RELATION ENTRE LEUCORACHIE ET MENINGITE BACTERIENNE

Superviseur

Pr Honoré Sourou BANKOLE Microbiologiste

Professeur Titulaire des Universités EPAC/UAC

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

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UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI ********

ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY CALAVI

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DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE ********

RAPPORT DE STAGE DE FIN DE FORMATION POUR L’OBTENTION DU DIPLOME DE LICENCE PROFESSIONNELLE

EN ANALYSES BIOMEDICALES

THEME

Réalisée et soutenu par :

Tobi Jaurès Raymond AZOCLI

Sous la direction de :

Composition du Jury :

Président : Professeur Théodora AHOYO

Examinateur : Docteur Olivia HOUNGBEGNON Superviseur : Professeur Honoré BANKOLE

RELATION ENTRE LEUCORACHIE ET MENINGITE BACTERIENNE

Année Académique : 2017-2018 11^ème promotion

11 Tuteur

M. Richard AMAGBEGNON Ingénieur des travaux

au CHU-MEL

REPUBLIQUE DU BENIN

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MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

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UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI

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ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY CALAVI

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DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE

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OPTION : ANALYSES BIOMEDICALES

DIRECTEUR EPAC : Professeur Guy Alain ALITONOU

DIRECTEUR ADJOINT EPAC : Professeur François-Xavier FIFATIN

CHEF DE DEPARTEMENT GBH : Professeur Eugénie ANAGO

Noms et Prénoms Matières enseignées ABLEY Sylvestre Déontologie médicale

ADOMOU Alain Physique

AGBANGLA Clément Génétique moléculaire

AGOSSOU Gilles Législation et droit du travail

AHOYO Théodora Angèle Microbiologie/ Santé Publique et Hygiène Hospitalière

AKAKPO B. Huguette Education physique et sportive

AKPOVI D. Casimir Biologie cellulaire/ Physiologie humaine/

Biochimie clinique

ALITONOU Alain Guy Chimie générale/ Chimie organique

ANAGO Eugénie Biochimie structurale / Biochimie clinique ANAGONOU Sylvère Education physique et sportive

ATCHADE Pascal Parasitologie / Mycologie BANKOLE Honoré Bactériologie / Virologie DESSOUASSI Noel Biophysique

DOSSEVI Lordson Techniques instrumentales

DOSSOU Cyriaque Techniques d’Expression et Méthodes de communication

DOUGNON T. Victorien Microbiologie/ Méthodologie de la Recherche

HOUNNON Hyppolite Mathématiques KOFFI Aristide Justin Anglais

KOUDANDE Marlène Hématologie générale KOUNASSO Gabriel Informatique général

LOKOSSOU Gatien Immunologie générale/ Immuno-pathologie LISTES DES ENSEIGNANTS

LOZES Evelyne Immunologie générale/ Immuno-pathologie MASLOKONON Vincent Histologie Générale

OGOUDIKPE Nicarette Informatique médicale SECLONDE Hospice Transfusion sanguine

SEGBO Julien Biologie moléculaire/ Biochimie clinique SENOU Maximin Histologie Générale/ Histologie appliquée

SOEDE Casimir Anglais

TOHOYESSOU Zoé Soins infirmiers

TOPANOU Adolphe Hématologie/ Hémostase YOVO K.S. Paulin Pharmacologie/ Toxicologie

DEDICACE

Dieu Tout Puissant,

Par ta puissance, Tu nous as inspiré et guidé durant toute notre formation.

Merci à Toi, de qui nous détenons toute vérité scientifique. Soit glorifier… Amen !

REMERCIEMENTS

Au terme de ce travail, Je voudrais transmettre mes sincères remerciements à :

 Mon feu père AZOCLI Henri Camille, qui a fait de ma réussite sa priorité en consentant des sacrifices énormes afin que je puisse parvenir à ce résultat. Vraiment merci pour ton soutien indéfectible même dans l’au-delà.

Que ton âme repose en paix.

 Ma chère maman DJAKPA Lydiane, trouve ici la concrétisation de tes vœux pour moi. Que Dieu le miséricordieux t’accorde longue vie, bonheur et prospérité.

 Mes frères et sœurs Désiré, Morel, Gérôme, Immaculée, Hermine, merci pour tous vos soutiens .Que Dieu vous protège.

 Mon Superviseur, Professeur Honoré BANKOLE, malgré vos multiples occupations vous avez accepté sans réserve de diriger ce travail. Permettez, cher Superviseur, de vous exprimer, notre respect et notre sincère reconnaissance. Demeurez bénis.

 M. AMAGBEGNON Richard votre attention, votre amabilité. Que Dieu vous élève d’avantage.

 Mme AMADOU Jeanne pour votre générosité et pour votre assistance.

Puisse Dieu vous comble de ses bienfaits !

 M. Miftaou, pour votre soutien moral, votre assistance et votre contribution financière. Que la paix soit avec vous.

 Mme TOKPLO Prudence pour votre contribution financière et votre encouragement que Dieu vous garde.

 Mme DJOSSOU Aichatou et à Mme DOTOU Edwige pour votre soutien affectifs ; vos conseils fraternels. Que Dieu vous bénisse.

 M. Thomas d’Aquin ZAGOUNON, Directeur Général du CHU- MEL, pour nous avoir acceptés comme stagiaires dans votre centre, nous vous exprimons toute notre gratitude.

 Docteur Simon AZONBAKIN, Médecin Biologiste et à Madame Bibiane BANKOLE BIOKOU, surveillante du laboratoire du Centre Hospitalier de la Mère et de L’enfant (CHU- MEL), pour votre sympathie et vos conseils. Que Dieu vous bénisse.

 Mme ANTHONY Diana, Chef de la section bactériologie nous sommes reconnaissant pour votre amabilité ; que Dieu vous bénisse.

 M. Ramanou SANNI, pour votre dévouement, vos conseils, votre attention, votre amabilité et votre disponibilité. Que Dieu vous élève d’avantage en sagesse.

 Tout le personnel du laboratoire du CHU-MEL pour leur accueil chaleureux et leurs implications active dans notre formation.

 Toutes les autorités de l’EPAC en particulier les professeurs du département de Génie de Biologie Humaine, pour la qualité de la formation

 A mes amis Léa L., Edmond B., Prisca H., et Candide B., pour votre preuve d’amitié et de solidarité. Dieu vous garde.

 A mes camarades de la 11^èmepromotion

Merci infiniment pour tout ce que nous avons eu à partager ensemble.

HOMMAGES

 A SON EXCELLENCE LE PRESIDENT DU JURY

Vous nous faites un grand honneur en acceptant de présider notre jury malgré vos multiples préoccupations. Veuillez agréer Monsieur le président, l’expression de notre profonde gratitude.

 AUX HONORABLES MEMBRES DU JURY

Nous sommes très sensibles à l’honneur que vous nous faites en acceptant de juger ce travail. Nous sommes persuadés que vos critiques et remarques contribueront à l’amélioration de la qualité de ce travail. Recevez nos vives considérations !

