Article pp.129-146 du Vol.25 n°2 (2005)

(1)

ARTICLE ORIGINAL ORIGINAL PAPER

Bactéries actives dans l’altération de l’anchois (Engraulis encrasicholus) entreposé sous glace

et à température ambiante

N. E. Chaouqy¹, A. El Marrakchi²*, A. Zekhnini³

SUMMARY

Bacteria active in the spoilage of anchovy (Engraulis encrasicholus) stored in ice and at ambient temperature

1077 isolates from different flora studied during the storage of anchovy in ice and at ambient temperature, were identified and examined for their enzymatic properties in relation to fish spoilage (proteolysis, TMAO reduction and histamine production). The different flora studied were found to reduce TMAO, breakdown anchovy proteins and produce histamine. However, the magnitude of these enzymatic activities was variable according to the nature of the flora. The sulfide-producing flora was proteolitic and reduced TMAO but was not able to influence much the histamine production. The enterobacteria were found to be very active either on histamine and on TMAO.

Within the spoilage microflora of anchovy stored in ice and at ambient temperature, Shewanella putrefasciens was active on fish proteins but showed no activity on histidine. Among the enterobacteria, Proteus was predominent and Morganella morganii was very active on histidine. Because of their pro- teolytic activities, Pseudomonas, Vibrio, Acinetobacter and Moraxella might play a certain role in the fish spoilage.

Keywords

anchovy, spoilage, proteolysis, TMA, histamine.

RÉSUMÉ

1077 isolats provenant de différentes flores étudiées au cours de l’entreposage de l’anchois entreposé sous glace et à température ambiante, ont été

1. Laboratoire d’Analyses et de Recherches Vétérinaires – BP 474 – Agadir – Maroc.

2. Département d’HIDAOA – Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II – BP 6202 – Rabat-Instituts – Maroc.

(2)

identifiés et testés pour leurs propriétés enzymatiques en relation avec l’alté- ration du poisson (protéolyse, réduction de l’OTMA et production d’histamine). Toutes les flores étudiées réduisent l’OTMA, dégradent les protéines du muscle de l’anchois et produisent l’histamine mais ces activités sont variables en fonction de la nature de la flore. La flore productrice d’H₂S est protéolytique, réduit l’OTMA mais elle manifeste une faible activité sur la production d’histamine tandis que les entérobactéries sont fortement histidinolytiques et très actives dans la réduction de l’OTMA. Shewanella putrefa- ciens domine parmi la flore active dans l’altération de l’anchois entreposé aussi bien sous glace qu’à température ambiante. Cette espèce réduit l’OTMA, dégrade les protéines mais elle est sans action sur l’histidine. Les Proteus dominent parmi les entérobactéries et Morganella morganii est très active dans la décarboxylation de l’histidine. En raison de leurs propriétés protéolytiques, les Pseudomas, Vibrio, Acinetobacter et Moraxella sont ame- nés à jouer un rôle dans l’altération du poisson.

Mots clés

anchois, altération, protéolyse, TMA, histamine.

1 – INTRODUCTION

L’anchois (Engraulis encrasicholus) occupe la troisième place parmi les pois- sons pélagiques débarqués dans les ports marocains en 2002 (ANONYME, 2002).

Cette espèce est connue par sa grande fragilité qui la rend éminemment péris- sable si des mesures de conservation adéquates ne sont pas prises immédiate- ment dès sa capture (CASTANON et BARRAL, 1990). En 2002, seulement 27,5 % du tonnage débarqué (20 969 tonnes) était destiné à la salaison, le reste, jugé de mauvaise qualité, est orienté vers la transformation en farine (ANONYME, 2002).

L’étude de la nature de la flore microbienne et de son évolution au cours de l’entreposage à basse température ainsi que l’évaluation des propriétés enzymatiques de cette flore permettent de mieux connaître les mécanismes qui pré- sident à l’altération du poisson. C’est dans cet objectif que des travaux ont concerné la sardine (EL MARRAKCHI et al., 1990 ; 1992 a et b ; 1994 ; GENNARI et al. 1999 ; GENNARI et TOMASELLI, 1988 ; ABABOUCH et al., 1996) et le maquereau (BENNOUR et al., 1991). Dans le même esprit, la présente étude se propose d’apprécier la nature et le potentiel enzymatique de la flore microbienne de l’anchois entreposé sous glace et à température ambiante. On peut espérer que les résultats qui en découleront seront en mesure de contribuer à la maîtrise de la qualité de ce petit pélagique.

(3)

2 – MATÉRIEL ET MÉTHODES

L’étude a porté sur l’anchois capturé au large de l’Atlantique marocain cen- tre ouest (Région d’Agadir), mis sous glace dès sa capture dans une glacière préalablement désinfectée puis débarqué au port d’Agadir. Le temps qui s’écoule entre la capture et l’arrivée au laboratoire est compris entre 5 à 7 heures.

2.1 Conditions d’entreposage

Immédiatement après arrivée au laboratoire, un premier prélèvement d’une dizaine d’individus d’anchois est effectué (Jo). Le reste du poisson est réparti en deux lots.

Le premier lot est divisé en deux parties dans des caisses en polystyrène, désinfectées et perforées pour permettre le drainage du liquide de fusion de la glace et/ou de l’exsudation du poisson, qui sera récupéré dans une caisse sous-jacente. Au cours de l’entreposage, pour l’essai sous glace, le liquide de fusion est remplacé par de la glace sous forme d’écailles, afin de respecter le ratio glace-poisson désiré. Les caisses se repartissent comme suit :

– poisson sous glace (ratio glace-poisson 1/4) ; – poisson sous sel à 5 %.

Les deux caisses sont placées dans une chambre froide (+ 4 °C).

Le deuxième lot qui sert de témoin est divisé en deux parties de la manière suivante :

– poisson sous sel à 5 % ; – poisson sans sel.

Les deux caisses sont entreposées à température ambiante (20 à 25 °C).

2.2 Appréciation organoleptique

Pendant le stockage, des prélèvements du poisson sont effectués en vue d’une évaluation sensorielle qui est menée selon le barème de cotation de la fraîcheur du poisson défini par le règlement du conseil N° : 103/76/CEE (ANO- NYME, 1976), par deux vétérinaires du laboratoire. Cette appréciation organoleptique est effectuée quotidiennement pour le lot réfrigéré et tous les 3 à 4 heures pour le lot témoin entreposé à température ambiante, afin de déterminer le temps de rejet organoleptique qui correspond au moment où l’anchois commence à s’altérer.

