Etude des dommages radio-induits par les protons et les rayons X ultra-mous dans l’ADN à l’état solide et en phase aqueuse

UNIVERSITÉ DE JIJEL

FACULTÉ DES SCIENCES EXACTES ET INFORMATIQUE DEPARTEMENT DE PHYSIQUE

THÈSE

Présentée pour l’obtention du diplôme de DOCTORAT EN SCIENCES

Spécialité : Physique Option : Physique Nucléaire

Par

Mounir SOUICI

Thème

Etude des dommages radio-induits par les protons et les rayons X ultra-mous dans l’ADN à l’état solide et en phase aqueuse

Soutenue le : 26 / 06 / 2016

Devant le jury :

Président Noureddine BOUTAOUI Prof. Université de Jijel Rapporteur Abdelfettah BELAFRITES Prof. Université de Jijel

Co-rapporteur Michel FROMM Prof. Université de Bourgogne Franche-Comté Examinateurs Ahmed BOUCENNA Prof. Université de Sétif

Abdeslam SEGHOUR D.R CRNA Alger

Nabil OUNOUGHI M.C.A Université de Jijel

Les travaux de recherche de cette thèse ont été réalisés au Laboratoire Chrono- Environnement (UMR, CNRS 6249) de l’Université de Bourgogne Franche-Comté dans le cadre du Programme National Exceptionnel (P.N.E).

Je tiens tout d'abord à remercier mon directeur de thèse, M. Abdelfettah BELAFRITES professeur à l'Université de Jijel. Je lui suis très reconnaissant pour la confiance qu’il m’a accordée, ses encouragements, et son aide pour mener à bien ce travail.

Je tiens à exprimer ma plus profonde gratitude et mes remerciements les plus respectueux à mon co-directeur de thèse M. Michel FROMM professeur à l’Université de Bourgogne Franche-Comté pour m'avoir chaleureusement accueilli dans son laboratoire.

Encore un grand merci pour ses précieux conseils et compétences scientifiques dont j’ai bénéficié tout au long de la réalisation de cette thèse. Un remerciement tout particulier pour ses qualités humaines, et qu’il trouve ici ma profonde reconnaissance.

Je tiens à remercier tout particulièrement M. Noureddine BOUTAOUI professeur à l’université de Jijel, pour m’avoir fait l’honneur de présider le jury de cette thèse.

Je suis infiniment reconnaissant à M. Ahmed BOUCENNA professeur à l’université de Setif, M. Abdeslam SEGHOUR docteur au CNRA Alger et M. Nabil OUNOUGHI maître de conférences à l’Université de Jijel, d’avoir accepté de participer au jury et d’examiner ce travail.

Je souhaite remercier très chaleureusement le docteur Omar BOULANOIR de m’avoir transmis ses connaissances théoriques et expérimentales.

Je tiens également à remercier tous les membres du laboratoire Chrono-

Environnement qui ont contribué de près ou de loin à l’élaboration de ce travail, tout

particulièrement, M Talat Tarik KHALIL, M. Cristophe MAVON, et M. Jean-Emmanuel

GROETZ.

laboratoire pour la réalisation des irradiations d’ADN avec les protons.

Table des matières

Introduction générale………. 1

Chapitre I : Concepts théoriques et fondamentaux I.1- Introduction ……… 5

I.2- Interaction des rayonnements ionisants avec la matière………. 5

I.2.1- Interaction des photons avec la matière………... 5

I.2.1.1- Effet photoélectrique………... 5

I.2.1.2- Effet Compton………... 6

I.2.1.3- Production de paires électron-positron………... 7

I.2.1.4- Diffusion Thomson-Rayleigh………... 8

I.2.1.5- Atténuation des photons par la matière………... 8

I.2.2- Interaction des particules chargées avec la matière………. 10

I.2.2.1- Mécanisme de l’interaction des particules chargées avec la matière………… 10

I.2.2.2- Le pouvoir d’arrêt………... 10

I.2.2.3- Transfert d’énergie linéique (TEL)……….. 11

I.2.2.4- Interaction des électrons avec la matière……….. 11

I.2.2.5- Pic de Bragg ………. 12

I.3- Dosimétrie ……….. 13

I.3.1- Définition de la dosimétrie ……….. 13

I.3.2- Grandeurs physiques……… 13

I.3.2.1- Fluence de particule……….. 13

I.3.2.2- Débit de fluence……… 13

I.3.2.3- Fluence énergétique………..……….... 14

I.3.2.4- Débit de fluence énergétique………... 14

I.3.3- Grandeurs dosimétriques……….. 14

I.3.3.1- Dose absorbée………... 14

I.3.3.2- Débit de dose………... 15

I.3.4- Notion de dosimétrie en radiobiologie………... 15

I.3.4.1- Dose équivalente………... 15

I.3.4.2- Dose efficace………... 17

I.4- Effet moléculaire de l’interaction des rayonnements ionisants…………...……... 18

I.4.1- Mécanisme de la radiolyse de l’eau………... 19

I.4.1.1- La phase physique………... 19

I.4.1.2- La phase physico-chimique………... 19

I.4.1.3- La phase chimique………...………. 20

I.4.2- Structure de l’ADN……….. 21

I.5- Types de dommages radio-induits dans l’ADN……….. 24

I.6- Technique de relaxation de plasmide……….. 25

Chapitre II : Dosimétrie des solutions irradiées avec les rayons X ultra-mous II.1- Dosimétrie de Fricke……….. 28

II.1.1- Généralités……….. 28

II.1.2- Description de la dosimétrie de Fricke………... 28

II.1.3- Préparation des solutions………..………... 28

II.1.4- Mécanisme de la réaction………...………...………. 29

II.1.5- Mesure de la dose absorbée………...………... 30

II.2- Dispositif expérimental………... 31

II.2.1- Source d’irradiation……… 31

II.2.2- Conditions d’irradiation………... 33

II.3- Atténuation des photons X dans l’eau - Effet de l’agitation………... 34

II.4- Dosimétrie des solutions irradiées avec des rayons X ultra-mous……...………. 35

II.5- Effet de l’évaporation sur la valeur de la dose absorbée………... 36

Chapitre III : Irradiation d’ADN plasmidique et complexes ADN-acide aminé en solution aqueuse par les rayons X ultra-mous III.1- Introduction………...………... 38

III.2- Conditions d’irradiation………...……… 40

III.3- Préparations des solutions d’ADN………...……… 40

III.4- Protocole expérimental………... 41

III.5- Détermination des cassures de brins d’ADN………...…… 42

III.6- Considérations préliminaires……… 42

III.6.1- Résultats et interprétations………...………. 42

III.6.1.1- Relation : Diffusion des radicaux d’hydroxyle – Taux de cassure de brins d’ADN plasmidique………...………...………... 42

III.6.1.2- Effet de l’agitation sur le taux de cassure des brins d’ADN plasmidique... 45

III.7- Etude de l’effet de capture du Tris sur le taux des dommages radio-induits dans l’ADN plasmidique………...……….…………... 47

III.7.1- Quantification par gel d’électrophorèse ………... 47

III.7.2- Rendements radiolytiques ………...………. 49

III.7.3- Cassures simples et doubles brins–Rapport (CSB/CDB)………... 52

III.8- Effet de la température sur le taux des dommages radio-induits dans l’ADN plasimidique... 56

