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Evaluation de l’efficacité thérapeutique d’un nouvel
inhibiteur des LIM Kinases “ Pyr1 ” dans le cancer du
sein
Chloe Prunier
To cite this version:
THÈSE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE GRENOBLE
Spécialité : Biodiversité du développement oncogenèse
Arrêté ministériel : 7 août 2006
Présentée par
Chloé
PRUNIER
Thèse dirigée par Laurence LAFANECHERE
préparée au sein de l’équipe 3 de l’Institut Albert Bonniot dans l'École Doctorale Chimie et Sciences du Vivant
Evaluation de l’activité
thérapeutique d’un nouvel
inhibiteur des LIM Kinases « Pyr1 »
dans le cancer du sein
Thèse soutenue publiquement le 26 novembre 2015 , devant le jury composé de:
Mme Diane BRAGUER
Professeur à la faculté de pharmacie de Marseille, Rapporteur Mme Clara NAHMIAS
Directrice de recherche au CNRS, Institut Gustave Roussy, Villejuif, Rapporteur
Mr. Jean-Luc COLL
Directeur de recherche à l’Institut Albert Bonniot CRI UJF/INSERM U823, Membre, Président
Mme Pascale COHEN
Professeur à la faculté de pharmacie de Lyon, Membre Mme Mireille MOUSSEAU
Oncologue médicale au CHU de Grenoble, Membre Mme Laurence LAFANECHERE
C. Prunier, 2015
Les expériences conduites au cours de ma thèse ont été réalisées à l’Institut Albert Bonniot à Grenoble en France et à l’Institut Hubrecht à Utrecht aux Pays-Bas.
Les travaux de recherches décrits dans ce manuscrit ont été financés par l’Université Joseph Fourier, l’INSERM, le CNRS et la Fondation de France.
« En essayant continuellement on finit par réussir. Donc: plus ça rate, plus on a de chances que ça marche »
Les devises Shadock.
RÉSUMÉ
Le cancer du sein était au premier rang des cancers chez la femme en termes d’incidence et de mortalité en 2008 (GLOBOCAN 2012, IARC). A l’origine de cette mortalité on observe notamment le développement de résistances aux chimiothérapies conventionnelles mais aussi le développement des métastases qui sont responsables de 90% des décès des patientes. Il est donc indispensable d’étendre l'arsenal thérapeutique à la disposition des cliniciens avec de nouvelles molécules actives sur les formes de cancers résistants aux chimiothérapies et ciblant le processus métastatique.
Au sein de notre équipe nous avons identifié un nouvel inhibiteur de la LIM Kinase (LIMK) baptisé « Pyr1 ». La LIMK est responsable de la régulation de la dynamique des microtubules et des microfilaments d'actine. Dans un premier article (Prudent et al., Cancer Research, 2012) nous avons montré que Pyr1 avait une activité anti-mitotique et anti-migratoire dans un modèle cellulaire de cancer de l’utérus. De plus une analyse pilote a montré que Pyr1 était efficace dans un modèle murin de leucémie où il augmente la survie des souris. Étant donné que la LIMK est surexprimée dans les cancers du sein et qu'une des conséquences cellulaires d'un traitement par Pyr1 est une stabilisation des microtubules, comme le fait le paclitaxel couramment utilisé pour le traitement des formes invasives de ces cancers , l’objectif de ma thèse a été d’étudier l’efficacité thérapeutique de Pyr1 sur des modèles cellulaires et murins de cancer du sein, et notamment sur les cancers résistants au paclitaxel.
Nous avons montré que Pyr1 ralentissait la croissance des tumeurs primaires et réduisait leur taille. Pyr1 est bien toléré et l’effet anti-tumoral est également observé sur des modèles résistants au paclitaxel. Nous avons ensuite étudié l’effet de Pyr1 sur la migration et l’invasion des cellules tumorales en utilisant notamment la microscopie intra-vitale. Nous avons observé que, bien qu’il ne diminue pas la vitesse de migration des cellules tumorales, Pyr1 entraine in vivo un changement morphologique important. Enfin, Pyr1 n’empêche pas la dispersion métastatique mais il prévient de manière efficace la croissance des métastases. Nous en avons conclu que Pyr1 est une molécule intéressante pour le traitement des cancers du sein résistants aux chimiothérapies conventionnelles et également sur le traitement des métastases.
SUMMARY
Breast cancer is the most common diagnosed cancer in women worldwide with an increase of 20% and 14% in terms of incidence and mortality, respectively, in 2008 (GLOBOCAN, 2012). This increase is mainly due to the lack of therapeutics that target the development of metastasis responsible for 90% of cancer death. Moreover, the development of resistance to available chemotherapies limits their effectiveness. It’s an urgent need to find new drugs that target the metastatic process and are efficient on resistant cancers.
Our team has identified a new LIM Kinase (LIMK) inhibitor called “Pyr1”. LIM Kinases are implicated in the dynamic regulation of the actin and microtubule cytoskeleton. We previously published data showing that Pyr1 has an anti-mitotic and anti-migratory activity on a cervical cancer cell line. Moreover, a pilot in vivo study has shown that Pyr1 was efficient in a leukemia mouse model where it increases the lifespan of treated compared to control mice (Prudent et al., 2012).
LIM Kinases have been shown to be overexpressed in breast cancer. Moreover the chemotherapeutical agents currently used for this kind of cancer belong to the class of taxanes (such as paclitaxel). Taxanes are cytotoxic compound that directly binds to microtubules and stabilizes them. Since Pyr1 treatment also results in microtubules stabilization, with a complete different mechanism of action, we have decided to investigate the anti-cancer effect of Pyr1 on breast cancer cell lines and xenografts, including paclitaxel resistant models.
We showed that Pyr1 decreases primary tumor growth and reduces their size. Pyr1 is well tolerated and the anti-tumor effect is also observed on paclitaxel resistant models. We then studied Pyr1 effects on migration and invasion in vitro and in vivo. Intravital imaging of tumors showed that, whereas Pyr1 didn’t slow down tumor cell migration, it induced a cell morphological change. Finally, Pyr1 does not affect metastasis spreading but prevents their growth.
These results indicate that LIMK inhibitors, such as Pyr1, may represent a pharmacological alternative for taxanes resistant tumors. Moreover, they could be potent agents to reduce the size of metastasis.
REMERCIEMENTS
Le travail présenté dans cette thèse a été réalisé au sein de l’équipe 3 « Polarité, Développement et Cancer » dirigé par le Dr. Marc Billaud. Je le remercie de m’avoir accordé sa confiance en m’accueillant au sein de son équipe.
Je tiens également à remercier les membres de mon jury de thèse:
Le Professeur Jean-Luc Coll pour avoir accepté d’être président du jury et pour m’avoir conseillé tout au long de mes travaux dans le cadre de mon Comité de suivi de thèse.
Le Docteur Clara Nahmias et le Professeur Diane Braguer pour avoir accepté d’évaluer et de critiquer mon travail de thèse.
Le Professeur Mireille Mousseau pour avoir accepté de faire partie de mon jury de thèse. Le Professeur Pascale Cohen pour avoir accepté de faire partie de mon jury et pour m’avoir conseillé tout au long de mes travaux dans le cadre de mon Comité de suivi de thèse.
Enfin et surtout le Dr. Laurence Lafanechère qui a été ma directrice de thèse. Laurence, je vous remercie pour ces quatre années de recherche passées à vos côtés. J’ai beaucoup appris du métier de chercheur en vous observant. Vous m’avez toujours soutenue et encouragée dans mes projets et vous m’avez donné l’opportunité de partir compléter mes travaux dans un laboratoire partenaire aux Pays-Bas. J’ai beaucoup d’estime pour vous et votre travail et j’admire la manière dont vous menez votre carrière scientifique. Je suis sûre que vous ferez une excellente directrice d’équipe !
Un grand merci aux membres de mon équipe:
Anne, ça a été un vrai plaisir de travailler avec toi. En plus d’être une collègue tu es devenue mon amie. Je suis tellement contente de t’avoir rencontrée! Merci pour tous ces bons moments passés ensemble (je pense particulièrement à la vidéo de thèse de Mailys…) et tous ceux à venir !
