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l’homéostasie locale de facteurs modulant la balance Pi/Ppi
Mathilde Guibert
To cite this version:
Mathilde Guibert. Altération du phénotype chondrocytaire : Rôle de l’homéostasie locale de facteurs modulant la balance Pi/Ppi. Rhumatologie et système ostéo-articulaire. Université de Lorraine, 2016.
Français. �NNT : 2016LORR0160�. �tel-01501673�
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Ecole Doctorale BioSE (Biologie-Santé-Environnement)
Thèse
Présentée et soutenue publiquement pour l’obtention du titre de
DOCTEUR DE l’UNIVERSITE DE LORRAINE
Mention : « Sciences de la Vie et de la Santé »
par Mathilde GUIBERT
Altération du phénotype chondrocytaire : Rôle de
l’homéostasie locale de facteurs modulant la balance Pi/PPi
Soutenue le 29 septembre 2016
Membres du jury :
Rapporteurs :
Monsieur Jérôme GUICHEUX Directeur de Recherche INSERM, UMR-S 791 LIOAD, Nantes Monsieur David MAGNE Professeur, UMR 5246 ICBMS, Lyon
Examinateurs :
Monsieur Arnaud BIANCHI, Ingénieur de Recherche CNRS, UMR 7365 IMOPA, Directeur de Thèse
Monsieur Hervé KEMPF Chargé de Recherche INSERM, UMR 7365 IMOPA, Co-directeur de Thèse
Membre invité:
Monsieur Jean-Baptiste VINCOURT Ingénieur de Recherche CNRS , UMR 7365 IMOPA, Nancy
---
Travail effectué au sein de l’UMR CNRS 7365 « Ingénierie Moléculaire et Physiopathologie Articulaire », Université de Lorraine.
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REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier Monsieur le professeur Jean-Yves JOUZEAU qui m’a permis de réaliser cette thèse dans son laboratoire et pour le soutien qu’il m’a apporté au cours de ces trois années en particulier pour ma poursuite professionnelle
Je remercie tout spécialement Monsieur le docteur Arnaud BIANCHI ou « Nono » pour son aide scientifique et humaine au cours de mon Master 2, pour l’obtention de ma bourse de thèse et tout simplement pour mes trois années de thèse. Merci de m’avoir fait confiance, de m’avoir encouragé pendant trois ans, de m’avoir fait des petites fiches pour résumer toutes mes manips et de m’avoir donné l’indépendance nécessaire pour mon projet de thèse. Sans toi, cette thèse n’aurait pas pu voir le jour.
Je remercie également Monsieur le docteur Hervé Kempf ou « Herrrvé » pour le temps qu’il m’a consacré. Ses conseils et son sens (très) critique ont été indispensables pour l’aboutissement de mes travaux et des articles scientifiques. Merci d’avoir accepté de codiriger cette thèse avec toute la bonne humeur et la rigueur scientifique nécessaire, merci de m’avoir supporté dans les moments de doute et merci pour toutes les discussions « non scientifiques » très agréables.
Je remercie Messieurs les Professeurs David MAGNE et Jérôme GUICHEUX de l’honneur qu’ils me témoignent en acceptant d’être rapporteurs de ce travail de thèse. Je les remercie du temps consacré à évaluer mes travaux et je leur en suis reconnaissante.
Je suis également très honoré que Monsieur le docteur Jean-Baptiste VINCOURT ait accepté de faire partie de mon jury de thèse. Un grand merci pour le temps consacré à mes travaux, à essayer de résoudre mes problèmes techniques. Sa bonne humeur, sa rigueur scientifique, son esprit de contradiction et ses conseils ont été des éléments clés au cours de ma thèse. Merci encore pour toutes nos discussions, à essayer de refaire le monde, je ne perds pas espoir que l’on y arrive un jour.
3
Je remercie la SFBTM pour son soutien.
Un grand merci à monsieur le professeur Pascal REBOUL pour son aide scientifique et sa sympathie. Merci d’avoir pris le temps de m’aider pour mon article scientifique mais aussi dès que cela était nécessaire
Un grand merci à madame le docteur Stéphanie GRANDEMANGE. Merci de m’avoir donné le goût de la recherche scientifique au cours de mes études et de m’avoir encouragé et aidé à poursuivre mes ambitions. Merci pour l’obtention de mon monitorat.
Je remercie tout spécialement Monsieur le docteur Mathieu RIFFAULT. Je n’ai surement jamais exprimé le bonheur de t’avoir rencontré mais sans ton amitié, ma thèse n’aurait pas été la même. Merci pour ta bonne humeur, tes conseils scientifiques et humains.
Merci pour tous les moments passés ensemble que ce soit au sein du laboratoire ou en Irlande et merci pour ton soutien infaillible.
Un grand merci à mes « sœurs de thèse » Caroline LAROYE et Léonore LEGER. Merci d’avoir été présentes pour moi dans les bons comme dans les mauvais moments. Merci pour nos longues discussions scientifiques ou non. Vous faites parties de mes plus belles rencontres au cours de cette thèse et j’espère que notre amitié perdurera.
Merci à mon stagiaire de M1 préféré, Guillaume TOUSSAINT pour son aide sur mon projet et ses conseils informatiques, en espérant te croiser l’année prochaine.
Je remercie mes « copains du midi » pour toutes les discussions faites à table à essayer de refaire le monde et le laboratoire. Merci à Paul pour sa folie et tous les fous rire que l’on a pu avoir, Merci à Sophie.
Je n’ai surement jamais assez exprimé « physiquement » la chance que j’ai eu de travailler durant ces trois ans au sein de l’équipe 4 mais j’espère que ces quelques lignes pourront représenter le plaisir que j’ai eu de travailler avec vous. Un grand merci à Cécile pour son aide logistique au quotidien et sa bonne humeur, à Meriem pour son
4
aide technique et scientifique en expérimentation animale et à Nathalie pour ses connaissances. Je remercie le Docteur Catherine YZYDORCZYK pour son aide technique durant mon master 2. Merci à toi d’avoir pris le temps de me former à la paillasse.
Merci à Frederic CAILOTTO pour tous ses conseils scientifiques et humains.
