Etude des étapes précoces de la mécanoperception chez le peuplier

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Etude des étapes précoces de la mécanoperception chez le peuplier

Delphine Gourcilleau

To cite this version:

Delphine Gourcilleau. Etude des étapes précoces de la mécanoperception chez le peuplier. Sciences agricoles. Université Blaise Pascal - Clermont-Ferrand II, 2011. Français. �NNT : 2011CLF22108�.

�tel-00653354�

N°D.U.2108

EcoleDoctoraledesSciencesdelaVie,delaSanté,Agronomie,Environnement N°d’ordre542

Thèse

Présentéeàl’UniversitéBlaisePascal pourl’obtentiondugradede

Docteurd’Université

Spécialité:physiologieetgénétiquemoléculaires

Soutenuele11Ͳ02Ͳ2011

DelphineGourcilleau

Etudedesétapesprécocesdela mécanoperceptionchezlepeuplier

Président: DrFrédéricDelbac,UMR6023LMGE,ClermontͲFerrand Rapporteurs: DrJeanͲMarieFrachisse,UPR2355ISV,GifͲsurͲYvette

DrChristianMazars,UMR5546SCSV,Toulouse DrGillesPilate,UR0588AGPF,Orléans

Examinateurs: DrNathalieLeblancͲFournier,UMR547PIAF,ClermontͲFerrand DrJeanͲLouisJulien,UMR547PIAF,ClermontͲFerrand

e°áâÅ°

Afindesurvivredansunenvironnementfluctuant,lesplantesontdéveloppéla capacitédepercevoiretderépondreàdesstimuliexternesdiversetparfoisextrêmes.Les sollicitationsmécaniquesjouentunrôleimportantaucoursdudéveloppementdesplantes etunnombrecroissantd’étudess’intéresseàlamécanoperception.Ledessindelavoiede signalisationentrelaperceptiondusignaletlarégulationdesgènesprécocesresteincertain.

Un modèle de la mécanoperception, proposantque lavariablemécanoperçuesoit la déformationdelamembrane,aétévérifiéàl’échelledelaplanteentièremaisdoitêtre validéauniveaucellulaire.Pourcela,etafind’identifierlesacteursmoléculairesprécocesde la réponse à la sollicitation mécanique, nous avons analysé la régulation du gène mécanosensiblePtaZFP2surculturescellulairesdepeuplier.

LegènePtaZFP2appartientàlafamillemultigéniquedesQͲtypeC2H2ͲZFPscodant desfacteursdetranscriptionputatifsetcomprenant16membreschezlepeuplier.Une analysephylogénétiqueetl’analysedel’expressiondecesgènesenréponseàdifférents stress abiotiques ont montré l’existence de deux groupes phylogénétiques. Ils se différencientpardesdoigtsdezinccaractéristiquesetdeuxnouveauxmotifsprotéiques (MALEALetLVDCHY)spécifiquesàchacundesgroupes.Cetteétudenousaégalement permisd’identifierunautregène,PtaZFP1,prochephylogénétiquementdePtaZFP2et fortementinduitparuneflexion.Aprèsavoirmisaupointunsystèmedesollicitation mécanique sur culturescellulaires,nousavonsdémontrél’implication ducalcium,des calmodulines,desjasmonatesetduH2O2dansl’inductionprécocedugènePtaZFP2parun signalmécanique.Nostravauxsuggèrentégalementl’existenced’uneinteractionentrela NADPHoxydase(enzymeimpliquéedanslaproductiond’EAO)etlescalmodulinesenamont dePtaZFP2.Finalement,desrésultatspréliminairessuggèrentunelocalisationnucléairede cetteprotéineetuneaccumulationtransitoireauseindestiges2haprèsuneflexion.Les outilsmoléculairesproduitsaucoursdecetravail(anticorps,protéinesrecombinantes) permettrontdecomprendrelerôledePtaZFP2danscettevoiedesignalisation.

MotsͲclés:Populus,sollicitationmécanique,C2H2ͲZFPs,facteurdetranscription, voiedesignalisation,calcium,H2O2.

