MISE AU POINT D’UNE METHODE MANUELLE D’ESTIMATION DU NOMBRE DE PLAQUETTES DANS LES CONCENTRES PLAQUETTAIRES STANDARDS (CPS)

(1)

Rapport de stage / EPAC / CAP / GBH Réalisé et soutenu par BADAROU Fataï Djidjoho Page 1 2

REPUBLIQUE DU BENIN

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MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

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UNIVERSITE D’ABOMEY CALAVI

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ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY CALAVI

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CENTRE D’AUTONOMIE ET DE PERFECTIONNEMENT

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Option : Analyses Biomédicales (ABM)

POUR L’OBTENTION DU DIPLOME DE LICENCE PROFESSIONNELLE THEME :

Présenté et soutenu par:

BADAROU Fataï Djidjoho

Sous la direction de : Devant le Jury composé de ;

Année Académique : 2016 – 2017 RARAPPPPOORRTT DDEE FFIIN N DDEE FFOORRMMAATTIIOONN

MISE AU POINT D’UNE METHODE MANUELLE D’ESTIMATION DU NOMBRE DE PLAQUETTES

DANS LES CONCENTRES PLAQUETTAIRES STANDARDS (CPS)

Président :Dr YADOULETON Anges Membre : Dr BAGLO Tatiana

Dr Jean Robert KLOTOE Tuteur :

D^JOGBESSI Didier Philippes Ingénieur en Analyses Bio Médicales Superviseur :

Dr Jean Robert KLOTOE Maître-assistant en

Physiologie

et Pharmacologie

(2)

Rapport de stage / EPAC / CAP / GBH Réalisé et soutenu par BADAROU Fataï Djidjoho Page 2

REPUBLIQUE DU BENIN

**********

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

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UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI

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ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI

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DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE

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DIRECTEUR

Professeur SOUMANOU Mohamed

DIRECTEUR ADJOINT Docteur AHOUANNOU Clément

CHEF DE DEPARTEMENT Docteur ATCHADE Pascal

CHEF CAP

Professeur AWANTO Christophe

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LISTE DES ENSEIGNANTS DU DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE (GBH)

I-ENSEIGNANTS PERMANENTS

N° Noms et prénoms Matières enseignées 1 AGBANGNAN Pascal Méthodologie de la recherche 2 AHOYO Angèle Théodora Microbiologie médicale et TP de

Microbiologie médicale, Santé Publique, Hygiène hospitalière

3 AKOWANOU Christian D Physique

4 AKPOVI Casimir Biologie cellulaire, Physiologie

cellulaire, Biochimie métabolique des lipides et enzymologie

5 ALAMOU Eric Biostatistique 6 ALITONOU Guy Chimie organique 7 ANAGO Eugénie Biochimie clinique

8 ATCHADE Pascal Parasitologie médicale et appliquée- mycologie

9 BANKOLE Honoré Bactériologie médicale et TP Bactériologie médical

10 DOUGNON Victorien Déontologie médicale et méthodologie de la recherche

11 FAH Lauris Histologie médical, biochimie

métabolique des glucides et immuno – hématologie

12 FANOU Brice Armand TP microbiologie médicale et Assurance Qualité en biologie médicale

13 HOUNSOSSOU Hubert Anatomie général

14 KLOTOE Jean Robert Santé et sécurité au laboratoire,

Equipement Biomédicaux, Cytologie sanguine et Hémostase

15 LOKO Frédéric Biochimie analytique 16 LOZES Evelyne Immunologie générale et

Immunopathologie

17 SEGBO Julien Biochimie structurale, Biologie moléculaire et Biologie moléculaire appliquée

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Liste des enseignants permanents (suite)

18 SENOU Maxime Histologie Spéciale et Hémopathies 19 TCHOBO Fidèle Paul Chimie générale

20 YADOULETON Anges Entomologie médicale 21 YEHOUENOU Boniface Microbiologie générale

Liste des enseignants non permanents

N° Nom et prénoms Matières enseignées

1 AGBANNON Tiburce Gestion des entreprises et gestion hospitalière

2 AGOSSOU Gilles Droit de travail

3 DESSOUASSI Noel Biophysique des solutions 4 HOUNNON Hypolite Mathématique

5 KOUNASSO Gabriel Informatique médicale

6 YOVO Kokou Paulin Toxicologie et Pharmacologie

(5)

 A Allah ! Le Tout Miséricordieux, le Très Miséricordieux qui m’a toujours guidé sur le bon chemin, ta lumière est ma force.

 A mon père, BADAROU Moussèdikou !

Vous n’avez ménagé aucun effort à investir sur la formation de vos enfants.

Puisse le Tout-Puissant Allah vous comble de sa grâce afin que vous puissiez jouir longtemps des fruits de vos peines.

 A ma mère AHOUANSOU Ohoué Christine !

Tous les sacrifices consentis à mon éducation, trouve à travers ce témoignage ma profonde gratitude.

 A mon feu grand-père DOSSOU-GANDJE AHOUANSOU qui nous a inculqué l’amour du travail. Que la terre vous soit légère !

 A tous ceux qui m’ont aidé de près ou de loin pour la réalisation de ce travail, profondes gratitudes !

Dédicace

(6)

 A mon superviseur de stage, Dr KLOTOE Robert, enseignant à l’EPAC.

Vos conseils et vos encouragements de tous les jours sont pour moi une valeur de fraternité. Recevez ici, monsieur le Docteur, le témoignage de ma profonde gratitude et de mon admiration. Vous cultivez en moi le sens de la rigueur et du travail bien fait.

 A notre chef service, le Professeur BIGOT André, vous nous avez soutenus et encouragés durant toute notre formation. Que le Tout-Puissant vous le rende au centuple.

 A mes tuteurs stage, messieurs DJOGBESSI Didier et COCO Cyriaque, actuels surveillants de la Banque de Sang du CNHU. Un simple « merci » ne saurait exprimer à vos égards. Recevez ici, messieurs, l’expression de ma profonde gratitude pour tous les efforts consentis et votre disponibilité pour la réalisation de ce travail.