LISTES DES SIGLES ET ABREVIATIONS

LCR : Liquide Céphalo-rachidien LCS : Liquide Cérébro-spinal SCN : Système nerveux central

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

CHU-MEL : Centre hospitalier de la mère et de l’enfant GB : Globule blancs

Inf : inférieur

PNN : polynucléaire neutrophile Leu : leucocytes

GB : Globule blancs mm³ : millimètre cube AMX : Amoxicilline CMX : Céfuroxime FOX : Céfoxitine AUG : Augmentin CIP : Ciprofloxacine CTR : Ceftriaxone GEN : Gentamycine

LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX

 Figures

Figure 1 : Zones de ceinture de la méningite en Afrique…………..7

Figure2 : Milieu de transport du LCR : Trans-Isolate………9

Figure 3: Recherche d’antigène soluble (kit PASTOREX MENINGITIS)……..10

Figure 4 : Frottis coloré au MGG………..11

Figure 5 : Quelques colonies colorées au Gram………11

Figure 6: Quelques géloses ensemencées………..12

 Tableaux Tableau I : Répartition des échantillons reçus en fonctions des services………..23

Tableau II : Répartition des échantillons en fonction de l’âge au service de néonatologie………...24

Tableau III : Répartition des échantillons en fonction de l’âge au service de Pédiatrie……….25

Tableau IV: Répartition des échantillons en fonction du sexe………...26

Tableau V : Enfants sous antibiothérapie avant prélèvement du LCR…………...27

Tableau VI : Aspect macroscopique des liquides de ponction lombaire…………28

Tableau VII: Répartition des échantillons en fonction de la leucorachie…………29

Tableau VIII: Différents aspect macroscopique en fonction de la numération des leucocytes………30

Tableau IX : Formule leucocytaire des frottis de LCR colorés au MGG…………31

Tableau X : Résultats issus de la culture……….32

Tableau XI : Résultats de la culture en fonction de la leucorachie……….33

Tableau XII : Différents germes isolées………..34

Tableau XIII : Profil de résistance des bactéries isolées……….35

SOMMAIRE

INTRODUCTION ...1

I-SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE...4

II-CADRE, MATERIEL ET METHODES...13

III-RESULTATS ET COMMENTAIRE...22

CONCLUSION ET SUGGESTION...33

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES……….34

ANNEXES……….. 36

TABLES DES MATIERES……….42

Résumé

RESUME / ABSTRAT

Le présent travail a eu pour objectif général de contribuer à l’amélioration du diagnostic biologique des méningites bactériennes. Pour ce faire, 30 échantillons de Liquide céphalo- rachidien ont été analysés. La numération leucocytaire a été réalisée et la leucorachie a été déterminée. Les échantillons ayant un taux supérieure à la normal ont été ensemencés sur de différents milieux de culture. Au terme de la manipulation, 10%

des échantillons de liquide céphalo-rachidien ont présenté une leucorachie importante avec culture positive. Les différents germes isolés sont Salmonella spp (66,67%) et Escherichia coli (33,33%).

Mots clés : Liquide céphalo- rachidien, leucorachie.

The general objective of this work was to contribute to the improvement of the biological diagnosis of bacterial meningitis. To do this, 30 samples of cerebrospinal fluid were analyzed. The leukocyte count was performed and the leukorachia was determined.

Samples with a higher than normal level was inoculated on different culture media. After the manipulation, 10% of the cerebrospinal fluid samples showed significant leukorachia with positive culture. The different isolated organisms are Salmonella spp (66.67%) and Escherichia coli (33.33%).

Key words: Cerebrospinal fluid, leukorachia.

Abstrat

INTRODUCTION

La méningite, une urgence médicale, peut être définie comme un processus inflammatoire d’origine généralement infectieuse, qui atteint le cerveau et la moelle épinière. Elle est responsable de nombreux séquelles et est caractérisée par une forte mortalité quand le diagnostic est posé tardivement et le traitement mal conduit [16,17]. Elle peut être d’origine bactérienne ou viral.

La méningite bactérienne est une infection présente partout dans le monde avec une implantation préférentielle dans certaines zones d'Afrique et d'Amérique [5]. Selon l'OMS, plus de 500 milles cas sont enregistrés chaque année et environ 30 milles cas sont signalés en Afrique subsaharienne [1]. Au Bénin, en 2006, 270 cas de méningite ont été notifiés avec un taux de létalité de 24% [4]. Il s’agit donc d’un véritable problème de santé publique. Les bactéries responsables sont répertoriées et les plus fréquents sont Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Neisseria meningitidis [8]. Cette maladie touche particulièrement les nourrissons et les enfants.

Dans le cadre du diagnostic biologique de la méningite bactérienne, le liquide céphalo-rachidien reste l’échantillon biologique le plus utilisé. A l’état normal, le liquide céphalo-rachidien ne contient presque pas de leucocytes. En cas de méningite bactérienne, la leucorachie est importante.

La présente étude a eu pour objectif général de contribuer à l’amélioration du diagnostic biologique des méningites bactériennes.

Spécifiquement, il s’est agi de :

- Evaluer la leucorachie chez 30 enfants suspectés de méningite bactérienne.

- Poser le diagnostic par la bactériologie de la méningite chez les 30 enfants malades.

Le présent document comporte dans sa première partie la synthèse bibliographique sur le liquide céphalo-rachidien et les méningites bactériennes. La deuxième partie prend en compte la méthodologie d’étude. Enfin la dernière partie présente les résultats obtenus et le commentaire.

CHAPITRE I-

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

1-DEFINITION ET ROLE DU LCR 1.1. Définition

Le LCR encore appelé Liquide cérébro-spinale (LCS), est un liquide biologique dans lequel baigne le système nerveux central (encéphale et moelle épinière) [3].

1.2- Rôle du LCR

Le LCR assure la protection du tissu cérébral contre les chocs et les secousses mécaniques et la régulation de la pression intracrânienne. Il participe également aux processus métaboliques cérébraux en régulant les échanges de substance et le transport des éléments nutritifs des neurones [3, 8].

1.3-COMPOSITION CYTOLOGIE ET CHIMIQUE DU LCR 1.3.1-Composition cytologie

Le LCR doit fournir au Système Nerveux Central (SNC) un environnement physico-chimique constant pour maintenir sa fonction à son efficacité maximale.

[3]. C’est un liquide Clair incolore (aspect « eau de roche » ou limpide), aseptique avec un PH qui avoisine 7, 32. Son poids spécifique relatif est de 1,005. Le LCR normale ne contient pas d’hématies et de rares leucocytes. Dans le LCR normale de l’enfant et de l’adulte, le nombre de leucocytes est inférieur à 05 éléments par mm³ et inférieur à 20 él/mm³ chez le nourrisson dont 50% de polynucléaire [5].

1.3.2-Chimie du LCR : glycorachie et protéinorachie.

1.3.2.1-Glycorachie du LCR

La glycorachie est le taux de glucose présent dans le LCR. Elle doit toujours être interprétée en fonction de la glycémie. Une glycorachie normal est comprise entre 0,45-0,60g/l soit 2,8 -4,2 mmol/l [8]. Cette valeur est diminuée (hypoglichorachie) dans 70% des cas de méningites bactériennes car ces bactéries utilisent le glucose du LCR comme source d’énergie pour leurs développements.

1.3.2.2-Protéinorachie du LCR

La protéinorachie est définie comme la concentration en protéines dans le LCR. Sa valeur normale est comprise entre 0,10-0,45 g/l.

Une hyperprotéinorachie s’observe dans les processus inflammatoires des méninges (cas de méningites bactériennes). Elle peut être associée à une réaction cellulaire c’est –à-dire une augmentation du nombre de leucocytes dans le LCR.

[19]

Le dosage de ces deux paramètres s’avère très important pour poser un diagnostic fiable de la méningite bactérienne. La chlorurorachie est en général normale et a souvent très peu d'intérêt médical.