TuáàÜtvà

The ability of plants to perceive and respond to various and even extreme environmentalstimuliiscrucialfortheirsurvivalinafluctuantenvironment.Mechanical solicitationsplayakeyroleduringplantdevelopmentandanincreasingnumberofstudies arededicatedtomechanosensing.Thewayhowplantssensemechanicalsignalsandbring about the changes in gene expression is still unknown. Recently, a model of mechanosensing,suggestingthatthephysicalvariableperceivedbycellsistheplasma membranestrain,hasbeenconfirmedatthewholeplantscalebutremainstobevalidated atthecellularlevel.Inthisaimandtoidentifythemolecularcomponentsinvolvedinthe earlystepsofthemechanicalsignalingpathway,theregulationofthemechanosensitive genePtaZFP2wasanalyzedinpoplarcellscultures.

ThemechanosensitivePtaZFP2genebelongstothemultigenicQͲtypeC2H2ͲZFPs family encoding putative transcription factors, consisting of 16 members inpoplar. A phylogeneticstudyandtheexpressionanalysisofseveralofthesegenesinresponseto abioticstresses, allowedustodetecttwophylogeneticgroups.Thesetwogroupsare distinguishedessentiallyontheirdifferentsignaturesoftheirtwozincfingerdomainsandon thetwoadditionalconservedmotifsMALEALandLVDCHY,specifictoeachphylogenetic group.AnothergeneoftheQͲtypeC2H2ͲZFPfamily,PtaZFP1,relatedtoPtaZFP2,wasshown toberegulatedbybending.Afterseveraladjustmentstoapplyamechanicalsolicitationto cellscultures,suchtreatmentsrevealedtheinvolvementofcalcium,calmodulins,jasmonic acidandH2O₂intherapidinductionofPtaZFP2geneexpressioninresponsetomechanical stress.Furthermore,ourdatashowedaninteractionbetweenanNADPHoxidaseenzyme (involvedinROSproduction)andcalmodulinsupstreamofPtaZFP2.Finally,preliminary resultssuggestedanuclearlocalizationofPtaZFP2andatransientaccumulationofthis proteininthestem2hoursafterbending.Themoleculartoolsthathavebeenproduced duringthiswork(antibody,recombinantprotein)willbeusedtostudytheroleofPtaZFP2in themechanicalsignalingpathway.

Key words: Populus, mechanical solicitation, C2H2ͲZFPs, transcription factor, signaling pathway,calcium,H2O₂

exÅxÜv|xÅxÇàá

Onpourraitpenserquecettepartiedelathèseestdeloinlaplusfacile…jenetrouve pas.Jepensequ’ilesttoutaussidifficilederédigerdesrésultatsscientifiquesetlesdiscuter quederédigerdesremerciements.Commentêtresûreden’oublierpersonne?Comment êtresûreden’oublieraucunmomentdesoutien,d’encouragement,derigolade,d’amitié, d’amour…etilyenaeu!!Mathèsen’apasétél’unedespériodeslesplusfacilesdemavie, maiselleaétéTRESricheenémotionsetj’aitoujourseuquelqu’unversquimetourner,sur quim’appuyeretrebondirquecesoitdansmonbureau,unbureauvoisin,àClermontouà l’autreboutdelaFrance.

Enpremierlieu,jetiensàremercierJeanͲLouisJulienpourm’avoiraccueillieausein del’UMRPIAFetm’avoirfaitconfiancedèslepremierjour(c'estͲàͲdireàpeuprèslaveille duconcoursdel’écoledoctorale).Mercid’avoirtoujourstrouvédutempspoursuivre l’avancéedemestravaux,pournosdiscussionsautourdusportengénéral(durugbyetdu footplusparticulièrementetdel’ASMetSaintétrèsspécifiquement),etsurtout,surtout:

mercipourmessuperbesétagèresquim’ontpermisdebienrangermabiblio…

S’iln’yavaitqu’uneseulepersonneàremercier,ceseraitcertainementNathalie LeblancͲFournier.Nath,mercidem’avoirfaitconfiance,dem’avoiraccueilliedanston bureau,d’avoirtoujoursétésipositive,d’êtreàl’écouteetdisponible,deprendreletemps deveniràlapaillasse…mercipourtout.

MerciàMrsJeanͲMarieFrachisse,ChristianMazarsetGillesPilatedemefaire l’honneurdejugercetravaildethèseetd’enêtrelesrapporteurs.MerciégalementàMr FrédéricDelbacd’avoiracceptédefairepartiedemonjurydethèse.

