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Université Abou Bakr Belkaid-Tlemcen
Institut des sciences techniques appliquées (ISTA) Module : Outils analytiques de Microbiologie Enseignant (e) : Dr CHERIF ANTAR Asma L1/2019.20202
TP 6 : Examen microscopique des micro-organismes /L’état frais
Objectif :
*Utiliser le microscope optique et réaliser la mise au point ;
*Observation microscopique des micro-organismes à l’état frais.
Introduction :
L’observation microscopique permet de faire une étude morphologique des micro- organismes. Elle comprend :
I. Examen à l’état frais II. Examen après coloration 1. Définition :
1.1. Le microscope optique (photonique) :
Figure 3 : microscope optique
1. Les oculaires sont des loupes situées près de l'œil qui permettent de grossir l'image donnée par l'objectif (le grossissement est de 10).
2. Le porte-oculaires (ou tête binoculaire) permet la vision binoculaire.
3. Le porte-objectifs (ou revolver) permet d'amener l'objectif dans l'axe de la préparation.
4. Les objectifs sont des loupes sous forme de lentilles convergentes. Les grandissements figurent sur les objectifs : x 10, x 40, x 100. Le grossissement total du microscope est donné grâce à la formule suivante : Gt = grandissement de l'objectif x grossissement des oculaires. Ex : pour l’objectif x40, Gt = 40 x 10 = 400.
5. La potence est la partie rigide qui relie la platine aux oculaires.
6. La platine est la partie sur laquelle est posée la préparation : elle est évidée dans sa partie centrale afin de permettre le passage des rayons lumineux.
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7. Le chariot (ou porte objet) permet de déplacer la préparation.
8. Le condenseur permet de concentrer les rayons de la source lumineuse sur la préparation.
9. Le diaphragme permet de régler la quantité de lumière qui arrive sur la préparation à observer.
10. La source lumineuse éclaire la préparation.
11. Le socle est la partie sur laquelle repose le microscope : lourd, robuste et stable.
12/13. Les vis de mise au point : Les vis de commande du chariot permettent de déplacer la préparation. La vis de commande du condenseur permet de monter ou d'abaisser le condenseur. 12/ La vis macrométrique permet un mouvement rapide de grande amplitude, visible à l'œil nu, pour effectuer les réglages grossiers de la mise au point de l'image. 13/ La vis micrométrique permet un mouvement lent, précis, pour effectuer les réglages fins de la mise au point de l'image.
1.2. L’état frais : est l’examen microscopique des micro-organismes vivants. Ce type d’observation permet d’apprécier par le biais du microscope optique:
La mobilité des bactéries et leur morphologie ;
La morphologie des champignons : levures et moisissures.
1.3. La mobilité bacterienne : il existe deux types de mobilité (figure 2) :
La mobilité polaire : en zigzag qui peut être mono-triche (A), lopho-triche (B) ou amphi- triche (C)
La mobilité péritriche : mouvement assez fluide i.e tous les flagelles vont dans le même sens (D)
Figure 2 : mobilité bacterienne 2. Technique :
1. Etat frais des bactéries :
1.1. À partir d’une culture en milieu liquide :
Déposer sur une lame propre soit le contenu d’une anse de platine ou une petite goutte à l’aide d’une pipette Pasteur prélevé d’une culture jeune en bouillon ;
Recouvrir la goutte d’une lamelleen évitant d’enfermer des bulles d’air ;
Ne pas prolonger l’observation au-delà de 3 à 10 minutes ;
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Le liquide ne doit pas déborder (sinon jeter la lame et recommencer).
1.2. À partir d’une culture sur milieu solide :
Déposer une gouttelette de l’eau stérile sur la lame ;
Prélever une fraction de colonie sur le milieu de culture gélosé à l’anse de platine ;
Émulsionner très délicatement (afin de ne pas casser les flagelles) de façon à obtenir une suspension homogène ;
Recouvrir d’une lamelle en évitant d’enfermer des bulles d’air ;
Ne pas prolonger l’observation au-delà de 3 à 10 minutes ;
Le liquide ne doit pas déborder (sinon jeter la lame et recommencer).
1.3. L’observation :
Les bactéries sont considérées comme mobiles lorsque des trajets très différents sont observés (déplacement dans toutes les directions).
Une bactérie immobile est animée de mouvements d’agitation normaux qu’il ne faut pas confondre avec la mobilité :
Mouvements browniens : agitation moléculaire.
Mouvement liquidien : entraînent toutes les bactéries dans le même sens et à la même vitesse et ils peuvent apparaitre lors de la pose de la lamelle.
ATTENTION ! Une bactérie mobile peut apparaître immobile si les conditions de l’observation ne sont pas optimales :
Les flagelles ne doivent pas être cassés par la préparation ou détruit par un instrument trop chaud ;
La bactérie doit provenir d’une culture jeune ;
La température de l’incubation peut aussi avoir de l’influence : certaines bactéries immobiles à 37°C sont mobiles à 22°C (Yersinia, Hafnia par exemple).
Il est possible de confirmer la mobilité par l’ensemencement d’une gélose molle.
2. Observation des champignons :
2.1. Les moisissures : l’observation des moisissures est réalisée par la technique dite du scotch dans le bleu coton :
Déposer quelques gouttes de bleu coton sur une lame propre ;
Appliquer un ruban adhésif sur une culture de moisissure ;
Coller le ruban adhésif sur la lame ;
2.2. Les levures : elles s'observent entre lame et lamelle comme les bactéries.
Les observations se font à l'objectif 40, oculaire 10 en mettant la lumière au maximum mais en fermant le diaphragme ;
Après observation, jeter l’état frais dans un bac contenant un désinfectant à large spectre car les bactéries sont vivante.