2.3 Analyses bactériologiques

Elles sont réalisées quelques heures après capture (Jo), aux temps de rejet organoleptique (J_t et H_t) et après le temps de rejet (Aj_t et AH_t). Des dilutions

(4)

2.3.1 Ensemencement

Un ml de chaque dilution est inoculé dans des boîtes de Pétri contenant les milieux pour isolement. Les flores étudiées sont : la flore mésophile sur Iron agar (FMIA), la flore psychrotrophe sur Iron agar (FPIA), la flore halophile modé- rée (FHM), les entérobactéries (ENT), la flore mésophile productrice d’H₂S (FMH₂S) et la flore psychrotrophe productrice d’H₂S (FPH₂S). Les conditions de culture figurent dans le tableau 1.

Tableau 1

Méthodes utilisées pour l’isolement bactérien.

Table 1

Methods used to isolate bacterial strains.

2.3.2 Isolement

À partir de chaque boîte retenue pour le dénombrement, on prélève 5 à 10 colonies. Pour les boîtes contenant moins de 5 colonies, on prélève toutes les colonies.

Les souches isolées sont purifiées sur le même milieu ayant servi à l’isolement et conservées sur gélose trypticase soja inclinée pour tous les isolats à l’exception de ceux de la FHM qui sont repiqués sur la même gélose préparée à l’eau de mer. Les isolats sont conservés à + 4 °C et leur entretien est assuré par un repiquage mensuel en attendant de les tester pour leur activité enzymatique et leur identification éventuelle.

2.3.3 Étude de quelques propriétés enzymatiques relatives à l’altération

Afin d’évaluer l’aptitude des isolats à l’altération, trois propriétés enzymatiques sont retenues : hydrolyse des protéines du muscle de l’anchois selon la technique de CHANDRASEKARAN et al., (1985), réduction de l’oxyde de triméthyla- mine (OTMA) selon la méthode décrite par GRAM et al., (1987) et enfin, production d’histamine, révélée par l’utilisation des milieux de NIVEN et al., (1981) et YAMANI et UNTERMANN (1985).

Flore étudiée Milieu de culture Conditions d’incubation Observations Entérobactéries (ENT) VRBG* (NFV08 054) 30 °C/24 à 48 heures Dénombrement des colonies roses ou

rouges de diamètre ≥ 0,5 Flore Totale Mésophile sur Iron agar

(FMIA)

Iron agar (Gram et al., 1987) 25 °C/3 jours Dénombrement de toutes les colonies Flore Mésophile productrice d’H₂S

(FMH₂S)

Iron agar 25 °C/3 jours Dénombrement des colonies noirâtres Flore Halophile modérée (FHM) Iron agar à l’eau de mer 25 °C/5 jours Dénombrement de toutes les colonies Flore Psychrotrophe sur Iron agar

(FPIA)

Iron agar 4 °C/10 jours Dénombrement de toutes les colonies Flore Psychrotrophe productrice

d’H₂S (FPH₂S)

Iron agar 4 °C/10 jours Dénombrement des colonies noirâtres

* : Gélose glucosée biliée au cristal violet et au rouge neutre.

(5)

2.3.4 Identification

Les isolats ayant manifesté au moins une des trois activités enzymatiques testées sont retenus pour l’identification. Tous les isolats retenus font l’objet d’une coloration de Gram et sont testés pour leurs réactions au KOH (GREGER- SON, 1978).

Les bactéries à Gram négatif sont examinées du point de vue de leur mobi- lité, de la présence d’oxydase (KOVACS, 1956) et de la production d’acide à partir du glucose (HUGH et LEIFSON, 1953). L’identification de ces isolats est complétée par la microméthode API 20E (Biomérieux 20100) et API 20 NE (Bio- mérieux 20 050) en suivant les instructions du fabricant et en se référant aux catalogues numériques.

Les cocci à Gram positif sont testés pour la présence de la catalase et la production d’acide à partir du glucose en utilisant le milieu Hugh et Leifson avec le pourpre de bromocrésol comme indicateur de pH.

3 – RÉSULTATS

3.1 Aptitude des isolats à l’altération

L’aptitude à l’altération est évaluée à travers trois propriétés enzymatiques : réduction de l’OTMA en TMA, dégradation des protéines du poisson (muscle de l’anchois) et décarboxylation de l’histidine.

Ces trois activités permettent d’apprécier la contribution des flores dénom- brées dans l’altération de l’anchois et aussi d’estimer le potentiel enzymatique des isolats identifiés.

3.2 Réduction de l’OTMA

Sur un total de 1077 souches isolées, 545 soit 50,6 % sont capables de réduire l’OTMA en TMA (tableau 2). Les souches réduisant l’OTMA, appartiennent à tous les groupes bactériens étudiés mais l’importance de cette réduction est variable en fonction de la nature de la flore. Ainsi, la flore productrice d’H₂S et les entérobactéries sont les plus actives, viennent ensuite la FMIA et la FPIA et, enfin, la FHM (tableau 2).

L’analyse statistique des données montre que les pourcentages des souches réductrices de l’OTMA ne diffèrent pas significativement (p < 0,05) entre la FMIA et la FPIA alors que les différences sont hautement significatives (p < 0,05) entre ces dernières et la FHM. Les entérobactéries, la FMH₂S et la FPH₂S ne diffèrent pas significativement (p < 0,05) dans la réduction de l’OTMA alors qu’elles diffèrent avec les autres flores étudiées. Au sein, de la flore totale sur Iron agar, les colonies noirâtres présentent des différences significatives avec les colonies blanchâtres.

(6)

Tableau 2

Aptitude enzymatique des différentes flores.

Table 2

Enzymatic properties of different flora.

3.3 Dégradation des protéines de poisson

484 isolats sur les 1077 étudiés soit 45 % dégradent les protéines du muscle de l’anchois : 130/312 (41,7 %) appartiennent à la FMIA, 129/263 (49 %) à la FPIA, 70/259 (27,5 %), 16/59 (27,1 %) aux entérobactéries, 67/96 (69,8 %) à la FMH₂S et 72/88 (81,8 %) à la FPH₂S (tableau 2). Ainsi, toutes les flores étudiées participent à la dégradation des protéines, mais la contribution respective de chacune des flores est variable. Bien entendu, la flore productrice d’H₂S, qu’elle soit mésophile ou psychrotrophe, est la plus active ; elle présente des différences significatives (p < 0,05) avec les autres flores étudiées. Il est très important de souligner qu’environ 30 % des colonies blanchâtres, non productrices d’H₂S donc non présumées protéolytiques, se sont révélées actives sur le muscle de l’anchois. À l’inverse, seulement entre 70 à 82 % des colonies noirâ- tres dégradent les protéines.

