ABRÉVIATIONS... 4
BUT DU TRAVAIL ... 7
RÉSUMÉ ... 8
INTRODUCTION... 10
I. Le mélanome... 10
1. Epidémiologie... 10
2. Classifications anatomopathologiques et cliniques. ... 10
3. Traitements. ... 12
II. Rappels théoriques concernant le développement d’un cancer... 13
1. La genèse d’un cancer... 13
2. La croissance tumorale. ... 14
a. Généralités. ... 14
b. La prolifération cellulaire. ... 15
c. L’apoptose et les autres types de morts cellulaires... 16
3. La migration cellulaire et la formation des métastases... 18
a. Généralités. ... 18
b. La migration cellulaire... 20
i. L’adhésion... 20
ii. La motilité... 23
iii. L’invasion. ... 25
4. Les cellules cancéreuses migrantes résistent à l’apoptose... 27
5. La néo-angiogénèse tumorale. ... 28
III. Les facteurs biologiques qui influencent le développement du mélanome. ... 29
1. Les phases de développement du mélanome. ... 29
2. Les différents facteurs modulant le développement du mélanome... 31
3. La néo-angiogenèse au sein des mélanomes... 33
4. La résistance des mélanomes à la chimiothérapie. ... 34
5. Pourquoi pensons-nous que la gastrine pourrait influencer la biologie des mélanomes ?... 35
a. Réponse à la question... 35
b. La gastrine et les peptides qui lui sont apparentés... 35
c. Les récepteurs cellulaires de la gastrine... 36
d. Rappel des effets biologiques exercé par la gastrine au niveau de divers types de cancers. ... 38
6. Pourquoi pensons-nous que la galectine 1 pourrait influencer la biologie des mélanomes ?.. ... 39
a. Réponse à la question... 39
b. La galectine 1 et les protéines qui lui sont apparentées... 40
c. Les ligands et rôles de la galectine 1. ... 41
d. Rappel des effets biologiques exercé par la galectine 1 au niveau de divers types de
cancers, dont les mélanomes... 42
MATÉRIELS ET MÉTHODES ... 45
I. Les modèles utilisés... 45
1. In vitro... 45
a. La culture cellulaire. ... 45
b. Les transfections transitoires... 45
2. In vivo. ... 46
II. Les techniques utilisées... 48
1. Pour évaluer le taux de croissance d’une population cellulaire... 48
a. In vitro... 48
i. Le test colorimétrique MTT... 48
ii. La cytométrie de flux... 49
b. In vivo: le marquage immunohistochimique révélant l’antigène Ki-67. ... 49
2. Pour évaluer le taux d’apoptose in vitro. ... 50
a. La cytométrie de flux... 50
b. L’analyse du clivage de PARP par western blot... 51
3. Pour détecter et quantifier les compartiments cellulaires acides. ... 51
4. Pour évaluer la migration cellulaire in vitro. ... 52
a. La vidéomicroscopie assistée par ordinateur. ... 52
b. Les chambres d’invasion de Boyden. ... 53
5. Pour évaluer ensemble la croissance et la migration : le test de la « cicatrice ». ... 54
6. Pour évaluer les phénomènes vasculaires in vivo : quantification des vaisseaux... 54
7. Pour évaluer le taux d’expression génique. ... 54
a. Au niveau de l’ARN messager. ... 54
iii. La RT-PCR. ... 54
iv. Les damiers d’ADNc. ... 56
b. Au niveau protéique in vitro. ... 57
v. Le western blot... 57
vi. La microscopie en fluorescence... 58
c. Au niveau protéique in vivo : l’immunohistochimie. ... 59
III. Analyses statistiques. ... 60
RÉSULTATS... 62
I. Rôles de la gastrine dans la biologie des mélanomes. ... 62
1. Caractérisation de l’expression des récepteurs à la gastrine... 62
2. Effets de la gastrine sur les propriétés de croissance des mélanomes in vitro... 64
3. Effets de la gastrine sur les propriétés de migration des mélanomes in vitro... 64
a. La motilité cellulaire... 64
b. L’adhésion cellulaire... 65
c. L’invasion cellulaire. ... 66
4. Caractérisation des effets de la combinaison thérapeutique de la gastrine avec un agent cytotoxique... 66
5. Caractérisation des rôles de la gastrine sur les phénomènes de néoangiogénèse tumorale in vivo. ... 67
II. Rôles de la galectine 1 dans la biologie des mélanomes... 69
1. Etude des effets de médicaments cytotoxiques in vitro. ... 69
2. Comparaison de la sensibilité aux molécules pro-apoptotiques et au témozolomide (pro-
autophagique) des modèles de mélanomes développés in vivo... 70
3. Mise au point de la déplétion transitoire des cellules B16F10 en galectine 1. ... 70
4. Caractérisation de la réponse au témozolomide du modèle métastatique B16F10 in vivo provenant de greffes de cellules transitoirement déficientes ou non en galectine 1... 72
5. Caractérisation du mécanisme d’action de la déplétion en galectine 1 sur la sensibilité au témozolomide... 73
a. Effets sur la motilité cellulaire... 73
b. Effets sur la mort cellulaire... 75
DISCUSSION ... 78
I. Résistance des mélanomes à l’apoptose. ... 78
II. La gastrine et le mélanome... 80
III. La gastrine renforce l’effet cytotoxique du cisplatine et de la dacarbazine. ... 81
IV. Gastrine et néo-angiogenèse... 82