Jetienségalementàremercierlesmembresdemesdeuxcomitésdethèse:JeanͲ LouisCouderc,DanielLocker,ChristianMazarsetBrunoMoulia.Mercidem’avoiraccordé devotretempsetpourvosprécieuxconseilsquinousontpermisd’effectuerdeschoix quantàl’orientationdelathèse.MesdeuxcomitésdethèseontvraimentétédesreͲ boosters!

JeremerciebienévidemmenttouslesmembresduPIAFpourleuraccueiletlabonne humeurquirègneauseindecelabo.Jecommenceraiparlesgensavecquij’aieuleplaisir de travailler: Bruno pour sa gentillesse, sa pédagogie et son intérêt; Eric pour sa disponibilité,sonémerveillementdelabiologiemoléculaireetl’azoteliquide;Norbert(si prisé!!)pouravoirtrouvéunpeudetempsafindemartyriserdescellulesavecmoi;Nicole poursapatience,sasimplicitéetsagentillessesanségal;Jérômepourtoutesonaideau niveaumanip(surtoutauniveauprotéique),soncynisme(quej’aisuapprendreàadorer) maissagentillessequandmême(sisijevousjure!!);Gisèle(quin’estpasunePiafounette d’ailleurs) d’avoir trouvé du temps pour m’initier aux joies incontestées de la bioͲ informatiqueetsagentillesse(ouitoutlemondeilestgentil…)etChristelle(sansquirien n’auraitétépossible)poursabienveillance,sonhumouretsesexcusespourmangerdu sucré.Jen’oubliepastouslesautresPiafounets:Boris(pourlessoiréesdisco),Aurélie(pour tadiscrétion,tonécouteetLEpdf!!),Mélanie(pournosrepasdumidi,tagentillesseettes conseils toujours très avisés), Catherine(pour ta bonnehumeur quasi sans faille,tes relecturesetd’êtremacoͲautrice!),Stéphane(pourtesabsences,tesoignonsdePariset pouravoirdétruitmasiprécieuseménagère),Patricia(pourteshistoiresd’unautretemps, PompompidouettesdemiͲdemiͲdemipartsdegâteau),JeanͲStéphane(pourtesminutesͲ culture),Valérie(pourtonRoyalismeincomparable),Philippe(pour tonkouignaman), Sylvaine(pouravoirréussiàmetutoyer),Brigitte(pourlesregardsquiendisentlong...), Agnès (pour le vide que tu as laissé: tu es irremplaçable), tous les stagiaireset/ou doctorants:David,Hosam,Aude,Marine,JingetunementiontoutespécialepourJohann (mêmesit’espasunthésardduPiaf)parcequec’étaitquandmêmebienavantquandt’étais là…MespenséesvontégalementverstouslesmembresduGDEC(JulieB.etJulieB., Delphine,SendaetMonique)etduPIAFͲINRA(làilssonttropnombreuxpourquejelescite).

Nombreuxsontceuxquimemanquerontetquejen’oublieraijamais…

Merciàtouslesgensquisontautourdemoipourmesoutenir,medemander régulièrementoùj’ensuisetsurtoutmefairepartagerdepursmomentsdebonheur.Merci auxFléauxaugrandcompletetenparticulierauxDrouglazet(KlervietDevrigÆDPF!!).

MerciàlaMascaradeetenparticulierauxDelorme,MamanBéa,Marion,Pierrot,Crevette etYépile:parcequevousm’aveztoutsimplementmanquépendantces3ansetvousêtes commeunedeuxièmefamille(unegraaaandefamille).MerciàlafamilleGilliotteausens

largeetenparticulieràJeanͲPierre,Patricia,ArnaudetLaurepourleursoutienetleur intérêtpourlestressmécaniquedesarbres.

CommentfairedesremerciementssansparlerdemacopineAnaïs…Tuesl’unedes plusbelleschosesquem’aitapportéClermont.UnENOOOORMEmercipourtousces moments passés ensemble, notre superficialité, notre méchanceté, le step(sans trop réfléchirquandmêmestpparcequec’estdur…)etpuistoutenfait.Iln’yapasdemots.

UnmercitoutspécialàSaintépourm’avoirfaitrêver(oupas…)etàlaSNCFet Cofiroutequinem’ontjamaisautantvu(etnemereverrontcertainementjamaisautant) quependantces3annéesdethèses.

Bienévidemment,merciàmon«petit»homme…dem’avoirsupportée(danstous lessensduterme)pendanttoutcetemps,d’avoirréussiàconstruirequelquechoseavec moimalgréladistanceetlesmomentsdifficiles,d’êtrelàpourmoitoutsimplement.

