Modélisation de système synthétique pour la production de biohydrogène

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de biohydrogène

Nicolas Fontaine

To cite this version:

Nicolas Fontaine. Modélisation de système synthétique pour la production de biohydrogène. Bio-

Informatique, Biologie Systémique [q-bio.QM]. Université de la Réunion, 2015. Français. �NNT :

2015LARE0016�. �tel-01374738�

pour l'obtention du Doctorat en Sciences spécialité Biologie Informatique

par

Nicolas Fontaine

Modélisation de système synthétique pour la production de biohydrogène

Rapporteurs :

Christine Sinoquet Maître de Conférences HDR, Université de Nantes Jean-Loup Faulon Directeur de Recherche, Université d'Evry Val d'Essone

Examinateurs :

Frédéric Cadet Professeur, Université de la Réunion

Directeurs de thèse :

Brigitte Grondin-Pérez Professeur, Université de la Réunion Directeur Bernard Offmann Professeur, Université de Nantes Co-Directeur

Le 28 septembre 2015

∆G _r Enthalpie libre d’une r´ eaction

∆G _c Enthalpie libre d’un compos´ e λ Constante enzymatique de d´ egradation

E0 Concentration initiale d’une enzyme

BES Bio Electrical System, syst` eme bio´ electrique kcat Constante enzymatique d’activi´ e

Km Constante enzymatique d’affinit´ e

MEC Microbial Electrolysis Cell, cellule d’´ electrolyse microbienne MFC Microbial Fuel Cell, pile ` a combustible ` a microbes

N ° EC Enzyme Commission number PHB Polyhydroxybutyrate

PNS Purple Non Sulfur bacteria, bact´ eries pourpres non-sulfureuses RMSE Root-Mean-Square Error

R2 Coefficient de d´ etermination

SAB Syst` eme acellulaire de Biotransformation

SBML Systems Biology Markup Language, Hucka et al. (2003)

TTN Total Turn-over Number

Table des mati` eres v

1 Introduction 1

1.1 Introduction sur la production de biohydrog` ene . . . . 2

1.1.1 Hydrog` ene et biofuels . . . . 2

1.1.2 Biohydrog` ene . . . . 4

1.2 Hydrog` ene et enzymes . . . . 5

1.2.1 Les hydrog´ enases . . . . 5

1.2.2 Les nitrog´ enase . . . . 7

1.3 Biohydrog` ene ` a partir de voies m´ etaboliques . . . . 8

1.3.1 Biophotolyse . . . . 8

1.3.2 Photofermentation . . . . 12

1.3.3 Dark fermentation . . . . 14

1.4 Hydrog` ene biologique issu de proc´ ed´ es artificiels . . . . 17

1.4.1 Les syst` emes bio´ electriques (BES) . . . . 17

1.4.2 Les syst` emes artificiels de biotransformation acellulaire . . . . 17

1.4.3 Int´ egration de syst` emes . . . . 20

1.5 L’accessibilit´ e ` a l’hydrog` ene . . . . 23

1.5.1 G´ en´ eralit´ es ´ economiques sur le biohydrog` ene . . . . 23

1.5.2 Point sur les syst` emes acellulaires . . . . 24

1.6 Etudes de syst` ´ emes m´ etaboliques via des m´ ethodes in silico . . . . 26

1.6.1 Mod´ elisation analytique . . . . 26

1.6.2 Mod´ elisation syst´ emique . . . . 32

1.7 Objectifs de la th` ese . . . . 37

2 Mod´ elisation analytique d’un syst` eme acelluaire de biotransformation de

polysaccharide en hydrog` ene 39

2.1 Mod´ elisation dynamique du syst` eme enzymatique . . . . 40

2.1.1 Identification des ´ el´ ements biochimiques du r´ eseau . . . . 40

2.1.2 Identification d’un mod` ele dynamique . . . . 44

2.1.3 Validation du mod` ele . . . . 50

2.2 Optimisation in silico du syst` eme enzymatique . . . . 53

2.2.1 Optimisation : choix du syst` eme et des param` etres ` a modifier . . . . 53

2.2.2 Optimisation : fonctionnement et strat´ egie employ´ ee . . . . 55

2.2.3 R´ esultats . . . . 57

2.2.4 D´ etermination des param` etres cin´ etiques de mutants . . . . 68

3 Mod´ elisation syst´ emique d’un syst` eme acelluaire de biotransformation de polysaccharide en hydrog` ene 79 3.1 Contexte . . . . 80

3.2 M´ ethodes . . . . 81

3.2.1 Elaboration de la base d’apprentissage ´ . . . . 81

3.2.2 Normalisation . . . . 83

3.2.3 Les variables de sorties . . . . 84

3.2.4 Base de validation . . . . 84

3.2.5 Identification de mod` ele de type r´ eseau de neurones . . . . 84

3.2.6 Les crit` eres de performances . . . . 85

3.3 R´ esultats . . . . 87

3.3.1 Mod´ elisation de la pente . . . . 87

3.3.2 Mod´ elisation du plateau . . . . 89

3.4 Base minimaliste . . . . 92

3.4.1 Mod´ elisation de la pente . . . . 93

3.4.2 Mod´ elisation du plateau . . . . 100

4 Reconstruction et simulation de voies synth´ etiques 107 4.1 Contexte et objectif . . . . 108

4.2 Architecture du workflow . . . . 110

4.3 Pr´ erequis pour la reconstruction de voies synth´ etiques . . . . 111

4.3.1 Base de donn´ ees m´ etaboliques . . . . 111

4.3.2 Repr´ esentation de r´ eseaux m´ etabolique sous forme de graphe . . . . . 113

4.4 Le fonctionnement du workflow . . . . 114

4.4.1 D´ etermination d’un r´ eseau m´ etabolique d´ edi´ e ` a la production du pro- duit final . . . . 114

4.4.2 Enum´ eration de voies m´ etaboliques . . . . 116

4.4.3 Classification de voies m´ etaboliques . . . . 118

4.4.4 Mod´ elisation de voies synth´ etiques . . . . 121 4.5 Discussion . . . . 122

5 Conclusions et perspectives 125

5.1 Diff´ erentes mod´ elisations de syst` emes acellullaires de biotransformation . . . 126 5.2 Optimisation de syst` emes acellullaires de biotransformation . . . . 127 5.3 Reconstruction et simulation automatique de syst` emes acellullaires de bio-

transformation . . . . 129

Liste des tableaux 131

Table des figures 135

Bibliographie 139

Introduction bibliographique de la

th` ese

1.1 Introduction sur la production de biohydrog` ene

1.1.1 Hydrog` ene et biofuels

Apr` es des ann´ ees d’exploitation intensive, les ressources fossiles se tarissent et se rar´ efient.

Ce ph´ enom` ene engendre de nombreux probl` emes au niveau de l’´ economie, de la soci´ et´ e et pose la question sur l’approvisionnement en ´ energie dans le futur.

Cette utilisation massive des ´ energies fossiles a g´ en´ er´ e des ´ emissions en CO ₂ importantes avec des cons´ equences n´ efastes sur l’environnement de la plan` ete et sur la sant´ e de la population.

Cet autre probl` eme doit ˆ etre pris en compte pour la g´ en´ eration de nouvelles sources d’´ energies.

En effet depuis plusieurs ann´ ees, de nombreux travaux ont ´ et´ e r´ ealis´ es pour l’´ elaboration de nouveaux carburant alternatifs respectant l’environnement et capable de suppl´ eer ou de sub- stituer les carburants fossiles.

L’hydrog` ene est un des candidats aux sources alternatives d’´ energie. Il a ´ et´ e mis en ´ evidence dans sa forme gazeuse par le chimiste britannique Henry Cavendish en 1766 qui l’a d´ esign´ e sous l’expression

air inflammable

. Apr` es diverses manipulations Cavendish a montr´ e que la combustion de ce gaz engendre de l’eau. En 1781, le chimiste fran¸cais Antoine Lavoisier a nomm´ e ce gaz

hydrog` ene

suite ` a la combinaison du pr´ efixe grec

hydro

signifiant eau et du suffixe grec

g` ene

signifiant engendrer. L’hydrog` ene en tant que vecteur d’´ energie est en fait un gaz constitu´ e de deux atomes d’hydrog` ene H ₂ . Bien qu’il faudrait appel´ e ce gaz

dihydrog` ene

, il se fait couramment d´ esign´ e par le simple terme

hydrog` ene

.

Ce gaz poss` ede de nombreuses caract´ eristiques int´ eressantes au niveau de l’´ energie. Son uti- lisation dans un moteur ` a combustion adapt´ e demeure propre, elle relˆ ache de l’eau dans l’environnement. Elle poss` ede aussi une forte densit´ e ´ energ´ etique soit 142.35 kJ.g-1, soit approximativement trois fois plus que la valeur issue des carburants classiques actuels. L’hy- drog` ene peut ˆ etre aussi utilis´ e dans des piles ` a combustible pour la production d’´ electricit´ e.