Je remercie tout spécialement les étudiants de l’équipe 4: Merci au Docteur Melissa YELEHA-OUKOUMA pour son soutien, sa sympathie et ces changements capillaires qui m’intriguent encore, merci au docteur Hu YONG pour son apprentissage de la culture chinoise, merci à Julie HABLOT pour ses conseils techniques et les longues discussions dans le bureau. Un grand merci à Chahohua DENG d’avoir été mon binôme pendant trois ans, merci pour ton aide technique, tes conseils pertinents et surtout ta bonne humeur au quotidien dans ce « sacré labo » comme tu le dis si bien.
Je remercie mes collègues de l’association A-Team of Bios pour les bons moments passés. Merci pour votre investissement, j’espère que cette association durera aussi longtemps qu’existera le doctorat. Merci à mes collègues du bureau 2014, Arnaud, Benoit, JC, Amel et Cécile et Léo pour l’année formidable passée ensemble. Merci à tous les adhérents et membres du bureau passés et à venir. Un grand merci à Laurie pour son investissement associatif mais surtout sa bonne humeur.
Merci à mes collègues du conseil scientifique de l’école doctoral pour leur confiance et en particulier à Anne-Sophie pour toutes les réunions passées ensemble.
Merci à mes collègues du monitorat Guillaume, Claire et Sophie et merci au laboratoire STICMO pour la préparation de mes TPs. Merci à mes étudiants pour leur patience.
Merci à tous les membres du laboratoire, au personnel technique pour leur aide logistique et en particulier à Brigitte pour tout ce qu’elle a fait au quotidien pour les étudiants. Et merci à l’ensemble des étudiants d’IMOPA, vous êtes la richesse de ce laboratoire. En espérant n’oublier personne, merci à Gautier, Gabriel, Benjamin, Pan, Xing, Hao, Reine, Mahdia, Dima, Xavier, Irfan, Caro, Xiaomeng, Dafné, Samia, Jonathan, Yoan, Guitoune, Toinou et aussi à Lydia, Valérie, Laurent, Ghislaine, Nadia, Christophe et tous ceux que j’ai pu oublier.
Enfin merci à Sarah, Virginie, Olga, la famille MOULIN, Margot, mes amis de lycée et de fac, Merci à mon professeur de SVT de 4ème Monsieur BARTHELEMY
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A mes parents, Anne et Philippe
A mes grands parents, Nicole et Etienne,
A ma sœur, Lisa
Pour votre amour et votre soutien
A toute ma famille A tous mes amis
A David pour son soutien quotidien et les belles choses à venir,
Je dédie ce travail de thèse
6
7
SOMMAIRE
LISTE DES FIGURES ... 10
LISTE DES TABLEAUX ... 12
LISTE DES ABREVIATIONS ... 13
INTRODUCTION ... 16
CHAPITREI :LECARTILAGE ... 17
A. Le cartilage et ses propriétés ...17
1 Types histologiques ... 17
2 Organisation du cartilage articulaire... 18
3 Matrice extracellulaire et péricellulaire... 22
a. Les constituants de la matrice ... 24
b. Remodelage matriciel par les protéases ... 28
B. Chondrogenèse, marqueurs et facteurs de transcription ...30
1 Chondrogenèse et facteurs de transcription ... 31
2 Facteurs de croissance et cartilage... 34
a. Le TGF-β ... 34
b. Insuline et IGF ... 35
C. Modifications pathologiques du cartilage articulaire ...39
1 Perte du phénotype chondrocytaire ... 39
a. Dédifférenciation ... 40
b. Hypertrophie ... 42
2 Minéralisation ... 43
a. Processus de minéralisation et éléments minéraux ... 43
b. Minéralisation physiologique et matrice extracellulaire ... 43
c. Molécules impliquées ... 48
D. Pathologies articulaires ...49
1. Arthrose ... 49
a. Présentation clinique et pathogenèse ... 49
b. Anabolisme et modification du phénotype chondrocytaire ... 53
c. Signalisation dans le chondrocyte articulaire arthrosique... 57
d. Rôle de la MEC et de ses fragments dans la régulation du métabolisme du cartilage ... 58
e. Rôle de l’insuline et l’IGF dans la pathologie ... 62
2. Pathologies microcristallines ... 64
a. Présentation clinique et pathogenèse ... 65
b. Effets moléculaires des cristaux ... 66
CHAPITREII :LABALANCEPI/PPI ... 70
A. Balance Pi/PPi : Généralités ...70
B. Production et dégradation du PPi : Les ectonucléotidases ...71
1. Les ectonucléotidases : 4 familles ... 73
a Les ecto-nucléoside triphosphate/diphosphorylases (E-NTPDases) ... 73
b L’Ecto-5’-nucleotidases (eNs)... 74
c Les phosphatases Alcalines (ALPs) ... 77
d Les Ecto-nucleotide pyrophosphatases/phosphodiestérases (E-NPPs) ... 78
3 Fonctions physiologiques et pathophysiologiques des ENPPs ... 83
a. Les NPPs modulent la transduction du signal medié par les nucléotides ... 83
b. NPP1 dans la signalisation de l’insuline ... 85
c. NPP1, NPP3 et PPi intracellulaire ... 86
d. ENPP1 et PPi régulent la minéralisation osseuse et cartilagineuse ... 87
C. Transport du PPi et du Pi ...91
1 Transport du PPi : Ank ... 91
a. Structure et fonction de la protéine ANK ... 91
b. Régulation de l’expression de ANK ... 95
c. Influence d’ANK sur le phénotype cellulaire ... 97
d. Interaction de la protéine ANK ... 97
2 Transport du Pi ... 98
8
a. Pit ... 98
b. xPR1 ... 100
D. Les pathologies associées à ENPP1, ANK, Pit et TNAP ... 100
1 Chondrocalcinose... 100
2 Calcifications pathologiques des ligaments et des capsules articulaires ... 101
3 Calcification artérielle généralisée de l’enfance (GACI) ... 103
4 Calcification familiale primaire cérébrale (PFBC) ... 105
5 L’hypophosphatasie (HPP) ... 105
CHAPITREIII :METABOLISMEPHOSPHOCALCIQUE,FGF23ETCONSEQUENCES ARTICULAIRES ... 107
A. Métabolisme phosphocalcique ... 107
1 Absorption intestinale ... 108
2 Réabsorption rénale ... 108