Maya et Mailys, merci de m’avoir accueillie à mon arrivée dans le labo. Vous m’avez énormément aidé au début de ma thèse ainsi que tout au long de ces quatre années. Merci pour ces bons moments passés ensemble (fou rire, séance maquillage, blind test musical…). Sakina, merci pour ta gentillesse, ton calme et tous les bons conseils que tu as pu m’apporter pour mener à bien ma thèse. Tes pâtisseries marocaines vont me manquer!
Chantal, merci pour tes conseils au moment de la rédaction de mon manuscrit et de ma recherche de post-doc. Je ne sais pas comment tu fais pour réussir aussi bien ta carrière et gérer toute ta petite famille en même temps ! J’espère réussir à en faire autant dans le futur… Anca, merci pour ta gentillesse. Tu es une très bonne scientifique et je te souhaite le meilleur pour ta thèse.
Renaud, merci pour toutes tes idées et conseils scientifiques. Pour moi, tu es un peu l’homme qui a réponse à tout! Ce fut très intéressant de travailler avec toi et j’espère que nous aurons l’occasion de retravailler ensemble un jour.
Karin, merci pour tes conseils et tes critiques très constructives! C’est en partie grâce à toi que mon niveau de français s’est grandement amélioré! Peu de gens ont pris le temps de m’expliquer mes erreurs et comment m’améliorer. Je te remercie également pour ça.
Nico, merci pour tous tes conseils avisés d’un post-doc à un thésard.
Sandrine, merci pour ta gentillesse et ta générosité (particulièrement les petits gouters du vendredi soir).
Christopher, Anaëlle, vous n’êtes resté que 6 mois dans le labo mais vous vous êtes très bien intégrés à l’équipe. J’ai beaucoup apprécié votre présence et j’espère que nous resterons en contact pour échanger quelques anecdotes scientifiques.
Merci également à Jacques, Véronique et Jean avec qui j’ai partagé la vie du labo tout au long de ces années.
Merci également aux membres de l’équipe 1:
Corinne, merci pour tes critiques scientifiques et tes conseils au moment de ma recherche de post-doc.
Laure, Justyna, Sanela, Adèle, Alexander, Christos, merci à tous pour votre bonne humeur et nos conversations partagées au coin d’une paillasse (ou d’une bière !).
Un grand merci aux membres de la plateforme Optimale et de l’équipe 5:
Véronique, Amandine, Julien, Mélanie, Jonathan et Maxime qui m’ont énormément appris sur l’expérimentation et l’imagerie animale. Merci à ceux qui se sont levé tôt le weekend pour venir traiter les souris avec moi ou ceux qui ont terminé tard le soir pour finir à temps l’imagerie des souris...
Je remercie également le Dr. Van Rheenen et le reste de son équipe aux Pays Bas:
Jacco, thank you for welcoming me in your lab and introduce me to the field of intravital microscopy. This mobility was such a great experience for my professional and personal life, I hope we will work together again.
Maria, Anoek, Evelyne, Saskia, Arianna, Daniëlle, thank you for welcoming me in your lab and considered me as your fellow during 6 month. I really miss you guys…
Merci à mes copains du Comité des thèses:
Jessica, Matteo, Yohan, Aysegul, Delphine, Neda, pour nos discussions, apéros, soirées (déguisé ou non) et restos. C’est toujours agréable de se rendre compte qu’on n’est pas seul dans cette grande aventure qu’est la thèse.
Merci à mes copains de Grenoble et d’ailleurs:
Chacha et Clément, Benoit, Marion, Nelly, Seymour, Camille, Marionette, Sophie, Alicia, les colocs du Sappey, les colocs de Corenc, les colocs de Brossolette, MA coloc : Claire, Julia, Edith et tous les autres. Votre présence m’a permis de garder une vie sociale, qui je suis persuadée, a participé à la réalisation de ce projet dans les meilleurs conditions qui soient! Antoine, une petite ligne rien que pour toi. Merci d’être là… et de faire d’aussi bons brownies!
Enfin, merci à ma famille et surtout à mes parents :
Table des matières
SUMMARY... 5
REMERCIEMENTS ... 6
TABLE DES FIGURES ...14
TABLE DES TABLEAUX...17
LISTE DES ABREVIATIONS ...18
AVANT-PROPOS ...21
INTRODUCTION ...24
1. Le cancer du sein... 24
1.1. Généralités ... 24
1.2. Epidémiologie du cancer du sein ... 25
1.3. Anatomie du sein ... 27
1.4. Classification des cancers du sein. ... 30
1.4.1. Histologie des cancers du sein... 30
1.4.1.1. Les carcinomes in situ ... 30
1.4.1.2. Les carcinomes infiltrants ... 31
1.4.2. Classification moléculaire... 32
2. Le processus métastatique dans le cancer du sein ... 34
2.1. Généralités ... 34
2.1. Migration et invasion ... 36
2.1.1. Migration individuelle... 37
2.1.2. Migration collective ... 39
3. Thérapie des cancers du sein ... 42
3.1. La chimiothérapie ... 43
3.1.1. Les taxanes ... 44
3.1.2. Mécanisme d’action... 45
3.2. Le phénomène de résistance... 47
4. La famille des LIM Kinases, nouvelle cible thérapeutique dans le cancer ... 51
4.1. Généralités ... 51 4.2. Structure... 53 4.3. Substrats... 55 4.4. Régulation... 60 4.4.1. Régulateurs positifs ... 61 4.4.2. Régulateurs négatifs ... 62 4.5. Fonctions biologiques... 63
4.5.1. LIMKs et le cycle cellulaire... 63
4.5.2.1. LIMKs et polarité ... 68
4.5.2.2. LIMKs et protrusions... 69
4.5.2.3. LIMKs et adhésion ... 71
4.5.2.4. Les microtubules dans la migration cellulaire ... 74
4.6. LIM Kinases et cancer... 74
4.6.1. La voie des protéines Rho-GTPases dans le cancer... 74
4.6.2. LIMKs et cancer ... 76
4.6.2.1. Surexpression des LIMKS dans les cancers invasifs ... 76
4.6.2.2. LIMKs, régulation de la transcription et EMT ... 76
4.6.2.3. LIMKs, dégradation de la matrice et migration ... 78
4.6.2.4. LIMKs et établissement des métastases ... 79
5. Les inhibiteurs de LIM Kinases ... 80
OBJECTIFS...86
MATÉRIELS ET MÉTHODES...88
RÉSULTATS ... 100
1. Analyse de l’efficacité thérapeutique de Pyr1 dans les cancers du sein invasifs... 100
1.1. Choix des lignées cellulaires ... 100
1.2. Pyr1 affecte la dynamique du cytosquelette d’actine et microtubulaire des lignées cellulaires invasives surexprimant la LIMK1 ... 103
1.3. Les lignées cellulaires invasives sensibles à Pyr1 sont résistantes au paclitaxel. ... 104
1.4. Pyr1 a un effet antitumoral sur des modèles d’allogreffes de cancer mammaire murin (TS/A-pGL3) et de xénogreffes de cancer du sein humain (MDA-MB-231) ... 105
1.4.1. Pharmacocinétique de Pyr1 in vivo... 105
1.4.2. Posologie de Pyr1 in vivo... 106
1.4.3. Effet antitumoral de Pyr1 in vivo ... 106
2. Analyse de l’efficacité antimétastatique de Pyr1 dans les cancers du sein invasifs ... 111
2.1. Pyr1 inhibe la migration et l’invasion des lignées cellulaires de cancer du sein in vitro... 111
2.2. Pyr1 inhibe la formation de FLPs nécessaires à l’établissement des métastases ... 114
2.3. Pyr1 induit in vivo une transition de la migration des cellules tumorales d’un type mésenchymal vers un type amiboïde... 115
2.4. Pyr1 réduit la migration, dans la tumeur, des cellules MDA-MB-231 Dendra2 de forme allongée .. 119
2.5. Pyr1 réduit la charge métastatique... 121
2.6. Pyr1 réduit la charge métastatique sur un modèle murin de cancer avancé ... 124
DISCUSSION... 132
1. Le choix des modèles in vivo... 132
2. Pyr1 et la croissance tumorale... 134
3. Pyr1 et le processus métastatique ... 136
PERSPECTIVES ... 144
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 148
ANNEXE 1... 164
Table des Figures
Figure 1: Les marqueurs de la cellule cancéreuse ...25
Figure 2: Estimation de l’incidence (bleu) et la mortalité (rouge) des cancers chez la femme dans le monde ...26
Figure 3: Anatomie du sein ...27