 Que le Tout-Puissant vous accorde des jours heureux et des grâces sur vous et les vôtres.

 A tous nos autres collègues de la Banque de Sang du CNHU qui n’ont ménagé aucun effort pour nous encourager dans la réussite de ce travail.

 A mon épouse GBENONNOU Rafiatou et à mes enfants, pour votre soutien permanent.

Remerciements

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 A son Excellence, le Président du Jury

C’est un honneur que vous me faites en acceptant de présider ce Jury. Veuillez recevoir ici l’expression de mes hommages les plus distingués.

 Aux Honorables membres du Jury

Je vous remercie de tout mon cœur pour avoir accepté de siéger dans ce Jury.

Veuillez recevoir ici l’expression de mes sincères déférences.

Hommages

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LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS

Sigle Signification

CPA : concentré plaquettaire d’aphérèse CPS : concentré plaquettaire standard CP : concentré plaquettaire

ANTS Agence Nationale de la Transfusion Sanguine ADTS A-L : Antenne Départemental de Transfusion Sanguine

Atlantique - Littoral

ADP : Adenoside monophosphate ATP : Adénoside tri-phosphate BDS : Banque de Sang

CNHU-HKM : Centre National Hospitalier et Universitaire Hubert Kotoukou MAGA

vWF : Facteur von Willebrand

GP : glycoprotéine

AMPc : Adenoside monophosphate cyclique PDGF : Platelet derivated growth factor

Plt : Plaquettes

TRALI : Transfusion Related Acute Lung Injury (=œdème pulmonaire lésionnel post-transfusionnel)

EPAC Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi CAP Centre autonome de perfectionnement

MGG

May-Grunwald Giemsa

(9)

LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES

LISTE DES TABLEAUX

N° de tableau

Titres Pages

Tableau I Indice de champ d’un oculaire de microscope et facteur multiplicateur associé pour le calcul de la numération plaquettaire

21

Tableau II statistique descriptive de l’hématocrite des échantillons utilisés pour la préparation des CPS

32

Tableau III Statistique descriptive de la concentration en plaquettes des CPS

32

Tableau IV Corrélation entre moyenne de Plt/champs et concentration réel de plaquettes dans les CPS

33

Tableau V Comparaison des moyennes du nombre de plaquettes obtenus par les deux méthodes

35

LISTE DES

FIGURES

N° Figure Titres Pages

Figure 1 : Schéma de la structure du thrombocyte ¹⁵

Figure 2 : Comptage sur cellule de Malassez ¹⁹

Figure 3 : Principe de l’analyse quantitative du buffy coat ²²

Figure 4 : Principe de la variation d’impédance ²⁵

Figure 5 : Principe de la cytométrie en flux ²⁵

Figure 6 : corrélation entre nombre de Plt par champs et numération par l’automate

33

Figure 7 : Box-plot du nombre de plaquettes suivant la méthode de numération

34

(10)

RESUME

Dans le cadre de notre rapport de fin de formation à l’EPAC, nous avons réalisé à la banque de sang de CNHU-HKM de Cotonou une étude qui a eu pour objectif de déterminer le nombre de plaquettes à partir de frottis de concentrés plaquettaires standards (CPS).

Dans ce sens, 35 échantillons de CPS produits par l’antenne départementale de la transfusion sanguine Atlantique – Littoral ont été utilisés. Une méthode de numération du nombre de plaquettes a été mise au point sur la base de frottis confectionnés à partir d’une gamme de dilution de CPS. Les frottis ont été colorés au MGG et le nombre de plaquettes a été compté au microscope.

Il ressort de cette étude qu’il y a eu une forte corrélation (0,999) entre la concentration en plaquette donné par l’automate et leurs nombres moyens par champs microscopique. De même, il existe un coefficient de proportionnalité (5,35) entre le nombre moyen plaquettaire sur frottis et la concentration réelle des plaquettes obtenue par l’automate. Les nombres moyens de plaquettes déterminés par les deux méthodes sont statistiquement égaux.

Cette nouvelle méthode de dénombrement des plaquettes constitue une alternative pour l’évaluation de la conformité plaquettaire des CPS.

Mots clés : CPS, frottis, méthode, numération, CNHU-HKM.

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ABSTRACT

As part of our end-of-training report at Polytechnic School of Abomey-Calavi, we conducted a study at the CNHU-HKM blood bank in Cotonou to determine the number of platelets from platelet concentrates smears (CPS).

In this sense, 35 samples of CPS produced by Atlantic - Littoral departmental department of blood transfusion were used. A platelet count method was developed based on smears made from a CPS dilution range. The smears were stained with MGG and the number of platelets was counted under a microscope.

This study shows that there was a strong correlation (0.999) between the platelet concentration given by the automaton and their mean numbers per microscopic field. Similarly, there is a coefficient of proportionality (5.35) between the platelet average number of smears and the actual platelet concentration obtained by the automaton. The average platelet numbers determined by the two methods are statistically equal.

This new method of counting platelets is an alternative for platelet compliance assessment of CPS.

Key words: SPC, smear, method, count, CNHU-HKM.

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INTRODUCTION

Les plaquettes (Plt) sanguines encore appelées thrombocytes sont de petites cellules anucléées qui jouent un rôle essentiel dans l’hémostase. Elles suppriment un saignement lors de l’apparition d’une brèche dans un petit vaisseau et évitent également tout saignement à l’intérieur du corps [1]. Leur nombre normal est de 150G/L à 450 G/L par mm³ de sang. Mais certaines pathologies conduisent à des insuffisances plaquettaires qui peuvent être d’origine quantitative (thrombopénie) ou qualitative (thrombopathie). Dans ces situations, on fait recourt aux concentrés plaquettaires dans le cadre d’un traitement préventif ou curatif afin de rétablir cette insuffisance plaquettaire [1; 2].