3.4 Production d’histamine

Parmi la totalité des isolats, seuls 90 soit 8,3 % sont capables de décar- boxyler l’histidine (tableau 2). Au sein des flores étudiées, les entérobactéries manifestent la plus grande activité histidinolytique du moment que 39 isolats sur 59 soit 66 % dégradent l’histidine. Viennent ensuite par ordre décroissant,

Substrat dégradé

Flore étudiée Protéine OTMA Histidine

FMIA CB[216]* CN [96]

NT [312]

63 (29,2)*

67 (69,8) 130 (41,7)

48 (22,2) 91 (94,8) 139 (44,5)

11 (5,1) 6 (6,2) 17 (5,4) FPIA CB [175]*

CN [88]

NT [263]

57 (32,6) 72 (81,8) 129 (49)

31 (17,7) 87 (98,9) 118 (44,9)

11 (6,3) 2 (2,3) 13 (4,9)

FHM [259] 70 (27,5) 53 (20,5) 13 (5)

ENT [59] 16 (27,1) 57 (96,6) 39 (66,1)

FM H₂S [96] 67 (69,8) 91 (94,8) 6 (6,2)

FP H₂S [88] 72 (81,8) 87 (98,9) 2 (2,3)

Total [1077] 484 (44,9) 545 (50,6) 90 (8,3)

CB : Colonies blanches.

CN : Colonies noires.

NT : Nombre total.

( )* : Pourcentage d’isolats ayant donné une réaction positive.

[]* : Nombre d’isolats testés.

(7)

la FMH₂S (6,2 %), la FMIA (5,4 %), la FHM (5 %), la FPIA (4,9 %) et enfin la FPH₂S (2,3 %).

3.5 Nature et évolution de la flore d’altération

L’identification a concerné tous les isolats ayant montré au moins une acti- vité enzymatique (protéolyse et/ou production d’histamine et/ou réduction de l’OTMA).

La nature et l’évolution de la flore active dans l’altération de l’anchois dépendent de la flore dénombrée.

À Jo, l’identification n’a concerné que les isolats de la FTIA et de la FHM, les entérobactéries et la flore productrice d’H₂S étant totalement absentes. Elle montre que la FTIA est formée essentiellement de Shewanella putrefaciens (2 isolats sur 6), Pseudomonas spp. (1/6), Vibrio alginolyticus (2/6) et Acinetobacter lwoffi (1/6) (tableau 3). Les isolats actifs sont plus nombreux parmi les mésophiles (5/6) que parmi les psychrotrophes (1/6).La FHM est formée par les bactéries actives appartenant aux genres ou espèces suivants : Vibrio spp. (2/4), Moraxella spp. (1/4) et Staphylococcus spp. (1/4) (tableau 4).

Tableau 3

Nature et évolution de la flore totale sur Iron agar (FTIA).

Table 3

Nature and evolution of total flora in Iron agar.

Genres et espèces TR TA

Total

bactériens Jo Jr AJr Hr AHr

Shewanella putrefaciens 2/6*

33,3 %

25/36 69,40 %

96/155 61,9 %

14/26 53,8 %

54/109 49,5 %

191/332 57,5 %

Pseudomonas spp. 1/6

16,7 % 8/36 22,2 %

25/155 16,1 %

4/26 15,4 %

12/109 11 %

50/332 15,1 %

Vibrio spp. 2/6

33,3 % 2/36 5,6 %

4/155 2,6 %

1/26 3,8 %

27/109 24,8 %

36/332 10,8 %

Proteus spp. 0/6

0 %

0/36 0 %

13/155 8,4 %

7/26 26,9 %

3/109 2,8 %

23/332 6,9 %

Autres** 1/6

16,7 % 1/36 2,8 %

17/155 11 %

0/26 0 %

13/109 11,9 %

32/332 9,6 % Jo : Jour O. Jr : Jour de rejet. Ajr : après jour de rejet. Hr : heure de rejet. AHr : après heure de rejet.

TR : température de réfrigération. TA : température ambiante.

* : Nombre d’isolats identifiés sur nombre d’isolats testés.

** : Autres : Aeromonas hydrophila, Moraxella spp, Acinetobacter lwoffi, Staphyloccocus spp. Chromobac- terium violaceum, Flavobacterium odoratum.

(8)

Tableau 4

Nature et évolution de la flore halophile modérée (FHM).

Table 4

Nature and evolution of moderately halophilic flora.

L’identification des isolats de la FTIA (tableau 3) révèle que l’espèce Shewa- nella putrefaciens prédomine nettement (57,5 % du total des isolats), viennent ensuite par ordre décroissant les Pseudommas (15,1 %), les Vibrio (10,8 %) et les Proteus (6,9 %). Au cours de l’entreposage, la proportion de S. putrefaciens augmente et passe de 33 % à Jo à 69,4 % aux temps de rejet organoleptique pour le poisson entreposé à basse température et 53,8 % pour celui stocké à température ambiante. Les Pseudomonas manifestent la même évolution et aux temps de rejet organoleptique, ils représentent entre 15 à 22 % des isolats en fonction de la température de stockage. En ce qui concerne les Vibrio, leur évo- lution confirme leur comportement mésophile du moment qu’ils ne représentent que 3,1 % (6 isolats sur 191) dans le cas du poisson réfrigéré tandis que lors de l’entreposage dans des conditions ambiantes normales leur proportion atteint 20,7 % (28 isolats sur 135). Aux temps de rejet organoleptique, les Proteus ne sont pas isolés dans le cas du poisson réfrigéré alors que leur proportion atteint 27 % chez le poisson entreposé à température ambiante.

L’addition du sel ne semble pas influencer la répartition des genres ou espè- ces bactériens identifiés à l’exception des Proteus qui représentent 10,4 % de la totalité des isolats dans le cas où le poisson est entreposé sans sel contre seulement 1,5 % lorsque le sel est utilisé (données non publiées).

Au sein de la FHM, les Vibrio prédominent avec S. putrefaciens, viennent ensuite l’espèce Flavobacterium odoratum et les Proteus (tableau 4). Le genre Pseudomonas ne représente que 5 % des isolats.