Finalement,merciàTOUTEmafamille.Merciàmesparentsetàmonfrèred’avoirsu gommerladistanceetd’avoirtoujours,toujoursétélàpourm’aideretmesoutenirdansles moments(très)difficiles,pourtouslesbonsmomentsremplisdesimplicitéetdesincéritéet pourvotrefierté…Vousavezété,êtesetsereztoujoursprécieux.

TuÜ°ä|tà|ÉÇá

AA :AcideAminé/AminoAcid

ABA :AcideABscissique

ACC :acide1ͲAminoCyclopropane 1ͲCarboxylique

ADN :AcideDésoxyriboNucléique AFLP :AmplifiedFragmentLength

Polymorphism

AGP :ArabinoGalactanProtein ANA :AͲNaphtaleineAceticacid ARN :AcideRiboNucléique ATP :AdénosineTriPhosphate C2H2 :2Cystéines/2Histidines Ca²⁺ :Calcium

CaM :CalModuline

CBL :CalcineurineBͲLike

CDPK :CalciumͲDependantProtein Kinase

CHIP :CHromatinImmuno

Precipitation Chx :Cycloheximide CML :CalModulineLike CPMCW :CytosqueletonͲPlasma

MembraneͲCellWall

CSC :CelluloseSynthaseComplex Cter :CͲterminal

DIECA :DIEthyldithioCArbamicacid DPI :DiPhenyleneIodonium

chloride

EAO :EspèceActivéedel’Oxygène EAR :ERFͲAssociatedͲamphilic

Repressor

ECL :Enhanced

ChemiLuminescence

EDTA : EthyleneDiamineTetraacetic Acid

EGTA :EthyleneGlycolTetraacetic Acid

EPSPS :5ͲEnolPyruvylShikimateͲ3Ͳ PhosphateSynthase ERF :EthyleneͲResponseFactor GdCl3 :GadoliniumChloride GFP :GreenFluorescentProtein GPX :GlutathionePeroXidase GUS :ɴͲGlucUronidaSe

HRP :HorseRadishPeroxydase INRA :InstitutNationaldela

RechercheAgronomique 2ip :N6Ͳ(Ͳ2Ͳisopentenyl)adenine

JA :JasmonicAcid

JAͲile :JAͲisoleucine

kDa :kiloDalton

LaCl3 :LanthanumChloride

LB :LuriaBroth

LOX :LipOXygénase

MAPK :MitogeneActivatedProtein Kinase

Mb :Mégabases

MCA :MechanosensitiveChannelof Arabidopsisthaliana

MS :MurashigeetSkoog

MscL :Mechanosensitivechannelof Largeconductance

MscS :mechanosensitivechannelof smallconductance

MSL :MscSͲLike

NADPH :NicotinamideAdénine DinucléotidePHosphate NLS :NuclearLocalizationSignal Nter :NͲterminal

OPDA :12ͲOxoͲPhytoDienoAte

pb :pairedebases

PBS :PhosphateBufferedSaline PCR :PolymeraseChainReaction PEG :PolyEthylèneGlycol PIAF :Physiqueetphysiologie

Intégrativesdel’ArbreFruitier etforestier

Pta :Populustremulaxalba QALGGH :GlutamineͲAlanineͲLeucineͲ

GlycineͲGlycineͲHistidine qPCR :quantitativePCR Qr :Quantitérelative

RGD :ArginineͲGlycineͲAspartate ROS :ReactiveOxygenSpecies

rpm :RotationParMinute RTͲPCR :reversetranscriptasePCR S³m :S³model,SumͲofͲStrainͲ