III.9- Séparation des effets directs et indirects………...……... 57

III.10- Etude de l’effet secondaire d’arginine sur l’ADN in-vitro………. 59

III.10.1- Expérience………... 61

III.10.2- Résultats et interprétations……….. 62

III.11- Conclusion……….………... 66

Chapitre IV : Irradiation de couches nanométriques d’ADN plasmidique par des protons dans la région du pic de Bragg IV.1- Introduction……….. 68

IV.2- Mode opératoire………... 69

IV.2.1- Préparation des cibles et irradiation par les protons……….…... 69

IV.2.2- Détermination des taux de cassure et des rendements radiolytiques………… 74

IV.2.3- Détermination des doses d’irradiation……….. 75

IV.3- Résultats………... 76

IV.3.1- Cassures simple brin et double brin……….. 76

IV.3.2- Sections efficaces……….. 79

IV.3.3- Rendements radiolytiques pour une cassure simple : G _CSB ……….. 82

IV.4- Evaluation des rendements de cassures simples et doubles dans le domaine du pic de Bragg………...………...………... 83

IV.5- Discussion……… 85

IV.6- Conclusion……….... 89

Conclusion et perspectives………... 91

Bibliographie………...………... 95

0

Introduction générale

1

De nos jours, les processus d’interactions des rayonnements ionisants avec les tissus vivants, sont l’une des préoccupations majeures dans la compréhension et l’évaluation des effets radio-induits. Ce domaine de recherche est pluridisciplinaire, il fait intervenir à la fois : la radiobiologie qui s’intéresse à l’étude des effets des rayonnements ionisants sur la matière biologique (Escanye et Durand 2010), la radiothérapie, avec les méthodes de traitement locorégional des cancers, qui consiste à utiliser les rayonnements pour détruire les cellules cancéreuses en bloquant leur capacité à se multiplier (Escanye et Durand 2010), la radiologie qui désigne dans le domaine médical l’ensemble des modalités diagnostiques et thérapeutique utilisant les rayons X (Jimonet et Métivier 2007), et la radioprotection qui englobe l’ensemble des règles, des procédures et des moyens destinés à la préventions et à la surveillance visant à empêcher ou à réduire les effets nocifs des rayonnements ionisants afin de protéger les populations qui y sont exposés, y compris l’environnement (Jimonet et Métivier 2007).

Les organismes vivants sont essentiellement constitués de molécules d’eau (65% dans l’organisme d’un adulte), par ailleurs, au cœur des cellules biologiques l’ADN joue un rôle prépondérant. L’ADN support de l’information génétique est une cible sensible des rayonnements ionisants. L’action des rayonnements se traduit par des dommages induits qui sont engendrés soit par effets directs, soit par des effets indirects via les produits de la radiolyse de l’eau. D’une manière générale les dommages dépendent de l’énergie absorbée par le milieu et de la nature du rayonnement ionisant. Pour cette raison on fait intervenir des grandeurs dosimétriques qui ont pour but de mesurer ou d’estimer la quantité d’énergie déposée dans un milieu. C’est la dose absorbée qui permet d’évaluer ces effets, elle détermine quantitativement l’énergie du rayonnement déposée par unité de masse de la matière en question.

Dans les recherches en radiobiologie on utilise généralement l’ADN plasmidique issu

de la célèbre bactérie E.coli. Cet ADN est exposé aux rayonnements ionisants en solution

aqueuse « phase liquide » ou sous la forme de couches sèches (état solide), voire en milieu

humide. En solution, les effets directs et indirects du rayonnement se manifestent d’une façon

compétitive, cela dépend de la composition chimique de la solution dans laquelle l’ADN est

dissous. Ces effets compétitifs peuvent être contrôlés et évalués expérimentalement en

modifiant la composition chimique de la solution, notamment en utilisant des capteurs de

radicaux libres (Tris et arginine dans notre cas) ou d’espèces oxygénées réactives. L’espèce

oxygénée réactive la plus agressive vis-à-vis de l’ADN et des autres molécules d’intérêt

biologique est sans contestation le radical hydroxyle (OH ^• ). Ses effets peuvent être observés

2

aussi bien suite à l’irradiation d’ADN plasmidique avec des photons (rayons X et gamma) qu’avec des particules chargées (alphas, protons, …) ou neutres (neutrons).

Il existe un grand intérêt pour les applications des rayons X ultra-mous (énergie inférieure à 5 keV) à l'étude des effets biologiques des irradiations, cela en raison de leur dépôt d’énergie très local à l’échelle cellulaire, voire moléculaire. D’un autre côté, l’efficacité de la protonthérapie dans le traitement des cancers, soulève la question des mécanismes mis en jeu dans l’endommagement de l’ADN par ces particules et de l’obtention de grandeurs opérationnelles (sections efficaces, …) pour son amélioration. Le travail effectué au cours de cette thèse s’est articulé autour de deux axes principaux: l’irradiation de l’ADN en solution aqueuse par les rayons X ultra-mous (1,5 keV, Al Kα) et l’irradiation de l’ADN sec par les protons, dont l’objectif est d’étudier les dommages radio-induit (taux de cassures simples et doubles, rendements radiolytiques, sections efficaces…) suite aux irradiations.

De nombreux travaux sont déjà réalisés utilisant les rayons X afin d’irradier des échantillons d’ADN en solution. Cependant dans le cas des rayons X ultra-mous (1,5 keV, Al Kα) générés par un tube de rayon X à cathode froide, peu de recherches utilisant les rayons X dans cette gamme d’énergie existent en radiobiologie. Il existe en effet un verrou technique lié essentiellement à la très faible profondeur de pénétration des rayons X ultra mous dans la matière. L’originalité de l’étude présentée dans la première partie, est que l’irradiation est effectuée à la température ambiante et avec un volume important ce qui permet d’améliorer la statistique tout en utilisant un milieu cible assez proche du milieu biologique réel de l’ADN dans la cellule.

Les protons sont utilisés comme un outil de traitement des tumeurs cancéreuses, cette méthode est basé sur l’endommagement de l’ADN de la cellule cancéreuse, ce principe exploite ainsi une propriété spécifique des protons lors de leur transfert d’énergie, en particulier à la fin de leurs parcours dans la matière, connue sous le nom de pic de Bragg.

L’exposition d’ADN sec à des protons dans la région du pic de Bragg fait l’objet de la deuxième partie. Il n’y a pas à l’heure actuelle de données sur les taux de cassures simples et doubles ainsi que sur les rendements radiolytiques dans la région du pic de Bragg.

Ainsi, cette thèse s’inscrit dans la recherche en radiobiologie. Le manuscrit est

structuré en quatre chapitres qui s’organisent de la façon suivante :

3

Dans le premier chapitre, sont présentés les différentes notions fondamentales des modes d’interaction des rayonnements ionisants avec la matière, et les notions dosimétriques ainsi que les principaux mécanismes de la radiolyse de l’eau afin d’expliquer les effets directs et indirects des rayonnements sur l’ADN, pour cela il est nécessaire de présenter la structure et les diveres lésions de l’ADN.

Dans le deuxième chapitre la description de la dosimétrie de Fricke, qui demeure le seul moyen de mesure de la dose absorbée dans les solutions aqueuses est présentée en détails. On présente également le dispositif expérimental utilisé pour l’irradiation des solutions de Fricke, et ensuite des solutions d’ADN. Nous présentons également les conditions d’irradiations, à savoir les paramètres liés à l’utilisation du générateur des rayons X ultra-mous (1,5 keV, Al Kα) et les conditions d’agitation des solutions irradiées. Le débit de dose est déterminé à partir de la dose absorbée mesurée de façon absolue. C’est une grandeur fondamentale à partir de laquelle sont exprimées les grandeurs quantitatives qui décrivent les dégâts à l’ADN en solution.