Figure 4: Représentation schématique du réseau lymphatique du sein ...28
Figure 5: Schéma d’une coupe transversale de glande mammaire...29
Figure 6: Représentation schématique d’un carcinome canalaire in situ...30
Figure 7: Représentation schématique d’un cancer canalaire (gauche) et lobulaire (droite) infiltrant 31 Figure 8: Le processus métastatique dans le cancer du sein ...34
Figure 9: Le processus métastatique permet aux cellules tumorales d’envahir d’autres organes et de proliférer à distance de la tumeur primaire...35
Figure 10: La cellule tumorale adopte différents modes de migration en fonction de son microenvironnement ...37
Figure 11: Les cellules cancéreuses peuvent effectuer des transitions entre les différents modes de migration en fonction des caractéristiques du microenvironnement...41
Figure 12: Formule chimique du paclitaxel et du docetaxel ...44
Figure 13: Mécanisme d’action des taxanes ...45
Figure 14: Mécanismes d’action potentiels du paclitaxel sur les cellules tumorales...46
Figure 15: Mécanismes de résistances développés en réponse aux traitements par des inhibiteurs de kinases...48
Figure 16: Nombre d’articles publiés sur la LIMK1 et la LIMK2 depuis leurs découvertes en 1990...52
Figure 17: Structures et similarités des LIMK1 et LIMK2 ...53
Figure 18: Structure cristallographique du domaine kinase de la LIMK1 humaine en association avec la staurosporine...55
Figure 19: Les LIMKs régulent l’activité de la cofiline en l’inactivant par phosphorylation...56
Figure 20: Régulation spatiale de la voie cofiline ...58
Figure 21: Schéma récapitulatif des différents substrats des LIMKs connus à ce jour...60
Figure 23: Schéma récapitulatif des différents régulateurs négatifs de l’activité et de l’expression des
LIMKs...63
Figure 24: Localisation subcellulaire de LIMK1 durant les différentes étapes de la mitose ...64
Figure 25: Localisation subcellulaire de LIMK2 durant les différentes étapes de la mitose ...65
Figure 26: Régulation temporelle des différents acteurs de la voie cofiline durant la mitose ...66
Figure 27: Schéma des différentes étapes de la migration cellulaire...68
Figure 28: La famille des Rho-GTPase régule la dynamique de l’actine nécessaire à la formation de protrusions au cours de la migration cellulaire...70
Figure 29: les adhérences focales sont des assemblages complexes réalisant l'interface entre la matrice extracellulaire et les filaments d’actine ...72
Figure 30: Vue schématique de l’organisation de l’actine dans des invadosomes/podosomes et des protéines nécessaires à leur formation ...73
Figure 31: Voies de signalisation contrôlées par les protéines Rho-GTPases ...75
Figure 32: Rôle de ROCK et des LIMKs dans la réponse induite au TGF-β au moment de l’invasion ....77
Figure 33: Dendrogramme de la famille des kinases humaines...81
Figure 34: Structure chimique des différents inhibiteurs des LIMKs...83
Figure 35: Les lignées cellulaires de cancer mammaire invasif surexpriment la LIMK1 ...102
Figure 36 : Caractérisation in vitro de l’effet de Pyr1 sur des lignées de cancer du sein invasives...104
Figure 37: Evaluation in vitro de la sensibilité des lignées de cancer du sein invasives à Pyr1 et au PTX ...105
Figure 38: Schéma expérimental du modèle d’allogreffes TS/A-pGL3 et de xénogreffes MDA-MB-231 ...107
Figure 39: Effet antitumoral de Pyr1 sur le développement des allogreffes TS/A-pGL3...107
Figure 40: Pyr1 modifie de manière significative les marqueurs de stabilisation des microtubules dans les tumeurs TS/A-pGL3 ...109
Figure 41: Effet antitumoral de Pyr1 sur le développement des xénogreffes humaines MDA-MB-231 ...110
Figure 42: Effet de Pyr1 sur l’invasion in vitro...113
Figure 43: Effet de Pyr1 sur le nombre et la taille des FLPs ...115
Figure 44: Schéma expérimental du modèle de xénogreffes orthotopiques MDA-MB-231 Dendra2 ...116
Table des tableaux
Table 1: Caractéristiques moléculaires des différents sous-types de cancer du sein ...33 Table 2: tableau synthétique résumant les caractéristiques cellulaires et moléculaires des modes de migration mésenchymateux et amiboïde ...39 Table 3: Récapitulatif des voies qui régulent la plasticité migratoire des cellules cancéreuses ...40 Table 4: Localisations chromosomale et tissulaire des différentes isoformes de la β tubuline humaine
Liste des abréviations
ATP Adénosine Tri-Phosphate
CAMK4 Ca2+/Calmodulin-dependent protein Kinase
CIN Chronophin
CREB c-AMP Response Element-Binding protein
CTCs Circulant Tumoral Cells
CXCL12 stromal cell-derived factor-1
EGFR Epidermal Growth Factor Receptor
EMT Epithelial to Mesenchymal Transition
FLPs Filopodia-Like Protrusions
FRAP Fluorescence Recovery After Photobleaching
GDP Guanine Di-Phosphate
GTP Guanine Tri-Phosphate
HER2 Human Epidermal growth factor Receptor 2
HSP90 Heat Shock Protein 90
JNK c-Jun N-terminal Kinase
LATS Large Tumor Suppressor
LIMKs LIM Kinases
LIMK1 LIM Kinase 1
LIMK2 LIM Kinase 2
MAL Actin-binding SRF co-factor Multimerix α-Lactalbumin
MAP Microtubules Associated Proteins
MAT Mesenchymal to Amoeboid Transition
MET Mesenchymal to Epithelial Transition
MLCK Myosin Light Chain Kinase
MMP Matrix Metallo-Proteinases
MRCK Myotonic dystrophy kinase-Related Cdc42-binding Kinase
MRP Multidrug Resistance-associated Protein
NESK Nck-interacting kinase (Nik)-related kinase (Nrk)/Nik-like-embryo-specific Kinase
NLS Nuclear Localization Signal
Nurr1 Nuclear Receptor Related 1 protein
PAK p21-Activated Kinase
PIP2 Phosphatidylinositol-4,5-diphosphate
PKA Protein Kinase A
PKC Protein Kinase C
PLCγ Phospholipase Cγ
PTX Paclitaxel
Pyr1 Pyridocarbazolone 1
RE Récepteur aux oestrogènes
ROCK Rho-associated protein kinase
RP Récepteur à la Progestérone
SRF Serum Response Factor
SSH Slingshot
TAF Tumor Associated Fibroblasts
TESK Testis-Specific protein Kinase
TGFβ Transforming Growth Factor β
VEGF Vascular Endothelium Growth Factor
WASP Wiskott-Aldrich Syndrome Protein
AVANT-PROPOS
Les premiers textes décrivant le cancer du sein remontent à l’Égypte ancienne. Des papyrus datant de 2 000 à 3 000 ans avant notre ère décrivent des ulcérations et tumeurs dans le sein, traitées par cautérisation. C’est ensuite au cours de l’antiquité qu’Hippocrate donne le nom de « cancer » à cette pathologie. En effet, les Asclépiades, médecins grecs auxquels se rattachait Hippocrate, avaient remarqué que les prolongements des tumeurs, lorsqu'ils touchaient les tissus voisins, pouvaient faire apparaître des vaisseaux sanguins dont le dessin faisait penser aux pinces d'un crabe. D'où la comparaison avec le karkinos en grec, l'écrevisse ou le crabe, le
cancre ou cancer. A cette époque, le cancer du sein est couramment observé mais le manque
de connaissance empêche une bonne prise en charge des patientes. De plus l’absence des techniques d'anesthésie et d’antisepsie jusqu’au 19ème siècle a un impact considérable sur la survie des patientes à la suite d’une chirurgie. Le dépistage par auto-examen apparaît au cours du 19ème siècle puis la mise en place de la mammographie dans la période d’entre-deux guerres permet de disposer de moyens de dépistage plus fiables. Ces méthodes perdurent encore aujourd’hui. Les grandes campagnes de dépistage ont commencé aux États Unis dans les années 70. Il a fallu encore quelques années avant de leur application en France. Depuis 2004, le dépistage organisé est réalisé sur l’ensemble du territoire et contribue à la prise en charge précoce des tumeurs et à un meilleur taux de guérison.
