Introduction
L
'extension de la chloroquino-résistance chez les isolats de Plasmodium falciparum pose un problème thérapeu- tique majeur. En raison du taux d'incidence élevé du palu- disme et des ressources financières restreintes en Afrique, les traitements alternatifs chez les malades atteints de paludisme à P. falciparu m c h l o roquino-résistant doivent être à la fois efficaces, bien tolérés et relativement peu coûteux. La sulfa- doxine-pyriméthamine répond à ces exigences et est préconisée pour le traitement de pre m i è re ou deuxième intention de l'ac- cès simple à P. falciparu m dans plusieurs pays africains, notam- ment en Afrique de l'Est et centrale. Ce médicament agit sur la voie de biosynthèse de l'acide folique. Le premier compo- sant de l'association (un sulfamide, également appelé l'anti- folique) inhibe l'enzyme dihydro p t é roate synthase ; le deuxième composant (un antifolinique) inhibe la dihydrofo- late réductase. Jusqu'à maintenant, peu de cas de résistance i n v i v o à la sulfadoxine-pyriméthamine ont été signalés en Afrique (5, 13).Des études cliniques ponctuelles ont suggéré qu'une autre association entre l'antifolique et l'antifolinique, à savoir le triméthoprime-sulfaméthoxazole, prescrit souvent en anti- biothérapie, serait efficace contre P. falciparum (3, 6). Avant d'envisager d'autres essais cliniques portant sur un nombre
important de malades, il nous semblait justifié d'évaluer l'ac- tivité du triméthoprime dans le modèle in vitro de P. falcipa - ru m afin de comparer son niveau d'activité à celui de deux autres inhibiteurs de la dihydrofolate réductase, la pyrimé- thamine et le cycloguanil (métabolite actif du proguanil) et d'évaluer la possibilité d'une résistance croisée in vitro. Notre étude, qui porte sur 29 souches de P. falciparum, permet une approche préliminaire du problème.
Matériels et méthodes
U
n prélèvement sanguin sur tube ACD a été réalisé avant traitement chez les malades impaludés en France métro- politaine et envoyé au Centre national de référence de la chi- miosensibilité du paludisme. Les patients étaient des expatriés ou des touristes français et des africains, résidant en France depuis plusieurs années, en retour de l'Afrique de l'Ouest et centrale. Des souches (ou clones) de P. falciparu m, entre t e n u e s in vitro par la technique mise au point par TR A G E Ret JE N S E N(25), ont été également testées.
La variante isotopique du semi-microtest a été utilisée pour d é t e rminer la sensibilité in vitro des parasites aux antifoliniques (15, 16) en utilisant un milieu dépourvu d'acide para- a m i n obenzoïque (1). Les résultats sont exprimés en concen-
S ensibilité in vitro de Plasmodium falciparum aux antifoliniques (triméthoprime, pyriméthamine, cycloguanil) : étude sur 29 souches africaines.
Summary:In vitro sensitivity of Plasmodium falciparum to trimethoprim.
The in vitrodrug sensitivity of three dihydrofolate reductase inhibitors (pyrimethamine, cycloguanil, trimethoprim) was determined against 29 strains and isolates of Plasmodium falciparumby an iso - topic semi-microtest. Trimethoprim is less active than pyrimethamine or cycloguanil and its activity is correlated with that of two other inhibitors, suggesting cross-resistance in vitroamong the dihy - drofolate reductase inhibitors.
Resumen :Sensibilidad in vitro de Plasmodium falciparum al trimethoprim.
La sensibilidad in vitrode tres inhibidores de la dihidrofolato reductasa (pirimetamina, cicloguanil, trimethoprim) fué estudiada contra veintineuve cepas y aislados africanos de Plasmodium falcipa- rum por el semi-microtest isotópico. El trimethoprim es menos activo que la pirimetamina o el ciclo - guanil y su actividad está correlasionada con la de dos otros inhibidores, lo que sugiere la resisten - cia cruzada in vitroentre los inhibidores de la dihidrofolato reductasa.