3 Hormones impliquées ... 109
a. Hormone Parathyroïde ... 109
b. Calcitriol (1,25(OH)2D3) ... 109
c. Les phosphatonines ... 110
4 Régulation phosphocalcique du tissu squelettique ... 111
a. Rôle du phosphate dans la plaque de croissance ... 111
b. Rôle du Pi dans le phénotype cellulaire ... 112
B. FGF23 ... 114
1 La famille FGF ... 114
2 Caractéristiques du FGF23 ... 116
3 Récepteurs et co-récepteur du FGF23 ... 117
4 Régulation du FGF23 ... 121
5 Sites principaux d’activité du FGF23 ... 122
a. Régulation au niveau rénal ... 122
b. Régulation au niveau du squelette ... 125
C. Pathologies associées au FGF23 et à Klotho ... 125
1 Rachitisme hypophosphatémique ... 126
a. Rachitisme hypophosphatémique lié à l’X (XLH) ... 126
b. Rachitisme hypophosphatémique autosomal dominant (ADHR) ... 127
c. Rachitisme hypophosphatémique autosomal récessif (ARHR) 1 et 2... 127
2 Les tumeurs osseuses productrices de FGF23 ... 127
3 Autres ... 127
a. Hyperphosphatémies par perturbation du FGF23 ... 128
b. FGF23 et maladie rénale chronique (CKD) ... 128
OBJECTIFS DE L’ETUDE ...129
RESULTATS ...133
A. Effet du FGF23 dans la différenciation hypertrophique des chondrocytes ... 134
1 Effet du FGF23 dans la différenciation hypertrophique des chondrocytes humains ... 134
a. Objectif du travail ... 134
b. Matériels et méthodes ... 134
c. Article ... 135
d. Conclusions et perspectives ... 147
2 Effet du FGF23 dans la différenciation hypertrophique des ATDC5 ... 148
a. Objectif du travail ... 148
b. Matériels et méthodes ... 148
c. Article ... 150
d. Conclusions et perspectives ... 181
e. Résultats supplémentaires ... 181
3 Conclusion générale... 183
B. Lien entre le FGF23 et le PPi ... 185
1 Objectifs du travail ... 185
2 Matériels et méthodes ... 185
3 Résultats ... 186
9
a. Efffet du FGF23 sur l’expression des marqueurs de la balance Pi/PPi ... 186
b. Contribution de FGFR1 et klotho dans les effets du FGF23 ... 186
c. Contribution des voies de signalisation induites par FGF23 dans les chondrocytes humains arthrosiques ... 189
4 Conclusions et discussion ... 190
C. Rôle du PPi sur le phénotype des chondrocytes articulaires ... 193
1 Objectif du travail ... 193
2 Matériels et méthodes ... 193
3 Résultats ... 194
4 Conclusions et hypothèses ... 222
5 Résultats complémentaires ... 223
A. RÔLE DES FRAGMENTS DE FIBRONECTINE DANS LES EFFETS DU PPI SUR LE PHÉNOTYPE CHONDROCYTAIRE ... 223
B. LE PPI NE S’OPPOSE PAS À LA PERTE DU PHÉNOTYPE CHONDROCYTAIRE CHEZ L’HOMME ... 229
C. COMPARAISON INTER-ESPÈCES DES EFFETS DU PPI SUR LE PHÉNOTYPE CHONDROCYTAIRE EN FONCTION DU MILIEU UTILISÉ ... 233
D. RÔLE DU MÉTABOLISME DE L’INSULINE SUR LE PHENOTYPE CHONDROCYTAIRE ET LIEN AVEC LE PPI ... 237
E. RÔLE DU PPI INTRACELLULAIRE SUR LE PHÉNOTYPE CHONDROCYTAIRE ... 243
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES...246
10
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Cartilage hyalin de la surface articulaire d’un os issu d’une articulation synoviale
... 18
Figure 2 : Schéma de l’articulation du genou chez l’Homme ... 19
Figure 3 : Représentation des différentes couches de chondrocytes au sein du cartilage articulaire ... 20
Figure 4 : Disposition des collagènes de type II dans la couche moyenne du cartilage ... 23
Figure 5 : Structure moléculaire de la Fibronectine. ... 26
Figure 6 : Structure de certaines MMPs et leurs substrats matriciels. ... 30
Figure 7: Les différentes étapes de la chondrogenèse ... 32
Figure 8 : Expression des protéines et des facteurs impliqués dans la chondrogenèse ... 33
Figure 9 : Voies de signalisation principales de l’insuline ... 36
Figure 10 : Cascade de transduction du signal émanant du récepteur IGF-1 activé ... 38
Figure 11 : Illustration des différents événements moléculaires de la dédifférenciation des chondrocytes ... 42
Figure 12 : Evènements moléculaires de l’hypertrophie des chondrocytes ... 45
Figure 13 : Représentation de la minéralisation intrafibrillaire du collagène ... 46
Figure 14 : Différents stade de la progression de l’arthrose du genou. ... 51
Figure 15 : Voies de signalisation et changements structurels pendant le développement de l’arthrose ... 52
Figure 16 : Cascade de signalisation impliquée dans l’arthrose ... 59
Figure 17 : Voies de signalisation activées dans les chondrocytes par les fragments de fibronectine ... 60
Figure 18 : Balance ePPi/ePi et pathologies microcristallines.. ... 65
Figure 19 : Conséquences pathophysiologiques des cristaux de CPPD ... 68
Figure 20 : Représentation schématique de l’équilibre Phosphate inorganique (Pi) / Pyrophosphate (PPi) dans le chondrocyte articulaire. ... 71
Figure 21 : Structure du PPi (A), d’un biphosphonate (B) et mécanisme de formation du PPi chez les mammifères (C). ... 72
Figure 22 : Ectoenzymes et kinases extracellulaires impliquées dans la génération d’adénosine. ... 76
Figure 23 : Structure des différents domaines des ENPPs ... 79
11
Figure 24 : Rôle de NPP1 dans l’hydrolyse de l’ATP et ses effets sur la minéralisation
osseuse ... 87
Figure 25 : Rôle du PPi dans les processus physiologiques et pathologiques de la calcification. ... 89
Figure 26 : Organisation spatiale de la protéine ANK ... 92
Figure 27 : Perturbation de la minéralisation des os longs chez les souris ENPP1-/-. ... 102
Figure 28 : Manifestations de la calcification artérielle généralisée de l’enfance ... 104