En ce qui concerne les traitements du cancer du sein, la découverte de la cellule par Virchow au 19èmesiècle a permis de mieux comprendre les mécanismes biologiques dérégulés dans le cancer et mettre au point des thérapies adaptées. De plus, l’arrivée de l’anesthésie et des techniques d’asepsie améliore grandement les interventions chirurgicales. De plus, la découverte des rayons X en 1895 par Röntgen permet le développement des premières radiothérapies du cancer du sein. La chimiothérapie quant à elle apparaît dans les années 1940 lorsque l’on se rend compte que les gaz asphyxiants, utilisés pendant la première guerre mondiale, s’attaquent aussi directement aux cellules en prolifération. Les premières chimiothérapies du cancer du sein apparaitront en 1960. Depuis, de nouvelles stratégies se mettent en place avec notamment l’essor de l’immunothérapie et des thérapies ciblées.
de 90% des décès des patientes atteints d’un cancer - limite l’arsenal thérapeutique. Il est donc indispensable de trouver de nouveaux traitements actifs sur les cancers du sein résistants et ciblant les métastases.
INTRODUCTION
1. Le cancer du sein 1.1. Généralités
Le cancer est la cause majeure de décès dans le monde avec 8,2 millions de décès en 2012 principalement dus aux cancers du poumon, du foie, du colon, du sein et de l’œsophage (GLOBOCAN 2012, IARC).
En France, 355 000 nouveaux cas ont été diagnostiqués en 2012 dont 200 000 chez l’homme et 155 000 chez la femme. Les cancers de la prostate, du sein, du colon-rectum et du poumon sont les cancers les plus fréquents. Enfin, on estime à 148 000 le nombre de décès par an dû au cancer (85 000 hommes et 63 000 femmes; Les cancers en France, Edition 2014, INCA, 2015).
Le cancer se développe en plusieurs étapes. Classiquement, on distingue une étape d’initiation suivie d'une phase de croissance tumorale. Les cellules tumorales prolifèrent localement dans un premier temps puis elles peuvent se détacher de la tumeur primaire et gagner la lymphe et la circulation sanguine pour former des métastases à d’autres endroits du corps. Selon Hanahan D. et Weinberg RA. (2011)1, l’initiation tumorale peut être causée par la dérégulation de certains processus physiologiques (Figure 1), tels que l’instabilité génomique et l’acquisition de mutations, la maintenance d’un état prolifératif constant couplé à la résistance à la mort cellulaire, la dérégulation du métabolisme et la promotion de l’angiogenèse. Parmi les facteurs qui favorisent la progression tumorale, l’échappement au système immunitaire et la promotion de l’inflammation sont deux facteurs clés. Enfin l’acquisition de la mobilité et la capacité à dégrader la matrice sont les premières caractéristiques acquises par les cellules métastatiques.
Figure 1: Les marqueurs de la cellule cancéreuse
Tiré de Hanahan D. et Weinberg RA., Cell, 2011.
1.2. Epidémiologie du cancer du sein
Le cancer du sein est le cancer le plus diagnostiqué dans le monde chez la femme, en 2012 (Figure 2). La même année plus de 1,5 millions de nouveaux cas ont été rapportés et 520 000 patientes sont décédées de ce cancer2. Selon le dernier rapport de l’IARC en 2008, l’incidence et la mortalité ont augmenté de 20% et 14% respectivement (GLOBOCAN 2012, IARC). Le dépistage systématique du cancer du sein dans les pays développés est à l’origine du taux d’incidence élevé observé. Cependant l’absence de dépistage et la difficulté d’accès au soin dans les pays en voie de développement fait que le taux de mortalité y est beaucoup plus élevé (GLOBOCAN 2012, IARC).
Le dernier rapport de l’AACR (American Association for Cancer Research, 2015) prévoit une augmentation de 50% des cancers du sein entre 2011 et 2030 aux États Unis. Cette hausse concerne principalement les cancers hormonaux-dépendant sur des personnes entre 70 et 84 ans et se justifie par l’administration de plus en plus systématique de traitements hormonaux au moment de la ménopause mais aussi par le vieillissement de la population mondiale.
Figure 2: Estimation de l’incidence (bleu) et la mortalité (rouge) des cancers chez la femme dans le monde
1.3. Anatomie du sein
Le mot sein provient du latin sinus qui désigne « la courbure, la sinuosité, le pli ». Le sein est un terme spécifiquement attribué aux femmes. Il correspond plus généralement aux mamelles, terme à l’origine du mot mammifères, qui, lui-même, désigne tous les animaux dotés de mamelles. La fonction biologique des mamelles est de produire le lait maternel nécessaire à l’alimentation du nouveau-né.
Le sein est constitué principalement de la glande mammaire et d’un tissu de soutien qui contient des vaisseaux, des fibres et de la graisse (Figure 3). La glande mammaire est constituée de compartiments eux même organisés en lobules mammaires et canaux lactifères. Les lobules produisent le lait maternel au moment de l’allaitement et les canaux le transportent jusqu’à la papille mammaire.
Figure 3: Anatomie du sein
Tiré de NATOMIMAGES.
préparer le corps à la gestation. La progestérone quant à elle joue un rôle important dans le cycle menstruel où elle permet la préparation de l’utérus à une possible grossesse.
Pour son bon fonctionnement, la glande mammaire est irriguée par de nombreux vaisseaux sanguins et lymphatiques. Les principales artères qui irriguent le sein sont les artères axillaire, thoracique et intercostale. Les ganglions lymphatiques sont situés au niveau du thorax (ganglions mammaires internes), de l’aisselle (ganglions axillaires) et autour de la clavicule (ganglions claviculaires) (Figure 4).
Figure 4: Représentation schématique du réseau lymphatique du sein
Tiré de l’INCa.
Figure 5: Schéma d’une coupe transversale de glande mammaire
MB = membrane basale. Tiré de: ipubli.inserm.fr.
1.4. Classification des cancers du sein. 1.4.1. Histologie des cancers du sein
Afin d’appliquer le traitement le mieux adapté à chaque patiente, en fonction du type et de la gravité de sa maladie, il est nécessaire d’aborder le cancer du sein dans sa complexité. D’un point de vue histologique, les tumeurs du sein peuvent être classifiées dans deux groupes: les carcinomes in situ et les carcinomes infiltrants.
1.4.1.1. Les carcinomes in situ
Les carcinomes in situ se définissent comme une prolifération de cellules malignes se développant dans la lumière des canaux et des lobules sans franchir la membrane basale et sans envahir le tissu conjonctif. Ils ne comportent théoriquement pas de risque d’envahissement ganglionnaire.
Les carcinomes canalaires in situ sont les plus fréquents (15 à 20% des cancers du sein). Ils se forment au niveau des canaux galactophores et ne sont pas invasifs (Figure 6). Ils sont principalement traités par chirurgie.
Figure 6: Représentation schématique d’un carcinome canalaire in situ
Les carcinomes lobulaires in situ sont plus rares (0,5% des cancers mammaires) et sont plutôt considérés comme des tumeurs à risque de développer un cancer infiltrant.
1.4.1.2. Les carcinomes infiltrants
Les carcinomes infiltrants sont caractérisés par leur capacité à envahir le tissu conjonctif et à faire des métastases (Figure 7). Le carcinome canalaire infiltrant représente plus de 70% des carcinomes infiltrants. Il se forme le long des canaux galactophores et se caractérise par une prolifération incontrôlée et par l’invasion des tissus environnants.
Le carcinome lobulaire infiltrant est plus rare (5 à 15% des cancers infiltrants) et se développe initialement au niveau des lobules.