1.4. ASPECT MACROSCIPIQUE ET CHIMIE DES LCR 1.4.1. LCR trouble « eau de riz »

Cet aspect macroscopique du LCR peut orienter vers une méningite purulente (bactérienne); ce caractère apparaît à partir de 200-500 globules blancs par mm³ dont 50-80 % de polynucléaires ; avec une protéinorachie > 0,40 g/l, hypoglichorachie < 40 % de la glycémie. La méningite est à considérer comme bactérienne [1].

1.4.2. LCR lymphocytaire

Plus de 10-100 éléments/mm³ dont plus de 50 % de lymphocytes ; avec une protéinorachie supérieure à 0,4 g/l et hypoglichorachie < 40 % de la glycémie : étiologie bactérienne probable (Listeria, BK accompagné d'une hypochlorurorachie). La méningite est à considérer comme virale [1].

1.4.3. LCR trouble purulent

Plus de 1000 globules blancs /mm³ avec une prédominance de polynucléaires surtout neutrophile. On remarque une hyperprotéinorachie et une hypoglychorachie. La méningite due à une bactérie dite pyogène [1].

1.4.4. LCR hémorragique

La contamination du LCR par des globules rouges fait discuter un traumatisme lors de la ponction lombaire ou une hémorragie sous arachnoïdienne (hémorragie méningée).

La protéinorachie devient alors difficilement interprétable puisque la présence de 1000 globules rouges augmente la protéinorachie de 0,1 g/l [1].

1-5-CONTEXTE CONDUISANT A L’EXAMEN D’UN LCR

L’examen cytobactériologique du LCR est demandé dans le cadre du diagnostic précoce et du traitement d’une méningite. L’examen cytochimique du LCR permet de reconnaître ou de suspecter une étiologie bactérienne justifiant un traitement antibiotique immédiat [7].

2. MENINGITES 2.1. Définition

La méningite est une infection du SNC due à une inflammation des membranes qui enveloppent le cerveau et la moelle épinière (méninges).Elle peut être causée par des microorganismes qui peuvent être des bactéries, des virus, des parasites ou des champions [2].

2.2. Epidémiologie

La ceinture africaine de la méningite, s'étend de l'Ethiopie à l'Est au Sénégal à l'Ouest. Dans cette zone des cas sporadiques sont observés selon un cycle annuel saisonnier, alors que de grandes épidémies éclatent de façon irrégulière.

Les pays inclus dans la ceinture africaine de la méningite sont les suivants : Bénin, Burkina Faso, Nord-Cameroun, Éthiopie, Gambie, Ghana, Mali, Niger, Nord-Nigéria, Sénégal, Soudan et Tchad avec une incidence de 800.000 cas environ entre 1970 et 1992 (OMS, 2016).

Bien que les plus graves des épidémies frappent surtout les pays africains situés au sud du Sahara, dans la ceinture africaine de la méningite, elle est devenue un problème mondial, susceptible d'affecter n'importe quel pays, quel que soit son climat [8].

Figure 1 : Zones de ceinture de la méningite en Afrique

Source : OMS, 2016

2.3. Physiopathologie

La survenue d'une méningite suppose que l'agent pathogène soit capable de franchir, d'envahir l'espace sous-arachnoïdien et d'y produire une inflammation.

Les bactéries le plus souvent mise en cause dans la plupart des méningites bactériennes gagnent les méninges, à partir du rhino-pharynx par voie :

 hématogène sous forme d'une simple bactériémie ou d'une septicémie;

 lymphatique et péri-nerveuse trans-éthmoïdale (lame criblée) [2].

2.4. Différentes formes de méningites et les bactéries en causes

Généralement les méningites sont reparties en trois catégories selon le contexte de survenu.

Elles sont parfois d’origine bactérienne, virale, ou parasitaire et surviennent très souvent chez : les nouveau-nés (nourrissons), les enfants, des sujets ayant subis une neurochirurgie et des immunodéprimés[1].

On distingue :

 Méningites bactériennes ou purulentes :

Ces méningites découlent de l’envahissement du liquide céphalo- rachidien (LCR) par une colonie bactérienne et qui s’y développe [2].

Elles sont souvent dues au méningocoque (Neisseria méningitidis) qui est une bactérie aérobie, gram négatif, et qui se présente sous forme d’un diplocoque en grain de café ; au pneumocoque (Streptococcus pneumoniae) qui est un coccus Gram positif ; à certains bacilles Gram négatifs dont : Salmonella, Escherichia coli qui sont les plus souvent impliquées dans les méningites bactériennes du nouveau-né [6]. D’autres bactéries comme Staphylococcus aureus, HaemophilIus influenzae (bactéries fragile) peuvent être impliqués [1,3].

 Méningites virales

Elles sont généralement bénigne et d’une évolution favorable et son principalement dues à des entérovirus (dans 80% des cas). Divers autres virus sont impliqués comme le virus Herpès simplex et le virus de la poliomyélite. [2 ,9]

 Méningites fongiques, parasitaires

Elles sont dues à des champignons (principalement Cryptococcus neoformans et Candida spp), souvent rares et survenant sur les sujets immunodéprimés. Les parasites Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondi et d’autres sont souvent isolés dans le LCR en cas de méningites parasitaires. [3]

3. DIAGNOSTICS CYTOBACTERIOLOGIQUE DU LCR

L’examen cytobactériologique du LCR permet d’apprécier et d’établir un diagnostic bactériolique. Il se déroule en trois phases : pré-analytique, analytique, post-analytique.

3.1. Phase pré-analytique

C’est l’ensemble des étapes à exécuter avant le démarrage des analyses.

3.1.1. Prélèvement du liquide céphalo-rachidien (LCR)

Le prélèvement du liquide céphalorachidien (LCR) est réalisé idéalement avant toute antibiothérapie par ponction lombaire, après une asepsie rigoureuse de la peau entre les vertèbres lombaires L3–L4 ou L4-L5 [8]. C’est un acte médical simple, facile, peu douloureux mais très délicat qui est réalisé par un personnel qualifié, expérimenté (médecin ou neurologue).

La quantité moyenne de LCR requis pour la réalisation des différents examens est de 3 ml, recueillie dans 2 tubes stériles.

3.1.2. Acheminement du LCR vers le laboratoire

L’acheminement du LCR vers le laboratoire doit se faire sans délai ou au plus dans moins 30 minutes en raison de la lyse rapide des polynucléaires, et à l’abri du froid en raison de la fragilité de certaines bactéries, notamment les méningocoques.

L’acheminement peut se faire dans un milieu de transport spécifique, le Trans- Isolate, notamment lorsque le laboratoire est éloigné du lieu de prélèvement (figure2) .Un minimum de renseignements cliniques, en occurrence : l’âge, les traitements antibiotiques antérieurement reçus par le malade, le statut immunitaire et le type d’immunodépression, le contexte clinique et épidémiologique : (convulsion, purpura, actes de neurochirurgie) doit être transmis au laboratoire [14].

Figure2 : Milieu de transport du LCR : Trans-Isolate 3.2. Phase analytique

L'analyse du LCR passe par la réalisation de nombreux examens à savoir : les examens macroscopiques et microscopiques, la culture, l’isolement, l’identification d’éventuel germe pathogène et l'étude de leur sensibilité aux antibiotiques selon les recommandations du Comité Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-SFM).

 Examen macroscopique

Cet aspect du LCR est examiné à l’œil nu et tient compte de la couleur et de la turbidité. Cela permet de le classer en différentes catégories :

- clair, limpide ;

- louche et trouble «eau de riz»;

- xanthochromique ou jaune ; - hémorragique.