V. La galectine 1 et les mélanomes. ... 83
VI. Peut-on envisager une application thérapeutique pour une molécule anti-galectine 1 ? ... 86
CONCLUSIONS ... 89
ANNEXES ... 108
Abréviations
aa: acide aminé
ADN, ADNc : acide déoxyribonucléique, ADN complémentaire AIF : apoptosis inducinf factor
Akt : sérine/ thréonine protéine kinase B AMF : autocrine motility factor
AP-1 : protéine activatrice 1
Apaf 1 : apoptotic protease activating factor 1 ARF: alternate reading frame
ARN, ARNm: acide ribonucléique, ARN messager ATM : ataxie-télangiectasie molécule
Bad : protéine pro-apoptotique associée Bcl-2 Bak : protéine pro-apoptotique antagoniste de Bcl-2 Bax : protéine X pro-apoptotique associée à Bcl-2 BCA : acide bicinchoninique
Bcl-2 : protéine 2 des cellules de lymphome B Bcl-xl : long variant d’épissage de la protéine Bcl-X BECN1 : becline 1
bFGF: basic fibroblast growth factor
BNIP3 : Bcl-2-adenivirus E1B 19kDa-interacting protein 3 BSA : albumine bovine sérique
C: cystéine Ca
2+: calcium
Cas: substrat associé à Crk CCK: cholécystokinine CDK : cyclin-dependent kinase
Cdc42: cycle division control protein 42
Crk: protéine adaptatrice encodée par un oncogène viral de sarcoma aviaire Cu : cuivre
DAG : diacylglycérol
DAPK : death-associated protein kinase dNTP: déoxynucléotide tri-phosphate
DRP1 : death-associated related protein kinase 1 ERK: extracellular signal-regulated protein kinase FADD: Fas associated death domain protein
FAK: focal adhesion kinase
FAS : membre 6 de la superfamille des TNF récepteurs FCS : sérum de veau foetal
FDA: Food and Drug Administration FITC : fluorésceine isothiocyanate
G (G-17) gastrine (gastrine de 17 acides aminés) GBP: gastrin binding protein
Gly-gastrine: gastrine étendue d’une glycine HRP : Horse radish peroxydase Hsp70 : heat shock protein 70
IAP : protéine inhibitrice d’apoptose IFNα2b: interferon alpha 2b
IGF: insulin-like growth factor
IL: interleukine
ILK : integrin-linked kinase IP3 : inositol tri-phosphate
IV: intra-veineux
JNK : c-Jun N-terminal kinase
LEF-TCF: lymphoid enhancer factor- T cell factor LDH: lactate déshydrogénase
3-MA: 3-méthyladénine MAP: mitogen actived protein
M-CAM: melanoma cell adhesion molecule
MITF: facteur de transcription associé à la microphtalmie MGSA : melanoma growth stimulatory activity
MLC : myosin light chain MMP: métallo-protéase
MRDO : mean relative distance to the origin MT-MMP : métallo-protéase de type membranaire MTOC: microtublue organizing center
mTOR: cible mammalienne de la rapamycine
MTT : 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-déphenyltétrazolium bromide N-CAM : neural cell adhesion molecule
NFAT : Nuclear factor of activated T cells pre-existing component NFκB : facteur nucléaire kappa B
p53: protéine suppressive de tumeur p53 PAI: inhibiteur de l’activateur du plasminogène PARP : poly ADP-ribose polymérase
PAS : periodic acid schiff
PDGF: plattelet derived growth factor
PI3K : phosphatidyl-inositol-tri-phosphate kinase PKC : protéine kinase de type C
PLC: phospholipase C PS : phosphatidyl sérine
PTEN : tensine homologue phosphatase
Raf : sérine/ thréonine kinase homolgue de l’oncogène de leucémie murine v-raf Ras: rat sarcoma virus oncogene
Rac: Ras-related C3 botulinum toxin substrate Rb : protéine de suceptibilité au rétinoblastome Rho: Ras homology protein
RT-PCR: reverse transcription- polymerase chain reaction Scr: cellules transfectées avec un siRNA aléatoire Si : cellules transfectées avec un siRNA anti-galectine 1 siRNA: small interfering RNA
Src: Rous sarcoma oncogene
Stat : signal transductor and activator of transcription tPA : tissue-type plasminogen activator
TGF : tumor growth factor
TNF-α: tumor necrosis factor alpha TIMP: inhibiteur tissulaire des MMP TMZ: témozolomide
TRAIL: TNF-related apoptosis-induced ligand
TUNEL: terminal deoxynucleotidyl transferase deoxyuridine triphosphate nick-end labelling
UI: Unite Internationale
uPA: urinary plasminogen activator uPAR: récepteur à l’uPA
UV: rayon ultra-violet
Wnt: Wingless type Murine mammary tumor virus integration site
Wt: wild type cells
But du Travail
Le mélanome figure parmi les cancers associés aux pronostics les plus sombres, et ce en raison de son taux de réponse très faible à la radiothérapie et à la chimiothérapie. Cette résistance à la radiothérapie et à la chimiothérapie provient essentiellement du fait que les cellules de mélanomes sont résistantes à l’apoptose, et que la radiothérapie ainsi que bon nombre d’agents chimiothérapiques induisent la mort des cellules cancéreuses en y induisant l’apoptose. Dès lors, de nombreuses voies de traitements autres que la chimiothérapie et la radiothérapie ont été développées dans le cadre du mélanome, mais à nouveau avec un taux de réussite très faible.