Résumé :
La sensibilité in vitroà trois inhibiteurs de la dihydrofolate réductase (pyriméthamine, cycloguanil, triméthoprime) a été étudiée sur 29 souches et isolats africains de Plasmodium falciparum par le semi-microtest isotopique. Le triméthoprime est moins actif que la pyriméthamine ou le cycloguanil et son activité est corrélée à celle de deux autres inhibiteurs, ce qui suggère la résistance croisée in vitroparmi les inhibiteurs de la dihydrofolate réductase.
PA R A S I T O L O G I E
L. K. Basco (1) & J. Le Bras (1) (2)
(1) Centre national de référence de la chimiosensibilité du paludisme, Laboratoire de parasitologie, Hôpital Bichat-Claude Bernard,46 rue Henri Huchard,75877 Paris.
(2) Manuscrit n° 1757. Parasitologie. Accepté le 25 avril 1997.
Key-words: Malaria - Chloroquine - Pyrimethamine - Proguanil - Cycloguanil - Resistance - Dihydrofolate reductase - Africa
Mots-clés : Paludisme - Chloroquine - Pyriméthamine - Proguanil - Cycloguanil - Résistance - Dihydrofolate réductase - Afrique
tration inhibitrice 50 % (CI50), définie comme la concentration du médicament qui inhibe 50 % d'incorporation de l'hyp o - xanthine tritiée par rapport aux cupules témoins. Les CI50 sont calculées par régression non linéaire. Les seuils de sensibilité à la pyriméthamine et au cycloguanil sont, re s p e c t i v e m e n t ,
< 100 nM et < 50 nM. Les seuils de « résistance interm é d i a i re » à la pyriméthamine et au cycloguanil ont été fixés, respecti- vement, à des CI50 supérieures à 100 nM et à 50 nM dans notre étude antérieure (1). Les parasites présentant des CI50 de pyriméthamine et de cycloguanil supérieures à 2000 nM et 500 nM, respectivement, sont considérés comme « hautement résistants » à ces antifoliniques. Les coefficients de corr é l a t i o n e n t re les antifoliniques sont calculés par régression linéaire des CI50 exprimées en logarithme.
Résultats
L
'activité in vitro du triméthoprime a été comparée à celle de la pyriméthamine et du cycloguanil sur 29 isolats, souches ou clones de P. falciparum (tableau I). Dix-neuf sont sensibles à la pyriméthamine (CI50 moyenne géométrique 14,9 nM ; intervalle de confiance à 95 % = 9,5 – 23,2 nM).Quatre parasites ont une résistance intermédiaire à la pyri- méthamine (c'est-à-dire les CI50 entre 100 et 2000 nM), avec une CI50 moyenne de 307 nM (intervalle de confiance à 95 % = 76,2 – 1 239 nM). Six parasites hautement pyriméthami- no-résistants ont une valeur moyenne de CI50 de 1 1 3 7 6 n M ( i n t e rvalle de confiance à 95 % = 6 890 – 18 8 0 0 n M ). Vi n g t - trois parasites sont sensibles au cycloguanil (CI50 moyenne 9,40 nM ; intervalle de confiance à 95 % = 6,19 – 14,2 nM).
Trois isolats sur 29 ont une résistance interm é d i a i re au cyclo- guanil (c'est-à-dire des CI50 entre 50 et 500 nM ; CI50 moyen- ne géométrique 243 nM) et 3 sur 29 sont hautement cycloguanil-résistants (CI50 moyenne géométrique 1 315 nM).