Un LCR clair «eau de roche» n'exclut pas le diagnostic de méningites (cas des méningites virale, décapitées ou en phase de début) [2].

3.2.2. Examen indirect : recherche d’antigènes solubles pour l’orientation du diagnostic

La recherche d’antigène soluble repose sur la détection de fragments bactériens de nature polyosidique qui peuvent être reconnus par des techniques immunologiques.

Le Kit PASTOREX MENINGITIS, constitués de particules de latex sensibilisées par des antisérums spécifiques, permettant par une technique d'agglutination rapide sur carte, de détecter l'antigène correspondant dans le LCR

[5]. Certaines bactéries peuvent donc être détecté de façon indirecte : Neisseria meningitidis groupe A, groupe C, groupe B, E. coli, HaemophilIus influenzae b, Streptococcus pneumoniae et Streptococcus B (Streptococcus agalactiae) (figure3).

1-Kit et échantillon 2-Plaque d’identification 3-Dépôt des antisérums spécifiques

4-Dépôt de l’échantillon LCR 5-Etaler les suspensions 6-Réaction d’agglutination : +/-

Figure 3: Recherche d’antigène soluble (kit PASTOREX MENINGITIS)

3.2.3. Examen microscopique

C’est l’ensemble des observations microscopique faites à l’état frais et à l’état coloré.

 Cytologie quantitative

Le liquide céphalo-rachidien est examiné entre lame et lamelle (état frais) pour apprécier la richesse cellulaire et la présence de bactéries. La numération des leucocytes est réalisée sur cellule de Malassez à l’objectif X40. Le résultat est exprimé en éléments par mm³ [1].

 Cytologie qualitative

Lorsque la cytologie quantitative est positive et supérieure à 20 leucocytes /mm³, un frottis du culot de centrifugation doit être réalisé et coloré au May- Grünewald-Giemsa (figure 4). Une large prédominance des polynucléaires surtouts des neutrophiles est généralement observée dans les méningites bactériennes alors qu’elle est lymphocytaire dans les méningites virales [1, 10].

Figure 4 : Frottis coloré au MGG

 Coloration de Gram

La coloration de Gram, technique de coloration de base en bactériologie, elle utilise le colorant du violet de gentiane qui colore l’intérieur des bactéries. Ensuite l’alcool éthylique pour décolorer ces bactéries. En raison de la paroi plus épaie des bactéries Gram +, elles gardent la coloration violette. Les bactéries Gram- sont colorées en rose par la Fuschine phéniquée.

Coco bacille à Gram- Diplocoques à Gram+ Diplocoque à Gram - Figure 5 : Quelques colonies colorées au Gram

3.2.4. Mise en culture et identification

Elle est effectué systématiquement en premier temps afin d’éviter tout risque de contaminations du LCR en utilisant des milieux spécifiques tels que :

-la gélose au sang frais additionnée d’Acide Nadixilique Colistine, pour la recherche des Streptocoques ;

-gélose chocolat ou au sang cuit de mouton additionnée de 10% de polyvitex, pour la recherche de certaine espèce comme H. influenzae, Neisseria ;

L’aspect des colonies sur ces différents milieux ensemencés se présente comme suit (figure 6).

Colonie sur gélose au sang frais+ANC Colonies sur gélose au sang cuit + polyvitex

Figure 6: Quelques géloses ensemencées 3.2.5. Etude de la sensibilité aux antibiotiques

L’antibiogramme sur milieu solide, gélose Muller Hinton est classiquement utilisé dans nos laboratoires. Il permet de tester, l’action des antibiotiques sur une souche bactérienne identifiée.

3.3. Phase post-analytique

Au cours de cette phase, il s’agira d’interpréter les résultats obtenus puis de leurs transcriptions sur le bulletin d’analyse du malade et dans le registre.

CHAPITRE II-

MATERIEL ET METHODES

1. CADRE

1.1. Cadre institutionnel

L’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi qui à l’origine était nommée Collège Polytechnique Universitaire (CPU) et est créée en Février 1977 pour répondre à un besoin de formation technique au niveau de l’enseignement supérieur.

A l’époque, la mission assignée au CPU est de former des techniciens supérieurs capable de satisfaire les attentes liée à l’objectif de développement économique de la nation .Les évolutions de l’environnement notamment les progrès en matière technologique ont amené les autorités à engager des réformes en vue de prendre en compte ces avancées et faciliter l’actualisation des enseignements dispensés. Dans ce cadre, la dénomination a été modifiée : le Collège Polytechnique Universitaires est devenu Ecole Polytechnique d’Abomey – Calavi (EPAC).

L’enseignement à L’EPAC est organisé en deux secteurs : le secteur industriel et le secteur biologique dans lequel s’est déroulée notre formation dans le département de Génie de Biologies Humaine (GBH).

1.2. Cadre technique

Notre stage s'est déroulé au laboratoire du « Centre Hospitalier Universitaire de la mère et de l'enfant lagune (CHU- MEL) ».

1.2.1. Présentation du CHU-MEL

L’ex maternité lagune est situé à Cotonou dans le quartier TOKPA-XOXO non loin du lycée technique Coulibaly. De la maternité lagune, il est devenu HOMEL en Octobre 2002 après sa fusion avec le Centre de Santé Maternel et Infantile. C’est le premier centre hospitalier de référence dans la prise en charge de la mère et de l’enfant. En 2012, l’HOMEL change d’orientation et devient un Centre Hospitalier Universitaire de la mère et de l'enfant lagune (CHU-MEL).

1.2.2. Description du laboratoire du CHU-MEL

Le laboratoire est situé à gauche du portail de l’entrée du personnel, qui fait face au bâtiment appelé « BATIMAT ». Il est dirigé par un médecin biologiste et regroupe deux catégories socioprofessionnelles :

 les aides-soignants ;

 les techniciens et ingénieur des travaux.

Le laboratoire est composé du bureau de la surveillante, des salles de prélèvement (salle de prélèvement sanguin et la salle de PV), de quatre secteurs d’activités, des salles de garde, d’une laverie, un magasin et d’un hall d’accueil. Il est constitué de différents secteurs à savoir : la biochimie, la sérologie, l’Hématologie, la parasitologie et la bactériologie.

2. MATERIEL

2.1. Matériel biologique

Il est composé de 30 échantillons de liquide céphalo-rachidien provenant des enfants suspectés de méningite bactérienne.

2.2. Milieux de culture

Dans le cadre de ce travail, nous avons utilisé la gélose au sang frais additionnée à l’Acide Nalidixique Colistine, la gélose au sang cuit additionnée de 10% de polyvitex, la gélose EMB, la gélose Chapman, la gélose Mueller–Hinton et la galerie de Leminor.

2.3. Réactifs et Colorants

Les réactifs et colorants utilisés pour la réalisation de ce travail sont entre autres, le violet de gentiane, le lugol, la fuchsine phéniquée diluée au 1/10^è, l’alcool éthylique, le May Grunwald-Giemsa et le réactif de Kovac’s.

2-4. Appareils

Dans le cadre de ce travail, nous avons utilisés un microscope pour l’état frais et l’état coloré, l’hématimètre de Malassez pour la numération des leucocytes, un réfrigérateur pour conserver les milieux de culture préparés, stérilisés et coulés dans les boites de pétrie et les réactifs, une étuve réglée à 37°C pour la mise en culture des boites ensemencer, un autoclave pour stériliser les milieux préparés, une micropipette pour prélever un volume convenable de solution , une centrifugeuse pour séparer le culot du surnageant,

un réchaud à gaz pour préparer les milieux de culture, une balance électronique pour mesurer une quantité convenable de milieux de culture.