Figure 7: Représentation schématique d’un cancer canalaire (gauche) et lobulaire (droite) infiltrant
Tiré de NATOMIMAGES.
1.4.2. Classification moléculaire
Depuis la fin des années 1990, l’essor et la miniaturisation des techniques de séquençage à haut débit ont permis d’ajouter une caractérisation moléculaire aux données histologiques et cliniques classiques qui permet la classification des différents types de cancers du sein.
Les premières études génomiques des cancers du sein ont permis de mettre en évidence à l’échelle moléculaire, l’hétérogénéité de ce cancer, fortement suspectée jusqu’ici. Ainsi il a été établi 5 sous-types majeurs de cancer du sein, sur la base de l'expression transcriptionelle de plusieurs centaines de gènes: luminal A, luminal B, basal, positif pour HER2 et normal3. Les caractéristiques moléculaires de ces sous-types sont exposées dans la table 1.
Les sous-types luminal A et basal sont les plus fréquents. Le sous type luminal A correspond à des cancers de bas grade et donc de pronostic favorable. Ces cancers expriment des récepteurs hormonaux de type récepteurs aux oestrogènes ER, et sont principalement traités par hormonothérapie.
Le sous-type basal a un pronostic plus défavorable pour la survie globale. Les cellules cancéreuses appartenant à ce sous-type n’expriment pas de récepteurs hormonaux et il n’existe pas de chimiothérapies adaptées les ciblant. Parmi les sous-types basals on distingue les tumeurs triples négatives, ER-/PR-/HER2-. Ces tumeurs n’expriment ni les récepteurs aux œstrogènes (ER), ni le récepteur à la progestérone (PR) ni le récepteur au facteur de croissance épidermique humain (HER2). Cette catégorie de cancer représente moins de 15% des cancers du sein, mais a un pronostic particulièrement mauvais et répond très mal aux traitements disponibles. C’est pourquoi de nombreux essais thérapeutiques sont mis en place pour ces cancers.
Le sous-type HER2 représente 15 à 20% des cancers du sein et est caractérisé par une forte expression du gène HER2. L’essor des biotechnologies a permis de mettre au point des thérapies ciblées pour ce sous-type de cancer reposant notamment sur l’administration d’anticorps ciblant la voie HER2 (plus de détails sont exposés dans la partie 3. « Thérapie des cancers du sein »).
Enfin, le sous-type normal, comme son nom l’indique, ressemble à des cellules de tissu mammaire sain. Cependant, ce sous-type tend à disparaitre puisqu’il s’agirait en fait de cellules malignes ayant migré dans du tissu sain.
Table 1: Caractéristiques moléculaires des différents sous-types de cancer du sein
ER = récepteur à l’œstrogène, PR = récepteur à la progestérone, HER2 = récepteur au facteur de croissance épidermique humain 2. « + » signifie que le récepteur est exprimé, « - » qu’il ne l’est pas.
Sous-type moléculaire Signature moléculaire Pronostic
ER PR HER2
Luminal A + + - Bon
Luminal B + + +/- Intermédiaire
HER2 - - + Mauvais
Basal - - - Mauvais
2. Le processus métastatique dans le cancer du sein 2.1. Généralités
La capacité des cellules cancéreuses à se détacher de la tumeur primaire et coloniser d’autres organes pour établir des métastases est un processus complexe (Figure 8), composé de plusieurs étapes et qui repose à la fois sur les propriétés des cellules cancéreuses mais aussi sur celles du microenvironnement tumoral4.
Figure 8: Le processus métastatique dans le cancer du sein
Schéma d’une coupe transversale de canal lactifère. L’évolution du carcinome in situ vers un carcinome invasif peut être récapitulé en 3 phases: 1) l’envahissement de l’organe, 2) la rupture de la membrane basale et 3) le passage des cellules dans la circulation sanguine (bleu) et lymphatique (vert). Tiré de NATOMIMAGE.
Une fois dans la circulation sanguine, les cellules tumorales circulantes (CTCs) font face à un stress mécanique et environnemental important5,6. De nombreuses cellules ne survivent pas à cette étape. Malgré tout, celles qui y parviennent doivent adhérer à la paroi du vaisseau sanguin et s’extravaser au travers de la paroi pour envahir un nouveau tissu. Contrairement à ce que l’on pourrait penser, tous les cancers ne métastasent pas au même endroit. Ce tropisme semble s’expliquer par l’existence de niches pré-métastatiques qui correspondraient au microenvironnement idéal, propice à la croissance de chaque type cellulaire tumoral8. Ce concept de niche pré-métastatique est de plus en plus étudié9,10, mais ne fait pas l'objet de cette thèse.
Une fois que les cellules ont atteint leur niche, elles prolifèrent et forment des métastases, ou bien entrent en dormance. La dormance est un concept récent en cancérologie11,12 dont la régulation reste obscure. Lorsqu’une cellule entre en dormance elle persiste dans le tissu mais ne prolifère pas et ce pour une durée indéterminée. De nombreuses questions se posent quant aux mécanismes qui régulent la dormance. Résulte-t-elle d'un effet inhibiteur des cellules du microenvironnement ou du système immunitaire ? Quels sont les signaux cellulaires qui déclenchent la fin de la dormance ? Quoiqu’il en soit ce phénomène est de plus en plus étudié car il pourrait être à l’origine des rechutes observées après des phases de rémissions12.
Figure 9: Le processus métastatique permet aux cellules tumorales d’envahir d’autres organes et de proliférer à distance de la tumeur primaire
2.1. Migration et invasion
L’invasion fait partie des premières étapes du processus métastatique. Au cours de cette étape, la cellule se détache de la tumeur primaire pour envahir les tissus voisins et migrer à travers la matrice pour rejoindre la circulation sanguine13.
La migration cellulaire est un processus primordial au cours du développement de l’embryon durant lequel certaines cellules acquièrent une polarité et se déplacent de manière orientée en réponse à un stimulus intérieur (activation des voies de régulation de la migration) ou extérieur (sécrétion de facteurs de croissances des cellules du microenvironnement). C’est un processus qui est également activé à l’âge adulte lors de la cicatrisation, au moment du renouvellement des tissus ou au cours de la réponse immunitaire.
Figure 10: La cellule tumorale adopte différents modes de migration en fonction de son microenvironnement
Si les cellules adoptent une migration collective, comme c’est le cas dans de nombreux cancers épithéliaux, deux stratégies sont observées: les feuillets ou les amas. En revanche, si la cellule adopte une migration individuelle, comme c’est le cas dans les leucémies, elle adopte une migration amiboïde ou mésenchymal. Ces différents types de migration dépendent de l’expression intracellulaire d’intégrines qui sont des senseurs de la matrice extracellulaire, mais aussi de l’expression des systèmes de dégradation de la matrice tels que les protéases ou de la présence de protéines de jonction telles que les cadhérines. Tiré de Friedl P. et Wolf K., Nat. Rev., 2003.
2.1.1. Migration individuelle
Une des premières étape de la migration individuelle est le changement de morphologie. La cellule adopte une forme allongée de type fibroblastique et établit une polarisation antéro-postérieure. Elle met également en place de nouveaux contacts avec la matrice extracellulaire
via la formation de lamellipodes et pseudopodes qui sont des extensions de la membrane
riches en actine. La contractilité développée par la cellule et sa capacité à dégrader la matrice vont lui permettre d’être mobile et de migrer à travers le tissu14.
l’activation des protéases qui dégradent la matrice extracellulaire13,15. On l’observe dans différents types de cancers tels que les fibrosarcomes et les gliobastomes. L’inhibition des intégrines, de la voie MLCK (pour " Myosin Light Chain Kinase ") et des Rho-GTPases perturbent ce mode de migration.
La deuxième, la migration amiboïde, est caractérisée par une vitesse de déplacement élevée (10 à 30 fois plus rapide que la migration mésenchymateuse) due à la génération de pseudopodes et de projections de la membrane que l’on nomme "blebs" (Figure 11). La cellule n’adhère pas au substrat dans ce type de migration, complètement indépendant de l’expression des intégrines et de l’activité protéolytique13,15. Dans des conditions physiologiques, les lymphocytes, les leucocytes et les cellules dendritiques adoptent ce mode de migration. On l’observe également dans les lymphomes et les cancers du poumon. Ce mode de migration est également régulé par les Rho-GTPases et plus particulièrement les kinases ROCK et MRCK17,18.