Les concentrés plaquettaires (CP) comme les autres produits sanguins labiles (PSL) sont issus de dons de sang ou de ses composants. La réglementation impose des critères stricts pour le don, la préparation des produits individuels ou de mélanges, la qualification et la conservation, mais aussi pour les spécifications qui définissent le produit, en particulier pour ce qui concerne son contenu en principe actif thérapeutique.

Au Bénin, un seul type de concentrés plaquettaires est actuellement disponible [2] : le concentré plaquettaire standard (CPS) obtenu à partir d’une unité de sang total frais. Il est produit par les antennes départementales de l’Agence National de la Transfusion Sanguine (ANTS). La banque de sang (BDS) du Centre National Hospitalier et Universitaire Hubert Kotoukou MAGA (CNHU-HKM) reçoit ainsi les CPS produits par l’antenne départementale Atlantique-Littoral de l’ANTS (ADTS A/L).

La qualité de ces produits est un impératif pour les banques de sang. La norme européenne indique que la quantité de plaquettes par unité de CPS doit être supérieure à 6x10¹⁰ [5]. Mais comment s’assurer de la conformité en nombre de plaquettes des CPS cédées aux patients par la BDS du CNHU-HKM ? Cette

(13)

question est d’autant plus préoccupante qu’il n’existe pas un système d’assurance qualité au niveau de la structure productrice des CPS. Dans ces conditions la mise au point d’une méthode d’estimation rapide du nombre de Plt/CPS serait d’une utilité certaine pour les BDS. C’est ce qui justifie la présente étude qui a pour objectifs :

Objectif général

Mettre au point une méthode manuelle d’estimation du nombre de Plt/CPS.

Objectifs spécifiques

- Evaluer la corrélation entre le comptage des Plt sur frottis des CPS et leur numération à l’automate.

- Déterminer le coefficient de proportionnalité entre le nombre moyen de Plt par champs microscopique et le nombre de Plt fourni par l’automate

Le présent travail, hormis l'introduction et la conclusion, est organisé en trois parties :

- La première abordera la synthèse de littérature sur les plaquettes et les concentrés plaquettaires,

- La seconde traitera du matériel et des méthodes, - La troisième présentera les résultats et la discussion.

(14)

I. SYNTHESE DE LITTERATURE

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1. PLAQUETTES 1.1.

Origine

Les thrombocytes sont produits dans la moelle osseuse en plusieurs étapes. Les mégacaryoblastes se transforment progressivement en mégacaryocytes dont la fragmentation cytoplasmique est à l’origine des thrombocytes. La durée de cette production plaquettaire est d’une dizaine de jours.

1.2. Structure

Les plaquettes sont des cellules anucléées discoïdes à l’état inactif. Elles mesurent entre 2 et 3 µm de diamètre pour un volume moyen de 7 à 12fL. Elles contiennent des granules dont le contenu est sécrété lors de l’activation plaquettaire via un système caniculaire ouvert sur l’extérieur (Figure 1) [4].

Figure 1 : Schéma de la structure du thrombocyte [4]

Légende :

- le granule α contient le F4B (Facteur 4 plaquettaire), le βGT (βThrombomoduline), des protéines de la coagulation, des facteurs de croissance, des inhibiteurs de la fibrinolyse, des immunoglobulines …, - les granules denses contiennent notamment de l’ADP, de l’ATP, du calcium et de la sérotonine.

(16)

2. LES CONCENTRES PLAQUETTAIRES

Les concentrés plaquettaires peuvent être obtenus de deux manières :

 soit à partir d’un seul donneur pour obtenir un concentré plaquettaire d’aphérèse (CPA).

 soit à partir d’un mélange des plaquettes de plusieurs donneurs afin d’obtenir un mélange de concentré plaquettaire standard (MCPS).

L’efficacité de ces deux types de concentrés plaquettaires est équivalente [5].

2.1. Concentré plaquettaire d’aphérèse (CPA)

Les CPA sont obtenus lors du prélèvement d’un donneur de plaquettes. Ce type de don est réalisé à l’aide d’un automate d’aphérèse qui permet de réaliser la séparation des composés du sang, afin de récupérer les plaquettes dans une poche et de restituer les autres constituants du sang au donneur. Cet automate permet également de déleucocyter le produit. Le CPA ainsi obtenu est en attente des résultats de laboratoire de qualification biologique du don avant d’être transfusé.

Aucune préparation n’est nécessaire sur ce type de produit [6].

2.2. Concentré plaquettaire standard (CPS)

Les CPS sont obtenus après plusieurs dons de sang total. Le sang total est dans un premier temps centrifugé. Les différents constituants sont ensuite séparés dans des poches différentes (concentré des GR, plasma et concentré de plaquettes). Les concentrés des plaquettes provenant des dons de sang sont ensuite déleucocytés (la déleucocytation peut être également réalisée avant la séparation des constituants) à l’aide d’un filtre spécifique qui permet d’éliminer les GR en laissant passer les plaquettes dans la poche de conservation. Les concentrés des plaquettes déleucocytés sont ensuite mélangés avec quatre à six autres de plaquettes provenant d’autres donneurs de sang de même groupe [5, 6].

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2.3. Solution de conservation

Les CPS et les CPA sont respectivement conservés dans une solution de conservation à 65% et 35% de plasma. La solution de conservation peut être de l’Intersol (Fenwall), du T-Sol (Fenwall), du SSP ou du SSP + (Macopharma).

Cette solution de conservation est composée de citrate permettant la neutralisation de l’activation de la coagulation, d’acétate (substrat métabolique) et d’une solution saline afin de maintenir la pression osmotique dans la poche de plaquettes. Elle permet d’améliorer la qualité du produit notamment en diminuant les composants plasmatiques activés et les débris cellulaires.

Elle permet également de diminuer les réactions transfusionnelles de type allergique. Elle augmente également la durée de conservations des CP à cinq jours en France. Avec cette solution de conservation plusieurs pays d’Europe sont passés à sept (07) jours de conservation.

