Pyr1 induit in vivo une transition de la migration des cellules tumorales d’un type mésenchymal vers

Les résultats in vitro démontrent l'effet de Pyr1 sur les processus impliqués dans l’acquisition du caractère invasifs des cellules métastatiques suggérant ainsi que cet inhibiteur des LIMKs pourrait avoir d’importants effets anti-métastatiques in vivo.

Afin de tester cette hypothèse, nous avons tout d’abord étudié l’effet de Pyr1 sur la mobilité des cellules tumorales in vivo. Pour cela nous avons utilisé l’imagerie intravitale. Ce type d’imagerie consiste à combiner l’implantation d’une fenêtre mammaire chez la souris au niveau de la tumeur primaire et des séances d’imagerie confocale biphotonique à travers cette fenêtre sur l’animal vivant. J’ai intégré pendant 6 mois le laboratoire du Pr J. van Rheenen aux Pays-Bas (Hubrecht Institute, Utrecht) pour apprendre cette technologie et réaliser les expériences de microscopie intravitale.

Nous avons utilisé un modèle de xénogreffes orthotopiques de cancer du sein humain MDA-MB-231 (Figure 44). Les cellules ont été implantées au niveau de la mamelle. Elles expriment de manière stable dans le cytoplasme la protéine Dendra2. Cette protéine qui émet dans le vert a la propriété d'émettre dans le rouge après irradiation aux ultraviolets. Cette caractéristique peut être intéressante pour marquer une zone dans la tumeur et l’utiliser comme point de repère entre les différentes séances d’imagerie. Elle peut aussi permettre de suivre une population de cellules au cours du temps. Une fois la tumeur palpable (c’est-à-dire 30 à 45 jours après implantation des cellules), la fenêtre mammaire a été introduite par chirurgie. Deux jours plus tard, une première séance d’imagerie confocale sans aucun traitement a été réalisée et constitue un contrôle qui donne une idée de l’aspect général de la tumeur avant injection d’un quelconque produit. L’injection quotidienne intrapéritonéale de Pyr1 à 10 mg/Kg a commencé le jour suivant et a duré entre 8 et 13 jours. Une première séance d’imagerie confocale a été réalisée 2 à 3 jours après le début du traitement, la seconde au bout de 5 à 6 jours et la dernière avant le sacrifice, après 8 à 12 jours de traitement. Le microscope étant très utilisé, il n’a pas été possible d’observer en microscopie toutes les souris au même moment du traitement, ce qui explique l’espacement variable des séances d’imagerie entre les souris.

Nous avons observé, dès 3 jours après le début du traitement par Pyr1, d’importants changements (Figure 45A). D’une part, l’allure du tissu tumoral est hétérogène (Figure 45B), d’autre part, les cellules s’arrondissent (Figure 45A). Nous avons essayé de rendre compte des modifications du tissu tumoral en mesurant l’aire couverte par les cellules tumorales fluorescentes dendra2 et en la rapportant au reste du tissu non marqué. Nous avons observé qu’il y avait moins de fluorescence dans le groupe traité par Pyr1 que le groupe contrôle, ce qui pourrait traduire une détérioration du tissu tumoral après un traitement par Pyr1. On ne peut cependant pas affirmer que cet effet résulte d’une interaction directe de Pyr1 sur les cellules tumorales ou d’un effet indirect via les cellules du microenvironnement. Ce phénomène de détérioration apparente se confirme après exérèse des tumeurs et réalisation des coupes au cryomicrotome. Le tissu issu des tumeurs traitées par Pyr1 est très endommagé, se désintègre lors de la coupe et n’adhère pas à la lame. Il a donc été très difficile par la suite de réaliser l’analyse immunohistologique des tumeurs.

Néanmoins, en modulant différents paramètres et notamment, en augmentant l’épaisseur des coupes, nous avons pu évaluer le degré de prolifération et de mort cellulaire des tumeurs dans les deux groupes par marquage Ki67 et TUNEL respectivement. Nous avons observé une diminution de la prolifération et une augmentation de l’apoptose dans les tumeurs traitées par Pyr1 (Figures 45C et D).

Ainsi, l’effet antitumoral de Pyr1 semble résulter d'une diminution de la prolifération et d'une augmentation de l’apoptose. Ce mode d’action est semblable aux autres composés cytotoxiques couramment utilisés en chimiothérapies, comme les taxanes. Le changement de morphologie observée lorsque les cellules sont traitées par Pyr1 n’a encore jamais été décrit dans la littérature excepté pour des changements morphologiques du noyau en présence d’agents ciblant les microtubules¹⁹³.

Figure 45: Effet de Pyr1 sur les cellules tumorales

A Images représentatives des tumeurs après 8 jours de traitement par Pyr1 (10mg/Kg) ou le véhicule

acquises en microscopie intravitale. Les images proviennent de 3 souris différentes. Barre d’échelle = 100µm. B Mesure de la quantité de cellules MDA-MB-231 Dendra2 dans les tumeurs. Le signal fluorescent émis par la protéine Dendra2 a été quantifié en utilisant le logiciel ImageJ comme décrit dans le matériel et méthodes. En haut: images représentatives de la fragmentation utiliseé par ImageJ pour distinguer les zones fluorescentes des zones non fluorescentes. En bas: ratio moyen des zones fluorescentes (issues de l'émission de la protéine Dendra2) sur les zones non-fluorescentes dans les tumeurs traitées ou non par Pyr1. Barres d’erreurs = SEM, *p<0.05 (test de Student), n= 5 zones par tumeur à raison de 3 tumeurs par groupe. Barre d’échelle = 100µm. C Effet de Pyr1 sur la prolifération cellulaire. Images représentatives d’un immunomarquage de la protéine Ki67 après 8 jours de traitement et quantification, représentée sous forme d'histogrammes, du nombre de cellules

marquées. Trois tumeurs par groupe ont été analysées. Barres d’erreurs = SEM, *p<0.05 (test de Mann-Whitney), barre d’échelle = 50µm. D Effet de Pyr1 sur la mort cellulaire. Images représentatives d’un marquage par réaction TUNEL après 8 jours de traitement et quantification des cellules marquées. Trois tumeurs par groupe ont été analysées. Barres d’erreurs = SEM, *p<0.05 (test de Mann-Whitney), barre d’échelle = 50µm.

2.4. Pyr1 réduit la migration, dans la tumeur, des cellules MDA-MB-231 Dendra2 de