Le troisième chapitre sera consacré à l’ensemble de l’étude de l’irradiation d’ADN plasmidique dans l’eau par les rayons X ultra- mous (1,5 keV, Al Kα). Dans ce chapitre nous présenterons le protocole expérimental d’irradiation, la méthode de détermination et de quantification des cassures simples et doubles brins (CSB et CDB) par gel d’électrophorèse, les rendements radiolytiques qui seront exprimés en fonction de la concentration des solutions en ADN et de l’influence des conditions du milieu environnant de l’ADN. L’influence de la concentration de la solution de Tris et d’arginine, ces derniers étant les deux capteurs des radicaux libres utilisés dans notre étude, sera étudiée. L’effet de l’agitation spécifique des solutions d’ADN, l’effet de la température, et la proportion des effets directs et indirects seront et présentés dans ce chapitre. Les résultats obtenus lors de cette étude sont ensuite discutés et interprétés.

Le quatrième chapitre présentera la mise en œuvre d’une nouvelle technique des dépôts de couches nanométriques d’ADN plasmidique. Ces derniers sont ensuite irradiés par des protons dans la gamme d’énergie du pic de Bragg. Pour réaliser cette étude, l’irradiation est effectuée dans la gamme d’énergies 90 – 3000 keV, afin de déterminer ensuite les taux de cassures simples et doubles brins (CSB et CDB) par analyse en gel d’électrophorèse de l’ADN. Pour cela, l’ADN est re-dissous suite aux irradiations à fluences ou doses variables.

Cela conduit à la détermination des sections efficaces et des rendements radiolytiques dans le

4

domaine du pic de Bragg. L’évaluation des différents résultats obtenus est suivie de l’analyse des résultats et d’une discussion.

La conclusion générale et les perspectives clôtureront cette étude afin de mettre en

lumière l’apport de ce travail au domaine de la radiobiologie.

4

Chapitre I

Concepts théoriques et

fondamentaux

5 I.1- Introduction

En radiobiologie il est indispensable de de connaître précisément les relations qui existent entre les paramètres physiques et les mécanismes de l’interaction des rayonnements ionisants dans le milieu biologique ceci afin de décrire au mieux les effets biologiques des rayonnements. Ces effets sont liés principalement à deux molécules, la molécule d’eau qui forme plus de 70% du corps humain, et la macromolécule d’ADN en raison de son rôle important dans toutes les cellules biologiques, c’est la substance porteuse de l’information génétique. La dosimétrie des rayonnements permet de quantifier l’énergie déposée dans la matière et en fonction des grandeurs dosimétriques mesurées on évalue quantitativement et qualitativement les modifications induites. La dose dépend essentiellement de l’énergie et du type du rayonnement, et des propriétés et de quantité de la matière irradiée pendant le temps d’irradiation.

Dans ce chapitre, nous décrivons les principaux concepts de l’interaction de la matière avec les photons et les particules chargées, leur processus d’interaction et les notions dosimétriques, ainsi que les structures chimiques de l’eau et de l’ADN irradiés.

I.2- Interaction des rayonnements ionisants avec la matière I.2.1- Interaction des photons avec la matière

Lors de l’interaction des photons X et γ avec la matière on distingue trois mécanismes d’interaction inélastiques: l’effet photoélectrique, l’effet Compton et la production de paire électron-positron (Le Sech et Ngô 2010), ainsi qu’un élastique ; la diffusion de Rayleigh- Thomson.

I.2.1.1- Effet photoélectrique

Dans ce cas le photon incident est complètement absorbé et disparaît par transfert de la totalité de son énergie lors de son absorption par la substance soumise à l’action du rayonnement. Si l’énergie du photon hν est supérieure à l’énergie liaison E _l de l’électron, comme le montre la figure (I.1) ce dernier est éjecté de son atome avec une énergie cinétique E _c égale à :

⁄ (I.1)

6

m _e est v sont respectivement la masse et la vitesse de l’électron, et h est la constante de Planck.

Figure (I.1) : Processus de l’effet photoélectrique (Le Sech et Ngô 2010).

L’atome se retrouve sous forme ionisée, il s’en suit une réorganisation du cortège électronique de l’atome pour combler la lacune sur la couche de l’électron expulsé, en produisant un photon de fluorescence ou l’expulsion d’un électron d’une couche périphérique : c’est l’effet Auger.

I.2.1.2- Effet Compton

Contrairement à l’effet photoélectrique, l’effet Compton consiste à une transmission partielle de l’énergie du photon incident qui interagit par dissuasion élastique avec un électron atomique supposé libre. Il perd alors une partie de son énergie initiale hν et diffuse avec une énergie hν ^’ et sa trajectoire forme un angle θ par rapport à la direction d’incidence, cette perte en énergie est transmise à cet électron qui peut, sous certaines conditions, être expulsé du cortège électronique avec un angle υ. Cet électron est appelé électron de recul ou électron Compton (Figure I.2). La différence entre les longueurs d’onde du photon incident λ (avant la collision) et le photon diffusé λ ^’ (après la collision) est donnée par la relation de Compton :

(I.2)

c la célérité de la lumière.

7

Figure (I.2) : Processus de l’effet Compton (Le Sech et Ngô 2010).

I.2.1.3- Production de paires électron-positron

La production de paires est un processus qui se produit lorsque le photon incident pénètre dans le champ électrique du noyau. Sur la base de la conservation de l’énergie totale, ce processus impose que l’énergie du photon incident hν soit supérieure à 2 m _e c ² = 1,022 MeV. Ce photon disparaît alors en se convertissant en un électron et un positron, c’est la matérialisation d’un photon (Figure I.3). Le photon est électriquement neutre, et la conservation de l’énergie est évidemment vérifiée. On notera que le positron est un anti- électron.

Figure (I.3) : Processus de la production de paire électron-positron (Le Sech et Ngô 2010).

θ

υ hν ^’

hν

e recul

8 I.2.1.4- Diffusion Thomson-Rayleigh

La diffusion Thomson est la diffusion élastique des photons sur des électrons libres (non lié à un atome), elle n’apparaît que pour des photons de faibles énergies (Booker 2009).

Durant cette interaction l’électron réémet un photon de même énergie que le photon incident.

Il n’a donc aucune absorption par le milieu (Ounoughi 2013). La direction de propagation de l'onde électromagnétique associée au photon change sans variation de l'énergie. Cette diffusion est similaire à la diffusion Rayleigh à la différence près que cette dernière s'effectue sur des électrons liés à des atomes.

Dans le deuxième et le troisième chapitre de notre étude, l’irradiation de l’ADN en solution s’effectue avec des rayons X ultra-mous (1,5 keV, Al Kα). A cette énergie l’effet photoélectrique et la diffusion Compton sont privilégiés, la production de paire électron- positron est absente. L’effet majoritaire est l’effet photoélectrique.