Total

Shewanella putrefaciens 0/4*

0 %

6/11 54,5 %

13/30 43,3 %

2/11 18,2 %

5/45 11,1 %

26/101 25,7 %

Pseudomonas spp. 0/4

0 %

0/11 0 %

3/30 10 %

0/11 0 %

2/45 4,4 %

5/101 5 %

Vibrio spp. 2/4

50 % 0/11 0 %

0/30 0 %

7/11 63,6 %

20/45 44,4 %

29/101 28,7 %

Proteus spp. 0/4

0 %

3/11 27,3 %

2/30 6,7 %

1/11 9,1 %

5/45 11,1 %

11/101 10,9 % Flavobacterium

adoratum

0/4 0 %

2/11 18,2 %

11/30 36,7 %

0/11 0 %

3/45 6,7 %

16/101 15,8 %

Autres** 2/4

50 % 0/11 0 %

1/30 3,3 %

1/11 9,1 %

10/45 22,2 %

TR : température de réfrigération. TA : température ambiante.

** : Autres : Moraxella spp., Acinetobacter Iwoffi et Staphyloccocus spp.

(9)

Les entérobactéries sont formées essentiellement par le genre Proteus qui représente 65 % des isolats identifiés (tableau 5). Au sein de ce genre, les espèces P. vulgaris et Morganella morganii prédominent nettement. Viennent ensuite par ordre décroissant, les espèces suivantes : Enterobacter agglome- rans, Serratia plymuthica, Serratia marcesens et Providencia stuartii. Dans le cas de l’entreposage à basse température, ces bactéries ne sont isolées qu’après le temps de rejet organoleptique.

La flore productrice d’H₂S est dominée nettement par Shewanella putrefa- ciens qui représente 83 % des isolats identifiés (tableau 6). Quel que soit le mode de l’entreposage, cette espèce est plus fréquemment isolée à mesure que l’altération progresse. Elle figure aussi bien parmi les mésophiles que les psychrotrophes. Les autres espèces identifiées sont les suivantes : Vibrio algi- nolyticus (7,6 %) et Proteus spp. (6,6 %).

Tableau 5

Nature et évolution des Entérobactéries.

Table 5

Nature and evolution of Enterobacteriaceae.

Total

Enterobacter agglomerans

- - 9/19*

47,4 %

0/4 0 %

1/34 2,9 %

10/57 17,5 % Serratia

marcescens

- - 2/19

10,5 %

0/4 0 %

2/34 5,9 %

4/57 7 % Serratia

plymuthica

- - 5/19

26,3 %

0/4 0 %

0/34 0 %

5/57 8,8 % Proteus

vulgaris

- - 2/19

10,5 %

2/4 50 %

15/34 44,1 %

19/57 33,3 % Proteus

mirabilis

- - 0/19

0 %

1/4 25 %

1/34 2,9 %

2/57 3,5 % Morganella

morganii

- - 1/19

5,3 %

1/4 25 %

14/34 41,2 %

16/57 28,1 % Providencia

stuartii

- - 0/19

0 %

0/4 0 %

1/34 2,9 %

1/57 1,8 % Jo : Jour O. Jr : Jour de rejet. Ajr: après jour de rejet. Hr : heure de rejet. AHr : après heure de rejet.

TR : température de réfrigération. TA: température ambiante.

(10)

Tableau 6

Nature et évolution de la flore productrice de H₂S (FPH₂S).

Table 6

Nature and evolution of sulphide hydrogen producing flora.

3.6 Propriétés enzymatiques des genres et espèces isolés

La dégradation de l’OTMA est une propriété constante chez Shewanella putrefaciens, les entérobactéries et Staphylococcus spp. (100 % des isolats produisent la TMA) alors qu’elle est variable chez Vibrio et Chromobacterium violaceum (tableau 7). Cette variation est constatée au sein d’une même espèce bactérienne. Tous les Pseudomonas sont sans action sur l’OTMA.

La dégradation des protéines du muscle de l’anchois est l’œuvre des Pseudo- monas (96,4 % isolats testés), des Acinetobacter-Moraxella (100 %), des Vibrio (93,7 %) et de Shewanella putrefaciens (74,8 %). Chez les Proteus, l’activité pro- téolytique n’est pas une propriété constante : elle est totalement absente chez Morganella morganii et variable chez les espèces P. vulgaris (60 %) et P. mirabilis (66,7 %). La totalité des isolats s’identifiant à l’espèce Flavobacterium odoratum dégradent les protéines du muscle de l’anchois (tableau 7).

La production d’histamine est essentiellement due aux entérobactéries. Au sein de cette famille, les bactéries histamino-formatrices s’identifient à Morga- nella morganii (100 % des isolats testés), Proteus mirabilis (66,7 %), P. vulgaris (42,5 %), Enterobacter agglomerans (80 %), Serratia spp.(88,8 %) (tableau 7).

Parmi les Pseudomonas, seule P. aeruginosa est capable de dégrader l’histidine (51,6 % des isolats testés).

Parmi les 369 isolats de S. putrefaciens, aucun ne décarboxyle l’histidine. Il en va de même pour les espèces appartenant au genre Vibrio et aux bactéries s’identifiant à Moraxella spp., Acinetobacter lwolffi, Flavobacterium odoratum, Chromobacterium violaceum, Aeromonas hydrophila et Staphylococcus sp.

(tableau 7).

Total

Shewanella putrefaciens - 21/22*

95,5 %

74/84 88,1 %

11/16 68,8 %

46/61 75,4 %

152/183 83,1 %

Proteus spp. - 0/22

0 %

6/84 7,1

4/16 25 %

2/61 3,3 %

12/183 6,6 %

Vibrio alginolyticus - 0/22

4,5 %

0/84 0 %

1/16 6,2 %

13/61 21,3 %

14/183 7,6 %

Autres ** - 1/22

4,4 %

4/84 4,8 %

0/16 0 %

0/61 0 %

TR : température de réfrigération. TA: température ambiante.

** : Autres : Staphylococcus spp. et Chromobacterium violaceum.

(11)

Tableau 7

Propriétés enzymatiques des isolats.

Table 7

Enzymatic properties of isolates.

