectif x40

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Les échantillons ont fait ensuite l’objet de la coloration de Gram avant d’être ensemencés sur les milieux de culture.

 Coloration Gram

Nous avons réalisé pour chaque écouvillon un étalement que nous avons coloré en utilisant la technique décrite par Mounier et Denis (1987). Nous avons non seulement pu différencier les bacilles des cocci mais également les bactéries Gram positif (colorées en violet) des bactéries Gram négatif (colorées en rose) au microscope à l’objectif 100 à l’immersion. Les résultats lus nous ont permis de faire le choix des milieux de culture à utiliser.

 Culture

Nous avons ensemencé les culots urinaires et les suspensions obtenues des écouvillons sur les milieux de culture adéquats.

Résultats coloration Gram Milieux ensemencés

Cocci Gram positif Gélose Chapman

Gélose MH au sang frais de mouton Gélose nutritive

Bacilles Gram négatif Gélose nutritive Gélose Mac conkey

Levures Gélose sabouraud

Après vingt-quatre (24) heures d’incubation à l’étuve à 37°C, nous avons réalisé un contrôle sur les colonies apparues sur les milieux de culture ensemencés en colorant un étalement mince réalisé à partir des colonies une coloration de Gram.

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2.3.3.3.2. Identification des bactéries

Pour l’identification, la technique utilisée découle de la morphologie des colonies complétée des résultats de la coloration de Gram et des caractères biochimiques.

 Bacilles Gram négatif

 Test d’oxydase

Nous avons recherché l’oxydase pour séparer les entérobactéries et Acinetobacter des autres bacilles Gram négatif (Pseudomonas) (Delarras, 2007).

En effet, nous avons utilisé des bandelettes imprégnées du réactif, le N,N,N,N-tétraméthyl-1,4-phénylène diamine. Ainsi, nous avons :

- déposé sur une lame, la bandelette a été humectée d’eau distillée stérile.

- prélevé une colonie sur la gélose Mac conkey à l’aide d’un ensemenceur à usage unique en plastique ou d’une pipette pasteur boutonnée.

- écrasé la colonie sur la partie réactive et - fait la lecture après 30 à 60 secondes.

Lecture du test : Si le germe possède une oxydase, la partie de la bandelette où la colonie a été écrasée prend une teinte rose-violette et le test est négatif si la partie reste incolore.

Nous avons ensuite réalisé pour :

- les colonies oxydase positive, le test de fermentation du glucose, - les colonies oxydase négative, ensemencer la galerie Api 20 E.

 Test de fermentation du glucose

Il nous a permis de différencier les entérobactéries des Acinetobacter.

- Test de fermentation positif, Entérobactéries - Test de fermentation négatif, Acinetobacter sp.

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 Ensemencement de la galerie Api 20E

Nous avons recherché vingt (20) caractères biochimiques par des réactions enzymatiques. En effet, nous avons ensemencé les 20 microcupules contenant des substrats déshydratés de la galerie avec une suspension homogène de la bactérie à étudier. La galerie a été ensuite placée à l’étuve à 37° pendant 24 heures. Les réactions produites au cours de l’incubation se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par addition de réactifs. L’utilisation du catalogue d’identification Api 20 E nous a permis de reconnaître les entérobactéries. En effet, le catalogue utilisé dans le présent travail est un logiciel qui donne l’espèce bactérienne une fois que le score obtenu à la galerie est entré.

 Cocci Gram Positif

 Recherche de la catalase

Nous avons réalisé le test de recherche de catalase pour déceler les colonies suspectes productrices de cette enzyme. Pour ce faire nous avons émulsionné une fraction de colonie à tester à l’eau oxygénée.

Lecture du test : s’il y a production d’une effervescence, alors la bactérie possède une oxydase : le test est alors positif (Micrococcaceae). Et, s’il y a absence d’effervescence, alors la bactérie n’en possède pas ; le test est dit négatif et nous sommes en présence des Streptococcaceae.

Nous avons recherché Gram positif et catalase positive, la production ou non d’une DNase et d’une staphylocoagulase et étudier sur milieu gélose au sang frais la production d’hémolysine pour celle catalase négative et sur milieu D-coccosel, l’hydrolyse de l’Esculine.

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 Recherche de la DNase

Nous avons ensemencement de la gélose DNA à permis de rechercher la production de DNase chez les souches bactériennes. Cette recherche a été effectuée de la manière suivante :

- prélever une colonie sur la gélose Chapman,

- ensemencer sur la gélose DNase en spot de 5 à 10mm de diamètre, - incuber à 37°C à l’étuve pendant 24h,

- inonder le milieu avec du bleu de toluidine 0,1%,

- aspirer le surnageant à l’aide de la pipette pasteur stérile après 15min, - lire le résultat.

Lecture du test :

- Souche DNase (+) : L’apparition d’un halo rose autour d’un spot révèle la libération des nucléotides ou des polynucléotides résultant de l’hydrolyse de l’ADN du milieu ; le reste du milieu demeure bleu.