Figure 29 : Relations entre les organes, les hormones et les transporteurs impliqués dans l’homéostasie du phosphate ... 110
Figure 30 : Structure des gènes, ARNm et protéines du FGF23 ... 117
Figure 31 : Structures des FGFRs ... 118
Figure 32 : Voies de signalisation du FGF23 avec et sans Klotho ... 120
Figure 33 : Rôle rénal du FGF23 ... 123
Figure 34 : Rôle systémique du FGF23. ... 124
Figure 35 : Schéma représentant la différenciation du modèle cellulaire ATDC5.. ... 149
Figure 36 : Schéma bilan du rôle du FGF23 sur le chondrocyte ... 184
Figure 37: Expression des gènes du métabolisme du PPi dans des chondrocytes humains arthrosiques stimulés par FGF23. ... 187
Figure 38 : Effet de FGF23 sur l’expression de ANKH et la production de PPi dans des chondrocytes OA . ... 188
Figure 39: Contribution des voies de signalisation dans la stimulation de Ankh par FGF23 ... 189
Figure 40 : Schéma bilan du rôle de FGF23 sue l’hypertrophie des chondrocytes et le métabolisme du PPi ... 192
Figure 41 : Une stimulation par le PPi entraine une augmentation de l’expression de la fibronectine, d’ADAMTS8, de l’intégrine α5 et des MMPs. ... 225
Figure 42 : Une stimulation par le PPi entraine une augmentation du marquage de la fibronectine et de l’intégrine α5 dans les chondrocytes. ... 226
Figure 43 : Des chondrocytes humains arthrosiques ont été stimulés par 0.1mM de PPi, le surnageant récolté après 48h, 72h ou 96h et mis en contact avec des chondrocytes humains arthrosiques en culture. ... 228
Figure 44 : Le PPi n’inhibe pas la production de NO par des chondrocytes humains arthrosiques stimulés par l’IL1-β. ... 230
12
Figure 45 : Le PPi n’inhibe pas la perte du phénotype des chondrocytes humains
arthrosiques stimulés par l’IL1-β. ... 231
Figure 46 : Effets différents du PPi en fonction de l’espèce et du milieu utilisé. ... 236
Figure 47 : Effets de l’insuline et de l’IGF sur les cibles du PPi dans des chondrocytes humains arthrosiques. ... 239
Figure 48 : Effets de l’insuline et de l’IGF sur IGFR1 et IRS1 dans des chondrocytes humains arthrosiques stimulés ou non par du PPi. ... 240
Figure 49 : Rôle du PPi intracellulaire sur le phénotype chondrocytaire. ... 245
Figure 50 : Schéma bilan de l’ensemble des résultats sur le rôle du PPi et du FGF23 sur les chondrocytes articulaires issus de patients arthrosiques. ... 252
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Facteurs impliqués dans la dédifférenciation des chondrocytes ... 41Tableau 2 : Composants majeurs des vésicules matricielles (MVs). ... 47
Tableau 3 : Tableau des 4 familles d’ectonucleotidases. ... 76
Tableau 4 : Distribution tissulaire des NPPs humaines ... 82
Tableau 5 : Molécules extracellulaires affectant l’expression des NPPS ... 82
Tableau 6 : Tableau des différentes mutations de ANKH associées à des phénotypes pathologiques différents. ... 94
Tableau 7 : Tableau représentant l’ensemble des membres de la famille FGF et leurs rôles physiologiques ... 115
Tableau 8 : Pathologies associées au FGF23. ... 126
Tableau 9 : Taux d’inhibition de chaque shRNA testé ... 182
13
LISTE DES ABREVIATIONS
AASAL Anti-Arthrosique Symptomatique d’Action Lente
ABCC6 ATP-binding cassette sub-family C member 6
ACLT Anterior Cruciate Ligament Transection ; ACVs vésicules du Cartilage Articulaire
ADAMS Une Disintégrine et une Métalloprotéinase
ADAMTS Une Disintégrine et une Métalloprotéinase avec un motif Thrombospondine
ADHR Rachitisme Hypophosphatémique autosomique dominant
ADP Adénosine Diphosphate
AGE Advanced Glycation End products AINS Anti-inflammatoires Non Stéroïdiens ALP ou AP Phosphatase Alcaline
AMP Adénosine Monophosphate
AMPc Adénosine Monophosphate Cyclique ANKH progressive ankylosis protein homolog AP-1 Activator Protein 1
ARHR Rachitisme Hypophosphatémique autosomique récessif
ATP Adénosine Triphosphate BCP Phosphate de Calcium Basique BMP Bone Morphogenetic Protein
BSP Bone sialoprotein Ca2+ Ions Calcium
CKD Maladie rénale chronique CMD Dysplasie Craniométaphysale Col-fs Fragments de Collagène
COMP Cartilage oligomeric matrix protein CPPD Pyrophosphate de Calcium Dihydraté CTC Connective Tissue Calcifying Diseases DMP1 Dentin Matrix Protein 1)
DSPP Dentin Sialophosphoprotein
E-NTPDases Ecto-nucleoside triphosphate diphosphorylases
eN ecto-5’-nucleotidases ENPP Ectonucléotidase
pyrophosphatase/phosphodiesterases ePi Phosphate inorganique extracellulaire ePPi Pyrophosphate inorganique extracellulaire ERK Extracellular signal-Regulated Kinases FACIT collagènes associés aux fibrilles contenant des triples hélices interrompues FGF Fibroblast Growth Factor
FGFR FGF récepteur FN Fibronectine
Fn-fs Fragments de Fibronectine
GACI Calcification artérielle généralisée de l’Enfance
14
GAG Glycosaminoglycanes
GALNT-3 polypeptide N-acetylgalactosaminyl- transferase 3
GH Hormone de croissance GPI GlycophosPhatidylInositol
Grb2 Growth factor receptor bound protein 2 GTP Guanosine Triphosphate
HA Hydroxyapatite
HBS Héparane Binding Site HIF Hypoxia Inducible Factor HRE Eléments de réponse à l’hypoxie I-CAM Intercellular Cell Adhésion Molécule IAS Insaponifiables d’avocat et de soja IGF ; Insulin growth Factor
IGFBP IGF Protein Ihh indian hedgehog IL Interleukin
IL-1RA interleukin 1 Receptor Antagonist iPi Pi intracellulaire
iPPi ; PPi intracellulaire IRS insulin receptor substrate JNK c-Jun N-terminal kinases kDa kilo Daltons
Kl Klotho
LDA Acide lypophosphatidique