2.5. Autre matériel

Il s’agit des lames et lamelles, anse de platine, bec bunsen, portoir, râtelier, huile à immersion, disque d'antibiotiques, éprouvette graduée, boite de pétrie.

3-METHODES 3.1. Type d’étude

Il s’agit d’une étude prospective qui s’est déroulée du 20 Août au 19 Octobre 2018 au CHU- MEL.

3.1.1. Critères d’inclusion

Sont inclus dans cette étude tous les prélèvements de LCR des nouveau-nés et enfants âgés de 0-15ans sans distinction de sexe, ni de prise d’antibiotique et qui sont admis dans le service enfant regroupant la néonatologie et la pédiatrie. Les prélèvements doivent être accompagnés d’un bon d’analyse soigneusement renseigné : nom, prénom(s), âge, provenance, l’heure du prélèvement, diagnostic de présomption ; traitement antibiotique antérieur ou en cours.

3.1.2. Critères d’exclusion

Ont été exclus de l’échantillonnage de l’étude tous prélèvements de LCR : - acheminé au laboratoire au-delà de 30min après le prélèvement ;

- réalisé dans moins de 02 tubes et ayant un volume inférieure à 3ml par tube ; - transmis au laboratoire sans bon d’analyse ou mal renseigné ;

- d’aspect hématique (contenant du sang).

3.1.3. Préparation des milieux de cultures

Les milieux de culture ont été préparés et stérilisés selon les indications des fabricants (Annexes6).

3.2. Prélèvement

Le prélèvement du LCR est un acte strictement médical réservé aux spécialistes. Il permet de recueillir un volume de 3ml de LCR dans deux tubes stériles numérotés 1, 2.

Les échantillons de LCR ainsi prélevés sont acheminés sans délai au laboratoire pour analyse. Chaque échantillon de LCR est accompagné d’un bulletin d’analyse dûment remplie par le clinicien.

3.3. Phase technique 3.3.1. Première journée

Elle a été consacrée à l'examen macroscopique, microscopique et à la mise en culture du culot de centrifugation.

3.3.1.1- Examen macroscopique

L'examen macroscopique a permis d'apprécier l'aspect, la couleur, la turbidité des échantillons de LCR.

3.3.1.2. Examen microscopique

Il comprend l’état frais et l'état coloré.

a) Etat frais : numération des leucocytes

Après une agitation douce du LCR, la numération des leucocytes est réalisée à l’aide de la cellule de Malassez. Le nombre total de leucocytes comptés est exprimé par mm³.

α) Technique

- recouvrir la cellule de Malassez de la lamelle ;

- homogénéiser correctement et soigneusement l’échantillon de LCR ;

- remplir la cellule de Malassez du LCR total à l’aide d’une micropipette ou d’une pipette Pasteur ;

- attendre la sédimentation environ 5 à 10min ;

- passer au microscope puis observer et effectuer le comptage à l’objectif X40 ; - compter les leucocytes dans les 10 bandes de l’hématimètre de Malassez ; - calcul du nombre de leucocytes :

Les 10 bandes correspondent à un volume de 1mm³.

Soit N= Nombre de leucocytes comptés dans les 10 bandes et Y= Nombre total de leucocytes.

Y = N x inverse du volume = N/mm³ de LCR.

Lorsque le nombre de leucocytes compté est supérieur à la normal, un frottis est réalisé à base du culot de centrifugation et colorée au May-Grünwald-Giemsa (Annexes 2) en vue d’établir la formule leucocytaire.

β) Technique de confection de frottis - centrifuger 1 ml de LCR à 3000 tours pendant 15 mn ; - rejeter le surnageant par simple retournement ;

- remettre en suspension le culot ;

- placer la pointe de la pipette Pasteur au contact du culot ; le culot passe dans la pipette par capillarité ;

- déposer sur deux lames (une goutte du culot par lame) ; - étaler la goutte avec une lame rodée ;

- laisser sécher à l’air ;

- fixer le frottis et passer à la coloration.

b)-État coloré

A partir de la suspension précédente, un frottis est réalisé et coloré par la méthode de Gram (Annexe1). Il permet d’apprécier la morphologie des bactéries ainsi que leurs Gram, leurs modes de regroupement et surtout l’intensité de l’infection. Ce qui permet de donner une orientation rapide sur la bactérie responsable de l’infection, le choix du milieu de culture et les conditions de culture de cette bactérie. L'observation de la lame après la coloration est faite au microscope à l'objectif X100.

c)- Culture

Pour la mise en culture, des milieux de culture spécifique ont été choisis et ensemencés avec une anse de platine.

Il s’agit de la gélose au sang frais additionnée à l’Acide Nalidixique Colistine, la gélose au sang cuit additionnée de 10% de polyvitex sous une atmosphère enrichie en CO2, la Gélose Chapman et la gélose Eosine Méthylène Bleu (EMB).Ces milieux sont observés après 18 h à 24h d’incubation à 37°C et conservés pour la suite du diagnostic.

3.4.2 .Deuxième journée

Elle a été consacrée à la lecture des milieux ensemencés, à l'examen contrôle et à l’isolement.

3.4.2.1 .Examen de contrôle de Gram

Après lecture des milieux de culture ensemencés, un examen contrôle a été réalisé. Pour ce faire, un frottis coloré au Gram à partir de chaque type de colonie a été effectué et observé au microscope à l’objectif à immersion.

3.4.2.2-Identification

L’identification des bacilles Gram négatif a été faite en utilisant la galerie de Leminor. Les métabolites produits durant la période d’incubation se traduisent par des changements de couleurs spontanées ou révélées par addition de réactifs.

 Technique d’ensemencement de la galerie Leminor

La galerie de Leminor est composée de cinq milieux à savoir : la gélose de Kligler Hajna, la gélose au citrate de Simmons, le bouillon mannitol-mobilité le bouillon urée-indole et l’eau peptonée exempte d’indole.

L’ensemencement a été réalisé de la manière suivante :

 Bouillon urée-indole

Une colonie bien isolée de la souche à tester a été sélectionnée. Une partie de cette colonie a été émulsionnée dans le bouillon urée-indole ;

 Gélose Kligler-Hajna

Elle a été ensemencée à partir du bouillon urée-indole ci-dessus, par un piquage central dans le culot et des stries serrées sur la pente ;

 Gélose Mannitol-Mobilité

Elle a été ensemencée par un piquage central à partir du bouillon urée-indole ;

 Eau peptonnée exempte d’indole

Elle a été ensemencée à partir du bouillon urée-indole et lu après ajout du réactif de Kovac’s;

 Gélose citrate de Simmons

Elle a été ensemencée avec la partie restante de la colonie utilisée pour ensemencer le bouillon urée-indole.

La galerie ainsi ensemencée a été incubée à 37°C pendant 24h.

3.4.4. Troisième journée

Elle est consacrée à la lecture de la galerie de Leminor puis la réalisation de l’antibiogramme.