Son taux de conversion en ´ electricit´ e est deux fois plus important que la source utilis´ e dans les proc´ ed´ es thermiques classiques. Cependant, l’hydrog` ene pose plusieurs probl` emes de sto- ckage et de transport. Suite ` a sa faible densit´ e, il doit ˆ etre stocker sous haute pression pour optimiser le volume de stockage. Malgr´ e cette pressurisation le stockage d’hydrog` ene occupe un plus grand volume que le stockage de carburant fossile. Ainsi ` a ´ energie ´ egale, un volume d’hydrog` ene est trente fois sup´ erieure ` a un volume de gasoil. Un autre probl` eme demeure au niveau de la s´ ecurit´ e et de la manutention ; l’hydrog` ene est un gaz tr` es inflammable n´ ecessitant une manipulation avec pr´ ecaution.

Actuellement, l’hydrog` ene est couramment utilis´ e dans l’industrie en dehors du contexte

´

energ´ etique. Il permet la production d’ammoniac, de m´ ethanol et le raffinage dans les sta-

tions de production d’hydrocarbure. L’hydrog` ene sous forme gazeuse est peu pr´ esent dans notre environnement. Il est en effet mal retenu dans l’atmosph` ere et subsiste ` a l’´ etat de trace (environ 0,5 ppm). Les industries ont acc` es ` a une source artificiel d’hydrog` ene produite grˆ ace ` a des proc´ ed´ es bas´ ees sur des m´ ecanismes thermodynamiques utilisant gaz naturels, charbon ou p´ etrole. Ces proc´ ed´ es requi` erent une consommation cons´ equente d’´ energie fos- sile afin d’atteindre des temp´ eratures ´ elev´ ees. Une production de CO ₂ et d’autres polluants viennent s’ajouter ` a cette production. Ainsi bien que l’hydrog` ene soit un candidat potentiel comme sources d’´ energie alternative, sa production actuelle est bas´ ee sur une consommation de ressources fossiles p´ erissables et source de pollution.

Figure 1.1: Les principales sources actuelles de production d’hydrog` ene (d’apr` es IFP EN,

2011). Les ressources fossiles comme le gaz naturel(47%), les hydrocarbures (30%) et le

charbon (18%) sont ` a l’origine de 95% de la production globale d’hydrog` ene.

1.1.2 Biohydrog` ene

Pour r´ epondre ` a ce probl` eme, une s´ erie de travaux a ´ et´ e initi´ ee afin de d´ evelopper des proc´ ed´ es de production d’hydrog` ene ne n´ ecessitant pas de ressources fossiles et respectueux de l’envi- ronnement.

Une des r´ eponses est l’utilisation de proc´ ed´ es biologiques. Le biohydrog` ene est l’hydrog` ene issu de ces proc´ ed´ es biologiques. L’approche biologique consiste ` a d´ eterminer l’existence et ` a

´

etudier les m´ ecanismes de production de biohydrog` ene au sein du vivant, puis de s’y inspirer pour construire un processus industriel.

Pour survivre dans son environnement, un organisme doit ˆ etre capable d’extraire de son mi- lieu des ressources naturelles, qu’il peut transformer pour synth´ etiser l’ensemble des ´ el´ ements n´ ecessaire ` a son maintien. Le m´ etabolisme d’un organisme est l’ensemble des r´ eactions phy- sicochimiques participant ` a la survie, qui englobe la synth` ese d’´ el´ ement. Les enzymes sont les ´ el´ ements cl´ es des r´ eactions biochimiques. Les enzymes sont essentiellement des prot´ eines avec un rˆ ole de catalyseur facilitant les r´ eactions biochimiques par l’abaissement du seuil de l’´ energie d’activation. Elles augmentent ainsi la vitesse de r´ eaction, sans modifier l’´ equilibre.

Sans leur pr´ esence, ces r´ eactions sont impossibles ou tr` es lentes dans les conditions internes de l’organisme.Une enzyme est con¸cue pour catalyser un type de r´ eaction. Elle transforme un type de substrat sp´ ecifique en un type de produit. Chaque famille d’enzyme est d´ edi´ ee ` a un type de r´ eaction.

Au sein du vivant, il a ´ et´ e observ´ e des microorganismes poss´ edant un m´ etabolisme capable de synth´ etiser de l’hydrog` ene. Trois voies m´ etaboliques de production d’hydrog` ene ont ´ et´ e mises en ´ evidence ` a partir de ces entit´ es biologiques (figure 1.2) :

ˆ la biophotolyse se d´ eroule dans les microalgues et permet la d´ ecomposition de l’eau via l’´ energie lumineuse pour g´ en´ erer de l’hydrog` ene

ˆ la photofermentation n´ ecessite aussi la lumi` ere donnant lieu chez les bact´ eries pourpres non sulfureuses pour une d´ ecomposition d’acides organiques pour g´ en´ erer l’hydrog` ene

ˆ la

dark fermentation

s’effectue ` a l’obscurit´ e chez les prot´ eobact´ eries o` u des poly- saccharides servent de substrat de d´ epart afin de produire l’hydrog` ene.

Ces diff´ erentes voies regroupent un ensemble d’enzymes pour permettre la production d’hy-

drog` ene via une cascade de r´ eactions diff´ erentes.Elles poss` edent n´ eanmoins toutes un mˆ eme

type de r´ eaction qui permet la synth` ese directe d’hydrog` ene par l’action d’une famille enzy-

matique pr´ ecise et couramment appel´ ee les hydrog´ enases.

Figure 1.2: Les diff´ erents m´ ecanismes de production de l’hydrog` ene au sein de diff´ erents microorganismes. la biophotolyse et la photofermentation n´ ecessitent la pr´ esence de lumi` ere et se d´ eroulent respectivement dans les microalgues et les bact´ eries pourpres non sulfeureuses.

La dark fermentation est localis´ ee dans un grand nombre de prot´ eobact´ eries pouvant vivre en ana´ erobie partiel ou total.

1.2 Hydrog` ene et enzymes

Cette famille enzymatique regroupe en fait deux types d’enzymes :

ˆ les hydrog´ enases

ˆ et les nitrog´ enases

Le m´ ecanisme de l’enzyme repose sur un ´ echange d’´ electrons entre r´ eactifs pour g´ en´ erer une mol´ ecule H ₂ ` a partir de 2 protons H <sup>+</sup> . Les voies de production d’hydrog` ene utilisent diff´ erentes enzymes afin de d´ ecomposer leur substrat de d´ epart et g´ en´ erer un gradient de concentration d’´ electrons qui alimentera une hydrog´ enase ou une nitrog´ enase.

Ces types d’enzymes poss` edent des propri´ et´ es particuli` eres.

1.2.1 Les hydrog´ enases

Les hydrog´ enases permettent la r´ eduction de protons lors de la formation d’hydrog` ene ou

l’oxydation de mol´ ecules H ₂ lors de consommation d’hydrog` ene.

H ₂ ←−→ 2 H ⁺ + 2 e ^–

De multiples formes d’hydrog´ enases ont ´ et´ e mises en ´ evidence pour un large panel de mi- croorganismes. La majorit´ e de ces organismes sont des procaryotes. Mais il existe un nombre cons´ equent de formes chez les eucaryotes, chez les algues photosynth´ etiques plus pr´ ecis´ ement.

Malgr´ e cette h´ et´ erog´ en´ eit´ e, toutes les hydrog´ enases pr´ esentent un complexe m´ etallique au ni- veau de leur site actif. Selon la nature du complexe m´ etallique pr´ esent, les hydrog´ enases sont regroup´ ees en trois classes (Meyer (2007)) :

ˆ les [NiFe]-hydrog´ enases,

ˆ les [FeFe]-hydrog´ enases,

ˆ et les [Fe]-hydrog´ enases.

Les [NiFe]-hydrog´ enases constituent le groupe le plus ´ etendu. Les [FeFe]-hydrog´ enases sont

plus sujets ` a l’inhibition via l’oxyg` ene mais ils sont 100 fois plus actifs que les [NiFe]-

hydrog´ enase. Ces deux types d’hydrog´ enase poss` edent un centre actif compos´ e d’un clus-

ter fer-souffre, Fe-S, coordonn´ ees par des ligands carbonyle(CO) ou cyanide(CN-). Les [Fe]-

hydrog´ enases ne poss` edent pas ce cluster Fe-S et ne peuvent pas catalyser la r´ eaction redox

r´ eversible H ₂ ←−→ 2 H ⁺ + 2 e ^– . Elles sont moins abondantes et se trouvent uniquement dans

des arch´ eobact´ eries m´ ethanog` enes hydrog´ enotrophes.