LVH Hypertrophie Ventriculaire Gauche MAGP-1 Microfibril-associated glycoprotein-1 MAPK Mitogen-activated protein kinases MAS Syndrome McCune Albright MEC Matrice ExtraCellulaire
MEPE Matrix Extracellulaire Phosphoglycoprotein Mg2+ Ions Magnésium MGP Matrix gla protein MIA sodium monoiodoacetate MMP Metalloprotéinase
MSCs cellules souches mésenchymateuses MVs vésicules matricielles
Na2+ Ions Sodium
NF-κB Nuclear Factor-kappa B NK natural killer
NMP Nucléotide Monophosphate NO oxyde d’azote (N)
NTP Nucléotide Triphosphate OPN Opstéopontine
ORF Open Reading Frame, Cadre de Lecture Ouvert
PchoI phosphocholine PCM Matrice Péricellulaire
PDGF Platelet Derived Growth Factor PDK1 3-phosphoinositide dependent protein kinase-1
PEA phosphoethanolamine
PFBC Calcification familiale primaire cérébrale PG Protéoglycanes
PHEX Phosphate-regulating neutral endopeptidase
PHOSPHO1 phosphoethanolamine/phosphoch oline phosphatase
PI3K phosphoinositide 3-kinase
15
PKC Protein Kinase C PLP Pyridocal-5’-phosphate PTH Hormone Parathyroïdienne
PTHrP Parathyroid hormone-related protein PXE Pseudoxanthoma elasticum
RA Acide rétinoïque
ROS Espèce Réactive de l’Oxygène
RT-PCR Polymérisation en Chaine en Temps Réel SMCs Cellules musculaires lisses
SPARC secreted protein, acidic, cysteine-rich SPC Substilisin-like protein convertase TGF Facteur de Croissance Transformant TIMP Tissue inhibitor of metalloproteinases TIO Hypophosphatémie d’origine tumorale TLR2 Toll-like receptor 2
TNAP Tissue-non specific AP TNF facteur de nécrose tumorale Ttw tiptoe walking
UMS urate de sodium V-CAM ; Vascular CAM VD Vitamine D
VDR ; Récepteur à la Vitamine D
VEGF ; Vascular endothelial growth factor WT wild type
βGP βGlycérophosphate
16
INTRODUCTION
17
CHAPITREI : LECARTILAGE
A. Le cartilage et ses propriétés
1 Types histologiques
Le cartilage hyalin est le tissu cartilagineux le plus répandu chez l’Homme. Chez le fœtus, il forme la plus grande partie du squelette avant d’être remplacé par de l’os selon le processus d’ossification endochondrale (Chapitre I, paragraphe B). Chez l’adulte, il recouvre les surfaces articulaires et constitue le tissu de soutien du larynx, de la trachée, de la cloison nasale, du conduit auditif externe et le cartilage intercostal. Le cartilage hyalin est recouvert par une membrane fibreuse appelée périchondre. Il ne contient pas de fibres élastiques mais de nombreuses fibres de collagènes dont notamment du collagène de type II (Figure 1).
Le cartilage élastique est au contraire caractérisé par l’abondance des fibres élastiques dans sa matrice extracellulaire. Il se situe essentiellement au niveau du pavillon de l’oreille, du conduit auditif externe et de certains cartilages du larynx comme le cartilage thyroïde.
Enfin, le fibrocartilage est un tissu intermédiaire opaque entre le tissu conjonctif et le cartilage hyalin, il se distingue par la présence de fibres de collagène de type I ce qui lui permet une grande résistance mécanique au sein de certaines zones comme les disques intervertébraux ou la symphyse pubienne (Mitchell and Peel, 2009).
18
Figure 1 : Cartilage hyalin de la surface articulaire d’un os issu d’une articulation synoviale composé de larges et petits chondrocytes, adapté de Mitchell and Peel, 2009, coloration HE.
2 Organisation du cartilage articulaire
L’articulation est une entité fonctionnelle composée de cinq tissus essentiels : le tissu osseux, le tissu cartilagineux, la membrane synoviale tapissant les cavités articulaires, le liquide synovial et les tissus élastiques tels que les ligaments et les tendons (Figure 2).
A l’âge adulte, le cartilage est un tissu très spécialisé qui n’est ni vascularisé, ni innervé.
Son remodelage est lent et il est nourri par le liquide synovial. Il contient environ 2 à 5%
de cellules éparses dans une matrice extracellulaire (MEC) dont l’épaisseur varie en fonction des articulations.
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Figure 2 : Schéma de l’articulation du genou chez l’Homme, adapté de Drake, Richard L et al., 2015. L’articulation se compose de cinq tissus essentiels : le tissu osseux, le tissu cartilagineux, la membrane synoviale, le liquide synovial et les tissus élastiques (ligaments et tendons).
Du fait de son importance fonctionnelle et des pathologies l’affectant, le cartilage articulaire est le tissu cartilagineux le mieux connu et le plus étudié. La microscopie électronique a permis de mettre en évidence au sein du cartilage une organisation particulière selon la profondeur du tissu en différentes couches (Figure 3). A la surface du cartilage, il existe une zone acellulaire ou lamina splenda qui recouvre la couche superficielle. Cette zone est importante puisqu’elle permet l’accrochage de macromolécules présentes dans le liquide synovial et constitue également une couche protectrice.
La couche superficielle est riche en fibres de collagène II et elle est constituée de petites cellules aplaties inégalement réparties. Cette zone est riche en fibronectine et relativement pauvre en protéoglycanes (PGs). La couche intermédiaire ou moyenne est composée de cellules plus volumineuses et sphériques. Le réseau de fibres de collagène
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n’a pas d’orientation particulière. Au niveau de la couche profonde ou radiale, les fibres de collagène II sont disposées perpendiculairement à la surface, et les cellules sont moins nombreuses.