Les CP sont conservés durant cinq (05) jours au maximum entre 20 et 24°C. Cette température garantie l’efficacité de la transfusion mais augmente le risque de prolifération bactérienne durant la conservation. Les MCPS et CPA sont également maintenus durant la conservation à agitation légère afin de favoriser les échanges gazeux entre les cellules et l’atmosphère autour de la poche [7].

2.4. Transfusion des plaquettes

Toute thrombopénie inférieure à 20G/L avec ou sans syndrome hémorragique nécessite la transfusion de plaquettes :

- Chez l’adulte une (01) unité de CPS (soit 0,5x10¹¹/L) par 7 Kg de poids corporel pour augmenter le nombre de plaquettes de 0,2x10¹¹/L soit 10 CPS pour un adulte de 70Kg

- Chez le nouveau-né, le nourrisson et l’enfant, une (01) unité de CPS (soit 0,5x10¹¹/L) par 5 Kg de poids corporel avec au minimum une unité.

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Le rythme de transfusion dépend de l’évolution de la maladie causale et de nombreux facteurs associés. On augmente les doses devant une fièvre, infection, splénomégalie. Une transfusion unique chez un patient non réfractaire permet de maintenir le nombre de plaquettes au-dessus du seuil pendant 3 à 4 jours. Chez un patient réfractaire la dose quotidienne peut être fractionnée en deux à quatre transfusion. Les plaquettes doivent être transfusées dans l’heure qui suit leur arrivée dans l’unité de soin après avoir été remises en suspension (mouvement de chaloupe à défaut d’agitateur automatique) et la température ambiante [8].

3. Méthodes de numération des plaquettes

3.1. Les méthodes manuelles

3.1.1. Numération en cellule de comptage

Une numération précise des populations globulaire, leucocytaire et plaquettaire peut être effectuée après dilution d’un spécimen sanguin et lecture au microscope à l’aide d’une cellule de comptage (comme par exemple la cellule de Malassez) ou hématimètre. Les numérations plaquettaires et leucocytaires sont effectuées après dilution du sang, classiquement collecté sur EDTA, dans une solution d’oxalate d’ammonium lysant les hématies. La dilution du sang peut être facilitée grâce à l’utilisation d’un kit de dilution spécifique de la population sanguine à dénombrer (Thrombo-TIC® ou Leucoplate®) [9].

Après un temps de contact variable avec l’agent de lyse, la solution est déposée dans la chambre de comptage de l’hématimètre. La cellule de Malassez contient deux chambres calibrées et subdivisées en 100 rectangles de 0,01 mm³ chacun, soit un volume de 1mm³ dans le quadrillage de la zone de comptage. Il suffit ensuite de compter les cellules sanguines (plaquettes et/ou leucocytes) à l’aide d’un microscope dans les zones de lecture afin d’obtenir leur concentration (Figure 2).

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Figure 2 : Comptage sur cellule de Malassez (d’après [9])

Même si cette méthode reste la méthode de référence d’un laboratoire de biologie médicale lorsque les résultats d’un analyseur d’hématologie discordent avec la clinique et/ou l’examen du frottis sanguin, cette méthode est relativement peu précise. On rapporte des coefficients de variation intra-opérateur dépassant les 20% [9].

3.1.2. Frottis sanguin

L’examen du frottis sanguin est souvent négligé, semblant long et fastidieux mais reste néanmoins nécessaire pour confirmer ou infirmer les résultats donnés par un analyseur. Il peut permettre entre autres d’obtenir la numération plaquettaire semi quantitative. Cette évaluation semi-quantitative a été étudiée chez l’Homme et de nombreuses espèces animales. Un facteur de conversion compris entre 15 et 20 appliqué à une estimation du nombre moyen de plaquettes visualisées sur un frottis sanguin à grossissement x1000, a été rapporté chez l’Homme [10]. La corrélation entre un comptage manuel sur cellule de Malassez et une estimation du nombre moyen de plaquettes observées sur frottis sanguin au grossissement

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x1000 du microscope (oculaire x10 et objectif à immersion x100), a été établie à partir de 50 spécimens sanguins de chat [11]. Après exclusion des spécimens présentant des agrégats plaquettaires, le coefficient de corrélation obtenu était acceptable (r = 0,776) et l’équation de régression linéaire était la suivante [11] :

Y = 19,1 ∙ X

avec Y = le nombre de plaquettes obtenu sur cellule de Malassez X = le nombre moyen de plaquettes obtenu par champ au grossissement x1000

La corrélation est meilleure après transformation logarithmique (r = 0,892), mais il est plus pratique d’utiliser un facteur multiplicateur égal à 20, permettant rapidement de convertir le nombre moyen de plaquettes observées au microscope en une concentration plaquettaire (en 10⁹/L) [11]. Cependant, le facteur multiplicateur dépend du champ de vision du microscope et en particulier de l’indice de champ de l’oculaire (ou FN pour field number).

Dans l’étude précédemment citée, l’oculaire avait un indice de champ de 20 ou FN20 qui correspond à un diamètre de champ (c’est-à-dire de la zone circulaire de lecture) égal à 0,2 mm (avec l’oculaire de x10 et l’objectif à immersion x100).

Si l’oculaire était de FN22, le diamètre du champ de lecture aurait été plus grand, en conséquence le facteur multiplicateur du nombre moyen de plaquettes observées par champ aurait été plus faible (de l’ordre de 15) [9, 10]. Il existe une table de conversion des facteurs multiplicateurs en fonction de l’indice de champ de l’oculaire [10] (Tableau I).

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Tableau I : Indice de champ d’un oculaire de microscope et facteur multiplicateur associé pour le calcul de la numération plaquettaire (en 10⁹/L)

*Facteur multiplicateur à multiplier au nombre moyen de plaquettes observées par champ au grossissement x1000 (oculaire x10 et objectif à immersion x100) pour obtenir la numération plaquettaire (en 10⁹/L).