Table 2: tableau synthétique résumant les caractéristiques cellulaires et moléculaires des modes de migration mésenchymateux et amiboïde
Type du mode de migration Mésenchymateux Amiboïde
Morphologie des cellules
Allongées, fibroblastiques
(50-200 µm de longueur)
Rondes
(10-30 µm de longueur)
Vitesse de migration Faible: 0.1-1 µm/min Elevée: 0.1-20 µm/min
Interaction cellules-matrice
Intégrines + protéases
actives
Intégrines + protéases
non actives
Structure de l’actine Actine corticale + fibres de
stress Actine corticale
Voies de régulation identifiées Rac1/WAVE2,
Cdc42/MRCK18,21,22
RhoA/ROCK, Cdc42/MRCK18,23
Types cellulaires Fibroblastes Lymphocytes, neutrophiles
Cancers associés Cancers épithéliaux,
fibrosarcomes et glioblastomes
Lymphomes, cancer du poumon à petites cellules, cancer de la
prostate à petites cellules
2.1.2. Migration collective
On distingue la migration en feuillet de la migration en amas cellulaires (Figure 11). La migration des feuillets reste solidaire de la tumeur primaire14 formant une extension locale. On l'observe dans les cancers épithéliaux tels que les cancers du sein et les cancers du colon31,32. La migration en amas cellulaires quant à elle consiste en un détachement d’amas de cellules de la tumeur primaire. Ces groupes de cellules sont capables de migrer le long des tissus interstitiels et de rejoindre la circulation lymphatique et sanguine. Ce type de migration est associé à un caractère métastatique élevé et présage un mauvais pronostic14.
Dans certain cas, des fibroblastes s’associent aux groupes de cellules qui migrent collectivement, on parle de fibroblastes associés à la tumeur ou TAFs (pour " Tumor Associated Fibroblasts ")33. Leur fonction est de faciliter la migration des cellules cancéreuses en dégradant la matrice extracellulaire pour ouvrir le chemin. Les cellules cancéreuses n’ont plus qu’à suivre le chemin en utilisant la contractilité régulée par les kinases ROCK et MRCK, sans même avoir à secréter des protéases.
Tout comme pour la migration individuelle, les cellules qui migrent de manière collective peuvent initier une transition vers une migration mésenchymateuse, on parle de transition épithélio-mésenchymateuse (EMT pour " Epithelial to Mesenchymal Transition "). Elles peuvent également engager une transition vers une migration amiboïde, on parle alors de transition d’un état collectif vers amiboïde.
Table 3: Récapitulatif des voies qui régulent la plasticité migratoire des cellules cancéreuses
Tiré de Kale VP. et al., Cancer Letters, 2015.
Mode de migration primaire
Mode de migration après
transition Stimulus
Amiboïde Mésenchymal Inhibition de ROCK
Mésenchymal Amiboïde
Inhibition de Rac1 et MMP
Activation de ROCK
Collectif Mésenchymal EMT, perte des cadhérines
Collectif Amiboïde Inhibition de l’intégrine-β1,
Figure 11: Les cellules cancéreuses peuvent effectuer des transitions entre les différents modes de migration en fonction des caractéristiques du microenvironnement
3. Thérapie des cancers du sein
Différents types de traitements ont été développés pour répondre de manière adaptée aux différents types de cancers. Parmi eux on compte la chirurgie, la radiothérapie, les thérapies ciblées et la chimiothérapie.
La chirurgie est une technique efficace pour retirer la tumeur primaire. Elle est particulièrement avantageuse lorsque la tumeur est petite et non invasive. Elle peut être précédée d’une chimiothérapie néo-adjuvante permettant de réduire la taille de la tumeur pour faciliter son extraction. Des rechutes sont souvent observées après la chirurgie lorsque les tumeurs sont à un stade de développement avancé. Une chimiothérapie préventive, dite « adjuvante », est alors administrée après la chirurgie de résection de la tumeur (source: INCa).
Parmi les autres thérapies développées on distingue la radiothérapie qui a l’avantage d’être non-invasive. Elle utilise des rayonnements ionisants dirigés contre les cellules tumorales. Elle est souvent administrée en complément de la chirurgie. La radiothérapie présente cependant des inconvénients, car elle peut endommager les tissus sains avoisinant la tumeur et entrainer d’autres types de cancers, tels que des cancers de la peau (source: INCa).
Les thérapies ciblées sont quant à elles dirigées contre des cibles moléculaires. Parmi les plus connues: le trastuzumab (Herceptin®) qui est un anticorps monoclonal ciblant la protéine HER2 surexprimée à la surface des cellules cancéreuses. Il a une action thérapeutique antiproliférative et stimule le système immunitaire aidant à détruire les cellules cancéreuses. Un autre anticorps monoclonal, le bevacizumab (Avastin®), se fixe au VEGF et l’empêche de se fixer à son récepteur, l’EGFR. Cette action inhibe l’angiogenèse et diminue de manière indirecte la croissance tumorale. Il existe également des molécules telles que le lapatinib (Tyverb®) se fixant aux récepteurs à tyrosine kinase (comme HER2) et limitant la division et le développement des cellules cancéreuses. L’hormonothérapie fait également partie des thérapies ciblées ; comme son nom l’indique, elle n’est destinée qu’aux cancers du sein hormono-dépendants. Elle consiste en l’administration d’un traitement médicamenteux ou au retrait des ovaires (ovariectomie). Elle est souvent préconisée en complément d’une chimiothérapie ou radiothérapie (source INCa).
les thérapies ciblées, les chimiothérapies ne sont pas proposées de façon systématique et dépendent du stade du cancer au moment du diagnostic (source INCa).
3.1. La chimiothérapie
Il existe deux grandes classes d’agents de chimiothérapie pour traiter le cancer du sein: les agents ciblant l’ADN et les agents ciblant les microtubules.
Les agents ciblant l’ADN incluent les anthracyclines, les gemcitabines et les capecitabines. Les anthracyclines sont les plus connues et les plus utilisées. Ce sont des molécules chimiques d’origine naturelle qui ont été isolées pour la première fois en 1963 à partir d’un microorganisme du genre streptomyces. Inhibitrices de la synthèse de l’ADN elles induisent l’apoptose des cellules. Ces molécules s’intercalent au niveau des bases de l’ADN créant une déformation de la double hélice, une stabilisation du complexe topoisomerase II – ADN et la rupture du double brin d’ADN.
Parmi les anthracyclines les plus connues on distingue la doxorubicine (Adryamicin®) et l’épirubicine (Ellence®). Malgré leur grande efficacité thérapeutique, les anthracyclines présentent une toxicité cardiaque importante qui peut limiter leur usage.
La deuxième classe d’agents de chimiothérapie utilisée dans le traitement du cancer du sein est celle des agents ciblant les microtubules (MTAs, pour "Microtubule Targeting Agents"). Ils incluent les vinca-alcaloides, l’éribuline, les épothilones et les taxanes. Ces agents cytotoxiques modulent la dynamique et la structure des microtubules en se liant directement au niveau des microtubules ou des sous unités de tubuline, menant à des défauts au moment de la mitose. Ces effets entrainent la mort cellulaire.
Ces molécules peuvent être administrées en traitement néo-adjuvant avant une chirurgie de résection. Cela permet d’affaiblir la tumeur pour pouvoir l’enlever plus facilement mais aussi de tester le comportement de la tumeur en réponse à un premier groupe de drogues. Elles peuvent également être administrées en traitement adjuvant après la chirurgie de résection, le but étant ici de cibler les cellules tumorales qui auraient pu échapper à la chirurgie ou les possibles métastases déjà formées.
neuropathies périphériques. L’administration de combinaisons de molécules est très fréquent et souvent plus efficace dans de nombreux cas de cancer du sein.
La classe d’agents ciblant les microtubules qui nous intéresse est celle des taxanes car ils partagent, en partie, le même mécanisme d’action que notre inhibiteur. Pour cette raison, c'est cette classe que je vais détailler plus particulièrement.