1.2.2 Les nitrog´ enase

Les nitrog´ enases sont essentiellement rencontr´ ees chez les bact´ eries pourpres non sulfureuses et dans les h´ et´ erocystes des cyanobact´ eries dans la production de l’hydrog` ene via la lumi` ere (Meyer (1978)). Les nitrog´ enases sont essentielles pour constituer les r´ eserves azot´ ees de leur hˆ ote par la fixation de l’azote, N ₂ , ambiant. Comme les hydrog´ enases, diff´ erentes classes de nitrog´ enases existent selon la nature du complexe m´ etallique pr´ esent au site actif :

ˆ les [MoFe]-nitrog´ enase

ˆ les [VaFe]-nitrog´ enase

ˆ les [FeFe]-nitrog´ enase

La [MoFe]-nitrog´ enase est la mieux d´ ecrite. Elle peut fixer l’azote, N ₂ , via la r´ eaction sui- vante : N ₂ + 8 H ⁺ + 8 e ^–+ 16 ATP −−→ 2 NH ₃ ⁺ H ₂ + 16 ADP

La nitrog´ enase produit de l’hydrog` ene durant la fixation de l’azote. En absence d’azote et en pr´ esence d’une source importante d’ATP, la nitrog´ enase produit des quantit´ es plus impor- tantes d’hydrog` ene (Koku (2002)) :

8 H ⁺ + 8 e ^– 4 ATP −−→ 4 H ₂ + 4 ADP

Les nitrog´ enases agissent comme des verrous de r´ egulation du potentiel r´ eductif de la cellule (Kars (2010)). La pr´ esence d’azote est un inhibiteur de la production d’hydrog` ene. Pour des concentrations sup´ erieures ` a 20 µmol, la nitrog´ enase est en mode de fixation de l’azote (Wa- lig´ orska et al. (2009)). Une diminution de la concentration d’azote inverse le processus, et oriente la nitrog´ enase vers le mode de production d’hydrog` ene uniquement.

Propri´ et´ es Nitrog´ enase Hydrog´ enase

Substrats ATP, H ⁺ , N ₂ , ´ electron H ₂ , H ⁺

Produits H ₂ , NH ₄ ⁺ ATP, H ⁺ , N ₂ , ´ electron

Structure de prot´ eines Dim` ere monom` ere

Complexe m´ etallique Mo, Fe Ni, Fe, S

Temp´ erature optimale 30 ° C (A.vinelandii ) 55 ° C (R.rubrum), 70 ° C (R.capsulatus) pH optimum 7.1 -7.3 (A.vinelandii ) 6.5(R. sulfidophilus)

Inhibiteur N ₂ , NH ₄ ⁺ ,O ₂ CO, O ₂ , EDTA, pr´ esence d’acides organiques

Table 1.1: Comparaison entre les nitrog´ enases et les hydrog´ enases ( d’apr` es Ni et al. (2006),

et Lin et al. (2005))

1.3 Biohydrog` ene ` a partir de voies m´ etaboliques

Comme ´ enonc´ e pr´ ecedemment, il existe 3 grandes voies m´ etaboliques associ´ ees ` a l’hydrog` ene.

Toutes ces voies d´ ecomposent un substrat initial pour g´ en´ erer un gradient de concentration d’´ electrons n´ ecessaire au fonctionnement d’une hydrog´ enase ou d’une nitrog´ enase. Ces 3 voies sont :

ˆ la biophotolyse,

ˆ la photofermentation,

ˆ et la dark fermentation.

L’int´ egration de microoganismes effectuant une de ces voies m´ etaboliques dans un proc´ ed´ e de production est un sch´ ema classique pour produire du biohydrog` ene.

1.3.1 Biophotolyse

La biophotolyse se d´ eroule chez les algues vertes et les cyanobact´ eries avec quelques diff´ erences entre ces deux organimes (Yu and Takahashi (2007), Oh et al. (2011) Ananyev et al. (2012)).

Les algues vertes poss` ede une [FeFe]-hydrog´ enase ayant une forte activit´ e sp´ ecifique mais une inhibition tr` es forte par l’O ₂ . Les cyanobact´ eries comporte pr´ eferentiellement une [NiFe]- hydrog´ enase beaucoup moins sensible ` a l’O <sub>2</sub> mais moins active pour la production d’hy- drog` ene. Les cyanobact´ eries peuvent d´ eployer aussi une nitrog´ enase dans un h´ et´ erocyte. Un h´ et´ erocyte est une cyanobact´ erie sp´ ecialis´ ee pour la fixation de l’azote. Elle poss` ede une paroi plus ´ epaisse qu’une cyanobact´ erie normale, permettant de limiter l’entr´ ee d’O ₂ dans la cellule et d’empˆ echer une ´ eventuelle inhibition de la nitrog´ enase.

La biophotolyse consiste ` a d´ ecomposer l’eau en pr´ esence de lumi` ere afin de g´ en´ erer de l’O ₂

et H ₂ . Le principal int´ erˆ et de cette voie m´ etabolique est l’utilisation de substrats de d´ epart

tr` es accessible, l’eau et la lumi` ere. La culture d’algues peut ˆ etre aussi associ´ ee ` a la fixation

du CO ₂ par la photosynth` ese, et ` a la production de compos´ es utiles comme des huiles, des

compl´ ements nutritionnels, du bioplastique. La biophotolyse et la photosynth` ese utilisent la

mˆ eme structure cellulaire de capture de lumi` ere, compos´ ee des photosyt` emes I (PS I) et

II(PS II). PS I et PS II absorbent les photons lumineux afin de g´ en´ erer un pouvoir oxydant

capable d’oxyder l’eau. L’oxydation de l’eau produit des protons, une source d’´ electrons via

des compos´ es r´ eduits, et de l’O ₂ (1.3). PS I et PS II absorbent pr´ ef´ erentiellement la lumi` ere

dans les longueurs d’ondes respectives de 700nm et 680 nm. La photosynth` ese utilise le gra-

dient de concentration d’´ electrons pour l’accumulation de polysaccharide dans la cellule. La

biophotolyse dirige ce pouvoir oxydant vers l’hydrog` enase pour la synth` ese d’hydrog` ene. La

Figure 1.3: Sch´ ema adapt´ e de Yu and Takahashi (2007). M´ ecanismes de la photosynth` ese et de la biophotolyse chez les microorganismes photoautotrophes. L’excitation des photo- syst` emes I et II (PS I et PS II) par la lumi` ere permet de d´ ecomposer l’eau et d’augmenter le taux d’´ electrons g´ en´ erant un flux dans la cellule. Ce flux d’´ electrons peut ˆ etre dirig´ e vers la photosynth` ese o` u des voies m´ etaboliques comme le cycle de Calvin pour fournir la cellule en r´ eserve carbon´ e. La biophotolyse est l’autre destination de ce flux pour la formation de l’hydrog` ene au niveau d’une hydrog´ enase. La photosynth` ese et la biophotolyse se d´ eroulent en parall` ele, selon ses besoins la cellule favorisera une voie plutˆ ot qu’une autre. Un cer- tain nombre de r´ eactions permettent aussi de passer de l’une ` a l’autre par l’utilisation des r´ eserves carbon´ ees de la photosynth` ese pour g´ en´ erer de l’hydrog` ene ou par la consommation de d’hydrog` ene pour g´ en´ erer des r´ eserves carbon´ ees.

biophotolyse poss` ede deux modes : direct et indirect. Le mode direct (figure 1.4) produit de l’hydrog` ene directement durant la phase d’absorption de la lumi` ere.

Le mode indirect (figure 1.5) est d´ ecoup´ e en deux phases. Dans la premi` ere, les photo-

syst` emes absorbent de la lumi` ere afin de g´ en´ erer une source de polysaccharide endog` ene via

la photosynth` ese. La deuxi` eme phase se d´ eroule en absence de lumi` ere ; la source de polysac-

charide est d´ ecompos´ ee par fermentation afin d’alimenter l’hydrog´ enase avec un gradient de

concentration d’´ electrons et de synth´ etiser l’hydrog` ene.

Figure 1.4: Biophotolyse classique se d´ eroulant en pr´ esence de lumi` ere conjointement avec la photosynth` ese.

Figure 1.5: Biophotolyse d’une absence de lumi` ere. En pr´ esence de lumi` ere, seul la photo- synth` ese est active pour g´ en´ erer des r´ eserves de carbone. En absence de lumi` ere, ces r´ eserves sont utilis´ ees pour alimenter la production d’hydrog` ene.

Malgr´ e une production d’hydrog` ene avec des substrats de d´ epart simples, la biophotolyse soul` eve plusieurs probl` emes constituant un frein ` a son utilisation ` a l’´ echelle industrielle. Les principaux d´ efauts sont :

ˆ la sensibilit´ e des hydrog´ enases face ` a O ₂ ,

ˆ et la faible efficacit´ e de la conversion de la lumi` ere en compos´ e biologique, soit l’efficacit´ e photosynth´ etique.

En pr´ esence d’O ₂ , l’hydrog´ enase est fortement inhib´ ee. La biophotolyse peut se d´ erouler en

ana´ erobie pour ´ eviter l’apport de l’O ₂ externe. Cependant la biophotolyse g´ en` ere durant son processus de l’O <sub>2</sub> et inhibe elle-mˆ eme son hydrog´ enase. Des travaux ont tent´ e de produire des hydrog´ enases plus r´ esistantes ` a l’inhibition par isolement de nouvelles enzymes issues d’organismes divers ou ing´ enierie prot´ eique et g´ en´ eration d’une banque de mutants (Lieb- gott et al. (2010), Wu et al. (2011), Rousset et al. (2008), Cohen et al. (2005)). Une autre approche consiste ` a utiliser pr´ ef´ erentiellement des [NiFe]-hydrog´ enase moins sensibles ` a l’O ₂ et d’augmenter leur activit´ e. Une autre solution est de s´ eparer l’activit´ e de l’hydrog´ enase de la production d’O ₂ durant la conversion par la lumi` ere. Plusieurs m´ ethodes ont ´ et´ e test´ ees telles que la s´ eparation spatiale, l’immobilisation des chloroplastes, des consommateurs d’O <sub>2</sub> et la purge de gaz. Ces m´ ethodes ont eu peu de r´ esultats. L’utilisation de la biophoto- lyse indirecte repr´ esente un meilleur choix pour cette solution de s´ eparation. En absence de lumi` ere, la production d’hydrog` ene peut s’effectuer via la source endog` ene de polysaccharide et sans activit´ e li´ ee ` a la lumi` ere g´ en´ erant l’O ₂ . L’utilisation pr´ ef´ erentielle des h´ et´ erocytes de cyanobact´ eries est aussi une solution (Yu and Takahashi (2007), voir figure 1.6). Les cyano- bact´ eries ont la particularit´ e de vivre en colonie, sous forme de filaments de cellules normales avec quelques h´ et´ erocytes, en quantit´ e plus ou moins variable selon les conditions ext´ erieures.