Ainsi, il paraît aisé d’apprécier de façon semi-quantitative la numération plaquettaire dans l’espèce féline en l’absence d’agrégats plaquettaires. Une étude du même genre dans l’espèce canine a établi un facteur multiplicateur identique [70]. Par ailleurs, il est à souligner que l’observation du frottis permet également d’estimer le degré d’agrégation des plaquettes dans le spécimen.

3.2. Méthodes utilisant les automates d’hématologie

Les automates d’hématologie utilisent trois principes d’analyse distincts pour la détermination de l’hématocrite [9].

3.2.1. Analyse quantitative du buffy coat (QBC)

L’analyse quantitative de l’anneau leuco-plaquettaire ou buffy coat a été développée dans les années 1980 [9]. Elle se fonde sur la séparation des différentes populations de cellules sanguines selon leur densité. Cette méthode nécessite la centrifugation du sang (prélevé sur EDTA) dans un tube capillaire dont les parois sont recouvertes d’orange d’acridine, colorant vital et fluorochrome capable de se lier principalement aux nucléoprotéines et lipoprotéines. Un flotteur, dont la densité se situe à mi-chemin de celle des

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globules rouges et du plasma, est inséré dans le tube et permet l’étalement de la couche leuco-plaquettaire. La séparation des couches leuco-plaquettaires se fait en regard du flotteur (Figure 3). Sous illumination, les différentes couches vont émettre une fluorescence qui sera lue à plusieurs longueurs d’onde (UV) pour quantifier l’ADN et l’ARN et déterminer ainsi la taille des anneaux correspondants aux populations cellulaires colorées par l’orange d’acridine (plaquettes, granulocytes et lymphocytes/monocytes). Ainsi, l’épaisseur mesurée de chaque couche cellulaire permet, avec l’aide de données programmées pour chaque espèce, de calculer les numérations plaquettaire et leucocytaire en plus de la mesure de l’hématocrite.

Figure 3 : Principe de l’analyse quantitative du buffy coat (d’après [9])

(23)

Les numérations cellulaires ainsi calculées ne sont donc pas toujours exactes, en particulier lors d’affection perturbant la taille des cellules. De plus, dans le cas de la présence d’agrégats plaquettaires de grande taille, ces derniers ne pouvant s’intercaler entre le flotteur et les parois du tube se retrouvent parfois à la périphérie du flotteur. On note alors un pic anormal du tracé d’ARN situé à l’extrémité gauche de la courbe associée aux résultats chiffrés de cet automate (lié à la présence physiologique d’ARN dans les plaquettes) (Figure 2).

Cette méthode a pour avantages d’être robuste, peu coûteuse, relativement rapide et fiable, puisqu’elle se fonde sur le principe de la centrifugation de cellules de densité différente.

3.2.2. Variation d’impédance

Les automates à variation d’impédance utilisent le principe de Coulter, développé dans les années 1950, pour compter et mesurer les cellules. Dans ces analyseurs, le sang est dilué dans une solution électrolytique, puis les cellules passent entre deux électrodes, perturbant ainsi le courant électrique [9]. Une impulsion électrique sera comptée comme une cellule, et la taille de l’impulsion sera proportionnelle à la taille de la cellule (Figure 4). Le nombre et l’intensité des impulsions permettent d’obtenir la numération et le volume des cellules. Les hématies et les plaquettes sont comptées dans une première cuve, puis le comptage des leucocytes s’effectue dans la deuxième cuve de l’analyseur après lyse des globules rouges par une solution de saponine. Ainsi, les différents leucocytes, les plaquettes et les hématies sont uniquement différenciés par leur taille.

(24)

Figure 4 : Principe de la variation d’impédance (d’après [9])

L’un des inconvénients majeurs de cette méthode est sa tendance à sous-estimer la numération plaquettaire en raison des agrégats plaquettaires. En effet, lorsqu’ils sont de très grande taille, ils sont exclus du comptage, et lorsqu’ils se composent de quelques plaquettes, ils sont comptés en tant qu’hématies ou leucocytes [9].

Par contre, cette méthode est relativement rapide, peu chère et semble plus précise que les méthodes manuelles, en l’absence d’agrégats plaquettaires, puisqu’elle compte plusieurs milliers de cellules. Pour cette raison, elle continue à être utilisée dans des analyseurs de dernière génération utilisant le principe de la cytométrie en flux comme seconde évaluation des numérations globulaires et plaquettaires.

(25)

3.2.3. Cytométrie en flux

La cytométrie en flux est actuellement considérée comme la méthode la plus élaborée, voire le Gold Standard des automates d’hématologie en biologie médicale humaine, notamment pour la numération et la reconnaissance leucocytaire. Les cellules sanguines traversent un faisceau laser entraînant : 1/ son interruption, permettant le comptage (d’où parfois la dénomination de comptage par optique) ; 2/ sa diffraction en relation avec la taille, la granulosité et la densité de chaque cellule, permettant une identification précise des types cellulaires notamment celles des réticulocytes [9] (Figure 5).

Figure 5 : Principe de la cytométrie en flux (d’après [9])

Cette méthodologie a donc pour avantage de différencier les cellules plus exactement que les deux précédentes, et notamment les macroplaquettes versus les hématies. Les plaquettes seront identifiées comme telles puisque leur indice de diffraction est nettement différent de celui des hématies, malgré une taille voisine.

(26)

II. MATERIEL ET METHODES

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1. CADRE D’ETUDE

Notre étude s’est déroulée sur deux (02) mois du 12 juillet au 10 septembre 2017 à la Banque de Sang du CNHU/HKM de Cotonou. Le Centre National Hospitalier et Universitaire Hubert Koutoukou Maga de Cotonou est le premier centre de référence du Bénin dirigé actuellement par M. Alexandre K. SOSSOU, administrateur des hôpitaux.