3.4.4.1. Réalisation de l'antibiogramme

La méthode de l'antibiogramme par écouvillonnage est la technique utilisée pour notre étude. A partir d’une culture de 24h sur gélose, on prépare une suspension bactérienne (inoculum) à 0,5 Mc Farland en solution avec de l’eau physiologique stérile.

a)-Technique pour la préparation de la suspension bactérienne - disposer d’un tube à hémolyse contenant 2ml d’eau physiologique ; - sélectionner une colonie bien isolée de la souche à tester ;

- émulsionner une partie de cette colonie dans le tube à hémolyse contenant l’eau physiologique ;

- ajuster la turbidité de la suspension à 0,5 Mc Farland en ajoutant soit de l’eau physiologique en cas d’une concentration supérieurs, soit la partie restante de la colonie en cas d’une concentration inférieur ;

- diluer la suspension obtenue au dixième.

b)-Ensemencement

L’ensemencement a été réalisé sur la gélose Muller Hinton par la méthode d’écouvillonnage. L’écouvillonnage a été fait par stries serrées en tournant 3fois la boite de pétri d’un angle de 60°.

c)-Dépôt des disques

Des disques de papier buvard imprégnés des différents antibiotiques à tester ont été déposés à l’aide d’un pince stérile à la surface de la gélose à 2cm l’un de l’autre. La gélose est ensuite incubée à l’étuve à 37°C pendant 24h.

-Technique

- déposer les disques d'antibiogramme à plat sans glissement en les appuyant légèrement sur la surface de la gélose Mueller-Hinton ;

- une distance minimale de 15mm doit séparer un disque périphérique du bord de la boîte et deux disques doivent être éloignés au minimum de 30 mm de sorte que les zones d'inhibition ne se chevauchent ;

- laisser les disques s'imprégner pendant 15 minutes ; - Incuber à 37°C à l'étuve pendant 24 heures.

3.4.4. Quatrième journée

Elle a été consacrée à la lecture des antibiogrammes.

3.4.4.1- Lecture de l'antibiogramme et interprétation a)-Lecture

Mesurer les zones d'inhibition à l'aide d'une règle graduée. Les mesures obtenues sont comparées à celles figurant sur la fiche fournie par le fabricant afin de noter le profil de résistance de souches testées. Le diamètre de la zone d'inhibition nous permet de dire s'il y a résistance (R) ou sensibilité (S).

b)-Enregistrements et remise des résultats.

L’ECB étant une urgence médicale, les résultats du premier jour sont rendus au clinicien pour une orientation du diagnostic clinique en attente d’une éventuelle confirmation bactériologique après la culture.

CHAPITRE III-

RESULTATS ET COMMENTAIRES

1-RESULTATS

1.1-Caractéristiques sociodémographiques

Tableau I : Répartition des échantillons en fonction des services.

Services Effectifs

Pourcentage

Néonatologie 18

60%

Pédiatrie 12 40%

Total 30 100%

L’analyse de ce tableau révèle que 60% des échantillons proviennent de la néonatologie tandis que 40% proviennent de la pédiatrie.

Tableau II : Répartition des échantillons en fonction de l’âge au service de néonatologie

Tranche d’âges

(jours) Effectifs Pourcentage

[0-15[ 11 61,1%

[15-30[ 07

38,9%

Total 18

100%

L’analyse de ce tableau traduit que la majorité des échantillons soit 61,1%

proviennent des nouveau-nés de 0-15 jours d’âge.

Tableau III : Répartition des échantillons en fonction de l’âge au service de pédiatrie

Tranche d’âges

(ans) Effectifs Pourcentage

[1-5[ 07 58,3%

[5-10[ 03

25,0%

[10-15[ 02

16,7%

Total 12 100%

En pédiatrie, plus de la moitié des échantillons proviennent des enfants de moins de 5 ans soit 58,3 %.

Tableau IV : Répartition des échantillons en fonction du sexe

Sexe Effectifs Pourcentage

Masculin 11

36,7%

Féminin 19 63,3%

Total 30 100%

Ce tableau indique que la majorité des échantillons soit 63,3% proviennent des enfants de sexe féminin.

Tableau V : Enfants sous antibiothérapie avant la ponction du LCR

Il ressort de l’analyse de ce tableau que 30% des enfants étaient sous antibiothérapie avant le prélèvement.

Enfants sous

Antibiothérapie Effectifs

Pourcentage

OUI 09

30,0%

NON 21

70,0%

Total 30

100%

1.2. Examen macroscopique

Tableau VI : Aspect macroscopique des liquides de ponction lombaire

Aspect

Effectifs Pourcentage

LCR clair 18 60,0%

LCR jaune citrin 09 30,0%

LCR trouble

Total

03

30

10,0%

100%

Ce tableau traduisant une distribution de l’aspect du LCR indique que 60%

des échantillons avaient un aspect Clair et 10% un aspect trouble.

1.3. Examen microscopique

Tableau VII : Répartition des échantillons en fonction de la leucorachie

Leucorachie Effectifs

Pourcentage

≤ 20/mm³ 11 36,7%

20 – 50 /mm³ 16

53,3%

> 50/ mm³

Total

03

30

10%

100%

L’analyse de ce tableau révèle que 10% des échantillons ont une leucorachie très supérieur 50/mm ³.

Tableau VIII : Différents aspect macroscopique en fonction de la numération des leucocytes

Leucorachie Aspect

macroscopique Effectifs Pourcentage

≤ 20/mm³

Liquide clair

11

36,66%

Liquide clair

07

23,3%

20-50/mm³

Liquide jaune citrin

09

30,0%

> 50/mm³ Liquide

Trouble

03

10,0%

Total 30

100%

Après analyse de ce tableau, il ressort que 53,3% des échantillons contiennent un nombre de leucocytes compris entre 20-50 cellules/mm³ dont 23,3% présente un aspect clair et 30% un aspect jaune citrin. Tandis que dans 10%

des cas le nombre de leucocytes est supérieur à 50/mm³ avec un aspect trouble.

Tableau IX : Formule leucocytaire des frottis de LCR colorés au MGG.

PNN = Polynucléaire neutrophile

Il ressort de ce tableau que dans 68,4% des cas, la formule leucocytaire indique une prédominance de polynucléaire neutrophile. Tandis que, dans 31,5%

des cas, la formule leucocytaire indique un taux de neutrophile inférieur à 50%.

Formule leucocytaire Nombre de lames Pourcentage

50% PNN

50% Lymphocyte 00 00,0%

PNN supérieur à 50%

Lymphocyte Inférieur à 50%

13 68,4%

PNN inférieur à 50%

Lymphocyte supérieur à 50%

06 31,5%

Total 19 100%

1.4. Culture

Tableau X : Résultats issus de la culture

Culture Effectifs Pourcentage

Négative 27 90%

Positive 03

10%

Total 30 100%

Après la mise en culture des échantillons, 10% se sont avérés positive contre 90% qui sont négatives.

Tableau XI : Résultats de la culture en fonction de la leucorachie.

Leucorachie

Culture

Positive Négative

Total

≤ 20/mm3

00 11

(00,0%) (100%)

11

(100%)

20-50/mm³ > 50/mm3 00 16

(00,0%) (84,2%) 03 00

(15,78) (00,0%) 16

(100%)

03

(100%)

Total 03 27

(10%) (90%)

30

(100%) Le tableau ci-dessus nous montre que les échantillons ayant une leucorachie

> 50/mm³ soit 15,78% ont montré une culture positive.

Tableau XII : Différents bactéries isolées

Bactéries isolées Effectifs

Pourcentage

Salmonella spp 02

66,7%

Escherichia Coli 01

33,3%

Total 03 100%

Le tableau ci-dessus montre que 02 souches de Salmonella spp et 01 souche de E. coli ont été isolées de cette étude.