Etant ´ etanche ` a l’O <sub>2</sub> , les h´ et´ erocytes prot` egent la nitrog´ enase de l’inhibition par l’O ₂ . Ainsi la phase de conversion de la lumi` ere se d´ eroule dans une cyanobact´ erie normale et g´ en` ere une source de polysaccharide. Ensuite, cette source est transport´ ee vers un h´ et´ erocyte pour g´ en´ erer de l’hydrog` ene via la nitrog´ enase. Un environnement pauvre en azote et riche en carbone favorisera d’autant plus la nitrog´ enase. L’efficacit´ e de la conversion de la lumi` ere

Figure 1.6: Production d’hydrog` ene par une nitrog´ enase au sein d’un h´ et´ erocyte, d’apr` es Yu and Takahashi (2007) . La g´ en´ eration d’oxyg` ene et synth` ese d’hydrog` ene s’effectuent dans deux cellules distinctes. La cellule de gauche sous la lumi` ere produit une source de carbone et de l’oyxg` ene. Le substrat carbon´ e est ensuite transport´ e dans l’h´ et´ erocyte (cellule de droite) isol´ e d’oxyg` ene pour g´ en´ erer l’hydrog` ene.

est le second point limitant la biophotolyse. En th´ eorie, le rendement photosynth´ etique est

sup´ erieure ` a 80%, mais en pratique seulement une faible quantit´ e de la lumi` ere absorb´ ee,

entre 1 et 2%, est utilis´ ee pour g´ en´ erer des ´ electrons lors de la biophotolyse (Hallenbeck and Benemann (2002), Melis (2002)). Un rendement proche de 10% est ` a atteindre pour avoir un mod` ele viable ´ economiquement (Hallenbeck and Benemann (2002), Melis (2002)). Les photosyst` emes poss` edent des collecteurs de lumi` ere optimis´ es pour la capture de lumi` ere de faible intensit´ e. Ainsi face ` a une haute intensit´ e lumineuse, les photosyst` emes ne peuvent pas retenir toute l’´ energie. L’´ energie est perdue par dissipation thermique et par cons´ equent engendre ce faible taux de conversion. Dans la nature, ce ph´ enom` ene de dissipation permet

`

a la cellule de survivre face ` a une absorption massive de lumi` ere suite ` a une exposition trop intense (Govindjee (2002)). Diff´ erents travaux ont tent´ e de modifier la taille des collecteurs de lumi` ere avec un l´ eger gain de conversion (Govindjee (2002), Polle et al. (2002), Mussgnug et al. (2007), Berbero˘ glu et al. (2008)). L’efficacit´ e photosynth´ etique diminue aussi par le ph´ enom` ene d’ombragement entre microorganisme dans un milieu de culture. Les individus en surface captent l’essentiel de la lumi` ere et empˆ echent une capture de lumi` ere suffisante pour les individus plus en profondeur. Le design des photobior´ eacteurs est associ´ e ` a ce probl` eme.

Une surface large est requise pour une exploitation efficace si la conversion de la lumi` ere reste faible. En outre, le prix en surface des photobior´ eacteurs demeure important actuellement.

Des photobior´ eacteurs moins chers doivent ˆ etre mis en place pour une utilisation industrielle .

1.3.2 Photofermentation

Les bact´ eries pratiquant la photofermentation g´ en` erent de l’hydrog` ene en pr´ esence de lumi` ere et d’acides organiques en ana´ erobie. Les d´ echets alimentaires et la fermentation de produits issus de l’agriculture sont des sources importantes d’acides organiques pour la photofermenta- tion. Parmi les bact´ eries ayant cette voie m´ etabolique, les bact´ eries pourpres non-sulfureuses (PNS) sont les plus connues et nombreuses. Les PNS poss` edent un unique photosyst` eme pour la capture de la lumi` ere. Cette absorption de lumi` ere, coupl´ ee ` a la d´ ecomposition des acides organiques, g´ en` ere via diff´ erentes r´ eactions un flux d’´ electrons vers une nitrog´ enase (Hal- lenbeck and Benemann (2002),Koku (2002),Akkerman et al. (2002),Harwood et al. (2008), Brentner et al. (2010), McKinlay and Harwood (2010)). L’utilisation de la lumi` ere donne la possibilit´ e d’effectuer des r´ eactions thermodynamiquement non favorables. Les PNS peuvent diriger 100% des ´ electrons produits ` a partir d’acides organiques vers la synth` ese d’hydrog` ene.

(Harwood et al. (2008)).

La photofermentation a ses limites. Elle poss` ede un bon rendement de d´ ecomposition en

acides organiques mais sa vitesse de production d’hydrog` ene demeure faible. Comme la bio-

photolyse, elle est sujette ` a une faible efficacit´ e photosynth´ etique.

Figure 1.7: La photofermentation. Les bact´ eries pourpres non-sulfureuses captent les pho- ton de la lumi` ere via un photosyt` eme.Ce photosyst` eme excit´ e par la lumi` ere et la pr´ esence d’acides organiques dans le milieu permettent de g´ en´ erer un flux d’´ electron utilisable par une nitrog´ enase. Un apport en ATP est n´ ecessaire pour la synth` ese de l’hydrog` ene via la nitrog´ enase.

Elle pr´ esente aussi des contraintes plus sp´ ecifique li´ ees

ˆ ` a la nitrog´ enase,

ˆ ` a la pr´ esence d’une hydrog´ enase consommant l’hydrog` ene chez les PNS,

ˆ et ` a la pr´ esence d’une voie comp´ etitive.

Les efforts pour augmenter l’efficacit´ e photosynth´ etique de la photofermentation sont simi- laires aux travaux effectu´ es pour la biophotolyse (Kondo et al. (2002),Kim et al. (2006), Eltsova et al. (2010)).

La photofermentation se d´ eroule en ana´ erobie, diminuant l’inhibition li´ ee ` a l’O ₂ pour la nitrog´ enase. Cependant pour ˆ etre dans les conditions optimales de production en H ₂ , la concentration en N ₂ doit ˆ etre la plus faible possible. Diff´ erentes manipulations g´ en´ etiques ont ´ et´ e effectu´ ees afin d’obtenir des mutants moins sensibles la concentration en N ₂ (Kars (2010), Drepper et al. (2003), Kim et al. (2008), Hallenbeck et al. (2012))

La nitrog´ enase doit consommer, durant la synth` ese de H <sub>2</sub> , une quantit´ e constante d’ATP qui est g´ en´ er´ ee par l’activit´ e photosynth´ etique. Une variation de l’intensit´ e lumineuse engendre une chute majeure de la concentration en ATP, bloquant la synth` ese d’hydrog` ene.

Outre la pr´ esence de la nitrog´ enase, les PNS poss` edent une hydrog´ enase utilisant l’hydrog` ene

pour alimenter d’autres voies m´ etaboliques actives parall` element. La modification du g` ene de l’hydrog´ enase, hup, peut diminuer cette consommation et favoriser la g´ en´ eration de H ₂ du syst` eme (Rey et al. (2006), Kars et al. (2009),Liu et al. (2010)).

Les PNS produisent du polyhydroxybutyrate (PHB) comme source de stockage de carbone dans un environnement riche en carbone et pauvre en azote (Kemavongse et al. (2007), Wu et al. (2012a)). Ce stockage n´ ecessite une quantit´ e importante de m´ etabolites et d’´ el´ ements r´ eduits qui sont aussi requis dans la synth` ese d’hydrog` ene. La synth` ese de PHB est en comp´ etition avec la synth` ese d’hydrog` ene (Wu et al. (2012a),Hustede et al. (1993), Vin- cenzini et al. (1997)). L’enzyme PHB synthase permet de synth´ etiser le polym` ere de PHB.