Sensingmodel TBS :TrisBufferedSaline

TCH :TouCH

UMR :UnitéMixtedeRecherche

UV :UltraͲViolet

W5 :NͲ(6ͲAminohexyl)Ͳ1Ͳ naphthalenesulfonamide W7 :NͲ(6Ͳaminohexyl)Ͳ5ͲchloroͲ1Ͳ

naphthalenesulphonamide WAK :WallAssociatedKinase

XET :Xylogluycane

EndoTransglycosylase

XTH :XETHydrolase

ZF :ZincFinger

ZFP :ZincFingerProtein

fÉÅÅt|Üx

IntroductionGénérale...1

Synthèsebibliographique...4

A. Lepeuplier,unmodèled’étude...5

B. Lesvégétauxfaceauxstress...6

C. Lestressmécanique...7

1. Sollicitationsinternes...7

2. Sollicitationsexternes...10

D. Lesréponsesthigmomorphogénétiques...10

1. Modificationdelacroissancelongitudinale...11

2. Modificationdelacroissanceradiale...14

3. Modificationdusystèmeracinaire...15

4. Autresmodificationsetlimites...16

E. Perceptionettransductiondusignalmécanique...18

1. Laperceptiondusignalmécanique...18

a. Lavariablephysiquemécanoperçue...19

b. Lecontinuumcytosquelette–membraneplasmique–paroi:CPMCW...21

c. Lescanauxmécanosensibles...22

2. Lesacteursmoléculairesprécocesdelavoiedesignalisationdusignalmécanique...25

a. Lesmessagerssecondaires...25

b. Lescalmodulines...27

c. Lesprotéineskinases...28

d. Leshormones...29

e. Lesfacteursdetranscription...32

F. LesprotéinesàdeuxdoigtsdezincdetypeC2H2...34

1. Généralités,structureetclassification...34

2. Motifsconservés...37

3. FonctionsdesC2H2ͲZFPs...38

a. Implicationdansledéveloppement...38

b. Implicationdanslaréponseauxstress...39

4. LegènedepeuplierPtaZFP2...41

G. Objectifsdelathèse...44

Résultats...47

Chapitre1...48

EtudephylogénétiquedesQͲtypeC2H2ͲZFPschezlesplantesetanalysed’expressionde gènesdepeuplierenréponseauxstressosmotique,aufroidetàlasollicitationmécanique48 Chapitre2...67

Régulationdel’expressiondePtaZFP2suiteàunestimulationmécanique...67

A. Introduction...68

B. MatérieletMéthodes...71

1. Culturescellulaires...71

2. Applicationd’unesollicitationmécanique...71

a. Compressiondegelsd’agarose...71

b. Sollicitationparagitation...72

3. Traitementscellulaires...73

4. ProductiondesconstructionscontenantlepromoteurdélétédePtaZFP2enamontdes gènesrapporteursGFPetGUS...73

a. ClonagederégionsprogressivementdélétéesdupromoteurdePtaZFP2parle systèmeGateway...73

b. Transformationd’Agrobacteriumtumefaciens...74

c. Productiondescellulesdepeupliertransgéniques...75

d. Traitementscellulairesdeslignéestransgéniques...76

e. VérificationsparPCR...76

5. Extractionsd’ARNetsynthèsed’ADNc(RT)...77

a. Extractiond’ARNsàpartirdesgelsd’agarose...77

b. Extractiond’ARNsàpartirdeculturescellulairesetsynthèsed’ADNc...77

6. Extractionsd’ADN...77

7. Analysesd’expressionparRTͲPCRquantitativeentempsréel...78

C. Résultats...79

1. Applicationd’unesollicitationmécaniquesurdescellulesdepeuplier...79

2. Régulationdel’expressiondePtaZFP2aucoursdelasollicitationmécanique...81

3. DélétionsdupromoteurdePtaZFP2eteffetsurlaréponseàlasollicitationmécanique....82

D. Discussion...85

1. Applicationd’unesollicitationmécaniquequantifiableauniveaucellulaire...85

2. Régulationdel’expressiondePtaZFP2aucoursdelasollicitationmécanique...88

3. EtudedeszonesimportantesdupromoteurdePtaZFP2...91 E. Conclusion...94 Chapitre3...95 EtudedelaprotéinePtaZFP2...95 A. Introduction...96