Certains de ces traitements au sujet desquels de réels espoirs sont fondés font appel à l’utilisation de nouvelles formes de vaccinothérapie, d’immunothérapie ou encore à l’utilisation de
« biomolécules », c’est-à-dire à des molécules rencontrées de manière endogène par les cellules de mélanomes comme certaines cytokines. C’est dans cette voie que s’inscrit notre travail. En effet, nous avons voulu investiguer les rôles de la gastrine et de la galectine 1 sur le comportement biologique des cellules de mélanomes.
Nous avons choisi d’étudier le rôle potentiel de la gastrine au niveau de la biologie des mélanomes pour trois raisons majeures : 1) il existe des essais cliniques en cours faisant appel à des traitement
« anti-gastrine » dans le cas de cancers digestifs, 2) la gastrine modifie les paramètres biologiques de cancers ayant des origines embryologiques comparables à celles des mélanomes, à savoir les cancers médullaires de la thyroïde, les cancers du poumon à petites cellules et les gliomes, 3) le rôle de la gastrine n’a jamais été investigué à ce jour au niveau des mélanomes.
Nous avons choisi d’étudier le rôle potentiel de la galectine 1 au niveau de la biologie des mélanomes à nouveau pour trois raisons majeures, à savoir 1) la galectine 1 intervient dans le processus métastatique et/ou invasif de divers types de cancers, 2) la galectine 1 permet aux cellules cancéreuses, comme ce fut démontré dans le cas de mélanomes expérimentaux, d’échapper aux attaques du système immunitaire, 3) la galectine 1 confèrerait une certaine résistance aux cellules cancéreuses vis-à-vis de divers types d’agressions biologiques, dont par exemple les processus d’hypoxie.
Nous avons donc voulu investiguer la possibilité d’utiliser la gastrine et la galectine 1 comme
nouvelles cibles potentielles dans le cas de thérapies contre le mélanome.
Résumé
Comme nous l’indiquions dans le But du Travail, le mélanome figure parmi les cancers associés aux pronostics les plus sombres, et ce en raison de son taux de réponse très faible à la radiothérapie et à la chimiothérapie. Cette résistance à la radiothérapie et à la chimiothérapie provient essentiellement du fait que les cellules de mélanomes sont résistantes à l’apoptose, et que la radiothérapie ainsi que bon nombre d’agents chimiothérapiques induisent la mort des cellules cancéreuses en y induisant l’apoptose. Nous avons voulu investiguer les rôles de la gastrine et de la galectine 1 sur le comportement biologique des cellules de mélanomes afin de voir s’il était possible de proposer la gastrine et/ou la galectine 1 comme nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans le cas du mélanome.
Notre stratégie de recherche est basée sur le principe (démontré sur le plan expérimental par de nombreuses études) selon lequel les cellules cancéreuses migrantes résistent à l’apoptose, et sont dès lors protégées contre les effets pro-apoptotiques de la chimiothérapie et de la radiothérapie qui représentent la quasi totalité de l’arsenal thérapeutique dont disposent les oncologues pour combattre les cancers. Diverses études expérimentales ont démontré que le fait de réduire le taux de migration de cellules cancéreuses résistantes à l’apoptose conférait à celles-ci une sensibilité accrue aux agents pro-apoptotiques. Nos résultats démontrent que la gastrine modifie de manière très significative les propriétés migratoires des cellules de mélanomes, sans toutefois modifier leur sensibilité à des agents pro-apoptotiques. Au contraire, la gastrine protègerait les cellules de mélanomes contre l’apoptose. Nous démontrons également dans notre travail, in vivo, un rôle pro- angiogénique pour la gastrine au sein de xénogreffes de mélanomes humains. Signalons que notre travail est le premier à démontrer un rôle potentiel de la gastrine au niveau de la biologie des mélanomes, tout au moins sur le plan expérimental.
Tout comme nous l’avons observé pour la gastrine, la galectine 1 semble également conférer aux
cellules de mélanomes un certain degré de résistance aux agressions chimiothérapiques. Cette fois,
le fait de diminuer le taux d’expression de la galectine 1 au sein de cellules du mélanome murin
expérimental B16F10 (qui exprime des quantités importantes de galectine 1) renforce l’effet
thérapeutique du témozolomide qui est une molécule cytotoxique. Cet effet semble survenir, tout
au moins partiellement, suite à une diminution du taux d’expression de la protéine Hsp70 (suite à
la diminution du taux d’expression de la galectine 1), avec pour conséquence une augmentation de
la mort cellulaire par perméabilisation de la membrane des lysosomes.
Nous proposons une nouvelle approche thérapeutique pour combattre les mélanomes en faisant
appel à la technique des petits ARN interférants (siRNA), dirigés dans le cas présent contre la
galectine 1.
