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ZFP2V{tÑ|àÜx E
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TA \ÇàÜÉwâvà|ÉÇ
Comme nous l’avons souligné dans la synthèse bibliographique, ni les acteurs
moléculaires de la mécanoperception, ni le mode de régulation de celleͲci ne sont
complètementidentifiéschezlesplantes.Ladeuxièmepartiedecetravaildethèseapour
objectifdecomprendrelesétapesprécocesentrelamécanoperceptionetl’expressiondes
gènesmécanosensibles.
Lemodèlebiomécaniquedemécanoperceptionproposéaulaboratoirepréditque,lors
d’unesollicitationmécanique,chaquecellulepercevraitladéformationdesamembrane
plasmiqueetproduiraitunsignaldontl’intensitéestdirectementcorréléeàl’intensitédela
déformationperçue.Auseind’untissu,lesignalproduitcorrespondàlasommedessignaux
produitsparchaquecellulecomposantcetissuetayantsubiunedéformation.Cemodèlea
étéconfirméauniveautissulaire:danslazonefléchiedelatige,l’expressiondePtaZFP2est
corréléelinéairementàlasommedesdéformationslongitudinalessubiesparlescelluleset
calculéesurcetteportiondetige(Coutandetal.,2009).Noussouhaitionsdansunpremier
tempsmettreaupointunsystèmedesollicitationmécaniquepermettantdevaliderce
modèleauniveaucellulaire.Lapremièreétapedecetravailadoncconsistéàmettreen
placeunsystèmedesollicitationmécaniquequantifiablesurdescellulesdepeuplier.Deux
techniquesontététestéessuccessivement:lapremièrereposesurleprinciped’incluredes
cellulesdansungeld’agaroseetderéaliserunecompressioncontrôléedugel,laseconde
techniqueconsisteàmodifierl’agitationdesculturescellulaires.
Dansundeuxièmetemps,nousavonscherchéàcomprendrelarégulationdugène
PtaZFP2suiteàunesollicitationmécanique.Danslepremierchapitre,nousavonsidentifié
plusieurs molécules capables de réguler l’expression de PtaZFP2 selon une cinétique
similaireàcelleobservéesuiteàuneflexiondelatige:calcium,H2O2etjasmonates
(Gourcilleauetal.,soumis).Toutefois,nousavonségalementmisenévidencequecegène
pouvaitêtre régulépar d’autresstressabiotiques. Il semblaitdoncintéressantde(1)
retrouverparmilesmoléculescapablesderégulerl’expressiondePtaZFP2cellesquisont
gène promoteur boîtederéponse
TATAbox
ARNpolyméraseetfacteurs
detranscriptionassociés Protéinefortement inhibitrice Complexeprotéique faiblementactivateur Complexeprotéique
fortementactivateur Complexeprotéique
« silencieux »
Figure27:Schématisationd’unpromoteur.Lepromoteur,situéenamontdugènedontilrégule l’expression,possèdedesélémentscisͲrégulateurs(boîtesderéponse)capablesdefixerdes facteursdetranscriptionactivateurs(activationreprésentéepardesflèchesrouges)ouinhibiteurs (inhibitionreprésentéepardesflèchesbleues)agissantsurl’ARNpolymérase,elleͲmêmefixéesur uneTATAͲbox.
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identifierquellessontlesrégionsouélémentscisͲrégulateursdupromoteurimpliquésdans
cettemécanoperception.
Pour tester si ces molécules identifiées dans la première partie (calcium, H2O2 et
jasmonates)régulentl’expressiondePtaZFP2danslecadredelaréponseàlasollicitation
mécanique, nous avons utilisé une approche pharmacologique en étudiant l’effet
d’inhibiteursdecesdifférentesvoiessurl’inductiondel’expressiondePtaZFP2.
Lespromoteurs(ouséquencespromotrices)sontdesséquencessituéesenamontdela
séquencecodanted’ungène.Lafixationdel’ARNpolymérasesurunpromoteurauniveau
delaséquenceconsensusTATAAT(boîteTATA),située25nucléotidesenamontdusite
d’initiationdelatranscription,etl’activationdecetteARNpolymérase,sontcontrôléespar
des facteurs de transcription (éléments transͲrégulateurs), euxͲmêmes fixés sur des
séquencescisͲrégulatricesdupromoteur(Figure27).CesséquencescisͲrégulatricessont
égalementappeléesélémentsderéponseouboîtesderéponse.Ainsi,ensefixantsurces
séquencessituéesàdesdistancesvariablesdusited’initiationde latranscription,les
facteursdetranscriptionrégulentl’activitédel’ARNpolymérase.Ontrouvedesfacteursde
transcription de type activateur et d’autres de type répresseur: l’activité de l’ARN
polyméraserésulteraalorsdel’ensembledessignauxreçus.