Comparaison de l'activité in vitro des trois antifoliniques.
parasites* CI50 (nM)**
triméthoprime pyriméthamine cycloguanil
L-2/Côte d'Ivoire 44 700 7800 291
L-3/Côte d'Ivoire 729 32,8 15,2
L-17/Côte d'Ivoire 1840 18,0 9,0
L-18/Côte d'Ivoire 1840 18,3 10,5
L-19/Côte d'Ivoire 40 500 16800 1530
DM/Côte d'Ivoire 1070 18,8 10,9
DG/Côte d'Ivoire 86 1,7 0,9
MO/Côte d'Ivoire 5920 192 19,5
DA/Sénégal 94 25,4 16,3
DI/Sénégal 1920 19,1 17,7
BU/Sierra Leone 748 29,2 9,0
L-16/Sierra Leone 1080 25,6 8,1
AB/Burkina Faso 1780 21,7 16,9
FR/Burkina Faso 397 16,8 9,9
JA/Mali 1040 13,7 9,4
TR/Mali 76 16,5 6,1
ZE/Cameroun 21 100 2,5 1,7
MA/Cameroun 456 2,5 1,5
CA/Cameroun 437 49 11,6
BA/Cameroun 32 000 11000 266
AB/Cameroun 26 000 5430 184
FCM29/Cameroun 55 400 18100 1000
DO/Gabon 1350 12,4 6,5
LU/Zaïre 895 13,3 10,3
OU/Comores 5400 15300 1490
GL/Afrique 2300 245 12,3
MA/Afrique 11 900 1120 98,1
FO/Afrique 1070 169 15,9
DU/Afrique 4940 36,1 12,1
*Clones : FCM 29, L-3, L-16. Souches : L-2, L-17, L-18, L-19. Les autres parasites sont des isolats.
** Seuils de résistance in vitro(CI50) au triméthoprime > 2000 nM, à la pyriméthamine > 100 nM et au cycloguanil > 50 nM.
Le niveau d'activité du triméthoprime est nettement inférieur à celui des deux autres antifoliniques. Par rapport aux valeurs de CI50 de pyriméthamine, les CI50 de triméthoprime sont 2,5 à 8 400 fois plus élevées. Faute d'un nombre suff i s a n t d'isolats étudiés, le seuil de résistance au triméthoprime n'est pas bien établi. La distribution des valeurs de CI50 pourrait suggérer un seuil de 2 000 nM. En utilisant ce seuil de résis- tance, 18 sur 29 seraient sensibles au triméthoprime (CI50 moyenne 653 nM ; intervalle de confiance à 95 % = 386 – 1 110 nM) et 11 sur 29 seraient résistants (CI50 14 800 nM ; intervalle de confiance à 95 % = 7 190 – 30 500 nM). Un exa- men des valeurs de CI50 pour chaque souche montre que cer- taine souche est hautement résistante à un ou deux antifoliniques mais relativement moins résistante à un autre antifolinique. Cependant, l'analyse globale des résultats par des tests statistiques nous permet de constater une corr é l a t i o n e n t re les résistances aux trois antifoliniques. Ainsi, les réponses in vitro des parasites au triméthoprime et à la pyriméthamine (r = 0,746 ; p < 0,05) ou au cycloguanil (r = 0,713 ; p < 0,05) sont corrélées.
Discussion
L
e triméthoprime est un inhibiteur de la dihydro f o l a t e réductase, comme la pyriméthamine et le pro g u a n i l . C o n t r a i rement à ces deux derniers, le triméthoprime, associé au sulfaméthoxazole, est largement utilisé en antibiothérapie.Dans les essais cliniques réalisés en Afrique, avant l'émer- gence de la chloroquino-résistance, et au Brésil dans les années 70, le co-trimoxazole, administré à la même posologie que pour l'antibiothérapie, et la chloroquine avaient la même eff i- cacité contre P. falciparu m (7, 11, 12, 18). Les études cliniques plus récentes confirment l'efficacité du co-trimoxazole pour le traitement de l'accès simple à P. falciparu m chez les enfants africains au Malawi et en Gambie (3, 6). L'intérêt renouvelé dans le co-trimoxazole comme antipaludique est fondé essen- tiellement sur une erreur diagnostique possible liée à la confu- sion entre les présentations cliniques du paludisme et des pneumopathies chez les enfants africains (19) et, secondaire- ment, sur la re c h e rche d'un médicament efficace contre les souches chloroquino-résistantes. Sur le terrain où le diagnostic est souvent fait en fonction des symptômes et des signes cli- niques (sans confirmation du diagnostic au microscope), cer- tains cas de paludisme sont traités, à tort, par le co-trimoxazole seul (22). Les études cliniques montrent qu'il est possible de traiter les enfants atteints de paludisme, seul ou en association avec les pneumopathies, avec le co-trimoxazole. Il faut tou- tefois être prudent, étant donné des cas de re c rudescence après un traitement par co-trimoxazole seul et la lenteur de la répon- se clinique. En outre, le co-trimoxazole dont la pre m i è re com- posante agit sur la même cible moléculaire que la pyriméthamine, nous paraît déconseillé dans les zones d'en- démie de pyriméthamino-résistance, à savoir en Asie du Sud- Est et dans le bassin amazonien, du fait de la résistance cro i s é e observée in vitro.