Introduction
I. Le mélanome.
1. Epidémiologie.
Le mélanome est un cancer qui se développe à partir des mélanocytes. Ces cellules pigmentaires dérivent des crêtes neurales et sont retrouvées au sein de l’épiderme, des muqueuses des sphères ORL et périnéales ainsi que de l’œil (Gilbert, 2000). Le mélanome peut donc se développer au départ de ces différents sites (Figure 1). Selon le rapport du National Cancer Data Base (Chang et coll., 1998) 91% des mélanomes sont d’origine cutanée, 5% d’origine oculaire, 1%
ont pour origine les muqueuses et 2% ont un site primitif inconnu. Les modèles expérimentaux de mélanomes que nous avons utilisés dans notre travail sont d’origine cutanée. Aussi, nous nous sommes exclusivement intéressés à ce type de mélanomes dans la suite du chapitre
« Introduction ». Les principaux facteurs de risque des mélanomes cutanés sont liés à l’exposition aux rayons ultraviolets et à des prédispositions génétiques. Ces facteurs ont été analysés et détaillés dans les revues de Gandini et coll. (2005).
Le mélanome cutané est le cinquième site le plus fréquent de cancer chez l’homme, ce qui représente 4 à 5% de tous les cancers (Jemal et coll., 2005). Depuis une vingtaine d’années, l’incidence du mélanome ainsi que la mortalité qui lui est attribuée n’ont fait que croître. Ainsi en France, le nombre de cas pour 100 000 habitants par an est passé de 2.4 en 1980 à 7.6 en 2000 pour l’homme et de 3.9 à 9.5 pour la femme. La mortalité a été multipliée par environ 3 entre 1969 et 1997 (Grange, 2005). Enfin le mélanome est à l’origine de 1 à 2% des décès par cancer (Jemal et coll., 2005).
2. Classifications anatomopathologiques et cliniques.
Nous définissons ci-après différents systèmes qui permettent d’évaluer l’agressivité et le pronostic d’un cancer en général, et des mélanomes en particulier, et ce à partir d’analyses cliniques et anatomopathologiques liés au système TNM et à la détermination des stades.
Le système TNM : T désigne la tumeur primitive ; il existe 4 catégories de T qui sont fonction de
la taille de celle-ci et/ou de l’envahissement des tissus environnants. N désigne les nodes c’est-à-
dire l’envahissement d’un certain nombre de ganglions lymphatiques ou relais ganglionnaires. M
représente les métastases à distance dans d’autres organes.
Les stades : les différents statuts TNM vont être regroupés en stades (de I à IV) en fonction de leur pronostic vital ; au sein d’un même stade, il est possible de distinguer des sous-catégories.
Les stades I et II sont des cancers TxNoMo, le stade III est caractérisé par un envahissement lymphatique et le stade IV par la présence de métastases à distance.
Dans le cas des mélanomes en particulier, les différents facteurs permettant d’établir le statut TNM et le stade sont les suivants :
a. L’indice de Breslow (variable T du système TNM): le mélanome se développe localement parfois d’abord en surface puis en profondeur. Breslow (1970) a défini
« l’indice de Breslow » comme étant la mesure en millimètre de la plus grande épaisseur de la tumeur primitive. La survie du patient y est étroitement corrélée. Les valeurs seuils entre les différentes catégories de T1 à T4 sont de 1, 2 et 4 mm respectivement (Figure 2).
b. L’ulcération (sous-catégories a ou b de la variable T): l’ulcération du mélanome primitif se définit sur base d’une analyse histologique comme une absence d’épiderme intact à la surface de la tumeur : c’est un facteur de mauvais pronostic (Balch et coll., 1980). Ainsi pour une même catégorie T, le pronostic d’un cas ulcéré sera en réalité beaucoup plus proche de celui d’un cas non ulcéré de la catégorie T suivante.
c. L’envahissement lymphatique (variable N du système TNM): dans le cas du mélanome, la dissémination lymphatique peut mener non seulement à l’envahissement de ganglions, dont le nombre et leur envahissement micro ou macro métastatique sont pris en compte dans la classification TNM, mais également à la formation de lésions satellites autour du mélanome primitif ou encore à des métastases dites « en transit » entre la tumeur et les relais ganglionnaires. Ces phénomènes sont repris dans une catégorie Nc à part classée en fonction de leur pronostic défavorable.
d. Les métastases à distance (variable M du système TNM): elles sont principalement localisées au niveau de la peau et des tissus sous-cutanés, des poumons, du foie, du cerveau, des os et du tractus gastro-intestinal. Le nombre et le site des métastases à distance interviennent dans la classification (Figure 2).
e. Le taux de lactate déshydrogénase (LDH) sérique : un taux anormalement
élévé de LDH est le meilleur facteur prédictif de mauvais pronostic en cas de cancer métastatique,
et ce indépendamment du nombre ou du site de ces métastases (Deichmann et coll., 1999 ; Sirott et coll., 1993).
La Figure 3 illustre les taux de survie des différents stades et montre une diminution très importante de celle-ci dès qu’il y a une extension régionale (moins de 50% de survie à 5 ans) ou à distance du mélanome (moins de 10% à 5 ans). La Table 1, reprend la survie des différentes sous- catégories de stades en fonction de la classification TNM et de l’ulcération, montrant des taux similaires au sein d’une même sous-catégorie.