L’´ elimination de son g` ene bloque la synth` ese du polym` ere (Kim et al. (2006)). N´ eanmoins une g´ en´ eration faible de PHB n’est pas toujours synonyme d’une synth` ese forte d’hydrog` ene (Hustede et al. (1993)). Les travaux de Wu et al. (2012a) ont fait l’hypoth` ese que le PHB, en tant que r´ eserve d’´ energie, procure une protection et une stabilit´ e de la cellule face ` a des perturbations ext´ erieures comme le stress li´ e au pH. Cet effet b´ en´ efique permet le maintien de la cellule et la production d’hydrog` ene lors de conditions de stress. La g´ en´ eration de PHB est en comp´ etition avec la synth` ese d’hydrog` ene. Mais elle permet ` a la cellule de mieux faire face aux conditions externes et de maintenir son activit´ e. Ainsi ` a court terme, elle peut in- hiber la synth` ese, mais ` a long terme elle permet de maintenir plus longtemps un niveau de production d’hydrog` ene par la bact´ erie. Lors d’une exploitation ` a grande ´ echelle et inten- sive, il peut ˆ etre judicieux de bien analyser les conditions de cultures pour d´ eterminer si la synth` ese de PHB peut ˆ etre utile ou pas . De plus, le PHB est un polym` ere biod´ egradable ; son accumulation, comme sous produit d’une production d’hydrog` ene, pourrait servir pour la synth` ese de bioplastique.

1.3.3 Dark fermentation

La

dark fermentation

s’applique chez un grand nombre de bact´ eries organotrophes. La d´ ecomposition d’un polysaccharide , dans cette voie m´ etabolique, procure la source de d´ epart pour g´ en´ erer un flux d’´ electrons. La dark fermentation, comme son nom l’indique, est une fermentation et se d´ eroule donc uniquement en ana´ erobie. Pourtant cette voie m´ etabolique poss` ede quelques variations selon si l’organisme est un hˆ ote en ana´ erobie obligatoire, ou est un hˆ ote en ana´ erobie facultative (figure 1.8).

Le genre Clostridium et Escherichia coli servent de mod` eles respectivement pour les bact´ eries

en ana´ erobie stricte et en ana´ erobie facultative. Chacune d’elles utilise une hydrog´ enase

lors de la synth` ese. Mais elles divergent dans les r´ eactions biochimiques employ´ ees entre la

consommation du substrat et l’action de l’hydrog´ enase. Les strictes ana´ erobies ont comme

Figure 1.8: La dark fermentation est la production d’hydrog` ene ` a partir d’un polysaccharide en absence de lumi` ere par fermentation. Il existe 2 modes de dark fermentation selon que l’organisme vit exclusivement en ana´ erobie(voie jaune) ou en ana´ erobie partielle(voie bleu).

enzymes sp´ ecifiques la pyruvate ferredoxine oxydor´ eductase (PFOR, Hallenbeck (2005)) et la NADH/Ferredoxine oxydor´ eductase (NFOR, Wang et al. (2010)) qui utilisent respecti- vement le pyruvate, produit final de la glycolyse, et le NADH issu de la voie des pentoses phosphates. Ces enzymes fournissent l’hydrog´ enase en ´ electrons. Les ana´ erobies facultatives utilisent uniquement le pyruvate qui donne les ´ electrons n´ ecessaires, suite ` a la catalyse de la pyruvate formate lyase suivi de la catalyse de la formate hydrog` ene lyase (Hallenbeck and Benemann (2002) ; Hallenbeck and Ghosh (2009), Kim et al. (2009)).

La dark fementation est, parmi les voies m´ etaboliques li´ ees ` a l’hydrog` ene, la plus facile ` a

mettre en place par l’absence de gestion de la lumi` ere et l’application d’une simple fermenta-

tion. La fermentation est un processus biologique utilis´ e depuis l’antiquit´ e avec la production

de diff´ erents breuvages alcoolis´ es. La mise en place ` a l’´ echelle industrielle est courante et plus

simple que de bˆ atir des proc´ ed´ es utilisant la lumi` ere.Les esp` eces du genre Clostridium sont

les plus utilis´ ees en fermentation industrielle. Ainsi les infrastructures et le contrˆ ole sont d´ ej` a

relativement bien connus pour la dark fermentation. Le principal d´ efaut de la dark fermen- tation est le mauvais rendement en hydrog` ene ` a partir de la consommation de sucres. Selon la stœchiom´ etrie de l’oxydation du glucose, 1 mole de glucose g´ en` ere 12 moles de H <sub>2</sub> . Cepen- dant, le maximum th´ eorique dans un proc´ ed´ e biologique comme la dark fermentation est de 4 moles d’hydrog` ene par mole de glucose, soit seulement 33% de la stœchiom´ etrie maximale.

La production d’une grande quantit´ e de sous produits comme le lactate, l’ac´ etate, l’´ ethanol rentre en comp´ etition avec la production d’hydrog` ene. Comme le PHB pour les PNS, ces sous-produits sont la r´ esultante de voies m´ etaboliques ne participant pas ` a la production d’hydrog` ene, mais ils sont n´ ecessaires ` a la survie de la cellule. En pratique le rendement est inf´ erieur ` a 4 moles H ₂ /mole de glucose, il est proche des 1-2 moles H ₂ /mole de glucose avec un rendement sup´ erieur chez les an´ erobies strictes par rapport aux ana´ erobies facultatives (Hallenbeck (2005)).

De nombreuses manipulations g´ en´ etiques ont ´ et´ e r´ ealis´ ees dans l’optique de r´ eduire l’activit´ e

des voies comp´ etitives et de favoriser la production d’hydrog` ene par l’hydrog´ enase.

1.4 Hydrog` ene biologique issu de proc´ ed´ es artificiels

L’existence dans la nature des voies m´ etaboliques li´ ees ` a la production d’hydrog` ene a servi de base ` a l’´ elaboration de proc´ ed´ es de production. Cependant le biohydrog` ene peut ˆ etre produit via des concepts non existant dans la nature mais utilisant des outils issues de la biologie.

1.4.1 Les syst` emes bio´ electriques (BES)

Un syst` eme bio´ electrique combine des microorganismes et une cellule d’´ electrolyse ou une pile ` a combustible. Ce syst` eme donne lieu ` a des r´ eactions de r´ eductions d’acides organiques, dans des microorganismes fix´ es ` a l’anode ou la cathode. Dans la pile ` a combustible ` a microbes (MFC, Verstraete and Rabaey (2006)), le syst` eme est con¸cu pour produire de l’´ electricit´ e.

Les bact´ eries fix´ ees sous la forme de biofilm lib` erent des ´ electrons dans le milieu externe grˆ ace

`

a la r´ eduction des acides organiques via leur activit´ e biologique. Ces bact´ eries sont nomm´ ees bact´ eries exo´ electrog` enes. Les ´ electrons g´ en´ er´ es sont r´ ecup´ er´ es par l’anode pour ˆ etre utilis´ es par la cellule d’´ electrolyse.

La production d’hydrog` ene par un BES a ´ et´ e mise en place en 2005(Liu et al. (2005)). Ce syst` eme est appel´ e cellule d’´ electrolyse microbienne (MEC, Logan et al. (2008)). La MEC est une variante de la MFC (voir figure 1.9). Elle n´ ecessite en plus de la pr´ esence de mi- croorganismes dans le syst` eme, la pr´ esence d’une source de courant externe et une absence d’O <sub>2</sub> au niveau de la cathode. La production d’hydrog` ene est situ´ ee au niveau de la cathode.

Une ´ electrolyse classique, sans les microorganismes, g´ en` ere de l’hydrog` ene mais l’ajout de cet

´ el´ ement dans la MEC diminue le voltage, n´ ecessaire, d’un facteur 10 (Rozendal et al. (2007), Hu et al. (2008)).

Les BES ont tendance ` a perdre en efficacit´ e lors de l’augmentation de la taille du proc´ ed´ e et par la perte d’´ energie issue de l’ensemble des activit´ es biologiques des microorganisme sans int´ erˆ ets, ou mˆ eme gˆ enants, pour la g´ en´ eration des ´ electrons.

1.4.2 Les syst` emes artificiels de biotransformation acellulaire

La biologie synth´ etique est un paradigme r´ ecent, d´ ej` a appliqu´ e dans la production de biohy- drog` ene, visant ` a ´ etablir des proc´ ed´ es biologiques de production non retrouv´ es dans la nature.

Ce paradigme consid` ere les ´ el´ ements du vivant comme des outils et des pi` eces de construc-

tion, pouvant ˆ etre utilis´ es et assembl´ es afin de parvenir ` a construire un syst` eme biologique,

Figure 1.9: Deux syst` emes bio´ electriques : la pile ` a combustible ` a microbe (MFC) ` a gauche et la cellule d’´ electrolyse microbienne (MEC) ` a droite. Ces 2 syst` emes ont un biofilm de bact´ eries exo´ electrog` enes sur l’anode. Ces bact´ eries d´ ecomposent les acides organiques du milieu pour transf´ erer des ´ electrons vers l’anode. La MFC utilise cette source d’´ electrons pour produire de l’´ electricit´ e en pr´ esence d’oxyg` ene. La MEC produit de l’hydrog` ene ` a partir de ces ´ electrons et d’une source d’´ electricit´ e en absence d’oxyg` ene.

in´ edit des syst` emes biologiques naturels mis en place par les organismes vivants.

Les enzymes sont les ´ el´ ements cl´ es d’une voie m´ etabolique. En consid´ erant les enzymes comme des briques du vivant, il est possible de prendre celles qui sont int´ eressantes afin de construire une voie m´ etabolique artificielle totalement in´ edite par rapport aux voies naturelles. En outre, il est possible d’utiliser directement ces enzymes ` a l’ext´ erieur de cellules.