Figure 3 : Représentation des différentes couches de chondrocytes au sein du cartilage articulaire, adapté de (Ovalle and Nahirney, 2013). A la surface du cartilage, il existe une zone acellulaire qui recouvre la couche superficielle (zone I), riche en fibres de collagène II et constituée de petites cellules aplaties inégalement réparties. Cette zone est riche en fibronectine et relativement pauvre en protéoglycanes (PGs). La couche intermédiaire ou moyenne (zone II) est composée de cellules plus volumineuses et sphériques. Au niveau de la couche profonde ou radiale (zone III), les fibres de collagène II sont disposées perpendiculairement à la surface, et les cellules sont moins nombreuses. Des techniques d’histologie permettent de mettre en évidence une ligne de démarcation la “tidemark” qui correspond au front de calcification et démarque le cartilage calcifié. Enfin, on trouve du tissu osseux, l’os sous-chondral puis l’os cortical.
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La concentration en PGs y est élevée. Des techniques d’histologie permettent de mettre en évidence une ligne de démarcation nommée “tidemark” qui correspond au front de calcification du cartilage. Enfin, on trouve du tissu osseux, l’os sous-chondral puis l’os cortical.
Le cartilage articulaire est un tissu élastique et résistant aux forces biomécaniques associées aux mouvements de l’articulation permettant ainsi d’assurer un bon glissement entre les pièces osseuses articulaires. Son coefficient de friction très bas permet d’amortir et de répartir les pressions. Il est composé d’une matrice extracellulaire dense secrétée par un seul type cellulaire, les chondrocytes.
Ces cellules sont normalement dans un état quiescent. Cependant, ces cellules peuvent entrer en apoptose ou subir des changements phénotypiques (Chapitre I, paragraphe C), entrainant des altérations dans la composition et la structure du cartilage articulaire à l’origine de pathologies comme l’arthrose ou l’arthrite (Kierszenbaum, 2006).
Les chondrocytes sont enfermés dans une matrice extracellulaire mais l’environnement immédiat du chondrocyte, la matrice péricellulaire (PCM) est pauvre en collagène de type II et forme avec la cellule un chondron. En microscopie électronique, le chondrocyte est de forme sphérique ou ovoïde et mesure de 30 à 40µm de diamètre (Archer and Francis-West, 2003). Les chondrocytes possèdent un noyau central développé, des mitochondries et des vacuoles lysosomiales. Ces cellules fonctionnent principalement en anaérobie. Il s’agit de l’un des rares tissus à fonctionner en hypoxie. Il existe un gradient hypoxique qui varie de 10% d’oxygène en surface à 1% en profondeur important pour la différenciation de ce tissu (Portron et al., 2015). Les chondrocytes ne migrent pas et se multiplient peu ou pas dans un cartilage normal. En raison de la caractéristique avasculaire du cartilage, les nutriments de base proviennent exclusivement du liquide synovial. Ce liquide correspond à un dialysat sélectif du plasma auquel manquent les protéines de poids moléculaire élevé. Seules les « petites » molécules peuvent pénétrer le cartilage par simple diffusion ou imbibition favorisée par la mobilité de l’articulation (Allan, 1998). Les « grosses » molécules ne peuvent pénétrer que sous l’effet de la compression intermittente qui s’exerce au cours des mouvements (Chevalier and Richette, 2005).
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3 Matrice extracellulaire et péricellulaire
La matrice extracellulaire est essentielle pour le maintien de l’articulation, elle est constituée d’un réseau tridimensionnel contenant essentiellement des fibres de collagènes et des protéoglycanes. Les collagènes de type II, IX et XI confèrent au cartilage sa résistance, sa forme et son élasticité. On retrouve le collagène de type VI autour des chondrocytes et le collagène X dans le cartilage calcifié. C’est le collagène II qui est le constituant principal de la matrice cartilagineuse, représentant 80 à 90% de sa composition (Figure 4).
Dans le cartilage, la matrice péricellulaire (PCM) est une zone de la MEC spécialisée qui entoure directement les chondrocytes. La PCM est donc considérée comme le microenvironnement, permettant la communication entre les chondrocytes et la MEC.
En plus du collagène de type II et des protéoglycanes, le collagène de type VI est un élément structural majeur de la PCM. Un complexe de biglycane et de décorine permet l’agrégation du collagène de type VI avec le réseau de fibrilles de la PCM. Le biglycane et la décorine connectent le collagène de type VI avec la matriline qui en retour se lie à l’agrécane et le collagène de type II de la MEC du cartilage (Zhang, 2014). Il est maintenant connu que ce domaine péricellulaire permet de connecter l’activité métabolique du chondrocyte avec l’environnement mécanique de l’articulation (Wilusz et al., 2014).
La synthèse, l’incorporation et la dégradation des protéines de la MEC sont dirigées par les chondrocytes présents en faible densité dans la matrice mais aussi la membrane synoviale qui entoure l’articulation. Certains facteurs peuvent perturber ces fonctions chondrocytaires et favoriser le catabolisme du cartilage au détriment de la synthèse. C’est le cas dans de nombreuses pathologies comme l’arthrose où des enzymes protéolytiques dépendantes du zinc, les métalloprotéinases (MMPs), qui appartiennent à la famille des peptidases, déstructurent la matrice. L’expression et l’activité de ces protéines sont induites par des signaux extracellulaires comme les cytokines interleukine 1β (IL-1β) ou le TNF-α (Tumor Necrosis Factor) via les voies de transduction NF-κB et AP-1 et sont retrouvées en forte concentration au sein des articulations arthrosiques (Hashimoto et al., 2008).
De plus, la matrice cartilagineuse contient de nombreuses macromolécules avec
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la capacité d’être dégradées et de perturber la MEC. C’est le cas de la fibronectine, du collagène de type II, de différents protéoglycanes, de l’acide hyaluronique, de la protéine matricielle oligomérique du cartilage (COMP) et de petites quantités d’autres types de ligands de la MEC. Lors de la dégénérescence du cartilage, la concentration de ces fragments augmente considérablement.
Enfin, le turnover du protéoglycane est estimé à environ 25 ans alors que la demi-vie du collagène est d’environ 400 ans (Sophia Fox et al., 2009; Verzijl et al., 2000).