I.2.1.5- Atténuation des photons par la matière

L’atténuation d’un faisceau de photons monochromatiques étroit dans un milieu provient de l’absorption des photons selon les processus cités plus haut . La probabilité totale de subir une interaction avec la matière pour un photon incident est déterminée par le coefficient d’atténuation linéique (Fulford 2000). Cette atténuation suit une loi exponentielle décroissante (Le Sech et Ngô 2010) :

(I.3) I 0 : l’intensité du photon incident

I : l’intensité du photon transmis

μ: le coefficient d’atténuation linéique exprimé en cm ^-1 x : l’épaisseur du milieu traversé exprimé en cm

En raison de l’influence de la nature du milieu absorbant sur l’atténuation des photons, on définit ainsi μ m le coefficient d’atténuation massique exprimé en cm ² g ^-1 (Le Sech et Ngô 2010) :

⁄

(I.4)

9

ρ : la masse volumique du matériau exprimée en g cm ^-3

σ tot : la section efficace totale d’interaction des photons exprimée en barn : 1 barn = 10 ^-24 cm ² N : le nombre d’Avogadro

M : la masse atomique de la matière traversée Et on peut écrire alors (NIST) :

(I.5) x _m : l’épaisseur massique exprimé en g cm ^-2

avec :

(I.6)

En fonction de la nature du milieu et de l’énergie des photons incidents, les trois effets se produisent avec des probabilités différentes On représente sur la figure (I.4) la contribution des trois processus de la photoabsorption par la matière.

Figure (I.4) : Evolution du coefficient d’atténuation linéique en fonction de l’énergie des photons pour les trois effets considérés (Le Sech et Ngô 2010).

La section efficace totale est égale à la somme des sections efficaces partielles.

avec :

10 σ : la section efficace de l’effet photoélectrique κ : la section efficace de l’effet Compton τ : la section efficace de la production de paires

L’effet photoélectrique est significatif dans la zone des faibles énergies (en dessous de 100 keV), et l’effet Compton domine pour les énergies hν inférieures à 1,022 MeV c’est-à- dire dans la zone des énergies intermédiaires, avant cette énergie la production de paires est nulle, Dans la zone des énergies élevées (hν > 1,022 MeV) l’effet de la production de paires est dominant. Ceci implique que pour des énergies de 1,5 keV le processus le plus significatif est l’effet photoélectrique.

I.2.2- Interaction des particules chargées avec la matière

I.2.2.1- Mécanisme de l’interaction des particules chargées avec la matière

Les particules chargées (lourdes ; essentiellement les noyaux : ¹ H ⁺ : proton, ² H ⁺ : deuton, les particules α, et les ions positifs ou légères comme l’électron) (Foos 2009), perdent leur énergie en traversant la matière par collision avec les électrons ou avec le noyau atomique.

I.2.2.2- Le pouvoir d’arrêt

La perte d’énergie dE par unité de distance parcourue dx de la particule incidente dans la matière représente le pouvoir d’arrêt S (en anglais : Linear Stopping Power) est donnée par :

⁄ (I.7)

S peut par exemple être exprimé en keV/µm, il est définit comme étant la somme de

trois termes (Le Sech et Ngô 2010), le pouvoir d’arrêt de l’interaction avec les électrons, avec

le noyau et le pouvoir d’arrêt radiatif. En fonction de l’énergie des ions incidents l’un de ses

termes est dominant, si l’énergie est de l’ordre du MeV, l’interaction est due principalement

aux collisions inélastiques avec les électrons du milieu traversé, et le terme de l’interaction

avec les noyaux atomiques du milieu se produit essentiellement pour des collisions élastiques

à faibles énergies (de l’ordre du keV).

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L’expression du pouvoir d’arrêt S est donnée par la formule de Bethe (Foos 2009) :

(I.8) où :

z : la charge de la particule incidente v : la vitesse de la particule incidente m 0 : la masse de l’électron au repos e : la charge de l’électron

n : le nombre d’atomes par unité de volume du matériau absorbant Z : le numéro atomique du matériau absorbant

I : la valeur moyenne du potentiel de l’ionisation et de l’excitation du milieu (absorbant) I.2.2.3- Transfert d’énergie linéique (TLE)

Pour quantifier l'effet du rayonnement ionisant sur la matière a été introduite la notion du transfert d'énergie linéique ou TEL. Il est définit comme étant la quantité qui décrit l'énergie transférée par une particule ionisante traversant la matière, par unité de distance (-dE/dx). Il peut être exprimé en keV par micromètre (keV.um ^-1 ) (Gillard 2005).

Le TEL dépend principalement de l’énergie de la particule et de la nature de la substance traversée, ainsi le TEL apparaît d’une importance fondamentale en physique des rayonnements et dans la détermination des effets biologiques en particulier les effets liés aux irradiations des tissus vivants (Jimonet et Métivier 2007). Ainsi on distingue les rayonnements à TEL élevé (les particules α, les ions lourds et les neutrons,) et les rayonnements de faible TEL (électrons et les X et γ) (Pouthier 2006; Gillard 2005).

I.2.2.4- Interaction des électrons avec la matière

Quel que soit l’énergie des électrons incidents traversant la matière, ils perdent leur

énergie et produisent deux mécanismes distincts (Foos 2009; Jimonet et Métivier 2007).

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À faibles énergies, l’interaction des électrons avec la matière se traduit par un ralentissement par des collisions, conduisant à des excitations ou à des ionisations. À haute énergie le ralentissement s’effectue par émissions électromagnétique sous la forme d’un rayonnement X appelé rayonnement de freinage (ou Bremsstrahlung), lorsque ces électrons passent au voisinage des noyaux des atomes de la substance irradiée.

Lors de l’irradiation des échantillons d’ADN plasmidique en solution par les rayons X ultra-mous (1,5 keV, Al Kα), les électrons secondaires générés auront des énergies inferieures à 1,5 keV, et donc leurs modes d’interaction seront limités, avec très peu de rayonnement de freinage. Des études expérimentales sur le spectre d’électrons secondaires générés à la surface de l’or (Brun et al. 2009) et sur la surface de tantale (Alizadeh et al. 2011) irradiés par des rayons X (1,5 keV, Al Kα), ont montrés respectivement que 96% et 95% des électrons secondaires ont des énergies inferieurs à 30 eV.

I.2.2.5- Pic de Bragg

Une propriété spécifique des particules chargées lourdes est que le TEL est maximum à la fin de leurs parcours. La courbe passe par un pic très marqué qui se produit juste avant que les particules ne s’arrêtent, il est appelé le pic de Bragg (Figure I.5).

La protonthérapie est une technique de radiothérapie de pointe qui utilise les protons qui grâce à l’existence du pic de Bragg offrent une grande exactitude dans le traitement de tumeurs en profondeur.

Figure (I.5): Illustration graphique de la dose en fonction de la profondeur où l’on peut voir

le pic de Bragg dans le cas de traitement de l’œil par proton thérapie (Gillard 2005 et les

références trouvées ici).

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À cet effet nous allons étudier les effets des protons dans l’ADN dans la région du pic de Bragg (quatrième chapitre) en irradiant des couches nanométriques d’ADN avec des protons dont l’énergie varie entre 90 et 3000 keV.

I.3- Dosimétrie

I.3.1- Définition de la dosimétrie

L’utilisation des rayonnements ionisants dans de nombreuses disciplines notamment en radiobiologie, en radioprotection et en radiothérapie, implique de définir un certain nombre de grandeurs et paramètres physiques qui permettent de les caractériser en un point et sous des conditions bien déterminées. Lors de l’irradiation d’un milieu qu’il soit vivant ou non, la dosimétrie est la technique qui permet de déterminer la valeur et la répartition de la dose absorbée ainsi que son estimation. La dose dépend essentiellement de la nature et de l’énergie du rayonnement, de la nature et de la masse de la substance irradiée, de la section (géométrie) du faisceau, ainsi que de la distance entre la source d’irradiation et la surface du milieu (Escanye et Durand 2010).