Espèces et genres bactériens Réduction

OTMA Protéolyse Décarboxylation histidine Shewanella putrefaciens [369]*

Pseudomonas [55] : P. putida [2] P. vesicularis [11] P. aeruginosa [31] P. fuorescens [10] P. aureofaciens [1] Moraxella spp. [5] Acinetobacter lwoffi [15] Flavobacteriun odoratum [29] Chromobacteriun violaceum [5] Aeromonas hydrophila [1] Vibrio [79] :

V. alginolyticus [54] V. Fluvialis [6] V. hollisae [6] V. mimicus [15] Staphylococcus [12] Proteus [83] :

Morganella morganii [37] P. vulgaris [40]

P. mirabilis [6] Providencia stuartii [1] Enterobacter agglomerans [10] Serratia marcescens [4] Serratia plymuthica [5]

369 (100)*

0,0%

0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 4 (80)

0 (0)

72,1 % 45 (83,3)

5 (83,3) 2 (50) 5 (33,3) 12 (100) 100,0 % 37 (100) 40 (100) 6 (100)

1(100) 10 (100)

4 (100) 5 (100)

276 (74,8) 96,4 % 2 (100) 11 (100) 29 (93,5) 10 (100) 1 (100) 5 (100) 15 (100) 29 (100) 2 (40) 1 (100)

93,7 % 50 (92,6)

5 (83,3) 4 (100) 15 (100)

1(8,3) 33,7 %

0 (0) 24 (60) 4 (66,7)

0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)

0(0) 29,10 %

0 (0) 0 (0) 16 (51,6)

0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)

0 % 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 69,9 % 37 (100) 17 (42,5) 4 (66,7)

0 (0) 8 (80) 3 (75) 5 (100)

Total [673] 545(81) 484(71,9) 90(13,4)

( )* : Pourcentage d’isolats ayant donné une réaction positive.

[]* : Nombre d’isolats identifiés.

(12)

4 – DISCUSSION

Toutes les flores étudiées possèdent les trois propriétés enzymatiques tes- tées mais l’importance de ces activités est variable en fonction de la nature de la flore.

La flore productrice d’H₂S, qu’elle soit mésophile ou psychrotrophe est fortement protéolytique et très active dans la réduction de l’OTMA mais elle est faiblement histidinolytique. Cette observation explique pourquoi lorsque la sardine (EL MARRAKCHI et al., 1990) ou le maquereau (BENNOUR et al., 1991) sont correctement réfrigérés, il y a absence de corrélation entre l’altération organoleptique et la production d’histamine à des taux dépassant les limites accepta- bles.

Le dénombrement des bactéries productrices d’H₂S est considéré comme le moyen le plus approprié pour évaluer le potentiel d’altération microbienne du poisson après capture du moment que la production de ce sulfure est l’une des manifestations organoleptiques majeures de l’altération. Ainsi, LEVIN (1968) puis, plus tard, JENSEN et SCHULTZ (1980) proposèrent des milieux pour dénombrer les bactéries capables de produire l’hydrogène sulfuré à partir du thiosulfate de sodium. Cependant, ces milieux ne permettent pas le dénombrement des bac- téries capables de produire l’hydrogène sulfuré à partir d’acides aminés soufrés mais pas à partir du thiosulfate de sodium. Cette constatation a conduit GRAM

et al. (1987) à améliorer la détection de ces bactéries en supplémentant, avec la cystéine, le milieu de JENSEN et SCHULTZ (1980). Cette modification permit une amélioration sensible dans la détection des bactéries d’altération du poisson, particulièrement Shewanella putrefaciens. Cependant, certaines bactéries comme celles appartenant au genre Pseudomonas, se sont révélées capables de dégrader les protéines du muscle de la sardine (EL MARRAKCHI et al. 1992) mais ne peuvent être prises en compte dans le milieu proposé par GRAM et al.

(1987) parce qu’elles ne produisent pas d’H₂S ni à partir du thiosulfate, ni à partir de la cystéine. C’est pour confirmer ces observations que nous avons évalué le potentiel protéolytique des colonies blanchâtres en les testant sur le milieu de CHANDRASEKARAN et al. (1985). Nos résultats montrent bien que le potentiel pro- téolytique des bactéries d’altération n’est pas toujours associé à la production d’H₂S et qu’il existe actuellement un besoin pour la mise au point d’un milieu pour le dénombrement des bactéries protéolytiques ; le milieu de CHANDRASE- KARAN et al. (1985) ne permet que la réalisation de tests qualitatifs.

L’activité protéolytique est une propriété présente chez toutes les flores.

Bien entendu, elle est plus élevée chez la flore productrice d’H₂S (colonies noires sur milieu Iron agar) qu’elle soit mésophile ou psychrotrophe et chez la flore halophile modérée qui est généralement dominée par les bactéries natives du milieu marin.

L’aptitude des Pseudomonas à dégrader les protéines est reconnue par plusieurs auteurs (HERBERT et al., 1971 ; BARILE et al., 1985 a et 1985b ; GRAM et al., 1990 ; EL MARRAKCHI et al., 1992 GENNARI et al., 1999). Les espèces de ce genre bien que non productrices d’H₂S et de TMA, sont capables de produire de mauvaises odeurs chez le poisson entreposé sous glace (HERBERT et al., 1971 ; HERBERT et SHEWAN, 1976 ; GRAM et al. 1990).

(13)

Shewanella putrefaciens (anciennement Alteromonas putrefaciens) est considérée comme le principal acteur de l’altération du poisson qu’il soit entre- posé a basse ou moyenne température (GENNARI et al., 1999 ; KOUTSOMANIS et NYCHAS ; 1999 ; GRAM et al., 1987) ou conditionné sous atmosphère gazeuse (DALGAARD et al., 1993). Cependant, GRAM et al. (1990), ne lui accordent qu’un rôle mineur dans l’altération de la perche du Lac Victoria entreposée sous glace. L’aptitude à dégrader les protéines n’est pas une propriété constante chez cette bactérie puisque seulement 74,8 % des isolats sont protéolyliques.

Cette variation phénotypique est également rapportée par EL MARRAKCHI et al.

(1992) qui ont relevé que seuls 63,6 % des isolats de S. putrefaciens étaient capables de dégrader les protéines du muscle de la sardine et s’explique par la variabilité biochimique de cette espèce au sein de laquelle STRENSTROM et MOLIN (1990) reconnaissent plusieurs biogroupes. L’aptitude à la protéolyse est suggérée comme critère taxonomique pour identifier différents biotypes au sein de cette espèce (EL MARRAKCHI et al., 1992).

Les isolats appartenant au groupe des Acinetobacter-Moraxella sont tous protéolytiques. En 1971, HERBERT et al., leur attribuent un rôle dans l’altération de la langoustine (Nephrops norvegicus). Plus tard en se basant sur l’inocula- tion d’un bouillon de poisson stérile, GRAM et al. (1987), constatent que ce groupe bactérien provoquait une forte odeur de poisson altéré. Enfin, EL MAR- RAKCHI et al. (1994) ont pu mettre en évidence leur propriété protéolytique sur le muscle de la sardine en utilisant le milieu de CHANDRASEKARAN et al. (1985).