B. MatérieletMéthodes...99 1. Productiondesouchesd’AgrobacteriumexprimantlaprotéinePtaZFP2enfusionavecla

GFP 99

a. ClonagedelafusionPtaZFP2ͲGFPparlesystèmeGateway...99 b. Transformationd’Agrobacteriumtumefaciens...100 2. Testsd’agroinfiltrationsurdesplantsdetabac...100 3. Productiond’uneprotéineétiquetée6ͲHistidinesdansE.coli...101 a. Transformationdesbactéries...101 b. Culturebactérienneetinductiondelaproductiondeprotéines...102 c. Extractiondesprotéinesd’E.colisolublesetinsolubles...102 d. Purificationdelaprotéinemarquée6ͲHistidinesenconditionsdénaturantes...103 e. Détectiondesprotéines...103 4. Etudedel’accumulationdelaprotéinePtaZFP2invivo...104 a. Matérielvégétaletconditionsdeculture...104 b. Sollicitationmécanique...105 c. Extractionsdeprotéines...105 d. Détectiondesprotéines...105 5. Immunolocalisation...106 a. Sollicitationsmécaniques...106 b. Fixationetinclusiondumatérielvégétaldanslarésine...107 c. Coupeshistologiques...107 d. Immunolocalisationinsitu...107 e. Réactiondecoloration...108 C. Résultats...109 1. LocalisationsubͲcellulairedelaprotéinePtaZFP2...109 2. Productiond’anticorpsantiͲPtaZFP2etdelaprotéinemarquée6ͲHistidinesdansE.coli..110 a. Productiond’anticorpsspécifiquesdePtaZFP2...110 b. ProductiondelaprotéinePtaZFP2dansE.coli...110 3. EtudedelaprotéinePtaZFP2invivo...114

a. Accumulationdelaprotéineinvivosuiteàunestimulationmécanique:détectionpar

westernͲblot...114 b. LocalisationtissulairedePtaZFP2:immunolocalisation...116 D. Discussion...118 1. LocalisationsubͲcellulairedelaprotéine...118 2. ProductiondelaprotéinedansE.coli...120 3. Etudedelaprotéineinvivo...121 4. Localisationtissulairedelaprotéine...122 E. Conclusion...124 DiscussiongénéraleetPerspectives...125

A. QuesepasseͲtͲilenamontdePtaZFP2lorsd’unesollicitationmécanique:larégulation

dugène...126 1. Laréponseaustressmécaniqueauniveaucellulaire...126 2. LarégulationdugènePtaZFP2...128

a. Lesmessagerssecondairesetlessignauxchimiquesimpliquésdanslarégulation rapidedel’expressiondugènePtaZFP2aucoursd’unesollicitationmécanique...128 b. LepromoteurdePtaZFP2etlesfacteursdetranscriptionpotentiellementimpliqués danssarégulation...135 B. QuesepasseͲtͲilenavaldugène:étudedelaprotéine...138 1. Etudephylogénétiqueetmotifsprotéiques...138 2. Etudedelaprotéine...140 RéférencesBibliographiques...145 Annexes...162 Annexe1...163 Annexe2...165 Annexe3...166 Annexe4...167 Annexe5...168 Annexe6...169 Annexe6...169 Annexe7...170

1

\ÇàÜÉwâvà|ÉÇ Z°Ç°ÜtÄx

\ÇàÜÉwâvà|ÉÇ Z°Ç°ÜtÄx

2

Danslanature,lesvégétauxsubissentdescontraintesd’originesenvironnementales variées : teneureneau ou en composants du sol, intensitélumineuse, température, pathogènes,etc...Siellessontenexcèsouensituationdecarence,ellespeuventalorsêtre perçuescommeunstressparlaplante.Jusqu’àrécemment,lessollicitationsmécaniques étaientsouventpeuconsidérées.Pourtant,danslesconditionsnaturelles,lesplantessont constammentsoumisesauxsollicitationsmécaniquesquipeuventêtred’origineinterne (croissanceetdifférenciationcellulaire,variationdepressiondeturgescence)ouexterne (vent,toucher,passagesd’animaux,activitésanthropiquesoutoutsimplementimpactdela pluieoupoidsdelaneige).

Chez les ligneux, cette capacité à percevoir et à répondre aux sollicitations mécaniquesestessentiellepourpermettreauxarbresdesemaintenirdroitsetd’atteindre deshauteurspouvantallerjusqu’àplusieursdizainesdemètres.Eneffet,pourmaintenir leurstabilitédansunenvironnementmécaniqueconstammentfluctuant(dufaitdeleur croissance continue et des variations météorologiques), les arbres doivent adapter continuellementlacroissancedeleurtroncetdeleursbranchesainsiqueledéveloppement deleursystèmeracinairepourmaintenirleurancrageausol(Mouliaetal.,2006).En d’autrestermes,unarbredoitmesurermécaniquementàlafoislesconséquencesde l’augmentationdesonpoidspropreetdesapriseauvent,afind’acclimatersacroissanceet sastructure.Cesmodificationsdecroissance(réductiondelacroissancelongitudinale, augmentationdelacroissanceradialeetdel’enracinement)amènentlaplanteàêtreplus résistanteauxfuturessollicitationsmécaniques.D’autrepart,laplantedoits’acclimaterà sonenvironnementextérieur:silesplantesarrêtaientleurcroissanceprimaireàchaque sollicitation,leurcroissanceseraitextraordinairementfaible.Laplantedoitdoncrépondre seulementauxsollicitationsmécaniquesponctuellesetajustersasensibilitéauxflexions successives,cequiestdéfinicommel’accommodation(Martinetal.,2010).Siaujourd’hui lesréponsesphysiologiquesdesplantesauxsollicitationsmécaniquessontrelativementbien connues, il n’en est pas de même pour les acteurs moléculaires impliqués dans la mécanoperceptionetsarégulation.