I.3.2- Grandeurs physiques I.3.2.1- Fluence de particules

La fluence de particules est une grandeur considérée comme unité fondamentale de la dosimétrie.

Lorsqu’un faisceau de particules incidentes dN traverse une sphère centrée sur le point étudié de section diamétrale dS, on peut calculer pour un nombre de photons aussi bien que pour des particules chargées, la fluence (Φ) en ce point par (Escanye et Durand 2010) :

(I.9)

La fluence s’exprime en nombre de particules par unité de surface (particule/m ² ).

I.3.2.2- Débit de fluence

Le débit de fluence ou le flux ( ̇), est la fluence par unité de temps, il s’agit donc d’un

nombre de particule par unité de surface par unité de temps (Escanye et Durand 2010) :

14

̇ (I.10) ̇ sera donnée en particule/m ² .s.

I.3.2.3- Fluence énergétique

On définit la fluence énergétique (F) comme le rapport de l’énergie totale transportée par les particules dN à la surface dS ((Escanye et Durand 2010) :

(I.11) F est exprimé en J/m ² .

I.3.2.4- Débit de fluence énergétique

Par conséquence le débit de fluence énergétique sera donc (Escanye et Durand 2010) : ̇ (I.12)

Son unité est exprimée en J/m ² .s.

I.3.3- Grandeurs dosimétriques I.3.3.1- Dose absorbée

La dose absorbée est définie par l’énergie communiquée d’une part, par la différence entre la somme des énergies de toutes particules ionisantes entrantes dans un élément de volume dV et celle de toutes les énergies des particules ionisantes qui l’ont quitté, et d’autre part, par la différence entre la somme de toutes les énergies libérées et la somme de toutes les énergies absorbées dans toutes les réactions nucléaires, transformations et interactions de particules élémentaires qui ont lieu dans cet élément de volume. La dose absorbée (D) sera (Le Sech et Ngô 2010) :

(I.13)

dE est l’énergie cédée par le rayonnement en un point du milieu considéré entouré par le

volume dV d’un élément de matière de masse dm.

15

La dose absorbée dans le système international, s’exprime en joule (J) par kilogramme (kg), c’est le Gray (Gy) : 1 Gy = 1 J/kg. Il existe une autre unité ancienne qui est le rad (1 Gy

= 100 rad) (Jimonet et Métivier 2007).

Dans le cas de notre étude, la détermination de la dose absorbée lors de l’irradiation des échantillons d’ADN en solution avec les rayons X ultra-mous (1,5 keV, Al Kα) est effectuée par le dosimètre de Fricke

I.3.3.2- Débit de dose

Le débit de dose ( ̇) est la dose délivrée par unité de temps, c’est une caractéristique de la dose absorbée à un moment t :

̇ (I.14)

Ce débit de dose absorbée dans le système international s’exprime en Gray par seconde (Gy/s). En pratique, on utilise le Gray par minute (Gy/mn) ou le Gray par heure (Gy/h) (Foos 2009; Escanye et Durand 2010).

I.3.4- Notion de dosimétrie en radiobiologie I.3.4.1- Dose équivalente

Les effets biologiques induits dans un tissu ou organe pour une même dose absorbée diffèrent d’un rayonnement à l’autre. En effet, l’endommagement d’un tissu ou un organe dépend de la qualité du rayonnement ionisant. La dose équivalente notée H _T,R est définie comme le produit de la dose absorbée D T,R par un tissu ou un organe T due au rayonnement R, pondérée par le facteur de pondération W R lié à la nature du rayonnement en cause (Foos 2009; Jimonet et Métivier 2007), soit :

(I.15)

Quand il s’agit d’un faisceau de rayonnements complexe (faisceau constitué de rayonnements de nature différente) (Foos 2009; Jimonet et Métivier 2007), la dose équivalente est alors la somme des doses équivalentes correspondant à chacun des rayonnements, l’expression (I.15) devient donc:

∑ ∑ (I.16)

16

La dose équivalente H _T,R est exprimée en sievert (1 Sv = 1 Gy).

On note que la notion de la dose équivalente qui est appelée parfois dose biologique dépend principalement de l’efficacité biologique relative (EBR) (Le Sech et Ngô 2010).

L’EBR est définie comme le rapport de la dose absorbée d’un rayonnement de référence par la dose absorbée du rayonnement considéré produisant un même niveau d’effet biologique, ainsi la dose équivalente H T,R résulte de la multiplication de la dose absorbée par l’EBR (Le Sech et Ngô 2010; Foos 2009). L’EBR permet de comprendre l’évolution de la relation Dose-effet en fonction de la nature du rayonnement (Foos 2009).

La comparaison issue de l’EBR des différents types de rayonnements produisant certains dégâts (effets stochastiques) dans un organe, permet de déterminer expérimentalement des valeurs estimées de W R , ces valeurs sont récapitulées sur le tableau (I.1) les facteurs de pondération W R pour chaque type de rayonnement (Jimonet et Métivier 2007):

nature et énergie du rayonnement Facteurs de pondération Valeurs W _R

Photons de toutes énergies 1

Electrons 1

Neutrons d’energie :

< 10 keV 10 Ŕ 100 keV 100 keV Ŕ 2 MeV 2 MeV Ŕ 20 MeV

> 20 MeV

5 10 20 10 5 Particules alpha, fragments de fission,

noyaux lourds

20

Protons d’énergie > 2 MeV 5

Tableau (I.1) : Facteurs de pondération des différents types de rayonnements ionisants

(Jimonet et Métivier 2007; Foos 2009).

17 I.3.4.2- Dose efficace

La radiosensibilité intrinsèque aux différents rayonnements des tissus ou organes de l’ensemble de l’organisme humain nous amène à affecter pour chaque tissu un facteur de pondération tissulaire W _T qui prend en compte la probabilité d’apparition des effets stochastiques radio-induits pour le tissu ou l’organe T considéré. Il s’agit de dose efficace D eff

qui est la somme des doses équivalentes H T,R pondérée par le facteur W T des tissus de l’organisme (Jimonet et Métivier 2007; Foos 2009) :

∑ (I.17)

L’unité de la dose efficace est le sievert (Sv). Par évidence, la somme des facteurs de pondération tissulaire est égale à 1 (∑ ), c’est la condition de normalisation (Foos 2009). Le tableau (I.2) indique les valeurs de W _T . C’est à travers de la valeur de la dose efficace qu’on peut estimer les risques pour l’homme causés par les rayonnements ionisants (Jimonet et Métivier 2007).

Tissu ou organe Facteur W _T de pondération pour les tissus

Gonades 0,08

Moelle osseuse (rouge) 0,12

Colon 0,12

Poumon 0,12

Estomac 0,12

Vessie 0,04

Sein 0,12

Foie 0,04

Œsophage 0,04

Thyroïde 0,04

Peau 0,01

Surface des os 0,01

Cerveau 0,01

Glandes salivaires 0,01

Autres tissus ou organes 0,12

Total 1

Tableau (I.2) : Facteurs de pondération Tissulaire ionisants (Jimonet et Métivier 2007).

18

I.4- Effet moléculaire de l’interaction des rayonnements ionisants

Le tissu vivant est constitué de molécules, ces molécules sont également constituées d’atomes d’hydrogène, d’oxygène, de carbone et d’azote (Jimonet et Métivier 2007). Les molécules sont regroupées et organisées pour former des cellules, et enfin les cellules contenant une solution aqueuse de composés chimiques sont organisées pour former les tissus vivants (tissus nerveux, musculaires…) (Jimonet et Métivier 2007).