Les espèces appartenant au genre Vibrio sont également actives sur les protéines de l’anchois. Cette activité est variable selon l’espèce : elle est de 100 % pour V. hollisae et V. mimicus, de 92,6 % pour V. alginolyticus et de 83 % pour V. fluvialis (tableau 7). Le potentiel protéolytique de ces bactéries a déjà été signalé, particulièrement pour le poisson entreposé aux températures moyennes par plusieurs auteurs (GRAM et al., 1987 ; GORCZYCA et al., 1985 ; CHANDRASEKARAN et al., 1985 ; EL MARRAKCHI et al., 1992 et 1994).

Au sein de la famille des entérobactéries, les espèces appartenant au genre Proteus, particulièrement P. mirabilis et P. vulgaris sont connues par leur poten- tiel protéolytique (EL MARRAKCHI et al., 1992 et 1994) tandis que Morganella morganii est sans action sur les protéines. Les coliformes sont également dénués de cette activité comme c’est le cas d’Enterobacter agglomerans.

La totalité des isolats s’identifiant à l’espèce Flavobacterium odoratum dégradent les protéines du muscle de l’anchois (tableau 7). Le genre Flavobac- terium peur représenter jusqu’à 60 % de la flore initiale du poisson capturé dans les mers froides ou tempérées (EL MARRAKCHI et al., 1982 ; GENNARI et TOMASSELLI, 1988). Au cours de l’entreposage sous glace, ce groupe bactérien est rapidement supplanté par les Pseudomonas et Shewanella putrefaciens (HERBERT et al. 1971, SHEWAN, 1971). Bien que les espèces appartiennent à ce genre manifestent une activité protéolytique régulière, le rôle joué par ces bac- téries dans l’altération du poisson demeure méconnu.

Les entérobactéries, flore de contamination d’intérêt hygiénique manifestent la plus grande activité histidinolytique. Elles sont considérées comme étant le groupe bactérien majeur dans la production d’histamine (ARNOLD et BROWN, 1978 ; FRANK, 1985 ; EL MARRAKCHI et al., 1992 et 1994 ; ABABOUCH et al. 1991)

(14)

duire rapidement l’histamine à des taux élevés particulièrement lorsque le poisson est entreposé à des températures moyennes (TAYLOR et al., 1978).

Les Pseudomonas sont peu ou pas histidinolytiques (RYSER et al., 1984).

Seule l’espèce P. aeruginosa est citée comme capable de produire l’histamine (TAYLOR et al., 1978 ; EL MARRAKCHI et al. 1992). Cette propriété est utilisée comme critère taxonomique pour cette bactérie par le Bergey’s Manual (KRIEG

et HOLT, 1984).

Les Vibrio, et particulièrement l’espèce V. alginolyticus, sont reconnus comme capables de produire l’histamine (YOSHINAGA et FRANK, 1982).

L’absence d’activité chez nos isolats de Vibrio demeure inexpliquée.

Une autre activité importante chez les entérobactéries est la dégradation de l’OTMA. Cette dernière propriété a d’abord été signalée par WOOD et BAIRD

(1943) à propos des entérobactéries puis a été confirmée plus tard par plusieurs auteurs pour E. coli (EASTER et al., 1982 ; ISHIMOTO et SHIMOKAWA, 1978 ; SAKA- GUSHI et KAWAI, 1981) et pour Proteus spp. (STROM et al., 1979). En 1985, une revue bibliographique de BARETT et KWAN a permis de faire le point sur les con- naissances relatives à la réduction bactérienne de l’OTMA. Shewanella putrefa- ciens est actuellement reconnue comme un puissant réducteur de l’OTMA aussi bien chez le poisson conservé sous glace (EL MARRAKCHI et al., 1992 ; GRAM et HUSS, 1996) que sur celui conditionné en atmosphère gazeuse (BOSKOU et DEBEVERE, 1997 ; DALGAARD et al. 1993). Selon BARETT et KWAN (1985), les espè- ces du genre Vibrio sont capables de dégrader l’OTMA. Cette activité a été étu- diée pour V. alginolyticus et V. parahaemolyticus par EASTER et al. (1982). Quant aux Pseudomonas, ils sont sans action sur l’OTMA (GRAM et al., 1990, EL MAR- RAKCHI et al. 1992). Ces données de la littérature sont en accord avec nos résul- tats.

5 – CONCLUSION

Sur la base de trois propriétés enzymatiques, les résultats obtenus permettent d’apprécier le rôle joué par les différentes flores et les divers genres ou espèces bactériens dans l’altération de l’anchois stocké à basse température et à température moyenne.

La dégradation de l’OTMA est l’œuvre, au début de stockage, de la FHM et de la FMIA. Au fur et à mesure que l’altération organoleptique progresse, la contribution de la flore productrice d’H₂S et des entérobactéries devient de plus en plus dominante. Cette dégradation ne semble pas être influencée par le mode de stockage : elle a lieu aussi bien à basse et moyenne température qu’il y ait salage ou non.

L’activité protéolytique est le fait de toutes les flores dénombrées mais l’action de la flore productrice d’H₂S est prépondérante. Au début du stockage, cette dégradation est l’œuvre essentiellement de bactéries non productrices d’H₂S (colonies blanchâtres sur Iron agar) et de la FHM. Au cours du stockage, il y a sélection des bactéries les plus actives dans la protéolyse du muscle du poisson, particulièrement parmi la flore productrice d’H₂S.

(15)

La production d’histamine est due essentiellement aux entérobactéries et à la flore productrice d’H₂S. L’activité histidinolytique est l’œuvre de bactéries mésophiles, ce qui explique son effet marqué lorsque le poisson est entreposé dans les conditions ambiantes normales.

Parmi les bactéries actives dans l’altération, citons en premier lieu l’espèce Shewanella putrefaciens. Cette bactérie produit la TMA, dégrade les protéines mais elle ne décarboxyle pas l’histidine. Elle domine nettement parmi la flore productrice d’H₂S et la FHM, ce qui lui confère un comportement à la fois mésophile, psychrotrophe et halophile modéré. Ces propriétés lui attribuent un rôle dans l’altération de l’anchois stocké sous glace et à température ambiante qu’il y ait salage (à 5 %) ou non.

Les Pseudomonas sont dénués d’action sur l’OTMA et sur l’histidine (à l’exception de P. aeruginosa) mais sont fortement actives dans la dégradation des protéines du muscle de l’anchois. Ils sont isolés également parmi les méso- philes et les psychrotrophes de la flore totale sur Iron-agar. Ne produisant pas d’H₂S, ni à partir du thiosulfate ni de la cystéine et étant fortement protéolyti- ques, leur rôle potentiel dans l’altération ne peut pas être pris en compte par le dénombrement des bactéries productrices d’H₂S dans le milieu de GRAM et al.