3. Traitements.
a. La chirurgie : la tumeur primitive doit être excisée et les marges de résection seront fonction de l’indice de Breslow. Pour les stades IA (Breslow ≤ 1mm, non ulcérés), cette intervention chirurgicale est suffisante et la survie excellente. Pour les stades cliniques IB et II, une analyse du ganglion sentinelle sera préconisée afin de déterminer la nécessité d’un évidement ganglionnaire si elle s’avère positive. Un tel évidement sera pratiqué en cas d’évidence d’atteinte ganglionnaire (stade III ou IV).
b. Les traitements adjuvants comprennent la radiothérapie, la chimiothérapie et l’immunothérapie. Un traitement adjuvant à base d’interféron sera discuté en fonction du risque pour les stades II anatomopathologiques. Pour les stades III et IV, ces divers traitements adjuvants, seuls ou en combinaison, peuvent être administrés.
La radiothérapie sera utilisée à visée palliative dans le cas de métastases cérébrales ou osseuses (Atallah et Flaherty, 2005 ; Marnitz et coll., 2006).
La chimiothérapie et la biochimiothérapie : il n’y a actuellement pas de traitement complémentaire
standart pour le mélanome. La dacarbazine est le seul médicament cytotoxique enregistrée par la
Food and Drug Administration (FDA) pour le mélanome ; elle est utilisée seule ou en combinaison
avec le cisplatine et la carmustine pour former le régime de Dartmouth ou également le cisplatine
et la vinblastine (traitement CVD) (Lens et Eisen, 2003). Malheureusement, aucune molécule seule
ou combinaison thérapeutique n’a pu être démontrée supérieure aux autres ; le taux de réponse,
c’est-à-dire de régression partielle ou complète de la maladie, est aux environs de 15% seulement
(Atallah et Flaherty, 2005). Plus récemment diverses études ont montré que le témozolomide a une
efficacité comparable à la dacarbazine et peut être utilisé dans le mélanome, seul ou en
combinaison ; cette molécule a l’avantage de passer la barrière hémato-méningée, pouvant ainsi
agir sur les métastases cérébrales, et de pouvoir être administrée par voie orale (Middleton et coll., 2000 ; Agarwala et coll., 2004).
L’immunothérapie : l’utilisation de biomolécules telles que les cytokines comme l’interleukine-2 (IL-2) ou l’interféron alpha 2b (IFNα2b) permettent de renforcer la défense immunitaire naturelle anti-tumorale et sont approuvées par la FDA pour le traitement du mélanome. La combinaison de ces traitements avec des agents cytotoxiques n’a pu être montrée plus efficace que leur utilisation seule (Falkson et coll., 1998; Keilholz et coll., 2005).
La chimiothérapie limitée à un membre : en cas de métastases en transit au niveau d’un membre, une chimiothérapie, généralement à base de melphalan, est administrée uniquement au niveau de celui-ci par dérivation vasculaire afin d’augmenter les doses sans pour autant augmenter les effets secondaires ; l’adjonction de TNF-α semble augmenter le bénéfice thérapeutique obtenu par cette technique (Grunhagen et coll., 2006).
Actuellement, malgré la diversité des produits potentiellement actifs, le taux de réponse reste donc au mieux de 15% quelle que soit la combinaison thérapeutique choisie, et le taux de survie des patients n’a pu être amélioré depuis plusieurs décennies (Atallah et Flaherty, 2005). Il est par conséquent impératif de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le mélanome. Pour ce faire, une meilleure compréhension de la biologie des mélanomes est nécessaire. Ainsi certains vaccins thérapeutiques sont porteurs d’espoir (Bystryn et Rudolph, 2005 ; Faries et Morton, 2005). L’utilisation d’outils pharmacologiques contre la protéine B-Raf qui est mutée dans environ 65% des mélanomes fait également partie des nouvelles perspectives thérapeutiques (Karasarides et coll., 2004).
Nous nous sommes intéressés à deux molécules susceptibles de moduler le comportement biologique du mélanome, à savoir la gastrine et la galectine 1. Nous souhaitons au préalable rappeler certaines notions d’oncogénèse en général et des mélanomes en particulier, avant d’expliquer les raisons pour lesquelles notre choix s’est porté sur ces deux biomolécules.
II. Rappels théoriques concernant le développement d’un cancer.
1. La genèse d’un cancer.
Un cancer est une population de cellules qui se développent anormalement au sein d’un
tissu sans plus répondre aux règles d’homéostasie de celui-ci. De plus, il présente des
caractéristiques d’agressivité qui lui confèrent une propension à la dissémination ou encore son
caractère « malin ». En effet, tant que ces dernières caractéristiques sont absentes, la tumeur est considérée comme « bénigne ».
Les cellules cancéreuses sont génotypiquement et phénotypiquement différentes de leurs congénères tissulaires non tumorales bien différenciées. Ainsi, d’une façon générale, plus un cancer est agressif, moins il exprime de marqueurs de différenciation caractéristiques des cellules du tissu à partir duquel il se développe. Selon Nowell (1976), la population cellulaire d’un cancer résulte du développement clonal d’une seule cellule après mutations, qui ne répond alors plus au contrôle de la croissance cellulaire. Ces cellules clonales présentent une instabilité génétique accrue et dès lors une tendance exacerbée à de nouvelles mutations à l’origine de sous-clones au sein de la tumeur (Figure 4). Ainsi, au fil des divisions cellulaires, la « pression environnementale » (comme la chimiothérapie ou la radiothérapie) va sélectionner des clones cellulaires de plus en plus agressifs et dédifférenciés au sein de la tumeur.