Il est situé au bord de la voie Cadjehoun-Ganhi, entre l’Institut National Médico- Sanitaire (INMES) et le Camp Guézo, le CNHU/HKM fait face à la présidence de la république. La Banque de Sang se situe à droite à moins de cent mètres de l’entrée principale du CNHU-HKM. Le bâtiment de la BDS est partagé avec l’Antenne Départemental de Transfusion Sanguine ADTS/AL. Le Chef Service de la BDS est le Professeur André BIGOT et l’actuel surveillant est M. Cyriaque COCO.

2. METHODE DE TRAVAIL 2.1. Echantillonnage

Notre étude a porté sur les CPS réalisés par le ADTS/AL et servis à la BDS du CNHU-HKM au profit des malades souffrant d’une thrombopénie.

2.2. Matériel

Le matériel utilisé est constitué de :

- Automate d’hématologie Sysmex KX-21N - Centrifugeuse

- Pipettes P1000 ; P100 ; P50 - Tubes secs

- Agitateur

- Lames et lamelles ou lames rodées - Microscope binoculaire

- Râtelier de Lames - Bac à colorant

- Colorants de May-Grunwald et Giemsa - Huile à immersion

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2.3. Mode opératoire

Les travaux se sont déroulés en deux phases

2.3.1. Corrélation et proportionnalité entre la numération des plaquettes à l’automation et sur frottis de CPS

Pour évaluer la corrélation et la proportionnalité entre la numération des plaquettes à l’automation et sur frottis de CPS, nous avons utilisé cinq échantillons de CPS. Les manipulations effectuées au moment de la cession des CPS, se résumé comme suit :

- sceller les boudins de chaque poche,

- couper le bout distal du boudin scellé et récupérer l’échantillon de CPS dans un tube sec neuf,

- Prélever dans deux tubes secs 100µl de CPS

- Le premier tube est utilisé pour déterminer le taux de plaquettes sur automate KX21N,

- A partir du deuxième tube, réaliser des dilutions successives au ½, ¼,¹/₈,

1/16,¹/32 et au ¹/64 dans six tubes secs neufs,

- Prélever 10 µl de CPS du deuxième tube et des dilutions et confectionner deux frottis minces,

- Laisser sécher les frottis pendant quelques minutes sur un râtelier de lames, - Mettre les frottis dans le bac contenant le May Grünwald pendant cinq (5)

minutes,

- Rincer dans un autre bac contenant de l’eau de robinet,

- Mettre ensuite les frottis dans le bac contenant le Giemsa pendant trente (30) minutes,

- Rincer à nouveau dans un autre bac contenant de l’eau de robinet, - Faire sécher les lames de frottis,

- Observer au microscope optique à l’objectif x100 (à immersion) - Compter les nombre de plaquettes dans 10 champs microscopiques

(29)

- Faire la moyenne du nombre de plaquettes par champs microscopique.

- Représenter le nuage de points du nombre moyen de plaquettes par champs microscopique en fonction de la concentration réelle de plaquettes obtenue par la méthode automatique

- Tracer la droite de tendance linéaire entre le nombre moyen de plaquettes par champs microscopique et la concentration réelle de plaquettes obtenue par la méthode automatique

- Déterminer pour échantillon le coefficient de proportionnalité entre le nombre moyen de plaquettes par champs microscopique et la concentration réelle de plaquettes obtenue par la méthode automatique.

- Déterminer le coefficient de proportionnalité moyen (facteur F) entre le nombre moyen de plaquettes par champs microscopique et la concentration réelle de plaquettes obtenue par la méthode automatique.

2.3.2. Comparaison entre le nombre réel de plaquettes déterminer par l’automate et celui calculé à partir du frottis de CPS

Elle a porté sur 30 CPS au moment de leur cession. La procédure utilisée est la suivante :

- sceller les boudins de chaque poche,

- couper le bout distal du boudin scellé et récupérer l’échantillon de CPS dans un tube sec neuf,

- prélever 10 µl de CPS du tube sec,

- confectionner deux frottis de CPS par échantillon - colorés les frottis au MGG

- observer les frottis colorés à l’immersion à l’objection 100X - Faire une double lecture en aveugle

- Compter les plaquettes dans 10 champs microscopiques.

(30)

- Calculer la concentration plaquettaire (G/L) de CPS en multipliant le nombre moyen de plaquettes par champs par le facteur F.

- Comparer le nombre de plaquettes déterminé par l’automate et celui obtenu par calcul à partir du nombre moyen de plaquettes par frottis de CPS.

2.4. Analyses statistiques

Pour les données quantitatives les moyennes et les écart-types ont été déterminées. Les fréquences ont été calculées au niveau des données qualitatives.

Pour évaluer la corrélation entre les différentes méthodes de détermination du nombre de plaquettes nous avons utilisé le test de corrélation de Pearson. La normalité de la population a été préalablement vérifiée par les tests de Kolmogorov-Smirnov et Shapiro-Wilk. Les moyennes ont été comparées par le test t. L’objectif poursuivi par l’utilisation de ce test est de comparer les résultats obtenus par la méthode de référence aux résultats obtenus par les techniques expérimentales. Puisque les moyennes proviennent des mêmes patients, elles sont appelées moyennes dépendantes.

(31)

III. RESULTATS ET DISCUSSION

(32)

1. RESULTAT

1.1. Statistique descriptive

L’étude a porté sur 35 CPS. Les échantillons utilisés pour leur préparation présentent une moyenne d’hématocrite de 40,93% avec un écart-type de 3,36 (tableau II).

Tableau II : Statistique descriptive de l’hématocrite des échantillons utilisés pour la préparation des CPS

N Valide 35

Manquant 0

Moyenne 40,9333 %

Ecart type 3,36240 %

Minimum 34,00 %

Maximum 47,00 %

La concentration en plaquettes des CPS utilisés varie de 162 à 370 G/L avec une moyenne de 254,73G/L (tableau III)

Tableau III : Statistique descriptive de la concentration en plaquettes des CPS

N Valide 35

Manquant 0

Moyenne 254,73 G/L

Ecart type 57,040 G/L

Minimum 162 G/L

Maximum 370 G/L

1.2. Corrélation entre nombre de plaquettes déterminé par l’automate et nombre moyen de plaquettes par champs microscopique

Le coefficient de corrélation de Pearson obtenu (0,999) montre l’existence d’une forte corrélation entre la concentration en plaquettes donnée par l’automate et le nombre moyen de plaquettes trouvé par champs microscopique (tableau IV).