Quelques études de l'activité antipaludique in vitro du tri- méthoprime ont été effectuées dans les années 80, après que l ' e fficacité clinique ait été démontrée dans les essais cliniques.
Bien que les études in vitro ne soient pas réalisées en parallè- le avec les études in vivo, les résultats in vitro tendent à s'ac- corder avec les résultats déjà connus sur l'efficacité clinique du triméthoprime. Les valeurs de CI50 du triméthoprime d é t e rminées antérieurement sur 7 souches de P. falciparu m
Tableau I.
L. K. Basco & J. Le Bras
Plasmodium falciparum aux antifoliniques.
varient entre 76 et 5 390 nM. Les CI50 de la souche chloro- quino-sensible et pyriméthamino-sensible F32/Tanzanie et de la souche chloroquino-résistante et pyriméthamino-résis- tante K1/Thaïlande sont, respectivement, 130 et 820 nM (21).
La CI50 de triméthoprime est 220 nM chez la souche 87/206/Gambie (6). La sensibilité de cette souche aux autres antipaludiques n'est pas déterminée. Les CI50 de 76 nM et 5 390 nM sont observées chez la souche pyriméthamino- s e nsible Sierra Leone I/CDC et la souche pyriméthamino- résistante Indochine III/CDC, respectivement (17). Les CI50 du triméthoprime de 29 parasites que nous avons étudiés sont généralement dans la fourchette des valeurs rapportées par les autres investigateurs. Le niveau de sensibilité de certains isolats africains (CI50 < 1 µM) évalués dans notre étude est compatible avec l'efficacité clinique modérée du trimé- thoprime. Nous soulignons toutefois quelques limites de l ' i nterprétation en clinique des résultats obtenus par le test de chimiosensibilité in vitro ; la pharmacocinétique, la pharma- codynamie et la prémunition chez les africains ne sont pas prises en considération par le test in vitro.
Nos données et celles des autres (17, 20) montrent que le cycloguanil est plus actif in vitro et in vivo chez la souris que la pyriméthamine et que cette dernière est plus active que le triméthoprime. Le cycloguanil est en général deux fois plus actif in vitro que la pyriméthamine (1). Le niveau de sensibi- lité des isolats sensibles au cycloguanil et/ou à la pyrimétha- mine est inférieur à 100 nM, ce qui s'approche des niveaux de sensibilité des autres antipaludiques des classes chimiques amino-4-quinoléines et amino-alcools.