Ces cellules de haut degré de malignité présentent en fait des caractéristiques des cellules souches embryonnaires pluripotentes présentes dans le tissu normal pour la régénération tissulaire (Pierce et coll., 1977). Pierce défend ainsi une autre théorie selon laquelle le cancer dérive d’une cellule souche embryonnaire ; la différenciation de ses cellules filles est incomplète et variable, ce qui explique le caractère indifférencié de certaines cellules cancéreuses (Sell et Pierce, 1994).
Néanmoins, ces cellules pourraient alors subir des mutations séquentielles selon le modèle de Nowell, les deux modèles ne s’excluant pas mutuellement.
Cette population cellulaire anormale est caractérisée par un échappement au contrôle homéostatique qui régule normalement la croissance du tissu ; elle va croître localement et former la tumeur primitive.
2. La croissance tumorale.
a. Généralités.
Une masse tumorale est, comme tout autre tissu, une population cellulaire en constante évolution ; elle est à tout moment la résultante de deux phénomènes : la prolifération des cellules tumorales d’une part et la mort de certaines d’entre elles d’autre part. Ainsi la croissance globale d’une tumeur peut avoir pour origine une augmentation de la prolifération et/ ou une diminution de la mort cellulaire. Aussi, rappèlerons-nous d’abord les mécanismes principaux de la prolifération cellulaire ainsi que certaines dérégulations fréquemment observées dans les cancers en général.
Ensuite nous résumerons brièvement certains des mécanismes moléculaires contrôlant la mort
cellulaire dans la section II.2.c.
b. La prolifération cellulaire.
La prolifération cellulaire résulte de divisions successives d’une cellule en deux cellules filles identiques ou mitoses. En fait, le cycle cellulaire peut être décomposé en quatre étapes principales et schématiques : les phases « S » de réplication d’ADN et « M » de mitose sont dites fonctionnelles et sont précédées chacune d’une phase préparatoire G1 et G2 respectivement (Figure 5). Les cellules peuvent également sortir du cycle cellulaire en phase G1 pour devenir
« quiescentes » en phase G0. La régulation et la progression de la cellule au sein de ce cycle fait intervenir la famille des kinases cycline-dépendantes ou protéines Cdk qui représentent les sous- unités catalytiques des complexes qu’elles forment avec les sous-unités régulatrices, les cyclines D, E, A et B. L’activité de ces complexes dépend également de la Cdk-activating kinase et d’inhibiteurs des protéines Cdk. Chaque phase du cycle cellulaire est ainsi caractérisée par l’expression et l’activité de certains de ces complexes qui s’induisent et se succèdent selon une séquence bien définie, ce qui permet le contrôle intrinsèque de la prolifération (Lodish et coll., 2000 ; Kufe et coll., 2003) (Figure 5). Le contrôle extrinsèque fait référence aux effets de nombreux facteurs de croissance qui vont moduler l’expression et l’activité des divers intervenants de ce processus durant la phase G1, jusqu’à un point de restriction ou de non retour au-delà duquel la cellule poursuivra son cycle quel que soit son environnement (Lodish et coll., 2000 ; Kufe et coll., 2003). Les signaux mitogènes, via notamment les voies de signalisation des MAPK et de la beta-caténine, vont ainsi moduler l’expression de la cycline D (Figure 6). La régulation de l’activité des complexes cycline D / Cdk-4 ou Cdk-6 est en effet une étape clé du cycle cellulaire ainsi que celle du complexe cycline E / Cdk-2, nécessaire et suffisant pour entrer en phase S (Kufe et coll., 2003).
D’autre part, des dommages de l’ADN vont générer des signaux qui peuvent induire l’arrêt du cycle cellulaire en phase G2 (checkpoint), soit pour permettre une réparation soit pour induire la mort cellulaire programmée de type I ou apoptose. p53 et la protéine ATM sont des intervenants majeurs dans ce processus qui est dérégulé dans de nombreux cancers (Kufe et coll., 2003).
Ceux-ci sont en effet caractérisés par des altérations du contrôle du cycle cellulaire en faveur de la prolifération; les plus fréquentes sont des mutations inactivatrices de gènes dits « suppresseurs de tumeurs » tels que ceux codant pour les protéines p53, rb ou encore certains inhibiteurs de Cdk comme les protéines p16 ou p21, ou l’activation d’oncogènes impliqués dans les voies de signalisation mitogènes tels que RAS, RAF ou AKT (Kufe et coll., 2003 ; Hearing et Leong, 2006).
Dans les mélanomes en particulier, les mutations les plus fréquentes concernent B-RAF (50-65%
des cas) et N-RAS (15% des cas) ainsi que CDKN2A, CDK-4 et PTEN / AKT qui interviennent de
façon directe ou indirecte sur la prolifération des mélanomes (Hearing et Leong, 2006).
c. L’apoptose et les autres types de morts cellulaires.
La mort cellulaire peut être le résultat de divers processus, programmés ou non. La nécrose est un phénomène pathologique non programmé et est caractérisée par une « explosion » non contrôlée de la cellule avec libération de son contenu dans l’espace extracellulaire entraînant une destruction en cascade des cellules avoisinantes ainsi qu’une réponse inflammatoire. Cette mort cellulaire ne requiert pas de dépense énergétique contrairement aux morts cellulaires programmées ou suicides cellulaires. Il existe deux types distincts de mort cellulaire programmée : le type I ou apoptose et le type II ou autophagie.