Cetravaildethèseapourbutdemieuxcaractérisercettevoiedesignalisationde réponseaustressmécaniquechezlepeuplier.Certainesmoléculesontdéjàétédécrites commeacteursdecetteréponse(Telewski,2006;Chehabetal.,2009)etcertainsgènes

\ÇàÜÉwâvà|ÉÇ Z°Ç°ÜtÄx

3

mécanosensiblesontétéidentifiésgrâceàuneapprocheglobale(Leeetal.,2005;LeblancͲ Fournieretal.,2008),maislesinteractionsentrecesdifférentsacteursrestentàdéfinir.

Cetteétudeadébutéaumomentoù,aulaboratoire,ungènemécanosensibleinduit dès5minutesaprèslaflexionaétéidentifiéchezlesligneux(LeblancͲFournieretal.,2008;

Martinetal.,2009).Cegène,nomméPtaZFP2,codeuneprotéineàdeuxdoigtsdezincde type C2H2, protéinesétantdécrites dans lalittérature comme étant des facteurs de transcription.Chezlepeuplier,lestravauxdel’équipeontmontréquecegènes’exprime localementdansla zonefléchieet que l’intensitédesonexpressionest linéairement corréléeàl’intensitédelasollicitationmécanique(Martinetal.,2009).Deplusl’induction del’expressiondecegèneenfonctiondel’intensitédesollicitationestmodifiéesuiteàdes sollicitationsmécaniquesrépétées.Cecimetenévidenceunphénomèned’accommodation delasensibilitémécanoperceptiveaucoursdel’acclimatationdesplantes(Martinetal., 2010). PtaZFP2 constitue donc un bon marqueur cellulaire précoce, à la fois de la mécanoperceptionetdelarégulationdecelleͲci.C’estcegènequenousutiliseronsiciafin decaractériserlavoiedesignalisationdustressmécanique.

Avantdeprésenterlesrésultatsobtenusaucoursdecestroisannéesdethèse,une synthèsebibliographiquedresseraunétatdeslieuxdesconnaissancesactuellesrelativesà notre sujet d’étude:mécanoperception, réponses thigmomorphogénétiques, molécules impliquées…Aprèsavoirintroduitetdécritlanatureetl’impactdesstressmécaniquessurle développementdesplantes,lasynthèsebibliographiqueprésenteralesacteurspotentielsde laperceptiondessollicitationsmécaniquesetlesmoléculesimpliquéesdanslavoiede réponseprécoce.Enfin,puisquelegèned’intérêtestuneprotéineàdoigtsdezincdela familledesC2H2,unepartiedelasynthèsebibliographiquedécriralastructure,lafonction, laclassificationetlerôledecesprotéinesdansledéveloppementainsiquelaréponsedes plantesauxstress.Finalement,nousdécrironsprécisémentlesobjectifsdecettethèse.

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LepeuplierestunligneuxdelafamilledesSalicaceaeet du genrePopulus.Il comprenddenombreusesespècesethybridesnaturelsoucréésparl’homme.C’estunarbre àcroissancerapidequifaitpartiedesarbreslesplusproductifsdesrégionstempérées (Zsuffaetal.,1996).Cependantsaforteproductivitéestliéeàuneforteexigenceeneau (Tschaplinskietal.,1994).Pourcetteraison,ilestretrouvéàl’étatnaturelsurlesrivesdes cours d’eau et sa culture est restreinte aux plaines alluviales. La France est le 3^ème producteurmondialdeboisdepeuplieravec240000hectares,soit2%desasurface forestière:laproduction,l’exploitation,latransformationduboisdepeuplierontune grandeimportanceéconomiqueenFrance.Leboisdepeuplierestprincipalementutiliséen déroulagepourlesemballageslégers(cagettes,caissettes,bourriches,boîtesàfromage),les allumettes,lecontreplaqué,maiségalementpourlafabricationdepalettesoupourses fibresutiliséesdanslafabricationdepâteàpapier.