Figure 4 : Disposition des collagènes de type II dans la couche moyenne du cartilage emprisonnant les protéoglycanes, eux-mêmes attachés sur une longue molécule d’acide hyaluronique. Des molécules appelées adhésines, de petits PG, servent à assurer la cohésion de l’ensemble collagène-PG (Ross and Pawlina, 2011).
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a. Les constituants de la matrice a1. LES collagènes
Les collagènes sont les protéines majeures des MEC des tissus de soutien (Figure 4). Les membres de la famille des collagènes sont tous organisés en trimères.
Dans le génome des vertébrés, il existe au moins 45 gènes qui codent pour 28 glycoprotéines de collagènes différentes. Ces collagènes ont été désignés par des nombres romains (I-XXVIII) selon leur ordre chronologique de découverte, et sont classés en fonction de la structure de leurs domaines et leur organisation supra- structurelle. Pour chaque type de collagène, une chaine α génétiquement distincte est désigné par un nombre. La chaine α d’un type de collagène étant différente de celle d’un autre type et chaque chaine α étant codée par un gène différent. Les collagènes peuvent être homotrimériques, c’est à dire composés de trois chaines α identiques comme pour le collagène de type I ou II. Au contraire, ils peuvent être hétérotrimériques, comprenant des chaines α codées par des gènes différents du même type de collagène, comme pour le collagène de type I.
La sous-famille des collagènes formant des fibrilles inclut les collagènes I, II, III, V, XI, XXIV et XXVII. Ces collagènes ont un long domaine continu en triple hélice. Ils sont synthétisés et secrétés sous la forme de pro-collagènes, contenant un pro-peptide C- terminal non-collagènique et un pro-peptide N-terminal. La présence de ces pro- peptides prévient un assemblage prématuré des molécules de collagènes en fibrilles.
L’assemblage est régulé par différentes enzymes. Le pro-peptide-C par une famille d’endopeptidases dont le membre fondateur est la Bone Morphogenetic Protein 1 (BMP-1) (Peltonen et al., 1985). Les enzymes de clivage ont des spécificités pour chaque type de collagène et le propeptide C-terminal du collagène de type II, également appelé Chondrocalcin est considéré comme un acteur important de la minéralisation du cartilage de croissance lorsqu’il est intégré à la MEC (Poole et al., 1984).
Après le clivage des pro-peptides, les molécules de collagènes s’assemblent entre elles pour former des fibrilles striées. Dans une fibrille, les molécules de collagènes sont assemblées longitudinalement en quinconce. Ainsi, un écart est présent entre deux molécules voisines.
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Les collagènes associés aux fibrilles contenant des triples hélices interrompues (FACIT) interagissent fortement avec les collagènes formant des fibrilles. Ces molécules affectent les propriétés de surface des fibrilles aussi bien qu’elles les protègent. Ce sont les collagène IX, XII, XIV et XX.
Le collagène IV est considéré comme un collagène « membrane basale ». Il est le composé collagène d’un réseau de différentes molécules matricielles et définit l’interface entre différents tissus (Wiradjaja et al., 2010).
Le collagène VI est ubiquitaire dans les tissus conjonctifs. Il forme un réseau filamenteux en interaction avec les fibrilles de collagènes et il enrichit les régions péricellulaires. Le collagène VI interagit avec de nombreuses molécules extracellulaires comme les collagènes I, II, IV, XIV, MAGP-1, perlécane, décorine et biglycane, l'acide hyaluronique, héparine et fibronectine tout comme les intégrines et les protéoglycanes de surface. Le collagène VI peut influencer la prolifération cellulaire, l’apoptose, la migration et la différenciation (Cescon et al., 2015; Guilak et al., 2006).
a2. LA fibronectine
La fibronectine (FN) est une glycoprotéine de 460kDa qui comprend deux chaines de 220 et 240kDa connectées par des ponts disulfures. Elle fonctionne comme une protéine d’adhésion et joue un rôle central dans de nombreux processus biologiques comme l’adhésion cellulaire et la migration. Elle contribue à la cicatrisation, l’embryogenèse et les métastases cancéreuses (Pankov and Yamada, 2002).
La fibronectine est localisée dans la MEC mais elle est aussi présente dans le plasma sanguin (nommée soluble plasma FN – pFN) (Mosesson and Amrani, 1980; Mosesson and Umfleet, 1970; Mosher and Williams, 1978).
Au contraire, la fibronectine cellulaire (cFN) est synthétisée sous la forme d’un dimère soluble par les fibroblastes mais également par d’autres types cellulaires comme les chondrocytes. Après sa sécrétion dans l’environnement extracellulaire, la fibronectine est assemblée en une matrice fibrillaire insoluble (Leiss et al., 2008).
La fibronectine peut être le ligand d’une douzaine de membres de la famille des récepteurs intégrines (Plow et al., 2000). Parmi ces intégrines, α5β1 est considéré comme la plus importante pour la formation et l’élaboration des fibrilles de fibronectine.
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La FN possède des sites de fixations pour de nombreux composants cellulaires comme les intégrines, le collagène et l’héparine (Figure 5) tout comme aux bactéries, virus, aux composants sanguins (comme le fibrinogène et le facteur XIII) et à d’autres protéines comme IGFBP3 (Insulin-like growth factor-binding protein 3 (Beattie et al., 2009)). Et de façon intéressante, la FN et IGFBP3 co-localisent dans la PCM du cartilage articulaire humain arthrosique et non arthrosique (Martin et al., 2002).
Figure 5 : Structure moléculaire de la Fibronectine (Leiss et al., 2008). Représentations des différents domaines structurels et des sites de liaison pour la FN, les intégrines, le collagène, la fibrine, l’héparine et les bactéries.
a3. Les intégrines
La terminologie « intégrines » a été utilisée en 1987 pour décrire une famille de récepteurs hétérodimériques, intégrés à la MEC grâce au cytosquelette intracellulaire, pour médier la migration et l’adhésion cellulaire. Les trois sous-unités β identifiées sont maintenant au nombre de huit et les sous-unités alpha sont 18. Ces sous-unités interagissent de manière non covalente pour former 24 membres différents. La diversité des intégrines est augmentée par l’épissage alternatif, les modifications post- traductionnelles et les interactions avec d’autres molécules intracellulaires ou de surface cellulaire. Il existe de nombreux ligands extracellulaires des intégrines dont de nombreuses protéines matricielles (BMP, collagènes, fibronectine, fibrinogène, laminines, vitronectine, etc.) mettant en évidence le rôle primaire des intégrines, l’adhésion cellulaire à la MEC (Plow et al., 2000).