3.1.1. Les taxanes
Les taxanes sont des diterpènes et existent sous la forme de 2 molécules commercialisées: le paclitaxel et le docetaxel (Figure 12). Le paclitaxel, isolé pour la première fois en 1962, est extrait, à l'origine, de l’écorce de l’if de l’ouest ou Taxus Brevifolia. Il obtient l’autorisation de commercialisation de la FDA pour la première fois en 1992 pour le traitement du cancer de l’ovaire, puis pour le traitement du cancer du sein. Il est commercialisé sous le nom de Taxol®, Paclitaxel Ebewe® ou encore Paclitaxel Mepha®. Il peut également être couplé à l’albumine et est commercialisé sous le nom d’Abraxan®.
Le docetaxel quant à lui fut isolé 10 ans plus tard. Il est extrait des aiguilles de l’if européen (Taxus baccata) et est un analogue du paclitaxel. Sa structure est voisine du paclitaxel mais son activité est doublée. Il fut prescrit dans un premier temps pour les cancers du sein métastatiques résistants aux anthracyclines, sous le nom de Taxotère®. On l’utilise également pour le cancer du poumon et de la prostate.
Figure 12: Formule chimique du paclitaxel et du docetaxel
3.1.2. Mécanisme d’action
Les taxanes ne se lient que très faiblement à la tubuline soluble cependant leur affinité pour la tubuline sous forme de microtubules est très grande. Le site de liaison du paclitaxel est situé sur la sous-unité β, à l’intérieur du microtubule (Figure 13). Il est capable de se lier à deux sous unités β adjacentes: deux liaisons hydrogènes sont établies entre le paclitaxel et une poche hydrophobe appelé « boucle M » de deux sous-unités β adjacentes34.
Figure 13: Mécanisme d’action des taxanes
A gauche, un dimère de tubuline complexé à une molécule de zampanolide (zampa). Ce nouvel agent stabilisant les microtubules se fixe sur le même site que le paclitaxel (tiré de Steinmetz MO. et al., Science, 2013). A droite, la coupe d’un microtubule montrant l’intérieur du polymère. Le paclitaxel se lie dans la lumière du microtubule entre deux sous-unités β adjacentes ce qui mène à la stabilisation du microtubule. Tiré de Jordan MA. And Wilson L., Nat. Reviews, 2004.
Contrairement aux vinca-alcaloïdes, la fixation du paclitaxel à la tubuline stimule la polymérisation du microtubule35. Le mécanisme d’action reste encore mal compris mais il semblerait que la fixation du paclitaxel entraine un changement conformationnel qui augmenterait l’affinité du microtubule pour les molécules de tubulines voisines36.
mitose avec un blocage entre les étapes de métaphase et d’anaphase, conséquence des défauts de mise en place du fuseau mitotique. Ce blocage aboutit à l’apoptose des cellules37.
Toutefois, l'idée classiquement admise que l'effet des MTAs sur les tumeurs résulte d'un effet sur la prolifération des cellules tumorales, via un blocage de la mitose est actuellement remise en cause. En effet, Timothy J. Mitchison38 a, par exemple, montré que la fréquence de division des cellules dans la tumeur n’est pas particulièrement élevée comme il l’a toujours été pensé39–44. Par exemple, une cellule de cancer du sein cultivée en boite de pétri a un temps de doublement d’environ 24h alors qu’une cellule dans la tumeur primaire a un temps de doublement compris entre 40 et 300 jours. Comment se fait-il alors qu’une drogue ciblant les cellules en division exerce un effet anti-tumoral alors que les cellules se divisent aussi lentement dans la tumeur primaire ? Comment est-ce compatible avec la durée de mise en contact avec la drogue?
De nombreuses hypothèses pour tenter d'expliquer ce paradoxe ont été élaborées (Figure 14). Selon certaines l’effet du paclitaxel passerait par un effet cytotoxique non seulement sur les cellules en division mais également sur les cellules quiescentes, voire même sur les cellules du microenvironnement. Ainsi, après 40 ans d’usage intensif des taxanes en cancérologies, leur mode d’action précis reste encore mal connu.
Figure 14: Mécanismes d’action potentiels du paclitaxel sur les cellules tumorales
Bien que très efficaces dans le traitement des cancers du sein, les taxanes entrainent des effets secondaires lourds tels qu’une toxicité neuronale et une myélosupression45,46. A cela s’ajoute le fait que de nombreux phénomènes de résistance sont développés en réponse à une chimiothérapie réduisant ainsi l’efficacité des thérapies disponibles pour le traitement du cancer du sein.
3.2. Le phénomène de résistance
L’apparition de résistances développées par les cellules tumorales en réponse aux traitements anticancéreux est un phénomène de plus en plus observé en clinique et limite considérablement l’efficacité des chimiothérapies. On distingue la résistance primaire de la résistance acquise (Figure 15). La résistance primaire se traduit par une absence de réponse à un traitement donné et s’explique par l’altération génétique de la cible thérapeutique ou d’autres protéines impliquées dans la voie de signalisation ciblée par le traitement. Elle repose également sur des facteurs propres au traitement d'un patient donné tels que l’interaction entre différents médicaments ou des facteurs cinétiques de biodistribution du médicament. Au contraire, la résistance acquise correspond au développement d’une résistance après une première phase de réponse au traitement. Ce type de résistance apparaît alors que le patient est toujours sous traitement et s’explique par le développement de mécanismes d’échappement de la cellule au médicament administré. Parmi les mécanismes principalement développés on distingue la mutation de la cible, le contournement de la voie de signalisation, la transformation des propriétés histologiques du tissu ainsi que la surexpression de pompes d'efflux telles que la glycoprotéine-P ou la « Multidrug Resistance-associated Protein » (MRP)47,48.
De manière plus spécifique, la résistance aux taxanes est principalement caractérisée par des mutations de la tubuline β ou la surexpression de certaines isoformes de cette dernière dans les cellules cancéreuses. Les mutations de la tubuline β sont rares et peu étudiées alors que l’expression anormale des isoformes l’est beaucoup plus.
partie C-terminale de la tubuline et induisant un degré de complexité supplémentaire. Si le rôle des modifications post-traductionnelles de la tubuline, et plus particulièrement de la tubuline alpha, est en voie d'élucidation49, la fonction des isoformes génétiques de la tubuline est encore mal comprise50.
Figure 15: Mécanismes de résistances développés en réponse aux traitements par des inhibiteurs de kinases
Modifié de Lovly CM. and Shaw T., Clin. Cancer Res., 2014.
Table 4: Localisations chromosomale et tissulaire des différentes isoformes de la β tubuline humaine Isoforme Localisation chromosomale Localisation tissulaire βI 6q21.33 Ubiquitaire βIIa βIIb 6p25.2 6p25.2 Neurones
βIII 16q24.3 Neurones et cellules
de Sertoli βIVa 19p13.3 Cerveau βIVb 9q34.3 Ubiquitaire βV 19p11.21 Utérus et endomètre βVI 20q13.32 Mégacaryocytes et plaquettes
D’autres mécanismes de résistance des cellules cancéreuses aux taxanes sont en cours d’investigation. Il semblerait que l’expression aberrante de certaines protéines associées aux microtubules (MAPs) joue également un rôle dans la résistance aux taxanes51–53. De manière plus surprenante, il semblerait que le cytosquelette d’actine puisse lui aussi jouer un rôle dans la résistance développée contre les taxanes. Bien que le cytosquelette d’actine et microtubulaire représentent deux entités distinctes, il est parfaitement établi à l’heure actuelle qu’il existe une interaction et une complémentarité entre ces deux entités54–56. Des études protéomiques et fonctionnelles dans les leucémies ont montrées que la perte de γ-actine par mutation ou sous-expression est corrélée à la résistance aux MTAs57–59. Reste à comprendre comment des perturbations de l’actine entrainent la résistance des cellules cancéreuses aux taxanes et si ce phénomène concerne d’autres types de cancer.
décrit que la LIM Kinase 2, ainsi que sont substrat principal, la cofiline, sont surexprimées dans des cellules de neuroblastomes résistantes aux MTAs. L’inhibition de l’expression de la LIM Kinase 2 par ARN interférence rétablit la sensibilité des cellules aux MTAs démontrant ainsi son rôle dans le processus de résistance. Bien entendu, d’autres études sont nécessaires pour comprendre comment la LIM Kinase 2, un régulateur du cytosquelette d’actine, influence la sensibilité aux chimiothérapies ciblant les microtubules.