Les effets des radiations ionisantes sur les cellules et les tissus vivants se traduisent par des excitations et des ionisations des atomes des molécules du système biologique. En particulier ces ionisations endommagent plus ou moins les propriétés fonctionnelles des molécules d’eau et d’ADN : l’eau en raison de sa quantité dans le corps (~70 %), et l’ADN pour des raisons qualitatives (support de l’information génétique), de plus il est couramment admis que l’ADN est une cible critique des rayonnements ionisant (Jimonet et Métivier 2007).

Généralement, les effets biologiques dans les cellules résultent de la combinaison des actions directes et indirectes des rayonnements ionisants sur les molécules qui forment les cellules (Jimonet et Métivier 2007; Turner 2007) :

 Les effets directs sont produits par l’action initiale du rayonnement lui-même, qui entraine des modifications dans l’ADN.

 Les effets indirects apparaissent lorsque les rayonnements interagissant avec les molécules d’eau produisant des espèces chimiques (radicaux libres) très réactives provenant de la radiolyse. Cela peut provoquer dans l’ADN des cassures simples ou doubles, causées par exemple par des radicaux libres tels le radical hydroxyle OH ^• . Par définition « Les radicaux libres sont des espèces chimiques possédant un ou des électrons célibataires, elles sont extrêmement réactives et ont par conséquence une durée de vie très courte. Ils se combinent entre eux ou avec d’autres radicaux libres, soit pour reconstituer la molécule initiale, soit pour donner naissance à des molécules étrangères au milieu initial appelées produits de radiolyse » (Foos 2009).

Il est intéressant d’analyser la proportion des effets indirects. On considère en effet

qu’ils contribuent pour une large part aux effets biologiques (Le Sech et Ngô 2010).

19 I.4.1- Mécanismes de la radiolyse de l’eau

Lors de l’irradiation de l’eau, il se produit une série d’évènements successifs dans un laps de temps très court, qui se produisant typiquement en trois phases : la phase physique, physico-chimique et la phase chimique. Elles sont illustrées en figure (I.9) (Le Caër 2011;

Turner 2007).

I.4.1.1- La phase physique

Dans cette phase, le processus initial de l’interaction conduit en 10 ^-15 s à la formation des molécules d’eau ionisées (H 2 O ⁺ ) avec la production d’un électron arraché (e ^- ) ou de molécules d’eau excitées (H 2 O*):

(I.18) (I.19) I.4.1.2- La phase physico-chimique

Durant cette phase physico-chimique (10 ^-15 s-10 ^-12 s), les trois espèces produites dans la phase physique induisent des modifications selon les processus suivants:

- La molécule d’eau ionisée réagit avec une molécule voisine conduisant, en environ10 ^-14 s à la formation d’un ion hydronium (H 3 O ⁺ ) et d’un radical hydroxyle (OH ^• ):

(I.20)

- La molécule d’eau excitée libère son énergie sous la forme d’un électron et d’un ion, ou s’engage dans une voie de relaxation dissociative donnant deux radicaux libres (I.22) :

(I.21) (I.22)

- Les électrons arrachés perdent progressivement leur énergie par collision (ionisation et

excitation) jusqu’à être suffisamment ralentis et donc se thermalisent pour enfin se

trouver piégés par les molécules d’eau qui les entourent. On obtient alors un électron

solvaté ou électron aqueux .

20

(I.23) I.4.1.3- La phase chimique

Au cours de la phase chimique (10 ^-12 s-10 ^-6 s), ces espèces diffusent dans la solution, et peuvent se recombiner les unes avec les autres et également avec les molécules environnantes dans des grappes par les réactions chimiques suivantes:

(I.24) (I.25) (I.26) (I.27)

(I.28)

(I.29) (I.30)

Figure (I.6): Processus de la radiolyse de l’eau (Le Caër 2011).

21 I.4.2- Structure de l’ADN

L’acide désoxyribonucléique appelé par son abréviation : ADN a été découvert par Frederick Miescher en 1869, c’est une molécule essentielle à tout système vivant, et c’est la substance qui porte dans sa structure l’information génétique sous forme codée (Gilman et Zoller 1994). L’ADN est une macromolécule polymérique formée par l’association de longue chaine de petites molécules comme les sucres (Gilman et Zoller 1994).

L’ADN est un des constituants majeurs du noyau de la cellule (d’où son nom d’acide nucléique) (Gilman et Zoller 1994). L’unité élémentaire qui forme les acides nucléiques est le nucléotide qui se joint pour former une chaine polynucléotidique (Hartl et Jones 2003). Les nucléotides contiennent les éléments chimiques suivants (Figure I.7) : un groupement de phosphate, un sucre et une base purique ou pyrimidique, la purine qui est constituée par les deux bases azotées l’adénine (A) et la guanine (G), et la pyrimidine qui est constituée également en deux bases azotées la cytosine (C) et la thymine (une base nucléique est une molécule plane contenant du carbone et de l’azote) (Gilman et Zoller 1994; Griffiths et al.

2006) (Figure I.8). Le sucre présent dans l’ADN est appelé désoxyribose, il possède un atome d’hydrogène lié à un atome de carbone (d’où le nom d’acide désoxyribonucléique) (Gilman et Zoller 1994; Griffiths et al. 2006).

Figure (I.7) : Un nucléotide de l’ADN (Gilman et Zoller 1994).

22

Figure (I.8) : Structure chimiques des bases qui compose les acides nucléiques (Hartl et Jones 2003).

L’ADN possède une forme très régulière, qui contient des sucres (désoxyribose) couplés à des groupements de phosphates, l’alternance de ces groupements identiques forme le squelette de l’ADN (Gilman et Zoller 1994; Griffiths et al. 2006). Le squelette sucre- phosphate et les bases imposent une configuration hélicoïdale de 20 Å de diamètre (Gilman et Zoller 1994; Hartl et Jones 2003) (Figure I.12).

La structure de l’ADN consiste en deux chaînes de nucléotides côte à côte « doubles

brins » complémentaires entrelacées en double hélice avec une orientation opposée ou anti-

parallèles (Gilman et Zoller 1994; Griffiths et al. 2006). Les deux chaînes polynucléotidique

sont enroulées l’une autour de l’autre, et chaque chaîne fait un tour complet tous les 10

nucléotides, de sorte que les nucléotides sont situés tous les 3,4 Å, et par conséquence il existe

10 paires de base par tour d’hélice dans chaque brin, (Gilman et Zoller 1994; Hartl et Jones

2003) (Figure I.9). Dans la double hélice les groupes de sucre-phosphate se situent à

l’extérieur de la molécule d’ADN alors que et les bases qui possède une séquence irrégulière

se trouvent à l’intérieur, l’appariement des bases puriques et pyrimidiques est assuré par les

liaisons hydrogène entre les deux brins de l’ADN (Gilman et Zoller 1994). En note qu’en

1953 James Watson et Francis Crick proposent le premier modèle de la structure de l’ADN en

double hélice (Griffiths et al. 2006).

23

Figure (I.9) : Structure en double hélice de l’ADN (Hartl et Jones 2003).

À l’intérieur de l’ADN, l’adénine ne peut interagir qu’avec la thymine ce qui forme une paire de base (deux liaisons hydrogène) et la guanine ne peut interagir qu’avec la cytosine pour former ainsi une autre paire de base (trois liaisons hydrogène) (Figure I.10) (Gilman et Zoller 1994). Les liaisons hydrogène entre les paires de bases maintiennent les deux brins d’ADN ensemble (Griffiths et al. 2006).