- Souche DNase (-) : absence de halo rose autour de la culture = absence de produits d’hydrolyse de l’ADN souche DNase (–). Le contour du spot est bleu.

 Recherche de la staphylocoagulase libre

Dans un tube en verre stérile, nous avons mélangé 0,5 ml de BCC ensemencé de chacune des souches de Staphylocoque à tester à 0,2 mL de plasma lyophilisé de lapin reconstitué suivant les prescriptions du fabricant (Annexe 3). Nous avons ensuite lu les réactions chaque 30 minutes pendant les six (06) premières heures puis 24 heures après. On note :

- dans les tubes contenant des souches productrices de la coagulase libre (coagulase positive), nous avons constaté l’apparition d’un coagulum visible après 24 heures à 37°C à l’étuve et,

- dans les tubes ne contenant pas de Staphylococcus aureus, il n’y a pas de coagulum visible.

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2.3.3.3.3. Identification des champignons

Nous avons identifié les espèces de champignons sur la base :

- pour les levures : de l’aspect de leur morphologie après les examens directs : état frais et coloré et test de filamentation et sur l’aspect des colonies sur la gélose Sabouraud d’une part et,

- pour les champignons filamenteux (moisissures) : de l’aspect des colonies sur les milieux Sabouraud et PDA et, au microscope optique après le « scotch-test ».

 Test de filamentation

Dans un (01) ml de plasma humain, nous avons émulsionné une colonie ; incuber à l’étuve à 37°C pendant 24h. Nous avons observé au microscope à l’objectif x40 entre lama et lamelle une goutte de la suspension de 24 heures.

Lecture du test : Le test est positif si au microscope, on observe des filaments mycéliens. Et lorsque les levures ne présentent aucun filament, le test est négatif.

2.3.3.3.4. Identification des espèces de moisissures

 Culture

Les spores de moisissures recueillies sur milieux PDA en Néonatologie ayant germée ont été ré-isolée sur de nouvelles plaques de gélose Sabouraud et PDA suivant la technique décrite par Fanou (2013) (Figure 1) et laissées à 25°C pendant cinq (05) jours.

Figure 1 : Schéma de culture des moisissures sur les milieux Sabouraud et PDA

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 Identification

Pour l’identification des moisissures, nous nous sommes limités à l’identification du genre essentiellement microscopique.

En effet, l’identification microscopique des souches, elle a consisté à réaliser un frottis par la méthode de scotchage (Fanou, 2013). Cette méthode consiste a accolé un échantillon de moisissures prélevé à l’aide d’un ruban adhésif transparent (scotch), à la périphérie d’une colonie de moisissure âgée de 7 jours maximum sur une lame porte-objet en verre afin de mieux apprécier les structures fertiles et d’éviter un nombre excessif de spores (Figure 2). Les genres fongiques ont été alors identifiés sur la base de l’aspect microscopique de leur appareil végétatif « thalle » et la disposition des spores sont observés au microscope optique au grossissement X40 et X100.

Chez les Aspergillia, le thalle est caractérisé par une tête aspergillaire (b) alors que chez les Penicillia, il est formé de filaments mycéliens organisés en forme de « pinceau » (a). Les Fusaria sont identifiés grâce à la présence de macroconidies fusiformes et cloisonnées (c) et les Mucor grâce à leur thalle dépourvu de filaments mycéliens (d) (Figure 3).

Figure 2 : Préparation de lames destinées à l’identification microscopique

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2.3.3.3.5. Antibiogramme

L’antibiogramme est une technique de détermination in vitro de la sensibilité des bactéries aux agents antibactériens. Il permet de mesurer la capacité d’un antibiotique ou d’un autre antimicrobien à inhiber la croissance bactérienne ou à détruire la bactérie in vitro. En effet, nous avons réalisé l’antibiogramme sur la (ou les) souche(s) identifiée(s) en utilisant la méthode de diffusion en milieu solide.

 Réalisation de l’inoculum bactérien

- Mettre en suspension dans 5ml d’eau physiologique stérile une colonie bactérienne parfaitement isolée.

- Ajuster la densité de l’inoculum à celle de l’étalon 0,5 Mac Farland.

A B

C D

Figure 3 : Aspects des thalles des « Penicillia » et d’Aspergillus

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 Ensemencement par inondation

La suspension bactérienne a été déversée de manière à recouvrir entièrement la surface de la plaque de gélose Muller Hilton. Des mouvements de rotation dans les deux axes, imprimés par la main ont accéléré le recouvrement.

L’excès du liquide a été renversé.

 Application des disques d’antibiotiques

Nous avons posé les disques d’antibiotique à l’aide d’une pince fine flambée, puis nous appuyons légèrement pour qu’ils adhèrent bien à la gélose.

Ces disques ont été disposés à 15 mm minimum de la périphérie de la plaque de gélose. Nous avons attendu 30 minutes pour la pré diffusion des antibiotiques avant de porter les boites à l’étuve à 37°C pendant 18-24 heures.

 Lecture

La lecture est basée sur la mesure du diamètre des zones d’inhibition ainsi que la prise en compte de certaines images caractéristiques sur les plaques de gélose.