Le seuil de résistance à la pyriméthamine n'est pas fixé en fonction des réponses cliniques, à la diff é rence du seuil de résistance au cycloguanil, qui est corrélé à des échecs pro- phylactiques (1). Le risque de résistance in vivo est réel chez les voyageurs non immuns sous chimioprophylaxie qui sont infectés par des parasites présentant à la fois une CI50 de cycloguanil > 50 nM et une CI50 de chloroquine > 100 nM (23). Faute de données cliniques, le risque de résistance i n vivo à la pyriméthamine et au triméthoprim ne peut pas être apprécié. Actuellement en France, très peu de cas de paludis- me sont traités par la sulfadoxine-pyriméthamine et nous ne disposons pas de données relatives aux échecs thérapeutiques de cette association. De même, le sulfaméthoxazole-trimé- thoprime n'est utilisé en thérapeutique que dans un cadre expérimental. Le sulfaméthoxazole-triméthoprime n'est pas préconisé pour traiter le paludisme, même dans les zones de pyriméthamino-sensibilité. Les raisons sont liées à la dispo- nibilité de la sulfadoxine-pyriméthamine qui a fait preuve de son efficacité à une dose unique contre les isolats sensibles (le sulfaméthoxazole-triméthoprime doit être pris deux fois par jour pendant cinq jours), au moindre coût de la sulfadoxine- pyriméthamine et à la crainte de sélectionner des souches bac- tériennes résistantes par l'usage massif de l'association. Pour cette raison, nous ne disposons pas de données cliniques qui peuvent nous aider à établir le seuil de résistance au trimé- thoprime. Outre ces inconvénients du sulfaméthoxazole-tri- méthoprime, l'activité antipaludique du triméthoprime et de la pyriméthamine ou du cycloguanil est corrélée in vitro, comme démontré sur quelques souches par Siddiqui et al.
(24) et par Petersen (21) et confirmé par notre étude sur un nombre plus important d'isolats. Cette corrélation se tradui- rait par une résistance croisée in vitro, et vraisemblablement in vivo, parmi ces trois antifoliniques. Le niveau de risque de résistances croisées entre le triméthoprime et la pyriméthamine et entre le triméthoprime et le cycloguanil est estimé par la
valeur du carré du coefficient de corrélation (r2), soit 0,556 et 0,508, respectivement. Ces niveaux de risque ne sont pas aussi élevés qu'entre la pyriméthamine et le cycloguanil (1).
L'observation que l'activité antipaludique du triméthoprime est nettement inférieure à celle de la pyriméthamine et du cycloguanil est en accord avec l'affinité de ces composés avec l'enzyme dihydrofolate réductase. Les études enzymatiques sur la dihydrofolate réductase de P. knowlesi et de P. berghei mettent en évidence la haute affinité du cycloguanil pour l'en- zyme par rapport à la pyriméthamine, qui, à son tour, se lie à l'enzyme avec plus d'affinité que le triméthoprime (cyclo- guanil > pyriméthamine > triméthoprime) (4, 8, 10, 14). Cet o rd re d'affinité correspond parfaitement à l'ord re d'activité i n vitro et in vivo chez la souris. On peut d'ailleurs noter que le triméthoprime est avant tout, un anti-bactérien, et la pyri- méthamine (et le cycloguanil), un antiprotozoaire, évoquant la divergence de la DHFR chez les bactéries et chez les pro- tozoaires. La différence d'activité antipaludique de ces trois antifoliniques n'est pas expliquée par la diff é rence éventuelle du taux d'accumulation dans les parasites car, contrairement au méthotrexate (inhibiteur de la dihydrofolate réductase essentiellement réservé au traitement des cancers) qui ne pénètre que dans les cellules possédant un système de trans- p o rt actif (9), la pyriméthamine, le cycloguanil et le trimé- thoprime passent librement dans n'importe quelle cellule (2).
En conclusion, nos données montrent l'activité in vitro d u triméthoprime sur un certain nombre d'isolats africains.
Cependant, par rapport à la pyriméthamine et au cyclogua- nil, son activité in vitro modérée, sa faible affinité pour la dihydrofolate réductase, sa lenteur d'action in vivo, la durée du traitement, la corrélation des réponses in vitro des tro i s antifoliniques et le risque d'une sélection concomitante de souches bactériennes résistantes lors d'un usage massif du médicament sont des facteurs défavorables pour le développement du sulfaméthoxazole-triméthoprime comme antipaludique.
Remerciements
Nous remercions tous nos correspondants pour l'envoi des prélèvements san- guins des malades impaludés.
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