Figure (I.10): Liaisons hydrogène entre les bases (Hartl et Jones 2003).

24

Dans la recherche en radiobiologie on utilise souvent les molécules d’ADN plasmidiques. Les plasmides sont des molécules d’ADN double brin circulaires, que l’on trouve dans beaucoup de souches bactériennes comme Escherichia coli (E.Ccoli) (Crépin 1987). Cet ADN plasmidique, comme nous allons le voir, est très utilisé en radiobiologie comme sonde afin de mesurer les effets des rayonnements en termes notamment de dommages à l’ADN.

I.5- Types de dommages radio-induits dans l’ADN

Suite à l’irradiation de la molécule d’ADN, les rayonnements ionisants réagissent avec les différents éléments qui composent l’ADN: les groupements phosphates, les sucres ou les bases puriques ou pyrimidiques, et peuvent générer par des effets directs ou indirects divers types de lésions ou dommages (Figure I.11), telle que les cassures de la chaîne polynucléotidiques (simples ou doubles), les dommages de bases, les pontages de l’ADN et les sites à dommages multiples (Gillard 2005; Pouthier 2006; Huguet 2010) :

Figure (I.11) : Types de dommages radio-induits dans l’ADN par les rayonnements ionisants (Pouthier 2006).

 Les cassures simples brins (CSB)

Les cassures simples brins résultent de la rupture d’un des deux brins d’ADN au

niveau des liaisons phosphodiester, ou par l’attaque d’un atome d’hydrogène de la liaison

base-désoxyribose ou phosphate-désoxyribose par les radicaux OH ^• , ou même par la perte

d’un atome d’hydrogène du sucre (désoxyribose).

25

 Les cassures doubles brins (CDB)

Les cassures doubles brins correspondent aux ruptures des deux chaînes d'ADN à des sites distants de quelques nucléotides avec plus ou moins de 10 paires de bases d’intervalle.

 Les dommages de bases

Ces dommages proviennent principalement des modifications de la structure chimique des bases puriques et pyrimidiques. Certaines lésions conduisent à la perte de bases et forment des sites abasiques.

 Les pontages de l’ADN

Les pontages se forment par l’intermédiaire des liaisons covalentes. On distingue trois types de pontages : ADN-ADN intra-brin, ADN-ADN inter-brin et ADN-protéines.

 Les sites à dommages multiples

La combinaison ou l’accumulation (clusters) des dommages localisés sur une courte distance (1 à 4 nm) forme un site de dommages multiples (ou MDS pour Multiple Damaged Site). On trouve dans ces dommages complexes la plupart des lésions décrites précédemment : CSB, CDB, dommages de bases et les sites abasiques.

De nombreuse études indiquent que le nombre et la distribution de ces dommages radio-induits dépendent de certains facteurs qui modifient la radiosensibilité de l’ADN comme le TEL du rayonnement, la structure de l’ADN, les substances protectrices ou capteurs de radicaux libres, et la température (Frankenberg-Schwager; 1990 Teoule 1987). Dans notre étude certains dommages seront étudiés en fonction de ces facteurs, en particulier les cassures simples et doubles brins.

I.6- Technique de relaxation de plasmide

L’ADN plasmidique peut se trouver sous trois formes topologiques :

 La forme surenroulée (S) qui est la forme native : dans cette topologie non

endommagée l’un des deux brins d’ADN présente des tours supplémentaires

d’enroulement par rapport à l’autre, le plasmide est dit surenroulé

26

 La forme circulaire (C) : la rupture de l’un des deux brins de l’ADN surenroulé rend le plasmide relâché encore appelé circulaire ou relaxé.

 La forme linéaire (L) : cette forme est obtenue par la rupture des deux brins de l’ADN surenroulé, l’ADN est devenu ouvert, que l’on appelle linéaire

On représente ces trois formes sur la figure (I.12).

Figure (I.12) : Les trois formes de l’ADN plasmidique (Fulford 2000).

Ces trois formes (S), (C), (L) peuvent être séparées et quantifiées par électrophorèse sur gel d’agarose, et à partir des données de la quantification, on peut remonter au nombre de cassures engendrées par le rayonnement par unité de masse de plasmide d’ADN (Dalton) et par unité de dose (Gray) (Boichot 2000).

Figure (I.13) : Observation expérimentale par AFM à l’air en mode tapping des

modifications induites sur l’ADN en solution aqueuse par des rayons X en utilisant la

27

technique de relaxation de plasmide. Irradiation avec une dose de 150 Gy en Tris 1,8 mM et EDTA 0,1 mM / [ADN] : 47 µg/ml (Boichot 2000) :

Forme I : ADN surenroulé (non endommagé) ; Forme II : ADN circulaire (cassure simple brin) ; Forme III : ADN linéaire (cassure double brin).

Dans le chapitre suivant nous déterminerons par le moyen du dosimètre de Fricke la dose absorbée. Cela sera réalisé on utilisant un volume de 100 µl de solution (sulfate ferreux) irradiée par les rayons X ultra-mous (1,5 keV, Al Kα) générés à l’aide d’un tube à cathode froide.

27

Chapitre II

Dosimétrie des solutions irradiées avec les rayons X

ultra-mous

28 II.1- Dosimétrie de Fricke

II.1.1- Généralités

Le dépôt spatial d’énergie des électrons secondaires produits par les rayons X ultra- mous (<5 keV) s’étend sur des distances de l’ordre du nanomètre, cela signifie qu’il est beaucoup plus petit que les dimensions des composants cellulaires, c’est la raison pour laquelle ce type de rayonnement fourni une sonde utile pour l'étude des effets biologique des radiations (Raju et al. 1987). Pour ce type de recherches il est nécessaire de connaitre la valeur de la dose déposée dans la matière ; cette grandeur physique permet d’évaluer les effets en fonction de la nature et de l’énergie du rayonnement utilisé. Quand il s’agit d’irradier des solutions aqueuses, l’utilisation de la dosimétrie de Fricke comme moyen de mesure de la dose reste la technique la plus fiable. Avec sa haute précision, la reproductibilité et la linéarité de sa réponse en fonction de la dose, la dosimétrie de Fricke est devenue la dosimétrie la plus utilisée dans les études de chimie sous rayonnement en solution aqueuse (Mirsaleh 2014), c’est une technique de dosimétrie absolue.

II.1.2- Description de la dosimétrie de Fricke

Selon de nombreuses études, le dosimètre de Fricke est le seul système chimique que l’on peut utiliser dans les études des rayonnements à faible TLE (transfert d'énergie linéique) (Pimblott et LaVerne 2002; Hoshi et al. 1985; Raju et al. 1987; Watanabe et al. 1995; Freyer et al. 1989). C’est le dosimètre le plus employé et le plus sensible aux irradiations, il a été mis au point en 1927 par Fricke (Blanc 2003). Il est reconnu comme un dosimètre chimique qui permet de relier la quantité d’énergie déposée dans le milieu aux modifications chimiques produites suite à l’irradiation (Trupin 2000). Cette dosimétrie consiste à la mesure du rendement de la réaction d’oxydation radiolytique des ions ferreux Fe ²⁺ en ions ferriques Fe ³⁺

en solution aqueuse après l’irradiation (Watanabe et al. 1995; Blanc 2003). Ce rendement est considéré comme une combinaison linéaire des rendements des espèces radicalaires produites dans l’eau (OH ^• , e ^- aq , H ^• , H 2 O 2 ) par le rayonnement ionisant (Watanabe et al. 1995).