Un syst` eme acellulaire de biotransformation (SAB) est un assemblage uniquement d’enzymes

ou d’autres sous-composants d’une cellule dans un milieu hors cellule. Cet assemblage a pour

fonction de transformer un substrat en un produit d’int´ erˆ et. L’utilisation d’un syst` eme sans

cellule permet d’´ eviter la pr´ esence d’´ eventuelles voies m´ etaboliques ´ etant en comp´ etition avec

la voie d´ ebouchant sur la fonction d’int´ erˆ et. Ce syst` eme est enti` erement d´ edi´ e ` a cette nouvelle

fonction et consacre les ressources du milieu disponibles dans cette tˆ ache. Un SAB est plus

simple au niveau de l’architecture vu qu’il ne comporte que les ´ el´ ements utiles ` a la tˆ ache

et qu’ils sont tous connus contrairement ` a un syst` eme utilisant un organisme en entier. Par

cons´ equent, le contrˆ ole d’un SAB est plus facile que dans le cas d’une population de microor-

ganismes g´ erant eux-mˆ emes leur m´ etabolisme selon les conditions rencontr´ ees. Cependant,

l’exp´ erimentateur doit maintenir directement les diff´ erentes conditions n´ ecessaires ` a l’emploi

des ´ el´ ements biologiques employ´ es, comme le maintien de la concentration des enzymes dans

le temps et le maintien des conditions externes optimales ` a la catalyse des enzymes, ` a l’instar

de la temp´ erature, de la pression et du pH.

Diff´ erents travaux sur les SAB ont ´ et´ e publi´ es dans le domaine de la production d’hy- drog` ene. Deux types de syst` emes sont observ´ es : le premier n´ ecessitant la lumi` ere, et le second n´ ecessitant des polysaccharides.

Syst` eme artificiel de production d’hydrog` ene via la lumi` ere

La biophotolyse et la photofermentation ont inspir´ e la conception de SAB produisant de l’hy- drog` ene via la lumi` ere (Winkler et al. (2011)). Ces syst` emes rassemblent un photor´ ecepteur, un donneur d’´ electron et un catalyseur d’hydrog` ene. Le photor´ ecepteur est un photosyst` eme I (PSI) isol´ e de cyanobact´ eries, d’algues, ou de cellules chlorophylliennes qui sont en g´ en´ eral des cellules d’´ epinards. La plastocyanine ou le cytochrome 6 sont isol´ es et directement utilis´ es comme donneur d’´ electrons du syst` eme. Le photosyst` eme, sous l’effet de la lumi` ere, va pou- voir, avec le donneur d’´ electrons, g´ en´ er´ e des ´ electrons excit´ es utilis´ es par le catalyseur. Une hydrog´ enase peut faire office de catalyseur (Ihara et al. (2006), Winkler et al. (2009), Lubner et al. (2009), Lubner et al. (2010)). Une autre solution est l’emploi de catalyseur m´ etallique comme des nanoparticules de m´ etaux nobles ` a l’instar du platine Pt, ou de l’or Au (Grimme et al. (2008), Grimme et al. (2009), Iwuchukwu et al. (2010)). Bien que fonctionnels, les SAB utilisant la lumi` ere pr´ esentent un faible rendement en comparaison avec les proc´ ed´ es utilisant des microorganismes. De plus, l’utilisation de m´ etaux nobles est on´ ereux et les syst` emes avec l’hydrog´ enase souffre de l’inhibition par l’O <sub>2</sub> . Le probl` eme principal demeure les ´ echanges d’´ electrons entre les diff´ erents composants :

ˆ entre le photor´ ecepteur et le donneur d’´ electrons

ˆ et entre le photor´ ecepteur et le catalyseur

La diffusion entre ces ´ el´ ements est limit´ ee. Diverses am´ eliorations tentent de favoriser les

´ echanges par l’addition au syst` eme de mol´ ecules interm´ ediaires facilitant le transfert d’´ electrons.

L’immobilisation des diff´ erents ´ el´ ements en un seul complexe, comme un complexe avec le photosyst` eme li´ e ` a une hydrog´ enase, facilite aussi l’´ echange.

Syst` eme artificiel de production d’hydrog` ene via les polysaccharides

Ce type de syst` eme est bas´ e sur la dark fermentation. L’int´ erˆ et d’utiliser un SAB d´ edi´ e ` a

l’hydrog` ene ` a partir de la consommation de sucres est de parvenir ` a mettre en place un

syst` eme plus performant que la dark fermentation au niveau des rendements tout en conser-

vant la possibilit´ e de consommer comme substrat de d´ epart des polysaccharides, famille de

macromol´ ecules abondantes dans la nature. De multiples combinaisons d’enzymes, provenant

d’une source vari´ ee en microorganismes, ont ´ et´ e utilis´ ees dans des syst` emes de ce type (Wood- ward et al. (2000), Zhang et al. (2007), Ye et al. (2009)). Outre l’hydrog´ enase, ces syst` emes poss` edent des enzymes associ´ ees au m´ etabolisme du carbone. En 2007, Zhang et al. ont construit un syst` eme de 13 enzymes convertissant un polysaccharide en hydrog` ene. L’amidon a ´ et´ e le substrat de d´ epart test´ e dans ce syst` eme. Puis en 2009, Ye et al. adaptent le syst` eme pour utiliser des compos´ es cellulosiques au d´ epart. La cellulose est un compos´ e moins cher que l’amidon et elle est facilement accessible ` a partir de v´ eg´ etaux et de d´ echets verts.

Avec un syst` eme similaire ` a la figure 1.10, le rendement s’approche du maximum th´ eorique de l’oxydation du glucose, donnant de l’hydrog` ene. Une mole d’anhydroglucose, produit ` a partir de la d´ ecomposition de polysaccharide, donne 11,2 moles d’hydrog` ene soit 93.1% du rendement th´ eorique (Ye et al. (2009)). La vitesse de production d’hydrog` ene ` a partir du cellobiose a atteint 3.92 mmol d’ hydrog` ene par heure par litre de culture. Ce syst` eme est efficace en terme de rendement, mais il reste perfectible au niveau de la vitesse de produc- tion. Zhang indiquent qu’un gain de vitesse d’un facteur 1000 est possible avec l’utilisation de hautes temp´ eratures, une augmentation de concentrations en enzymes et en substrats, l’emploi d’enzymes modifi´ ees et l’am´ elioration de divers composants du syst` eme.

1.4.3 Int´ egration de syst` emes

Plusieurs travaux (Guwy et al. (2011), Eroglu and Melis (2011)) ont assembl´ es diff´ erents proc´ ed´ es de g´ en´ eration d’hydrog` ene en un seul dans l’optique d’augmenter le rendement et la vitesse de production. Actuellement, la dark fermentation est l’un des seuls potentiellement viable pour une utilisation industrielle de par sa vitesse de production. Sa combinaison avec la photofermentation ou la MEC permet d’augmenter le rendement par la consommation des sous produits g´ en´ er´ es lors de la dark fermentation.

Ces combinaisons sont coˆ uteuses ` a mettre en place. Elles n´ ecessitent de larges infrastructures

avec des parties d´ edi´ ees ` a la r´ ealisation et au contrˆ ole de conditions de chaque proc´ ed´ e.

Figure 1.10: Syst` eme synth´ etique mis en place par Zhang et al. (2007) pour produire du

biohydrog` ene ` a partir d’amidon comme polysaccharide de d´ epart. Les abr´ eviations sont :

PPP, voie des pentoses phosphates ; G1P, glucose-1-phosphate ; G6P, glucose-6-phosphate ;

6PG, 6-phosphogluconate ; Ru5P, ribulose-5-phosphate ; et Pi, phosphate inorganique. les

enzymes employ´ ees sont :#1, glucane phosphorylase ;#2, phosphoglucomutase ;#3, G-6-P

d´ ehydrog´ enase ;#4, 6-phosphogluconate d´ ehydrog´ enase, #5 Phosphoribose isom´ erase ; #6,

Ribulose 5-phosphate ´ epim´ erase ; #7, Transaldolase ; #8, Transketolase, #9, Triose phos-

phate isom´ erase ; #10, Aldolase, #11, Phosphoglucose isom´ erase : #12, Fructose-1, 6-

bisphosphatase ; #13, Hydrog´ enase.

Figure 1.11: Int´ egration de plusieurs syst` emes artificiels ou issus de proc´ ed´ es biologiques

pour produire du biohydrog` ene.

Proc´ ed´ es de production Rendement en carbone Vitesse de production R´ eference

Biophotolyse - 0.6-30mL H ₂ /L/h Yu and Takaha-

shi (2007)

Photofermentation 80% 1-180mL H ₂ /L/h Eroglu and Me-

lis (2011)

Dark fermentation 33% 0.10-2L H ₂ /L/h Lee et al. (2011)

MEC 61-94% 0.01-6m3 H ₂ /m3/jour Cheng and Lo-

gan (2011)

SAB via cellulose 93% 3.92 mmol H ₂ /L/h Ye et al. (2009)

Int´ egration de syst` eme : Dark fermentation+

photofermentation

66% - Eroglu and Me-

lis (2011)

Guwy et al.

(2011) Table 1.2: Diff´ erents indicateurs de rendement et de vitesse de production de biohydrog` ene de plusieurs proc´ ed´ es de production.