(1987).

Comme les Pseudomonas, le groupe des Acinetobacter-Moraxella dégrade les protéines mais ne dégradent ni l’OTMA ni l’histidine.

Les Vibrio constituent un groupe majeur de l’anchois particulièrement dans le cas où le poisson est stocké à température moyenne avec un salage modéré (5 %). Ces propriétés leur confèrent un comportement mésophile et halophile modéré. Les espèces appartenant à ce genre réduisent l’OTMA, attaquent les protéines mais ne manifestent aucune activité histidinolytique.

Enfin, au sein des entérobactéries, les espèces appartenant au genre Pro- teus dégradent à la fois l’OTMA, l’histidine et les protéines du poisson à l’exception de Morganella morganii qui est sans action sur les protéines du poisson. Ce groupe bactérien est mésophile du moment qu’il est principalement isolé à partir du poisson entreposé à température ambiante.

Ces données permettent de comprendre que lors d’une réfrigération correctement conduite, la production d’histamine est nettement ralentie et jusqu’au temps de rejet organoleptique, il y a absence de corrélation entre l’accumula- tion de l’histamine dans le muscle et l’altération organoleptique qui est due principalement à S. putrefaciens et aux Pseudomonas qui ne sont pas ou peu histidinolytiques. Lors d’une mauvaise réfrigération (fluctuations importantes de la température) ou en l’absence d’une réfrigération, il y a corrélation parfaite entre les modifications organoleptiques et la production d’histamine. Ces cons- tatations apportent la confirmation que seule une réfrigération précoce, conti- nue et respectant un ratio glace-poisson convenable est en mesure de maîtriser la production d’histamine à un taux acceptable.

Dans le présent travail, Photobacterium phosphoreum, bactérie lumineuse active dans l’altération par son action fortement histidinolytique (ISHIMOTO et al., 1994) n’a pas été isolée. Ce résultat peut s’expliquer parce que cette bactérie est fréquemment associée à l’altération du poisson entreposé à basse tempéra-

(16)

appartenant à ce genre sont connues essentiellement pour leurs propriétés lipolytiques (GENNARI et al., 1989). L’absence de leur isolement s’explique parce que l’identification de ces bactéries n’a concerné que celles ayant manifesté au moins l’une des activités enzymatiques évoquées ci-dessus.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

ABABOUCH L.H., SOUIBRI L., RHALIBY K., OUAHDI O., BATTAL M., BUSTA F.F.

1996. Quality changes in sardines (Sardina pilchardus) stored in ice and at ambiant température. Food Microbiol. 13, 123-132.

ANONYME, 1976. Council Regulation N° 103/

76 freshness ratings. Off. J. Eur. Com- mun., N° : L 20 du 18 janvier 1976.

ANONYME, 2002. La pêche côtière et artisa- nale au Maroc. Rapport, statistiques.

Office National des Pêches. 35 p.

ARNOLD S.H., BROWN W.D. 1978. Histamine toxicity from fish products. Adv. Food Res. 24, 114-154.

BARETT E.L., KWAN H.S., 1985. Bacterial reduction of trimethylamine oxide. Ann.

Rev. Microbiol. 39, 131-149.

BARILE L.E., MILLA A.D., REILLY A., VILLAD- SEN., 1985a. Spoilage patterns of makerel (Rastrelliger faughni) I. Delays in icing.

ASEAN Food J. 1, 70-77.

BARILE L.E., MILLA A.D., REILLY A., VILLAD- SEN., 1985b. Spoilage patterns of makerel (Rastrelliger faughni) II.Mesophilic and psychrophilic spoilage. ASEAN Food J. 1, 121-126.

BENNOUR M., EL MARRAKCHI A., BOU- CHRITI N., EL OUADAA., 1991. Chemical and microbiological assessments of mackerel (Scomber scombrus) stored in ice. J. Food Prot. 54 : 789-792.

BOSKOU G., DEBEVERE J., 1997. Reduction of trimethylamine oxide by Shewanella spp. under modified atmospheres in vitro.

Food Microbiol. 14, 543-553.

CASTANON C.A., BARRAL A.O., 1990. On board handling and preservation of anchovy (Engraulis anchoita) catches.

Rev. Int. Froid. 13, 203-206.

CHADRASEKARAN M., LAKSHMANAPE P., RUMAL SAMY P., CHANDRAMOHAN D.,

1984. Occurrence of Vibrio during fish spoilage. Curr. Sci. 54, 31-32.

CHADRASEKARAN M., LAKSHMANAPE P., RUMAL SAMY P., CHANDRAMOHAN D., 1985. Fish flesh agar medium. A suitable experimental medium to the detection of spoilage bacteria. Antonie Van Leuwen- hook. 51, 219-225.

DALGAARD P., GRAM L., HUSS H.H., 1993.

Spoilage and shelf life of cod fillets packed in vacuum or modified atmospheres. Int. J. Food Microbiol. 19, 283- 294.

DALGAARD P., 1995. Qualitative and quantitative characterization of spoilage bacteria from packed fish. Int. J. Food Microbiol.

26, 319-333.

DALGAARD P., MEJIHOLM O., CHRISTEN- SEN T.J., HUSS., 1997. Importance of Photobacterium phosphoreum in relation to spoilage of modified atmosphere-pack- aged fish product. Lett. Appl. Microbiol.

24, 373-378.

EL MARRAKCHI A., AZLAF R., BARHOUMI M., 1982. Quelques aspects bacteriologi- ques de la sardine (Sardina pilchardus) récemment capturée et conservée aux températures de réfrigération. FAO Fish.

Rep. n° 268, pp. 45-53.

EL MARRAKCHI A., BENNOUR M., BOU- CHRITI N., HAMAMA A., KOUFAIL A., 1992a. The bacteriology of moroccan sardine (Sardina pilchardus) stored in ice. I.

Nature of the bacterial flora. Microbiol. Ali.

Nut. 10, 61-68.

EL MARRAKCHI A., BENNOUR M., BOUCHRITI N., HAMAMA A., KOUFAIL A., 1992b. The bacteriology of moroccan sardine (Sardina pilchardus) stored in ice.