(33)

Tableau IV : Corrélation entre moyenne de Plt/champs et concentration réel de plaquettes dans les CPS

Ptl à automate Plt sur frottis

Ptl à automate Corrélation de Pearson 1 0,999

Sig. (unilatérale) ,000

N 14 14

Plt sur frottis Corrélation de Pearson 0,999 1

Sig. (unilatérale) ,000

N 14 14

** La corrélation est significative au niveau 0.01 (unilatéral).

1.3. Proportionnalité entre nombre de plaquettes déterminé par l’automate et le nombre moyen de plaquettes par champs microscopique

La représentation du nuage de points du nombre moyen de plaquettes compté sur frottis en fonction de la concentration réelle de plaquettes obtenue par la méthode automatique, révèle un regroupement autour d’un même droite Y = 5,347X

(figure 6). Le coefficient de proportionnalité est donc de 5,35.

Figure 6: corrélation entre nombre de Plt par champs et numération par l’automate.

y = 5,3471x R² = 0,9902

0 100 200 300 400 500 600 700 800

0 20 40 60 80 100 120 140

Nombre de plaquettes (G/L)

Nombre moyen de Plt par champs

(34)

1.4. Comparaison entre le nombre de plaquettes réel et celui calculé à partir du frottis

En utilisant le coefficient de proportionnalité déterminé dans cette étude, le nombre de plaquettes a été déterminé sur frottis et comparé au nombre réel obtenue à l’automate.

La figure 7 présente la représentation du nombre de plaquettes obtenu par les deux méthodes. La médiane est dans le bas de la boite grise, ce qui suppose une distribution asymétrique vers les valeurs basses du nombre de plaquettes à l’automate. Tandis qu’au niveau du nombre de plaquettes obtenu sur frottis, la médiane est au milieu de la boite blanche, ce qui suppose une distribution symétrique. Aussi, la médiane est plus haute sur frottis que sur l’automate, ce qui indique que les valeurs de plaquettes sur frottis sont plus élevées. En ce qui concerne l’étendue interquartile, on note une grande variabilité des valeurs sur frottis que sur l’automate.

Figure 7 : Box-plot du nombre de plaquettes suivant la méthode de numération

(35)

La moyenne du nombre de plaquettes est de 254,73 sur l’automate contre 256,98 sur frottis. Les écart-types sont légèrement plus élevés au niveau de l’automate.

Mais le test t montre qu’il n’existe aucune différence significative entre la valeur du nombre de plaquette obtenue par les deux méthodes (tableau V).

En d’autres termes, la méthode de détermination du nombre de plaquettes sur frottis aboutit statistiquement aux mêmes résultats que la numération faite par l’automate.

Tableau V : Comparaison des moyennes du nombre de plaquettes obtenus par les deux méthodes

Moyenne N

Ecart type

Moyenne erreur standard

p value Plt à automate 254,73 30 57,040 10,414

0,227 Plaquette sur

frottis 256,9783 30 55,35836 10,10701

(36)

2. DISCUSSION

La connaissance du nombre de plaquettes par unité de CPS est un impératif pour le système de transfusion sanguine [12]. La méthode mise au point, de par sa simplicité offre une possibilité à tous les banques de sang de contrôler la conformité en plaquettes des CPS. En effet, cette méthode ne nécessite pas un matériel spécial. On a juste besoin d’un microscope, de lames, de colorant de MGG et d’huile à immersion. Cette méthode alternative de numération des plaquettes dans les CPS s’est inspirée de la numération plaquettaire semi- quantitative sur frottis sanguin [9] mais a abouti à des résultats meilleurs. Les travaux effectués sur les frottis sanguins ont donnés un coefficient de corrélation linéaire R² = 0,776. Dans notre étude réalisé sur les CPS, la corrélation obtenue est plus forte R² = 0,999. Cette différence peut s’expliquer par l’aisance du compte des plaquettes sur les frottis CPS. En effet, sur ces frottis les plaquettes sont pratiquement les seuls éléments présents, ce qui rend leur comptage facile.

La présence des autres cellules sanguines (hématies et leucocytes) sur les frottis de CPS est très rare. Alors que le comptage des plaquettes sur frottis sanguin est associé à de nombreux risques d’erreurs dont les artéfacts, les plaquettes dissimulées par les hématies ou leucocytes [10]. De risques d’erreurs existent aussi au niveau des frottis de CPS. Il s’agit surtout de la formation d’agrégats plaquettaires.

L’équation de régression linéaire de la numération des plaquettes sur frottis de CPS (Y = 5,35 X) est différente de celui obtenue sur frottis sanguin (Y = 19,1 X) [11]. Cette différence s’explique par la concentration élevée de plaquettes dans les CPS. Ce qui fait que le nombre moyen de plaquettes par champs microscopique est très grand sur les frottis de CPS.

Les concentrations de plaquettes déterminées par la nouvelle méthode présentent une légère augmentation mais non significative par rapport aux résultats de la numération plaquettaire automatisée. S’il est vrai que cette dernière est la

(37)

méthode de référence, on ne doit pas perdre de vue qu’elle entraine quelque fois des pseudo-baisse de la concentration plaquettaire liés à des agrégats produits par certains anticoagulants, notamment l’EDTA [12, 13].

(38)

CONCLUSION

Au terme de cette étude menée à la banque de sang de CNHU-HKM de juillet à septembre 2017 et qui a porté sur 35 échantillons de concentré plaquettaire standard, nous avons mise au point une méthode manuelle de numération des plaquettes. Elle consiste à confectionner des frottis de CPS colorés au MGG. La concentration plaquettaire (G/L) de CPS est égale au nombre moyen de plaquettes par champs multiplié par le facteur F (5,35).