II.1.3- Préparation des solutions

Le dosimètre de Fricke ou solution standard aérée de sulfate ferreux contenant 0,4

mol/l d’acide sulfurique (H 2 SO 4 ), 1 mmol/l de sulfate ferreux (FeSO 4 ), et 1 mmol/l de

chlorure de sodium (NaCl), est préparée dans l'eau distillée, doublement déminéralisée et ultra

pure ayant une résistivité supérieure à 18 MΩ.cm (Watanabe et al 1995; Freyer et al. 1998).

29

En vue d'assurer la saturation en oxygène et pour éviter toute élévation dubruit de fond dû à l'auto-oxydation qui pourrait fausser les mesures, la solution de Fricke doit être fraiche a préparée 1 jour avant l'utilisation (Watanabe et al. 1995), d’autre part, la saturation en oxygène a pour but de pallier le manque d’oxygène qui survient lorsque la dose augmente (Trupin 2000). Cette solution mère doit être stockée à 4°C et maintenue à température ambiante uniquement pendant les périodes d'irradiation et de mesure (Freyer et al. 1998).

La présence des impuretés organiques dans la solution provoque l’augmentation du rendement en Fe ³⁺ , et afin d’éliminer cette influence, il est indispensable d’ajouter la quantité de NaCl indiquée ci-dessus dans la solution (Trupin 2000).

II.1.4- Mécanisme de la réaction

Sous conditions aérées, et sous l’action indirecte du rayonnement, qui conduit à la formation des espèces oxydantes produites par décomposition radiolytique de la molécule d’eau, la formation des ions ferriques Fe ³⁺ suit le schéma réactionnel suivant (Pimblott et LaVerne 2002; Trupin 2000):

(II.1)

(II.2) (II.3) (II.4) (II.5) (II.6)

L’ion ferriques est formé selon les réactions (1), (4), et (6) à partir de la réaction (5).

Par conséquence, le rendement de formation de l’ion Fe ³⁺ est donnée par l'équation stœchiométrique suivante, où interviennent les rendements des produits radiolytiques (Pimblott et LaVerne 2002; Trupin 2000):

( ) ( ) ( ) ( ( ) ( ) ( ) (II.7)

Le rendement radiochimique G est le nombre de molécules ou radicaux produits par 100

eV d'énergie absorbée (Pimblott et LaVerne 2002), il s’exprime dans le système international

en moles par Joule (mol.J ^-1 ) (Blanc 2003) .

30 II.1.5- Mesure de la dose absorbée

Au moyen d’un spectrophotomètre d’absorption UV-Visible, il est possible de déterminer la concentration de la solution en Fe ³⁺ formé après l’irradiation de chaque échantillon à partir de la loi de Beer-Lambert, en mesurant l’absorbance à 304 nm (Trupin 2000; Blanc 2003). Il est indispensable d’effectuer une mesure de l’absorbance d’un échantillon non irradié, avec le même traitement qu’un échantillon irradié (stockage, exposition à la lumière, variation de la température, …), c’est la démarche qui mène à la détermination de la concentration de Fe ²⁺ oxydé en absence d’irradiation (Trupin 2000). Pour plus de précision dans les mesures, on note que l’absorbance de l’échantillon non irradié est mesurée au début et à la fin de la période d’analyse, et que la différence entre les deux mesures ne dépasse pas 0,001 (unité d’absorbance) (Freyer et al. 1998).

La différence en absorbance entre la solution irradiée et non irradiée est liée directement à la dose absorbée dans la solution de Fricke selon l’équation suivante (Mattsson et al. 1982):

( ( )

) (II.8) Où:

D _i : dose moyenne absorbée dans la solution en Gy

ΔA T : accroissement de l'absorbance à la température T au cours de la mesure spectrophotométrique

ρ: masse volumique de la solution dosimétrique (ρ =1.024 g cm ^-3 ) l : longueur du chemin optique de la cellule spectrophotométrique (1 cm) (ε _m ) _T : coefficient d'extinction molaire de Fe ³⁺ à 304 nm et à la température T

G T’ : rendement radiochimique en Fe ³⁺ à la température d’irradiation T' et à la dose Di

Si les températures pendant les mesures varient de 25°C, il est nécessaire d’établir une correction sur les valeurs du coefficient d'extinction molaire et le rendement radiochimique selon l’expression:

( ) ( ) [ ( )][ ( )] (II.9)

31

Dans lequel: K ₁ = 0.0069 C ^-1 et K ₂ = 0.0012 C ^-1 (Mattsson et al. 1982) (et les références mentionnés dans cette référence), et nous allons utiliser les données suivantes:

(ε m ) 25°C =219.6 m ² /mol à 304 nm (ICRU 1970) G 25°C = 0.92 µmol J ^-1 (Freyer et al. 1989).

II.2- Dispositif expérimental II.2.1- Source d’irradiation

Les rayons X ultra-mous que nous allons utiliser pour l'irradiation des solutions de sulfate ferreux et d’ADN plasmidique sont générés par une source à cathode froide avec une cible en aluminium (Figure II.1), elle fournit un faisceau de photons monoénergétiques de 1,5 keV (Figure II.2), la figure illustre la simulation d’un spectre énergétique du faisceau de rayons X dans l’air à la distance de la feuille d’aluminium de 10 mm. On remarque que l’intensité des photons augmente avec la tension appliquée, de la même manière que la contamination par le bremsstrahlung, qui est significative au-delà de 4 kV à cette distance (Ounoughi 2013), où la tension d’accélération des électrons appliquée aux bornes du tube est de 4 kV, le courant électrique est de 2 mA, et la pression dans le tube est de 0,069 mbar. On note que la modification de l’un quelconque des quatre derniers paramètres cités peut influencer directement la valeur du flux des rayons X produit (Ounoughi et al. 2013;

Ounoughi 2013).

Sur la figure (II.3) on montre une photographie de l’ensemble des équipements

expérimentaux qui contrôlent automatiquement et simultanément toutes les étapes de

l’irradiation.

32

Figure (II.1): Schéma du générateur de rayons X ultra-mous à cathode froide et du porte- échantillon équipé d'un micromoteur électrique qui permet d'agiter les solutions (agitateur de titane) au cours de l'irradiation.

Figure (II.2): Spectre énergétique simulé par le code PENELOPE à différentes tensions

appliquées et à 10 mm de la feuille d’aluminium (Ounoughi 2013).

33

Figure (II.3): Photographie des équipements expérimentaux.

II.2.2- Conditions d’irradiation

Dans notre étude dosimétrique, nous allons irradier 100 µl de solution de sulfate ferreux (solution de Fricke) en utilisant un porte échantillon en verre qui possède une forme cylindrique de 8 mm de diamètre, par conséquent la solution aura 2 mm d’épaisseur (Figure II.1).

Les échantillons ont été irradiés pendant les durées suivantes : 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 et 40 mn. Au cours de l'irradiation, l'humidité de l'atmosphère autour de l'échantillon est maintenue à 98% d'humidité relative à une température constante de 295°K et à la pression atmosphérique. Le contrôle de l’humidité et de la température de l'atmosphère sont assurées par une chambre climatique avec éclairage (l’éclairage n'a pas été utilisé dans cette étude) et d'humidité (KBWF 240 Binder) qui permet la circulation d'un flux d'air constant à travers un circuit fermé.

L’emplacement de l’échantillon par rapport à la feuille d'aluminium (source) est fixé à une

distance de 10 mm en utilisant un positionneur linéaire de vis à rouleaux avec une précision

de 10 µm.