Tableau XIII: Profil de résistance des bactéries isolées

Bactéries isolées

Profil de résistances des souches

Salmonella spp

AMX^R-GEN^R-AUG^R-FOX^R-CRO^S-CIP^R-C^R

AMX^R-GEN^s-AUG^R-FOX^R-CRO^S-CIP^R-C^R

Escherichia coli NET^S-CXM^S-GEN^S-CIP^S-CEP^R-AMX^R-AMP^R

AMX=Amoxicilline ;GEN=Gentamycine ;AUG=Augmentin ;FOX=Céfoxitine ;CXM =Céfuroxime CRO=Ceftriaxone ;CIP=Ciprofloxacine ;C=Chloramphénicol ;NET =Netilmicine ; AMP= Ampicilline.

R : Résistant ; S : Sensible.

Toutes les souches de Salmonella spp présentent une résistance à plusieurs classes d’antibiotiques.

La souche de E.coli a présenté une sensibilité à plusieurs antibiotiques que sont: la gentamicine, la netilmicine, la ciprofloxacine et à la Céfuroxime.

2. COMMENTAIRE

Le présent travail a eu pour objectif général de contribuer à l’amélioration du diagnostic biologique des méningites bactériennes.

Pour ce faire, 30 échantillons de LCR reçus des services enfants ont été manipulés. Parmi ces échantillons, 60% provenaient de la néonatologie et 40% de la pédiatrie. Cela pourrait s’expliquer par le fait que le CHU-MEL où s’est déroulée notre étude est le centre de référence par excellence au Bénin qui s’occupe bien de santé des femmes, des enfants mais surtout de celle des nouveau- nés. Cette population d’étude est constituée en majorité des enfants de sexe féminin soit 63,3% contre 36,7% de sexe masculin soit un ratio de 1,72.

L’analyse des donnés a révélé que 36,7% des échantillons de LCR étudiés avait un aspect clair, une leucorachie normale et une culture négative. Ceci se justifie biologiquement par une absence d’inflammation des méninges entrainant une leucorachie normal et une absence d’infection du LCR.

23,3% des échantillons après analyse des résultats avaient présentés un aspect clair, une leucorachie comprise entre 20-50 leucocytes par mm³ et une culture négative. Une telle leucorachie pourrait signaler la présence d’une infection après culture. Tel n’a pas été le cas. Ceci pourrait s’expliquer d’une part par la mise sous antibiotique de ses enfants avant le prélèvement et d’autre part par la présence probable d’une méningite d’origine virale. Le même constat a été fait pour 30% d’échantillon présentant un aspect jaune citrin avec une telle numération leucocytaire.

Sur un total de 30 échantillons, 10% avait présenté un aspect trouble avec une leucorachie supérieur 50 cellules/mm³. La culture était positive donc signale la présence de bactéries. La formule leucocytaire avait également montré une prédominance des PNN par rapport aux lymphocytes. Ces cas se traduisent par la présence de méningite d’origine bactérienne.

Les bactéries isolées à la culture étaient des entérobactéries. Il s’agit de Salmonella spp et Escherichia coli. Ces entérobactéries, hôte normaux du tube digestif de l’homme ont été isolés dans les échantillons de LCR.

Ceci pourrait s’expliquer par le faite que lors de l’accouchement, ces bactéries ont été transmises de la mère à l’enfant par inhalation du liquide amniotique. Ceci pourrait également amener à penser que ces enfants souffraient d’une infection généralisée. En effet, pour causer l’infections, ces bactéries passe par transite et peuvent se retrouver dans le LCR compte tenu de la physiologie de l’organisme. La méningite à Salmonella cause une lourde mortalité. Une étude réalisée par Sangaré L. et al à Ouagadougou au Burkina-Faso en 2004 avait montré l’existence de méningites dues à Salmonella, avec un taux de mortalité supérieur à 30% [6].

Face aux antibiotiques, la souche de Salmonella spp a présenté une résistance au céfoxitine et à plusieurs autres classes d’antibiotiques. Ce qui se justifie par une probable production de bèta-lactamase. La souche d’Escherichia coli a présenté une sensibilité à plusieurs antibiotiques; il s’agit de la gentamicine, la netilmicine, la ciprofloxacine et de la céfuroxime.

CONCLUSION ET SUGGESTIONS

A l’issus du présent travail, il convient de retenir que la plupart des méningites bactériennes sont caractérisés par une leucorachie très significative.

Cependant, il est nécessaire d’explorer les cas de leucorachie supérieure à 20 cellules/mm³ avec une culture négative qui peuvent se traduire par des méningites d’origine virale. En ce qui concerne les méningites bactériennes, le traitement aux antibiotiques doit être toujours disponible et plus efficace afin de pouvoir lutter contre les souches résistantes.

Il parait nécessaire de faire quelques suggestions :

- doter le laboratoire des kits spécifiques pour l’examen indirect : recherche d’antigène soluble dans le LCR afin de mieux orienter le diagnostic même en cas d’antécédent d’antibiothérapie.

- rendre disponible une gamme importante des disques d’antibiotique afin de pourvoir aider le clinicien dans le choix d’antibiotique notamment pour les souches présentant une multi-résistance.

1-El Mahtal K., Apport de l’examen cytobactériologique de liquide céphalo- rachidien au diagnostic de la méningite bactérienne, Mémoire de fin de cycle de Licence en Sciences & Techniques : Biologie & Santé, FST/FES, 2014,48p.

2-Bonko M., Aspects Microbiologiques Des Méningites Bactériennes Aiguës dans la région sanitaire des hauts bassins à Bobo-Dioulasso, Burkina Faso, 2007-2008, Mémoire de fin de cycle pour l'obtention du Diplôme d'Etude Approfondie en Biologie Appliquée et Modélisation des Systèmes Biologiques, UPB, 2009,75p.

3- Tanfour I., Conduite à tenir devant un LCR (Liquide céphalo –rachidien) purulent, Mémoire Online, Algérie –Diplôme d’état el laboratoire, 2011,86p.

4- Institut de veille sanitaire (DIT), Méningite à méningocoque, Afrique sub- saharienne 22mars 2007, Tableau 1 ménin gites : nombre de cas, décès et létalité, par pays et semaines de notification, 2006(source OMS) ,1p.

5-Talhata M.H., étude cytobactériologique du liquide céphalo-rachidien à Bamako : 1415 cas, Mémoire de Thèse, Université de Bamako/Faculté de médecine, de pharmacie et d'ondonto - stomatologie, 2002,70p.

6- Sangare L., M. Kïenou, P. Lompo et al, Méningites dues à Salmonella au CHU de Ouagadougou, Burkina Faso (2000-2004), Manuscrit n° 2886 “Santé publique” 2006, p 53-55.

7- Adams B., Méningites infectieuse à liquide claire et méningites purulent de l’enfant, revue parisienne (Paris) 1994, p1253-1260.

8-El bashin H., Landry M., Booys R., Diagnostics and treatment of meningitis, Arch Dis child,2003,88:615-20.

REFERENCE BIBLIOGRPHIQUE

9- Babakhouya A., Ponction lombaire au milieu pédiatrie, Mémoire pour l’obtention du diplôme de pédiatre, Université SIDI Mohamed Benn ABDELLAH/Faculté de médicine et de pharmacies/FES, 2005, 60p.

10- Anonymes, Techniques de Laboratoire pour le Diagnostic des Méningites à Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae et HaemophilIus influenzae.

OMS, 2016, WHO/CDS/CSR/EDC/99.7.

11-Rémi M., Principales étapes de l’analyse d’un liquide céphalo-rachidien : LCR, Lycée Docteur Lacroix – Narbonne, 2007,1p.