4. La famille des LIM Kinases, nouvelle cible thérapeutique dans le cancer 4.1. Généralités
La famille des LIM Kinases (LIMKs) est composée de deux homologues: la LIM Kinase 1 (LIMK1) et la LIM Kinase 2 (LIMK2). Découvertes dans les années 199061,62, les LIMKs sont exprimées de manière ubiquitaire dans tous les tissus63,64 avec une localisation à la fois cytoplasmique et nucléaire dans les cellules épithéliales. Cependant, des différences d’expression sont à noter entre LIMK1 et LIMK2 dans certains organes tels que le testicule64, ce qui suggère des fonctions cellulaires spécifiques propres à chacune. D’un point de vue structural, ces deux protéines sont composées de deux domaines LIM situés en position N-terminale, d’un domaine PDZ connecté à une région riche en proline et sérine, et d’un domaine catalytique situé en position C-terminale. Les domaines LIM ont été découverts pour la première fois en 1988 dans les protéines à homéo-domaines Lin-11, Isl-1, et Mec-3 (d’où le nom de LIM)65,66. Les LIMKs sont les seules protéines à domaines LIM ayant une activité catalytique67(Figure 17).
LIMK1 et LIMK2 sont codées par deux gènes différents situés sur deux chromosomes différents: 7q11.23 et 22q12.2 respectivement. Le gène codant pour LIMK1 est composé de 39 499 paires de bases soit 16 exons. Deux variants d’épissage pour LIMK1 sont connus à ce jour: l’un codant pour la protéine entière (GenBank NM_002314) l’autre pour une protéine
tronquée de 61 paires de bases, ce qui correspond au domaine catalytique
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=8051616&itemID=2&view= gbwithparts).
Le gène codant pour LIMK2 est quant à lui composé de 68 671 paires de bases soit 19 exons. Trois variants d’épissage ont été identifiés: le premier, LIMK2-1 (GenBank NM_001031801) codant pour la protéine entière, le deuxième, LIMK2-2a (GenBank NM_005569), tronqué au niveau des régions non-codantes 5’ et 3’ et codant pour une protéine plus petite, et le troisième, LIMK2-2b (GenBank NM_016733) qui génère une protéine correspondant à la combinaison du variant 1 en N-terminal et du variant 2a en C-terminal. Aucune différence fonctionnelle n’a été déterminée entre les différents variants, cependant des différences du taux d’expression dans les différents tissus ne sont pas exclues.
sont pas présentes chez le ver C. Elegans74,75 et que l’existence des LIMKs dans le règne végétal n’a pas été investiguée à ce jour .
Les LIMKs font parties de différentes voie de signalisation situées en aval des récepteurs à tyrosine kinase. Leur activité est principalement régulées par les petites protéines G de la famille des Rho-GTPases76tel que Rho, Rac et Cdc42, et sont responsables de la régulation de la dynamique du cytosquelette d’actine et microtubulaire77. Cette capacité à réguler deux des principaux composants du cytosquelette cellulaire fait des LIMKs des cibles stratégiques pour le contrôle des processus de division ou de migration cellulaire, principalement régulé le cytosquelette.
Ainsi, depuis leur découverte, l’intérêt pour les LIMKs ne cesse d’augmenter (Figure 16) et particulièrement dans le domaine du cancer. En effet, il a été montré que l’expression des LIMKs est dérégulée dans de nombreux cancers78–81 et semblent être corrélée au caractère invasif de ces derniers82. F. Manetti, en 2012, présente les LIMKs comme des cibles thérapeutiques attrayantes dans le traitement du cancer avec de nombreux partenaires moléculaires mais très peu de molécules inhibitrices disponibles83.
Figure 16: Nombre d’articles publiés sur la LIMK1 et la LIMK2 depuis leurs découvertes en 1990
4.2. Structure
Les formes complètes de LIMK1 et LIMK2 partagent la même structure protéique de base, composée de deux domaines LIM en N-terminal, suivis d’un domaine PDZ, d'une séquence riche en résidus proline et sérine (S/P) et d'un domaine catalytique de type kinase en C-terminal (Figure 17). On estime à 50% l’homologie entre les deux protéines avec 70% d’homologie au niveau du domaine kinase, 50% au niveau des domaines LIM et 46% au niveau du domaine PDZ68.
Figure 17: Structures et similarités des LIMK1 et LIMK2
LIMK1 et LIMK2 sont composées de 2 domaines LIM en position N-terminal suivi d’un domaine PDZ relié au domaine catalytique (C-terminal) par des séquences riche en sérine et proline. De manière générale, les deux isoformes partagent 50% d’homologies. Tiré de Scott R.W. et Olson F., J. Mol. Med. 2007.
Les domaines LIM sont des sites d’interactions avec d’autres protéines ou avec des complexes macromoléculaires. Ils sont composés de séquences riches en résidus cystéine et histidine qui ont la capacité de complexer un atome de Zinc. On parle également de motifs en doigt de Zinc. Les domaines LIM des LIMKs jouent un rôle important dans la régulation de l’activité kinase84,85 et contribuent à la fonction de cette dernière via l’interaction avec d’autres protéines86.
Post-synaptic density 95, Dlg et Zonula occludens-1, dont les 3 initiales forment son nom87, le domaine PDZ est constitué d’un assemblage de 80 à 90 acides aminés formant une poche hydrophobe dans laquelle vient s’insérer une protéine partenaire ou un ligand PDZ. Ce domaine est également important pour le traffic des LIMKs entre le cytoplasme et le noyau puisqu’il contient deux signaux d’export nucléaire riches en leucine (NES)88,89. On retrouve également deux signaux de localisation nucléaire (NLS) dans la structure des LIMKs. Le premier est situé entre le domaine PDZ et le domaine catalytique et est présent à la fois chez LIMK1 et LIMK2. Le deuxième est présent uniquement dans le domaine catalytique de LIMK290. L’existence de ces signaux d’imports et d’exports suggère des fonctions nucléaires de LIMKs et représente aussi un moyen de réguler leur fonction.
Les LIMKs phosphorylent leurs principaux substrats sur des résidus sérine62,69 et sont capables d’autophosphorylation sur des résidus serine et tyrosine91. Cependant, l’analyse de la séquence primaire des LIMKs permet difficilement de les classer en tant que tyrosine ou sérine/thréonine kinases. En effet, aucun motif propre aux tyrosine kinases (DLAARN ou DLRAAN) ni aux sérine/thréonine kinases (DLKXXN) n’a pu être identifié92. Quant au domaine catalytique, il est unique et ne ressemble à aucun autre appartenant à la famille des protéines kinases. Une étude phylogénétique a même montré qu’il était impossible de classer les LIMKs dans une des familles des protéines kinases existantes61. Toutefois, la présence d’un motif DLNSHN au niveau du domaine kinase permet aux LIMKs d’être intégrées dans la catégorie des " tyrosine kinases like ". Ainsi, sans que cela soit totalement démontré, les LIMKs sont souvent présentées comme ayant la double spécificité de sérine/thréonine kinases et tyrosine kinases.
Figure 18: Structure cristallographique du domaine kinase de la LIMK1 humaine en association avec la staurosporine
La chaine protéique est colorée suivant un gradient « rainbow » avec les extrémités N-terminale en bleu et C-terminale en rouge, respectivement (tiré de la « protein data bank » PDB, id: 3S95).
4.3. Substrats
Le principal substrat des LIMKs est la famille des protéines ADF/cofiline constituée de la cofiline 1 (musculaire), la cofiline 2 (non musculaire) et la destrine (aussi connue sous le nom de facteur de dépolymérisation de l’actine, ADF) (Figure 19). Dans la suite du manuscrit j’utiliserai le terme générique de cofiline pour faire référence aux trois protéines.