L’apoptose est un suicide cellulaire physiologique essentiel durant le développement, dans les
phénomènes immunitaires et le maintien de l’homéostasie tissulaire. Elle est médiée par une
cascade protéolytique impliquant les caspases qui sont une famille de onze cysteinyl aspartate
specific proteases subdivisées en caspases initiatrices (caspases 8, 10 et 9) et effectrices
(essentiellement les caspases 3, 6 et 7) (Lodish et coll., 2000 ; Alberts et coll., 2002 ; Okada et
Mak, 2004). Elles sont synthétisées sous forme inactive, les premières activant les secondes par
clivage. Ces caspases s’activent alors en cascade qui, une fois enclenchée est irréversible. Ces
enzymes, elles-mêmes ou par l’intermédiaire d’autres protéases, sont responsables de la
dégradation de la cellule, en particulier du cytosquelette et de la membrane nucléaire ainsi que de
la fragmentation de l’ADN en une « échelle nucléosomale » caractéristique de cette mort
cellulaire ; la cellule est finalement morcelée en plusieurs corps apoptotiques qui seront phagocytés
et digérés par les cellules voisines (Lodish et coll., 2000 ; Alberts et coll., 2002 ; Okada et Mak,
2004). Aucun matériel cellulaire n’est libéré dans l’espace extracellulaire durant ce phénomène ;
par opposition à la nécrose, la cellule « implose » lors de l’apoptose. L’initiation de ce processus
apoptotique peut résulter des voies dites extrinsèques ou intrinsèques. La voie extrinsèque
implique des signaux de mort cellulaire provenant de l’extérieur de la cellule via par exemple la
liaison des ligands Fas ou tumor necrosis factor (TNF) à leur récepteur Fas et TNF-R
respectivement. Via des protéines adaptatrices, il s’ensuit une activation de la caspase 8 à l’origine
de la cascade activatrice des caspases (Figure 7) (Alberts et coll., 2002 ; Jin et El-Deiry, 2005). La
voie intrinsèque concerne l’activation de l’apoptose par des signaux intracellulaires qui aboutissent
à un relargage du cytochrome c de la mitochondrie dont la membrane externe est perméabilisée; le
cytochrome c va former un complexe protéique avec la protéine Apaf 1 et la caspase 9, ainsi
activée, appelé apoptosome. Ce dernier entraînera alors la cascade protéolytique via les caspases 3,
6 et 7 (Figure 8) (Lodish et coll., 2000 ; Jin et El-Deiry, 2005). Le contrôle de la voie intrinsèque
de l’apoptose se fait grâce à la famille de protéines Bcl-2 dont certains membres (Bad, Bax, Bak
par exemple) sont pro-apoptotiques et favorisent le relargage du cytochrome c tandis que d’autres (Bcl-2, Bcl-xl) l’inhibent (Lodish et coll., 2000 ; Alberts et coll., 2002 ). De plus, les IAP ou inhibitors of apoptosis, peuvent empêcher l’activation des pro-caspases (Alberts et coll., 2002).
Si ces deux voies menant à l’apoptose sont les mieux connues à ce jour, d’autres, indépendantes des caspases ont également été décrites et revues par Bröker et coll. (2005) mais ne seront pas détaillées dans le cadre de notre travail.
La plupart des médicaments cytotoxiques actuellement utilisés en chimiothérapie induisent cette mort cellulaire programmée de type I mais la résistance des cellules cancéreuses à l’apoptose constitue l’un des obstacles majeurs aux traitements actuels. Cet aspect sera développé dans la section II. 4.
L’autophagie ou macro-autophagie est un processus dynamique au cours duquel des structures membranaires intracellulaires séquestrent des organelles et macromolécules en vue de les dégrader. La micro-autophagie fait référence à la dégradation intra-lysosomale de composés biologiques.
L’autophagie est un processus qui débute par la séquestration de matériel cellulaire dans une structure à double membrane formée à partir du réticulum endoplasmique et appelée autophagosome. Ce dernier fusionne ensuite avec un lysosome pour former un autolysososme dont les hydrolases acides vont digérer le contenu (Kondo et coll., 2005) (Figure 9). La régulation de ce processus peut se faire à différents niveaux décrits dans la Figure 10 : la becline 1 et la PI3K de classe III favorisent la formation d’autophagosomes tandis que la voie de signalisation PI3K de classe I – Akt – mTOR inhibe l’autophagie en empêchant la fusion de l’autophagosome avec le lysosome (Kondo et coll., 2005). D’autres intervenants modulant l’autophagie sont également repris dans la Figure 10.
Ce processus de turn over peut aboutir soit à la survie soit à la mort cellulaire. En effet, lorsque la cellule est en carence de nutriments et/ ou d’oxygène, l’autophagie va lui fournir de l’énergie ainsi que diminuer ses besoins métaboliques. Néanmoins, lorsqu’elle est trop avancée, elle aboutit à la mort de la cellule (Kondo et coll., 2005). Ainsi, au début du développement tumoral, l’autophagie agit comme suppresseur de tumeur en détruisant les organelles endommagées. Par la suite, en revanche, elle devient favorable au cancer, permettant en effet aux cellules du centre de la masse tumorale de survivre dans des conditions pauvres en oxygène, facteurs de croissance… (Kondo et coll., 2005).