12-Lorthior M., Richarde J., Beauvais P., et al la cytorrachie comme élément d’appréciation de l’évolution des méningites infantiles, Anales de pédiatrie, Paris, 1986, n°7, p595-602.

13-Société Française de Microbiologie, Examens cytochimique et

bactériologique du liquide céphalorachidien. In: Rémic 2é édition: par le groupe de la Société Française de Microbiologie (Ed).Référentiel en microbiologie médicale (bactériologie et mycologie), 2004, p 57-60.

14-Maazouzi I., Kasseni A., Diagnostique et traitement du MP aigüe, urgence médicale, Ed Kad, 1990, p269-270.

15-Amama H. Ami F. Mellouli F., Abdelkafis, les méningites purulente à propos de 251 cas âgées de 1 mois à 3ans au service de pédiatrie de Kaïroine, Revue Maghrébine de pédiatrie, vol VII, n°3, Mai -juin 1997, p139-147.

16-Marchal S., La méningite à méningocoque, Mémoire de thèse en pharmacie, Université Henri Poincare-nancy, France, 2006, 92p.

17-Sotto A., Méningite et méningo-encéphalites de l’adulte, Conférence de consensus 2008, Circulaire DGS/5C/2006/458. ECNn°96, février2010.

Annexe1 : Coloration de GRAM

*Technique

- recouvrir le frottis préalablement fixé du violet de Gentiane ; -laisser agir pendant une minute ;

-rincer à l'eau de robinet et écouter ;

-recouvrir le frottis de la solution de lugol ; -laisser agir 1 minute ;

-rincer à l'eau de robinet ;

-décolorer le frottis à l'alcool pendant une minute ; -laver à l'eau et écouter ;

-recouvrir le frottis à l'alcool pendant une minute ; -laver à l'eau et égoutter ;

-recouvrir le frottis de fuschine phéniquée ; -laisser agir pendant 20s ;

-laver à l'eau et égoutter ; -laisser sécher à l'air ;

-observer à l'objectif ×100 avec de l'huile à immersion.

Annexe 2: coloration de May-Grunwald-Giemsa (MGG).

Technique de coloration

*Technique

-tirer un frottis fin en se servant du culot issus de la centrifugation sur une lame à l’aide d’une lamelle ;

-laisser sécher le frottis ; -fixer le frottis ;

-passer à la coloration au MGG

ANNEXES

*Technique de coloration au MGG -recouvrir le frottis de colorant de May Grunwald ; - laisser agir 5 minutes

- rejeter le May Grunwald ;

- recouvrir le frottis de Giemsa dilué au 1/10ème ; - laisser agir 15 minutes ;

- rincer à l'eau jusqu'à ce que la différenciation soit complète: les lames seront colorées en rose ;

- laisser sécher ;

- lire à l'objectif 100 à immersion.

Résultats

-Les polynucléaires neutrophiles sont munis de noyaux bi ou multi lobés

-Les lymphocytes sont munis de gros noyau qui occupent presque toute la cellule.

Annexe 3 : Composition du violet de Gentiane

-Violet de Gentiane en poudre... 1g -Phénol... 2g -Alcool absolu...100ml Annexes 4: Composition du Lugol

-Iode... .. 1g -Iodure de Potassium... 2g -Eau distillée qsp... ... 200ml

Annexe 5: Composition de la Fuchsine

-Phénol... 5g -Alcool absolu... 10ml -Eau distillée... 100ml.

Annexe 6 : Préparation des milieux de culture

- Gélose au sang frais additionnée d'acide nadixilique et de colostine.

- Laisser refroidir à 45-50°C la gélose Columbia préalablement préparée;

- Ajouter 5% de sang de mouton défibriné stérile, le mélange ANC et poly vitex - Bien homogénéiser et couler en boite de Pétri;

 Gélose chocolat ou au sang cuit

- A partir de la gélose Columbia préalablement préparée, et non refroidie ajouter 5ml de sang de mouton à 5% et 5ml de sang de poly vitex

- Mélanger et couler en boîte de Pétri.

 Gélose Mueller Hinton

- Mettre 36 g de poudre dans un litre d'eau distillée ; - Porter à l'ébullition jusqu'à dissolution complète;

- Stériliser à l'autoclave à 121°C pendant 15 minutes et repartir en tubes ou flacon;

Annexes 7: Liste des antibiotiques utilisés au laboratoire du CHU-MEL.

Gentamycine...GEN Acide nalidixique... NA Erythromycine... E Ciprofloxacine... CIP Ampicilline... AMP Imipenène... IMI Ofloxacine... OFX Nétimicine... NET Augmentin………...AUG Ceftriaxone………...CRO

Annexe 8 : Fiche de collecte de données

Fiche N° ______________

Date : /__/__/ /__/__/ /__/__/__/__/

N o . R u b r i q u e s C o d e I d e n t i f i c a t i o n d u p a t i e n t

1. N o m Prén o m s

2. Age/__ __/Sexe /__/ Sujet sous ATB : oui=1 non=2 [ _ _ ] 3. P r o v e n a n c e : / _ _ / « N é o n a t o l o g i e o u p é d i a t r i e » = 1 E x t e r n e = 2 [ _ _ ]

A s p e c t m a c r o s c o p i q u e d u L C R

4. C o u l e u r d u L C R / _ _ / « C l a i r e a u d e r o c h e » = 1 , « J a u n e c i t r i n » = 2 , / _ _ / 5. A s p e c t d e s L C R / _ _ /c l a i r = 1 , t r o u b l e = 2 , L é g è r e m e n t t r o u b l e = 3

M i c r o s c o p i e : E t a t f r a i s

6. P r é s e n c e d e l e u c o c y t e s / _ _ / o u i / _ _ / N o n [ _ _ ] 7. Q u a n t i f i c a t i o n d e s l e u c o c y t e s : / _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ / [ _ _ ] 8. A p p r é c i a t i o n d e s l e u c o c yt e s : R a r e s / _ _ / q u e l q u e s / _ _ / n o m b r e u x [ _ _ ] 9. P r é s e n c e d e b a c t é r i e s / _ _ / o u i / _ _ / N o n [ _ _ ] 10. M o b i l i t é é v e n t u e l l e d e s b a c t é r i e s : / _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ / [ _ _ ] 11. P r é s e n c e d e p a r a s i t e s / _ _ / o u i / _ _ / N o n [ _ _ ] 12. P r é s e n c e d ’ a u t r e s é l é m e n t s / _ _ / o u i / _ _ / N o n [ _ _ ]

13. T y p e s d ’ é l é m e n t s _ _ _ _ _ _ [ _ _ ]

M i c r o s c o p i e : C o l o r a t i o n d e G R A M

14. C o l o r a t i o n d e G R A M : /_ _ / p o s i t i f /_ _ / C o c c i /_ _ /B a c i l l e [ _ _ ] 15. C o l o r a t i o n d e G R A M : /_ _ / n é g a t i f /_ _ / C o c c i /_ _ /B a c i l l e [ _ _ ]

C U L T U R E

16. P r é s e n c e d e g e r m e s / _ _ / o u i / _ _ / N o n [ _ _ ] 17. S i o u i : E s p è c e s _ _ _ _ _ _ _ _ ^{[ _ _ ]}

A N T I B I O G R A M M E

18. S e n s i b l e s ( S ) a u x a n t i b i o t i q u e s : [ _ _ ] 19. R é s i s t a n t s ( R ) a u x a n t i b i o t i q u e s : [ _ _ ] 20. I n t e r m é d i a i r e s ( I ) a u x a n t i b i o t i q u e s : [ _ _ ]