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En réponse a des signaux extracellulaires, les intégrines peuvent réguler de nombreuses fonctions cellulaires comme la prolifération, la différenciation, la survie, la migration tout comme la morphogenèse tissulaire et le remodelage.
Les chondrocytes issus de cartilage normal adulte expriment principalement les intégrines α1β1, α3β1, α5β1, α10β1, αVβ1, αVβ3 et αVβ5. Dans le cartilage arthrosique, une augmentation des intégrines α1β1 et α3β1 est observée en même temps que celles de α2β1, α4β1 et α6β1 non détectés dans le cartilage normal. Les intégrines permettent de lier les cellules à la MEC mais aussi de médier les effets de mécanotransduction. De plus, des études montrent que les intégrines, et en particulier α5β1, sont capables de réguler la production de MMPs (voir Chapitre I, paragraphe D) en conditions pathologiques (Loeser, 2014).
a4. Les protéoglycanes
Les protéoglycanes sont un groupe de protéines glycosylées, Ces molécules sont présentes au niveau extracellulaire (agrécane, versicane, décorine), péricellulaire (syndécane, glypicane) ou intracellulaire (serglycine). Le cartilage renferme plusieurs familles de protéoglycanes avec une localisation différente mais deux types de protéoglycanes sont différenciés dans le cartilage articulaire selon leur capacité d’agrégation à l’acide hyaluronique :
- les macroprotéoglycanes, de masse molaire élevée, majoritairement représentés par l’agrécane
- les protéoglycanes de petite masse molaire : la décorine, la fibromoduline et le biglycane.
Les agrécanes, chargés négativement piègent les molécules d’eau et forment des agrégats hydrophiles. Le cartilage peut donc être très hydraté, ce qui augmente sa résistance aux forces de compression. Les molécules d’agrécane n’existent pas individuellement dans la matrice extracellulaire, mais dans des agrégats de protéoglycanes. Chaque agrégat est composé d’un filament central d’acide hyaluronique avec jusqu'à 100 molécules d’agrécane rayonnant autour.
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Les PGs jouent un rôle majeur dans l’organisation de la matrice extracellulaire en interagissant avec d’autres molécules comme les collagènes, les glycoprotéines ou l’acide hyaluronique. Ce réseau dense confère au tissu cartilagineux une turgescence élastique et une résistance mécanique à la pression et à l’amortissement des chocs.
b. Remodelage matriciel par les protéases
Le clivage des composants de la MEC est un mécanisme de remodelage matriciel important pour la régulation de l’abondance, de la composition et de la structure de la MEC ainsi que pour le relargage de molécules biologiquement actives comme les facteurs de croissance. Ce remodelage matriciel est par exemple essentiel à la différenciation endochondrale (voir Chapitre I, paragraphe B) mais lorsque sa régulation est perturbée, l’intégrité des tissus est compromise permettant l’initiation de processus pathologiques comme l’arthrose (voir Chapitre I, paragraphe D). La MEC peut être clivée par différentes familles de protéases :
b1. Les metalloprotéinases matricielles
Ce sont les principales enzymes impliquées dans la dégradation de la MEC. Leur activité est basse en conditions normales mais augmente pendant des mécanismes de réparation ou de remodelage et dans des tissus pathologiques ou inflammés. Les MMPs sont produites sous forme soluble ou comme des protéinases ancrées à la membrane cellulaire. Elles clivent les composants matriciels avec une large spécificité de substrats.
Aujourd’hui 23 MMPs humaines ont été identifiées. La plupart sont secrétées comme zymogènes, des précurseurs protéiques inactifs, puis sont activées dans l’espace extracellulaire. Cette activation a lieu par un clivage protéolytique ou par des oxydations du groupe thiol. Les MMPs sont capables de dégrader l’ensemble des protéines matricielles (Figure 6) (Bonnans et al., 2014).
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Figure 6 : Structure de certaines MMPs et leurs substrats matriciels (d’après Bonnans et al., 2014). Les metalloprotéinases sont composées des métalloprotéinases matricielles (MMPs), des adamlysines (qui incluent ADAMs – une disintégrine et une métalloprotéinase, et ADAMTS – des ADAMs avec un motif thrombospondine, et les astacines ). Ce sont des enzymes muti-domaines qui contiennent le motif hautement conservé HEXXHXXGXXH (ou X est un acide aminé) dans lequel trois résidus Histidine chélatent un ion de zinc dans le domaine catalytique. Les métalloprotéinases sont produites comme des enzymes sous forme soluble, ou liés à la membrane qui clivent les composants de la matrice extracellulaire. Les MMPs sont composés de domaines fonctionnels partagés : un domaine peptide signal, un domaine propeptide, un domaine catalytique et un domaine hemopexine-like (à part MMP7, MMP23 et MMP26).
b1. Les Adamlysines (ADAMs)
Cette famille de protéines inclut les ADAMS (a disintegrin and metalloproteinase) et ADAMTS (ADAM with a Thrombospondin motifs). Aujourd’hui 22 gènes ADAM ont été identifiés chez l’Homme mais seulement 12 codent pour des protéinases actives.
Les ADAMS peuvent cliver des ectodomaines de protéines transmembranaires adjacents à la membrane cellulaire, puis relarguer l’ectodomaine complet de cytokines, facteurs de croissance, récepteurs ou molécules d’adhésion.
Au contraire des ADAMS, les agrécanases (ADAMTS1, 4, 5, 8, 9, 15 et 20) sont protéoglycanolytiques. ADAMTS2, 3 et 14 clivent les collagènes I, II et III et sont importantes pour le dépôt des fibrilles de collagène normal sur la MEC d’une manière tissu-spécifique.
B. Chondrogenèse, marqueurs et facteurs de transcription
A part pour la formation des os de la voute crânienne, de la mâchoire et de la clavicule (qui a lieu par le processus d’ossification intramembranaire), le squelette des Vertébrés est formé par le processus d’ossification endochondrale. Pendant ce processus, chaque élément du squelette est d’abord mis en place à partir de progéniteurs mésenchymateux