Certains médicaments telles que le tamoxifène ou le témozolomide n’induisent pas l’apoptose mais
bien cette mort cellulaire programmée de type II (Kanzawa et coll., 2004 ; Kondo et coll., 2005),
pouvant elle-même aboutir finalement et en conséquence à des processus apoptotiques (Roos et coll., 2007). Le développement de médicaments pro-autophagiques représente aussi une alternative thérapeutique intéressante aux médicaments pro-apoptotiques, d’autant qu’il semble exister des voies de signalisation communes à ces deux morts cellulaires. En effet, une inhibition de l’apoptose favorise l’autophagie et vice versa (Kondo et coll., 2005 ; Kroemer et Jäättelä, 2005).
La famille Bcl-2 contrôlerait non seulement l’apoptose mais également l’autophagie et pourrait être impliquée dans la connexion entre ces deux voies de mort cellulaire (Pattingre et Levine, 2006).
Si les lysosomes jouent un rôle clé dans l’autophagie, ils en ont néanmoins d’autres dans les morts cellulaires programmées. La perméabilisation lysosomale implique le relargage des hydrolases dans le cytoplasme et est tantôt effecteur de la mort par apoptose induite par le TNFR-1 ou p53 par exemple et tantôt initiateur de mort cellulaire (Kroemer et Jäättelä, 2005). Celle-ci sera de type apoptotique caspase-dépendante, apoptosis-like caspase-indépendante ou nécrotique si le relargage est massif (Kroemer et Jäättelä, 2005). La PI3K régule la taille, l’activité et la maturation des lysosomes qui, dans le cas des cellules cancéreuses, sont caractérisés par une résistance à la perméabilisation attribuée à la localisation à leur membrane de la protéine Hsp70 contrairement aux cellules normales (Kroemer et Jäättelä, 2005). Les lysosomes constituent ainsi une cible intéressante pour le traitement spécifique des cancers.
La catastrophe mitotique : est causée par une mitose aberrante. Lorsque l’ADN présente des anomalies, les protéines ATM et p53 interviennent pour arrêter le cycle cellulaire en phase G2 afin de le réparer ou d’induire l’apoptose. Si ce checkpoint est défectueux, la cellule entrera en phase M alors que l’ADN n’est pas réparé ou pas totalement dupliqué, ce qui mènera à la mort cellulaire par catastrophe mitotique (Okada et Mak, 2004).
3. La migration cellulaire et la formation des métastases.
a. Généralités.
La migration cellulaire reste l’un des obstacles majeurs au traitement des cancers en général et du mélanome en particulier. En effet, l’acquisition de capacités migratoires par les cellules cancéreuses permet leur dissémination loco-régionale et métastatique, à l’origine de 90%
des décès des patients cancéreux. Cette migration résulte de l’intégration finement régulée de trois
processus majeurs: l’adhésion, la motilité et l’invasion. En effet, en fonction des caractéristiques
cellulaires de ces trois composantes, la migration peut revêtir diverses formes : selon les propriétés
adhésives entre les cellules, le mouvement sera unicellulaire ou collectif c’est-à-dire impliquant une seule ou au contraire une colonie de cellules ; selon les interactions de la cellule avec la matrice extracellulaire et sa capacité à la dégrader, la migration sera de type mésenchymateux ou amoeboïde (Friedl et Wolf, 2003). De plus, la cellule cancéreuse est douée d’une plasticité remarquable : si elle est soumise à des modifications de l’une ou l’autre de ces trois propriétés, elle pourra s’y adapter et passer d’une forme de migration à l’autre (Friedl et Wolf, 2003 ; Friedl, 2004). Néanmoins, de façon schématique, la migration cellulaire peut-être décomposée en différentes étapes principales décrites dans la Figure 11, chacune d’entre elles étant modulée en fonction du type de migration considérée.
Ainsi les cellules migrantes vont pouvoir coloniser les vaisseaux sanguins et lymphatiques que la tumeur a recrutés pour lui apporter les facteurs de croissance et les nutriments nécessaires à son développement (Figure 12). Via la circulation, les cellules cancéreuses vont atteindre le lit vasculaire d’autres organes et en sortir pour coloniser le tissu cible et y former des métastases (Figure 12). La migration cellulaire est donc essentielle pour la dissémination des cellules tumorales, non seulement au sein du tissu mais également à distance.
Fidler, 2003
Figure 12: schématisation du développement d’un cancer: une population de cellules cancéreuses se développe au sein d’un tissu. Ensuite, pour croître d’avantage, la tumeur recrute des vaisseaux sanguins et lymphatiques qui vont lui apporter nutriments et facteurs de croissance. D’autre part cette circulation va être colonisée par les cellules cancéreuses migrantes qui se détachent de la tumeur primitive et viennent envahir ces vaisseaux. Les cellules sont ainsi amenées par l’appareil circulatoire dans les lits vasculaires d’autres organes, vont adhérer à leur paroi et, après extravasation, vont coloniser et proliférer au sein de l’organe cible pour créer des métastases. Elles peuvent être à l’origine de nouvelles disséminations au sein du tissu et vont ainsi petit à petit détruire les organes ainsi envahis.