L’UMRPIAF(PhysiqueetphysiologieIntégrativesdel’ArbreFruitieretforestier) s’intéresseàl’impactdesfacteursenvironnementauxsurlacroissanceetlasurviedes arbres.Lepeuplierestunmodèleintéressantpourlesapprochesmoléculairesdufaitdeses caractéristiques génétiques et des outils disponibles. Il possède en effet un «petit»

génome: 485 Mb réparties sur 2n=38 chromosomes. Comparativement, le génome d’Arabidopsisthalianacomporte125Mbsur2n=10chromosomesetlegénomedupinest 40à50foisplusimportant.Populustrichocarpaaainsiétélepremierarbredontlegénome aétéentièrementséquencé(Tuskanetal.,2006).Undesavantagesdecetteespèceestque l’onpeut facilement la multiplierparcultureinvitro. Latransgénèse dupeuplierest maîtriséeetc’estl'essencequiafaitl'objetduplusgrandnombred'essaisetdetests d'arbres génétiquement modifiés. On nommera le clone INRA 717Ͳ1B4 sur lequel de nombreuxessaisdetransgénèsesontréalisésenFrance.

Aujourd’huilepeuplierestdevenuuneplantemodèlepourleligneuxaumêmetitre qu’Arabidopsisthalianapourlesherbacées.

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L’animalfaitfaceauxagressionsdumilieuextérieurparunestratégieglobaledetype

«fightorflight»,c'estͲàͲdirelittéralement«batsͲtoioufuis»:l’animalpeutsoitcombattre lestressetsedéfendre,soitfuirlessituationsstressantesversunenvironnementplus favorable(Pottersetal.,2007).Lesvégétauxsontpourlaplupartdesorganismesfixésetne peuventfuirlestress.Ainsi,beaucoupdeplantesmodifientleurcroissanceet/ouleur physiologielorsqu’ellessontexposéesàunstress.C’estcequel’onpeutdéfinircommela plasticité développementale qui est la capacité d’un génotype à produire différents phénotypes en fonction de son environnement (Pigliucci, 2001). Ces réponses physiologiquespermettentauxplantessoitdesedéfendredirectementcontrelestresspar desprocessusd’acclimatation,soitdelimiterleurexpositionàceluiͲcipardesmodifications decroissanceoudesdécalagesphénologiques.

D’unpointdevuegénérallesstressinduisentdesréponsesmorphogénétiquesquise décomposenteni)unemodificationdel’élongationcellulaire,ii)unevariationlocaledela divisioncellulaireetiii)unealtérationdeladifférenciationcellulaire(Pottersetal.,2007).

Lespremièresmoléculesintervenantsuiteàlaperceptiondecesdifférentsstresssont diversesmaissouventcommunes.OnretrouveparmicellesͲcilecalcium(Ca²⁺),lesespèces activéesdel’oxygène(EAO),lesphytohormones(auxine,acideabscissique(ABA),éthylène, jasmonates)(Clapham,1995;Sandersetal.,1999;Milleretal.,2008;KooandHowe,2009).

Laspécificitédelaréponseestdonnéeparlaoulesmolécule(s)synthétisée(s),lelieude synthèse,sonintensitéetsadurée:onparledesignaturespatioͲtemporelle.AinsilesEAOet lecalciuminterviennentdanslaréponseàdenombreuxstressmaisc’estlaspécificitéde leur signature spatioͲtemporelle qui dicte la réponse (Clapham, 1995; McAinsh and Hetherington, 1998; Gechev et al., 2006; McAinsh and Pittman, 2009). On retrouve égalementcephénomènedesignaturecalciquedansdenombreuxprocessusphysiologiques chez l’homme (Berridge et al., 1998). Cependant, si les réponses physiologiques aux différentsstresssontgénéralementbiendécrites,lesmécanismesdeperceptionetlesvoies designalisationrestentmalexpliqués.Denombreusesétudess’intéressentdoncauxvoies moléculairesassociéesauxstress.