1.5 L’accessibilit´ e ` a l’hydrog` ene

1.5.1 G´ en´ eralit´ es ´ economiques sur le biohydrog` ene

Le coˆ ut de production est le facteur cl´ e pour permettre d’avoir de l’hydrog` ene accessible pour l’utilisation courante. Chaque type de production d’hydrog` ene poss` ede un coˆ ut d´ ecoulant de la nature du proc´ ed´ e de fabrication et des mati` eres premi` eres utilis´ ees. Ce coˆ ut et la distribution sont les principaux freins de l’exploitation de l’hydrog` ene

Fuel Mati` ere premi` ere Coˆ ut de production (US $ /MBtu) Hydrog` ene photobiologique eau, acides organiques 10

Hydrog` ene par fermentation m´ elasse 30

Hydrog` ene par pyrolyse charbon, biomasse 4

Hydrog` ene par ´ electrolyse eau 10

Hydrog` ene par d´ ecomposition de vapeur eau 13

Ethanol par fermentation ´ m´ elasse 31.5

Gasoil p´ etrˆ ole 6

Table 1.3: Coˆ ut de revient de diff´ erents proc´ ed´ es de production de carburants(Wu et al.

(2012b).

Le d´ epartement li´ e aux ´ energies des ´ Etats-Unis poss` ede un plan de d´ eveloppement de l’hy- drog` ene comme vecteur d’´ energie. Il s’est fix´ e pour objectif un coˆ ut de production de 14- 21 $ par gigajoule (Wu et al. (2012b)) soit approximativement 2 $ /kg d’hydrog` ene pour ˆ etre comp´ etitif par rapport au coˆ ut des carburants fossiles. La pyrolyse est le proc´ ed´ e de pro- duction d’hydrog` ene le plus ´ economique. Cependant elle n´ ecessite de brˆ uler du charbon ou de la biomasse ; dans une perspective environnementale et d’exploitation ` a long terme, le biohydrog` ene est plus durable.

La mati` ere premi` ere, utilis´ ee dans la fabrication d’un carburant, a un impact important sur le coˆ ut de production d’un carburant. Elle repr´ esente 50 voir 80 % du prix du produit fini (Lynd et al. (1999); Zhang (2010) ) comme c’est le cas pour

ˆ le gasoil issu du p´ etrˆ ole,

ˆ le biodiesel issu des huiles v´ eg´ etales,

ˆ l’´ ethanol issu du ma¨ıs et autres plantes sources de polysaccharides.

A cet ´ egard, le biohydrog` ene poss` ede la caract´ eristique de pouvoir ˆ etre g´ en´ er´ e ` a partir de diff´ erents d´ echets peu couteux ` a l’instar des d´ echets solides municipaux, des effluents indus- triels, des boues d’´ epuration. Outre leur coˆ ut infime en tant que d´ echet, l’emploi de ces rejets permet leur recyclage. La production d’hydrog` ene pourrait alors d´ evelopper un rˆ ole parall` ele cibl´ e sur la d´ epollution de secteurs industriels.

1.5.2 Point sur les syst` emes acellulaires

Dans le cas des SAB, le coˆ ut de revient d´ epend aussi beaucoup des enzymes utilis´ ees. En ef- fet, les enzymes doivent ˆ etre synth´ etis´ ees et purifi´ ees contrairement aux proc´ ed´ es utilisant un microorganisme entier. Cette ´ etape de synth` ese et de purification doit ˆ etre la moins coˆ uteuse possible et doit avoir la meilleure efficacit´ e catalytique possible. La mesure de l’efficacit´ e est bas´ ee sur le rapport entre la quantit´ e de produit synth´ etis´ e(=QP) et la quantit´ e d’enzyme utilis´ ee(=QE). Ce rapport est le

total turn-over number

, TTNw :

TTNw = ^QP _QE (Zhang et al. (2010))

La stabilit´ e de l’enzyme dans le temps joue aussi un rˆ ole important sur le coˆ ut de pro-

duction d’hydrog` ene. L’ing´ enierie enzymatique est une solution pour obtenir des enzymes

performantes et durables permettant d’acc´ eder ` a des coˆ uts proches de 2 $ /kg H ₂ .

Figure 1.12: Diagramme publi´ e par Zhang et al. (2010) donnant des estimations du coˆ ut de production d’hydrog` ene via un SAB ` a partir des coˆ ut de synth` ese et du TTN qui est le rapport entre la quantit´ e de produit synth´ etis´ e(P) et la quantit´ e d’enzyme ou de biocatalyste utilis´ ee (E). TTN = ^quantit´ _quantit´ ^e(P) _e(E) , TTNw = ^masse(QP _masse(E) ⁾ .

Les estimations de coˆ uts sont bas´ ees sur le prix du de la mati` ere premi` ere, des 13 enzymes du syst` eme, et des cofacteurs ´ etudi´ es qui sont le NADP, ses rempla¸cants potentiels comme le NAD et des biomim´ etiques artificiels. Le prix de la mati` ere premi` ere est de 0.18/kg de polysaccharide.

Le graphe (a) donne une estimation du coˆ ut de production d’hydrog` ene partir des coˆ uts de synth` ese des enzymes, quand le TTN des cofacteurs = 1000000. Le coˆ ut d´ ecroit rapidement avec l’augmentation du TTNw des enzymes. Une valeur de TTNw ` a 2 ∗ 10 <sup>5</sup> est le seuil d’am´ elioration au del` a duquel aucune baisse du coˆ ut n’est observ´ ee.

Le graphe (b) montre l’impact du choix et du TTN des cofacteurs sur le coˆ ut quand TTNw

est de 100000 pour les enzymes.

1.6 Etudes de syst` ´ emes m´ etaboliques via des m´ ethodes in silico

L’utilisation de SAB permet en partie d’´ eliminer le probl` eme li´ e au rendement mais le syst` eme reste ` a am´ eliorer notamment au sujet de la vitesse de production d’hydrog` ene et du coˆ ut de revient. Pour contourner ces difficult´ es, l’am´ elioration des enzymes par ing´ enierie des prot´ eines est souvent mise en œuvre. L’ing´ enierie des prot´ eines a d´ ej` a fait ses preuves pour optimiser des enzymes, cependant elle n´ ecessite la mise en place de processus exp´ erimentaux assez longs et coˆ uteux pour produire et identifier l’enzyme id´ eale. Le passage au pr´ ealable par une approche in silico permet d’aiguiller vers la direction ` a suivre pour optimiser avec un gain de temps et de coˆ ut.

Dans le cas d’un r´ eseau m´ etabolique ` a am´ eliorer, la d´ emarche in silico consiste d’abord ` a conceptualiser ce syst` eme en un mod` ele math´ ematique pouvant reproduire le plus fid` element le comportement du syst` eme r´ eel. Une fois le mod` ele g´ en´ er´ e et valid´ e, il pourra ˆ etre utilis´ e pour identifier les points ` a modifier du syst` eme et leur influence sur le comportement du syst` eme. Deux approches de mod´ elisation sont possibles :

ˆ une approche analytique n´ ecessitant une connaissance d´ etaill´ ee de tous les composants

´ el´ ementaires du syst` eme. Un mod` ele analytique est aussi appel´ e mod` ele de connaisance.

ˆ une approche syst´ emique qui consiste regrouper des composants ´ el´ ementaires en une seule entit´ e reproduisant le comportement du syst` eme. Ce regroupement impose une mod´ elisation plus macroscopique du syst` eme.

Le choix de l’approche d´ epend de l’usage attendu et des connaissances disponibles sur le syst` eme. Quelle que soit l’approche utilis´ ee, le mod` ele doit pouvoir reproduire un comporte- ment donn´ e du syst` eme. La pr´ ecision du mod` ele est variable selon la m´ ethode employ´ ee et la complexit´ e du syst` eme.

1.6.1 Mod´ elisation analytique

Reconstruction de r´ eseaux m´ etabolique

L’approche analytique est le type de mod´ elisation le plus utilis´ e par les biochimistes dans

l’´ etude du m´ etabolome. Elle n´ ecessite de d´ eterminer le plus grand nombre de m´ ecanismes

mol´ eculaires pr´ esents, qui sont les briques ´ el´ ementaires du syst` eme m´ etabolique. La recons-

truction in silico de r´ eseaux m´ etaboliques permet d’identifier et d’analyser les m´ ecanismes

mol´ eculaires impliqu´ ees dans un ´ etat physiologique d’un organisme. La premi` ere phase consiste

`

a r´ ecup´ erer les informations m´ etaboliques des r´ eactifs, des enzymes et des r´ eactions impliqu´ ees dans une voie m´ etabolique (Francke et al. (2005)) . Cette phase n´ ecessite le recueil de donn´ ees

`

a partir de publications et de bases de donn´ ees biologiques regroupant des informations li´ ees aux voies m´ etaboliques et aux g` enes, aux prot´ eines, aux r´ eactions impliqu´ es. De nombreuses bases permettent la collecte de ces donn´ ees, nous pouvons citer quelques exemples :

ˆ la base KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) est une des premi` eres bases, sur internet, regroupant les informations de g` enes, prot´ eines, r´ eactions et de voies m´ etaboliques issues du s´ equen¸cage d’un panel important d’organismes.