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TP 7: Examen microscopique après coloration/Coloration simple
Objectifs :
Réaliser des frottis bactériens ;
Déterminer la morphologie des bacteries et leur mode de groupement après une coloration simple des frottis.
1-Introduction :
L’identification permet de mettre en évidence une ou plusieurs propriétés biochimiques d'une bactérie. Elle repose sur la morphologie, les caractères enzymatiques et biochimiques.
1. Caractères morphologiques :
Examen macroscopique des caractères culturaux
L’aspect des colonies dépend du milieu, de la durée et la température d’incubation. Il ne pourra être décrit convenablement qu’à partir des colonies bien isolées. La description des colonies doit mentionner plusieurs éléments:
La taille : petite, moyenne ou grande ;
La forme : bombée, plate, ombiliquée, à centre surélevé ;
L’aspect de la surface : lisse, rugueux, muqueux ;
L’opacité : opaque, translucide, transparent ;
La consistance : grasse, crémeuse, sèche, muqueuse ;
Pigmentation.
Examen microscopique après coloration simple :
L’examen après coloration permet d’observer des bactéries tuées fixées sur une lame et ayant subi l’action d’un ou plusieurs colorants. Les colorations, réalisées sur des frottis sèches et fixes, sont classées en :
Coloration simple (un seul colorant) : La coloration au bleu de méthylène peut apporter des informations concernant la morphologie des germes.
Coloration différentielle ou double type Gram ;
Colorations spéciales des structures bactériennes (capsules, spores….).
2-Matériel nécessaire :
Culture bacterienne, colorant simple (bleu de méthylène), microscope optique, lame microscopique, anse de platine, l’eau distillée et l’huile à immersion.
5 3-Mode opératoire :
1. Réalisation des frottis : les frottis doivent être étalés en couche mince et régulière, puis séchés et fixés :
1-Étalement sur lame de verre : notez la référence de l’échantillon sur une lame propres ;
2-Prélevez stérilement à l’aide d’une anse de platine une goutte de culture bactérienne et étalez un film mince,
2-Séchage : le séchage est effectué à l’aire libre jusqu’à ce que le frottis présente un aspect mat.
3-Fixation du frottis : consiste à tuer les bactéries et les coller sur la lame, sans altérer leur structure.
La fixation s’effectue par la chaleur :
2. Coloration simple : sur le frottis fixé et refroidi :
1-Faire couler la solution de bleu de méthylène jusqu'à ce que toute la lame soit recouverte.
2-Laisser agir 1 minute.
3-Rincer abondamment la lame l'eau du robinet jusqu'à élimination du colorant.
4-Sécher à l'air ou délicatement entre deux feuilles de papier filtre fin (ou buvard), sans frotter.
5-Examiner au microscope, objectif à immersion.
4-Résultats : les bactéries sont colorées en bleu sombre. Cette coloration est intéressante pour l'observation rapide des frottis mais elle permet seulement l'étude de la morphologie desbactéries.
La morphologie bacterienne :
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TP 8: Examen microscopique après coloration/Coloration différentielle
Objectifs :
Réaliser la coloration différentielle afin de classer les bactéries selon leur type de Gram 1-Introduction :
Les bactéries peuvent être groupées en 2 catégories selon la méthode de coloration de Gram (appelée également coloration double ou différentielle). Cette technique a été mise au point en 1884 par le bactériologiste Danois Hans Christian Gram. La répartition des bactéries en Gram+ ou Gram- (selon leur affinité aux solvants) est un critère systématique important pour leur classification. Elle donner également des indications sur leurs formes et leurs mode de groupement.
2-Mode opératoire :
1- Réaliser un frottis bactérien.
2- Recouvrir le frottis de la solution de cristal violet, laisser agir 1 minute ; 3- Rincer à l'eau ;
4- Recouvrir la préparation de Lugol, Laisser agir 1 minute ; 5- Rincer à l'eau ;
6- Décolorer à l'alcool 95°, laisser agir 30 sec ; 7- Rincer à l'eau courante ;
8- Recouvrir la lame de la solution de Fuchsine, laisser agir 1 minute ;
9- Rincer abondamment à l'eau, égouttée, sécher entre deux feuilles de papier buvard très propres.
10- Observation au grossissement 100 avec une goutte d’huile à immersion.
3-Résultats :
A l’issue de cette coloration, on peut distinguer :
-Des bactéries colorées en violet foncé : elles sont dites à Gram positif ; - Des bactéries colorées en rose : elles sont dites à Gram négatif.
4-Explication :
1-Le violet de gentiane colore le cytoplasme des bactéries.
2- Le Lugol permet de fixer cette coloration interne.
3- L'alcool sert à décolorer le cytoplasme des bactéries à Gram négatif : elles ont une paroi pauvre en peptidoglycanes (donc plus fine) qui va laisser passer l'alcool (molécule hydrophile), et qui décolorera le cytoplasme. Pour les bactéries à Gram positif, la paroi constitue une barrière imperméable à l'alcool car elle est composée d'une couche importante de peptidoglycanes (donc plus épaisse). Elles resteront alors de couleur violette.
4- La recoloration à la Fushine ou la contre-coloration ayant pour but de donner aux bactéries à Gram négatif décolorées une teinte rose permettant leur visualisation au microscope.
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Figure : Paroi des bactéries à Gram positif et à Gram négatif