La comparaison entre les résultats de cette nouvelle méthode et ceux obtenus à l’automate révèle une égalité des moyennes. Les objectifs que nous poursuivrions en choisissant ce terme : « Mise au point d’une méthode manuelle d’estimation du nombre de plaquettes dans concentré plaquette standard » sont atteints.

Nous voudrions terminer cette conclusion en attirant l’attention des autorités de la santé en général et en particulier celle des responsables de la transfusion sanguine sur la nécessité de doter les laboratoires d’immuno-hématologie des moyens adéquats et de personnel qualifié afin d’offrir des produits sanguins labiles de bonne qualité aux malades.

(39)

Références bibliographiques

1. P. Horde Juin 2017 Plaquettes sanguines Journal des Femmes Santé (sante- medecine.journaldesfemmes.com)

2. Nguyen KA, Cognasse F, Boussoulade F, Fabrigli P, Odent-Malaure H, Absi L, Chavarin P, Garraud O. Les concentrés plaquettaires en transfusion sanguine : préparation, normes et principes de sécurité pour une meilleure tolérance et l’éviction d’effets indésirables. Hématologie 2013 ; 19 : 371-382.

3. Sweeney J. Quality assurance and standards for red cells and platelets. Vox Sang 1998 ; 74 (Suppl. 2) : 201-5.

4. Zandecki M. Les plaquettes sanguines : structure, fonctions, méthodes d’exploration.

Faculté de Médecine – CHU 49000 Angers France. Disponible sur https://tenma123.files.wordpress.com/2008/10/34-plaquettes-sanguines.pdf consulté en octobre 2017.

5. Stivala JFA, Wagstaff W. Quality assurance in blood transfusion. Vox Sang 1994 ; 67 (Suppl. 5) : 37-42.

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Contrôle de qualité des concentrés plaquettaires : expérience du centre de transfusion de Sousse (Tunisie) Ann Biol Clin 2004, 62 : 115-9

7. Masse M. Qualité des produits plaquettaires : méthodes actuelles d’exploration in vitro.

Transfus Clin Biol 1995 ; 2 : 79-84.

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8. Seghatchian J, Krailadsiri P. The platelet storage lesion. Transfusion Med Rev 1997 ; 11 : 130-44.

9. Granat F. 2016. Agrégation plaquettaire in vitro : effets anticoagulants du CTAD et utilisation à des fins diagnostiques dans les espèces sensibles. Doctorat de l’Université de Toulouse, 90p

10. Woo HY, Shin SY, Park H, Kim YJ, Kim HJ, Lee YK, Chae SL, Chang YH, Choi JR, Han K, Cho SR, Kwon KC. Current status and proposal of a guideline for manual slide review of automated complete blood cell count and white blood cell differential. Korean J Lab Med2010 ; 30: 559-66.

(40)

Rapport de stage / EPAC / CAP / GBH Réalisé et soutenu par BADAROU Fataï Djidjoho Page 40 11. Etienne M F L. 2009. Etude comparative de la mesure de l’épaisseur du buffy-coat avec les valeurs chiffrées de l’hémogramme chez le chien. Doctorat de l’Université de Toulouse, 90p

12. Stivala JFA, Wagstaff W. Quality assurance in blood transfusion. Vox Sang 1994 ; 67 (Suppl. 5) : 37-42.

13. Rym Ellouze Sami Guermaz, Ann Biol Clin 2013 ; Importance de l’étape préanalytique en hémostase, 71(4):401-7.

(41)

Table des matières

Dédicace ... 5

Remerciements ... 6

Hommages ... 7

LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS ... 8

LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES ... 9

RESUME ... 10

ABSTRACT ... 11

INTRODUCTION ... 12

Objectif général ... 13

Objectifs spécifiques ... 13

I. SYNTHESE DE LITTERATURE ... 14

1. PLAQUETTES ... 15

1.1. Origine ... 15

1.2. Structure ... 15

2. LES CONCENTRES PLAQUETTAIRES ... 16

2.1. Concentré plaquettaire d’aphérèse (CPA) ... 16

2.2. Concentré plaquettaire standard (CPS) ... 16

2.3. Solution de conservation ... 17

2.4. Transfusion des plaquettes ... 17

3. Méthodes de numération des plaquettes ... 18

3.1. Les méthodes manuelles ... 18

3.1.1. Numération en cellule de comptage ... 18

3.1.2. Frottis sanguin ... 19

3.2. Méthodes utilisant les automates d’hématologie ... 21

3.2.1. Analyse quantitative du buffy coat (QBC) ... 21

3.2.2. Variation d’impédance ... 23

3.2.3. Cytométrie en flux ... 25

II. MATERIEL ET METHODES ... 26

1. CADRE D’ETUDE ... 27

2. METHODE DE TRAVAIL ... 27

2.1. Echantillonnage ... 27

2.2. Matériel ... 27

2.3. Mode opératoire ... 28

2.3.2. Comparaison entre le nombre réel de plaquettes déterminer par l’automate et celui calculé à partir du frottis de CPS ... 29

(42)

Elle a porté sur 30 CPS au moment de leur cession. La procédure utilisée est la suivante : ... 29

2.4. Analyses statistiques ... 30

III. RESULTATS ET DISCUSSION ... 31

1. RESULTAT... 32

1.1. Statistique descriptive ... 32

1.2. Corrélation entre nombre de plaquettes déterminé par l’automate et nombre moyen de plaquettes par champs microscopique ... 32

1.3. Proportionnalité entre nombre de plaquettes déterminé par l’automate et le nombre moyen de plaquettes par champs microscopique ... 33

1.4. Comparaison entre le nombre de plaquettes réel et celui calculé à partir du frottis ... 34

2. DISCUSSION ... 36

CONCLUSION ... 38

Références bibliographiques ... 39