ˆ La base BioCyc, apparue plus tard, regroupe actuellement des informations sur 3530 voies m´ etaboliques et g´ enomes.

ˆ la base BRENDA (BRaunschweig ENzyme DAtabase, Schomburg et al. (2013)) est d´ edi´ ee ` a la collecte de donn´ ees d’enzymes ` a partir de publications ou de divers travaux exp´ erimentaux. Elle propose une fiche d´ ecrivant les propri´ et´ es biochimiques de chacune de ses enzymes.

Ce recueil d’informations doit permettre de lister tous les agents biochimiques d’une voie et leurs r´ eactions associ´ ees, et de d´ ecrire leurs interactions entre eux. Une fois le mod` ele construit et v´ erifi´ e, la phase de simulation ` a proprement dit peut d´ ebuter.

Mod´ elisation via l’´ etude du r´ eseau

Le but de la mod´ elisation consiste, ` a partir d’un mod` ele, ` a pr´ evoir le comportement du syst` eme ou de la voie m´ etabolique ´ etudi´ ee, dans des situations donn´ ees et sur des ´ echelles de temps donn´ ees. Il existe plusieurs m´ ethodes pour effectuer ces pr´ evisions ` a partir du mod` ele, mais elles se basent toutes sur la stœchiom´ etrie des r´ eactions pr´ esentes souvent repr´ esent´ ees dans une matrice S. S est la matrice stœchiom´ etrique regroupant en lignes les m´ etabolites et en colonnes les r´ eactions. Une case ij donne le coefficient stœchiom´ etrique du m´ etabolite i pour la r´ eaction j. Cependant, deux approches peuvent ˆ etre distingu´ ees :

ˆ des pr´ evisions bas´ ees sur l’´ etude de pseudos ´ etats stationnaires du syst` eme, c’est-` a-dire lorsque que les variations de concentrations, de volumes sont nulles ;

ˆ des pr´ evisions bas´ ees sur la dynamique de l’ensemble, o` u quel que soit l’´ etat du syst` eme

le mod` ele peut pr´ evoir le comportement des ´ el´ ements biochimiques.

Mod` ele ` a l’´ etat stationnaire

L’´ etat stationnaire est d´ efini par l’´ equation d’´ equilibre suivante : dc(t)

dt = 0 = S ∗ v

c est un vecteur d´ ecrivant la concentration des m´ etabolites, c(t) est constant ` a l’´ etat sta- tionnaire. v est un vecteur ayant les vitesses des r´ eactions du syst` eme.

Les principales m´ ethodes bas´ ees sur l’´ etat stationnaire sont l’analyse des flux d’´ equilibre (

flux balance analysis

), l’´ etude des modes ´ el´ ementaires, et l’observation des voies extrˆ emes.

Un flux est la vitesse de synth` ese ou de consommation d’un m´ etabolite au niveau d’une r´ eaction ou plusieurs r´ eactions associ´ ees dans un syst` eme m´ etabolique. L’analyse des flux d’´ equilibre consiste ` a observer les flux m´ etaboliques sous des contraintes de deux types :

ˆ des contraintes aux extrˆ emes du syst` eme limitant l’apport du substrat de d´ epart ou l’excr´ etion du produit final

ˆ des contraintes internes qui limitent les flux internes du syst` eme

Cette analyse permet d’avoir une estimation de l’importance des flux dans le syst` eme ` a l’´ equilibre et dans des conditions particuli` eres.

Les modes ´ el´ ementaires (Schuster et al. (2002)) et les voies extrˆ emes (Schilling et al. (2000)) utilisent le concept de chemin m´ etabolique. Dans un organisme, plusieurs jeux de r´ eactions permettent d’obtenir le mˆ eme produit. Chacun de ces jeux forme un chemin m´ etabolique.

Un mode ´ el´ ementaire est un chemin m´ etabolique unique au sein d’un r´ eseau, d´ ecrit ` a l’´ etat stationnaire :

ˆ un mode ´ el´ ementaire est constitu´ e d’un nombre minimal de r´ eactions et forme une unit´ e fonctionnelle du r´ eseau.

ˆ l’´ elimination d’une r´ eaction d’un mode ´ el´ ementaire rend caduque sa fonctionnalit´ e.

Les voies extrˆ emes sont des sous-parties des chemins formant des modes ´ el´ ementaires. La d´ etermination d’une voie extrˆ eme repose sur les mˆ eme r` egles qu’un mode ´ el´ ementaire avec deux particularit´ es suppl´ ementaires.

ˆ Les r´ eactions internes au syst` eme sont d´ ecompos´ ees en deux r´ eactions une sens et l’autre

antisens

ˆ Une voie extrˆ eme est unique, elle ne peut ˆ etre repr´ esent´ ee par la combinaison d’autres voies extrˆ emes pr´ eexistantes du r´ eseau.

Les modes ´ el´ ementaires et les voies extrˆ emes permettent d’identifier tous les processus pos- sibles au sein d’un r´ eseau m´ etabolique, en tenant compte de sa topologie, de la stoechiom´ etrie des r´ eactions, leur sens et leur r´ eversibilit´ e.

Figure 1.13: Figure de Papin et al. (2004). Exemple d’un r´ eseau m´ etabolique avec ses modes

´ el´ ementaires et ses voies extrˆ emes. Le r´ eseau est compos´ e de 3 m´ etabolites, r´ eactions internes et 3 r´ eactions d’´ echange(a). Le r´ eseau poss` ede 4 modes ´ el´ ementaires (b) et 3 voies extrˆ emes (c). La r´ eaction d’´ echange du m´ etabolite A est r´ eversible, elle est d´ ecompos´ ee en 2 r´ eactions irr´ eversibles dans le cas de voie extrˆ eme (c).

Il existe une ´ equivalence entre les modes ´ el´ ementaires et les voies extrˆ emes de cet exemple : EIMo 1 = ExPa 1, EIMo 2 = ExPa 2, EIMo 3 = ExPa 3, EIMo4 = ExPa 1 + ExPa 2.

Les mod` eles stationnaires permettent d’avoir une visualisation globale de l’intensit´ e et de l’orientation des flux pr´ esents au sein du m´ etabolisme. Cependant, par leur nature, ces mod` eles ne peuvent pr´ edire que le comportement des syst` emes ` a l’´ etat stationnaire.

Mod` ele dynamique

Un mod` ele dynamique, aussi appel´ e mod` ele cin´ etique, permet de donner une pr´ evision du

comportement du syst` eme durant un temps donn´ e qui peut englober aussi bien l’´ etat station-

naire que l’´ etat initial et la transition entre ces ´ etats. La conception d’un mod` ele dynamique

repose, le plus souvent, sur l’identification et l’utilisation d’´ equations diff´ erentielles. Dans le cas d’un syst` eme m´ etabolique, les ´ equations diff´ erentielles permettent de d´ ecrire la concen- tration des diff´ erents m´ etabolites du syst` eme.La r´ esolution de l’ensemble de ces ´ equations permet la reproduction des diff´ erents comportements du syst` eme.

Une r´ eaction, dans un mod` ele dynamique, est d´ efinie non seulement par les m´ etabolites qui lui sont associ´ es, mais aussi par sa vitesse. L’ensemble des vitesses de r´ eactions est la base du mod` ele dynamique d’un syst` eme m´ etabolique. En effet, l’int´ egration dans le mod` ele d’une

´

equation donnant la vitesse permet le suivi dynamique des concentrations des m´ etabolites du syst` eme. Chaque vitesse de r´ eaction du syst` eme doit ˆ etre retranscrit en une expression alg´ ebrique, une loi cin´ etique, fonction de la concentration des m´ etabolites dans le temps.

Cette loi cin´ etique est une estimation de la vitesse r´ eelle. Ainsi, la difficult´ e d’identification de tel mod` ele r´ eside dans l’utilisation d’une loi cin´ etique la plus adapt´ ee au cas de figure rencontr´ e. Plusieurs lois cin´ etiques ont ´ et´ e mises en place et souvent utilis´ ees pour traduire une vitesse au sein d’une r´ eaction. Parmi ces lois, nous trouvons :

ˆ la loi d’action de masse

ˆ la loi de Michaelis-Menten

ˆ la loi de convenance cin´ etique (

convenience rate law

)

La loi d’action de masse a ´ et´ e d´ etermin´ ee en 1867 par les chimistes norv´ egiens Cato Guldberg et Peter Waage. Elle associe les concentrations des m´ etabolites ` a l’´ equilibre ` a une constante K _T qui d´ epend uniquement de la temp´ erature.

K T = Y

[produit]/ Y

[substrat]

Cette loi permet d’obtenir l’´ equation de vitesse simple : r = k Y

R ^vi _i

r est la vitesse de r´ eaction.

k est une constante de vitesse propre ` a cette r´ eaction.

Ri d´ esigne les concentrations des r´ eactifs et vi leur coefficient stœchiom´ etrique en tant que r´ eactif.

La loi d’action de masse est utilis´ ee pour exprimer la cin´ etique de r´ eactions chimiques, mais

elle reste insuffisante pour d´ ecrire des r´ eactions biochimques. En effet, elle ne tient pas compte

du comportement de l’enzyme, elle ne d´ ecrit pas les interactions enzyme-substrat(s) possibles.