II. Enzymatic properties of the bacterial flora. Microbiol. Ali. Nut. 10, 147-155.

(17)

EL MARRAKCHI A., BENNOUR M., HAMAMA A., EL KHAIDAR S., 1994. Bactéries actives dans l’altération de la sardine (Sardina pilchardus) entreposée sous glace (0 °C) et à température ambiante (25 °C). In

« Contribution du froid à la préservation de la qualité des fruits, légumes et pro- duits halieutiques. Actes du Symposium de l’Institut International de Froid. Actes Ed. IAV Hassan II. Rabat-Maroc.

FRANK H.A., 1985. Histamine forming bacteria in tuna and other marine fish. In Hista- mine in marine products : Production by bacteria, measurement and prediction of formation. Edit. Pan B.S and James D.

FAO Fisheries technical paper n° 252.

GENNARI M., TOMASELLI S., 1988. Changes in aerobic microflora of skin and gills of mediterranean sardines (Sardina pilchar- dus) during storage in ice. Int. J. Food Microbiol. 6, 341-347.

GENNARI M., ALACQUA G., FERRI F., SERIO M., 1989. Charaterization by conventional methods and genetic transformation of Neisseriaceae (genera Psychrobacter-Aci- netobacter) isolated from fresh and spoiled sardines. Food Microbiol. 6, 1999- 210.

GENNARI M., TOMASELLI S., COTRONO V., 1999. The microflora of fresh and spoiled sardines (Sardina pilchardus) caught in Adriatic (Mediterranean) Sea and stored in ice. Food Microbiol. 16, 15-28.

GRAM L., TROLLE G. HUSS H.H., 1987.

Detection of specific spoilage bacteria from fish stored at low (0 °C) and high (20 °C) températures Int. J. Food Micro- biol. 4, 65-72.

GRAM L., WEDDEL-NEERGARD C. HUSS H.H., 1990. The bacteriology of fresh and spoiling Lake Victorian Nile perch (Lates niloticus). Int. J. Food Microbiol. 10, 303- 316.

GRAM L., HUSS H.H., 1996. Microbial spoilage of fish and fish products. Int. J. Food Microbiol. 33, 121-137.

GREGERSON T., 1978. Rapid method for dis- tinction of Gram-negative from Gram-positive bacteria. Eur. J. Appl. Microbiol. 5, 123-127.

HARDY R., SMITH S.G.M., 1976. The storage of mackerel (Scomber scombrus). Develo- pment of histamine and rancidity. J. Sci.

HERBERT R.A., HENDRIE M.S., GIBSON D.M, SHEWAN J.M, 1971. Bacteria active in the spoilage of certain sea foods. J.

Appl. Bacteriol. 34, 41-50.

HERBERT R.A., SHEWAN J.M, 1976. Roles played by bacterial and autocatalytic enzymes in the production of volatile sul- phides in spoiling North Sea cod (Gadus morrhua). J. Sci. Food Agric. 27, 89-94.

HUGH R., LEIFSON E., 1953. Taxonomic significance of fermentation versus oxida- tive metabolism of carbohydrates by various negative bacteria. J. Bacteriol. 66, 24-26.

HUSS H.H., 1995. Quality and changes of fresh fish. FAO Fisheries Technical paper n° 348.

ISHIMOTO M., SHIMOKAWA O., 1978.

Reduction of trimethylamine N-Oxide by Escherichia coli as anaerobic respiration.

Zeitschrift Allg. Microbiol. 18, 173-181.

ISHIMOTO M., KASAMA K., MORII H.1994.

Histamine formation and bacterial flora in mackerel stored in ice and the temperature of ice. Nippon-Suisan-Gakkaishi. 60, 763-771.

JENSEN M., SHULZ E., 1980. Jernagers anvehdelse trl friskhedsbestemmesle af fresk. Danks. Vet. Tidsskr. 63, 314-318.

KRIEG N.R., HOLT J.G., (Eds). Bergey’s Man- ual of Systematic Bacteriology. Vol 1. 9^th ed ., Williams and wilkins (Baltimore, Lon- don), 1984.

KOUTSOMANIS K., NYCHAS G.J.E., 1999.

Chemical and sensory changes associated with microbial flora of mediterranean boque (Boops boops) stored aerobically at 0,3,7 and 10 °C. Appl. Environn. Micro- biol. 65, 698-706.

KOVACS N., 1956. Identification of Pseu- domonas pyocyanea by oxidase reaction.

Nature London. 178, 703.

LEVIN R.E., 1968. Detection and incidence of specific species of spoilage bacteria on fish. I. Methodology. Appl. Microbiol. 16, 1734-1737.

NIVEN C.F., JEFFREY M.B., CORLETT D.A., 1981. Differential plating medium for quantitative detection of histamine-producing bacteria. Appl. Environ. Microbiol.

41, 321-322.

(18)

trophic pseudomonads isolated from fish.

J. Food Prot. 47, 378-380.

SAKAGUSHI M., KAWAI A., 1981. Growth of Escherichia coli and the associated reduc- tion of trimethylamine N-oxide in fish muscle extracts. Bull. Jap. Soc. Fish. 47, 439.

SHEWAN J.M., 1961. The microbiology of sea water fish. In BORGSTROM (ed). Fish as food. Acad. Press (New-york) p. 487-560.

SHEWAN J.M., 1971. The microbiology of fish and fishery products. A progress report. J.

Appl. Bacteriol. 34, 299-315.

SHEWAN J.M., HOBBS G., 1967. The bacteriology of fish spoilage and preservation.

Prog. Indus. Microbiol. 6, 169-208.

STRENSTROM I.M., MOLIN G., 1990. Classifi- cation of the spoilage flora of flesh, with special reference to Shewanella putrefa- ciens. J. Appl. Bacteriol. 68, 601-608.

STROM A.R., OLAFSEN J.A., LARSEN H., 1979. Trimethylamine oxide a terminal

electron acceptor in anaerobic respiration of bacteria. J. Gen. Microbiol. 112, 315- 320.

TAYLOR S.L., GUTHERTZ L.S., TIUMAN M.L.F., LIEBER E.B., 1978. Histamine production by food-borne bacterial species.

J. Food Safety. 1, 173-187.

WOOD A.J., BAIRD E.A., 1943. Reduction of trimethylamine oxide by bacteria. The Enterobacteriaceae. J. Fish Res. Bd. Can.

6, 184-201.

YAMANI M.I., UNTERMANN F., 1985. Devel- opment of a histidine decarboxylase medium and its application to detect other amino-acid decarboxylases. Int. J. Food Microbiol. 2, 273-278.

YOSHINAGA D.H., FRANK H.A., 1982. Hista- mine producing bacteria in decomposing skipjack tuna (katsuwonus pelamis). Appl.

Environ. Microbiol. 44, 447-452.