Identifierlesboîtesderéponseausignalmécaniqueauseind’unpromoteurpermetdonc
d’accéderpotentiellementauxfacteursdetranscriptionrégulantlegènecorrespondant.Au
commencementdecetravaildethèse,lespromoteursdesgènescodantpourlesprotéines
QͲtype C2H2ͲZFP n’avaient pas été analysés. De plus, seule une boîte de réponse
potentiellementimpliquéedanslestressmécaniqueaétéidentifiée,paruneapprochein
silicobaséesurl’analysebioinformatiquedetouslespromoteursdesgènesinduitsparla
blessure(stressmécaniquelésant)chezArabidopsisthaliana(Walleyetal.,2007).Larégion
5’enamontdelaséquencecodantedugènePtaZFP2aétéisoléeprécédemmentpar
criblageparPCRd’unebanqued’ADNgénomique(Martinetal.,2009).Unerégionde2,2kb
avaitétéinitialementisoléemaisles700premièrespairesdebasemontraientuneforte
homologieavecunADNcderacinedepeuplier:unfragmentde1512pbaétéfinalement
conservé(Martin,2009).UneanalyseaveclelogicielPLACEWebSignalScanapermis
d’identifier plusde 330 éléments de réponse potentiels;la Figure26de lasynthèse
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promoteurseucaryotes(Martinetal.,2009).Surunpromoteur,touslesélémentscisͲ
régulateurs identifiés in silico ne sont pas forcément fonctionnels. Par exemple, de
nombreusesboîtesderéponseàl’obscuritésontprésentessurlepromoteurdePtaZFP2
alorsqueleniveaud’expressiondugèneàl’obscuritén’estpasdifférentdeceluidétectéàla
lumièreenconditiontémoin(Figure22delasynthèsebibliographique)(Martinetal.,2009).
Afindetesterquelles régions du promoteur sontimpliquéesdanslarégulationde
PtaZFP2,nousavonsréalisédesdélétionssuccessivesdupromoteurdePtaZFP2placéesen
amontdesgènesrapporteursGUSetGFP,ettestélaréponsedesconstructionsaustress
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Lesculturescellulairesdepeuplier(Populustremulaxalba,clone717Ͳ1B4)ontété
initiéesentransférant2à3gdecal«frais»dans20mLdemilieuMB5liquide(Annexe1)
additionné de 2 mg.mLͲ1 d’acide 2,4Ͳdichlorophénoxyacétique (2,4ͲD), 0,2 g.LͲ1 de LͲ
glutamine et 1 mg.LͲ1 de vitamines (acide nicotinique, chlorhydrate de pyridoxine et
chlorhydratedethiamine).Ellesontétémaintenuesàl’obscuritésousuneagitationdouce
(120rpm)dansunechambredecultureà23°Cpendantaumoins8joursetontétéréͲ
ensemencéestousles4joursenmettant10mLdelaculturecellulairedans40mLdemilieu
MB5liquidefraisadditionnéde2mg.mLͲ1d’acide2,4Ͳdichlorophénoxyacétique(2,4ͲD),0,2
g.LͲ1delͲglutamineet1mg.LͲ1devitamines(acidenicotinique,chlorhydratedepyridoxineet
chlorhydratedethiamine).
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a. Compressiondegelsd’agarose
40mLdeculturecellulairedepeuplier(environ12gdecellules)ontétéincubéspendant
10minavec400µLderougeneutre(colorantvital,1%).Aprèssédimentationdescellules,le
milieudeculture(coloréenrouge)estretiréet20mLdemilieuMB5liquidefraisadditionné
de2mg.mLͲ1d’acide2,4Ͳdichlorophénoxyacétique(2,4ͲD),0,2g.LͲ1deLͲglutamineet1mg.LͲ
1devitamines(acidenicotinique,chlorhydratedepyridoxineetchlorhydratedethiamine)
ontétéajoutés.LaculturecellulaireaétéplacéedansunbainͲmariedontlatempératureest
ajustéeprogressivementà35°C.Parallèlement,3,6gd’agaroselowmelting(Sigma)sont
dissousdans100mLdecemêmemilieu.Cegelestincubéluiaussià35°Cafind’éviterun
chocthermiquepourlescellules.Aprèsavoiratteintlabonnetempérature,les20mLde
Figure28:Machined'essaidetraction/compressionInstron(modèle5565)utiliséepoureffectuer
lestestsdecompressiondegelsd’agarose.
Plateauxde
compression
Celluledeforce
Systèmede
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concentrationfinaledugeld’agaroseestdoncde3%.Aprèspolymérisation,legelest
démoulé,immergédansdumilieudecultureafind’éviterledessèchementetplacéen
chambredeculture(23°C,obscurité).Pours’affranchirdustressliéàl’inclusiondescellules
danslegeld’agarose(stressmécaniqueetthermique),lestestsdecompressionontété
effectués24haprèslaréalisationdecesgels.
Desparallélépipèdesrectanglesde60x35x15mm3ontétédécoupés.Ceséprouvettes
ontétésollicitéesencompressionentre2plaquesenacierrecouvertedeplexiglasàl'aide
d'unemachined’essai(Instron,modèle5565,Figure28).Lesvitessesdesollicitationtestées
étaienttypiquementde1%.minͲ1etletauxdecompressionmaximumde25%.Unappareil
photonumériqueaétéutilisépourphotographiertouteslesminuteslafacelatéralede
l'échantillonetsuivrel'étatdedéformationdescellulesaucoursdel'essai.Alafindel'essai,
l'échantillonestlaisséaurepospendant10minutes(délaid’expressiondePtaZFP2en
réponseàunesollicitationmécanique(Martinetal.,2009))avantd'êtreplongédansde
l’azoteliquidepuisconservéàͲ80°Cjusqu’àanalyse.
b. Sollicitationparagitation
Desaliquotsde5mLdeculturecellulairedepeuplier(environ1,5g)de4joursontété
placésdansdestubesstérilesde15mLetlaisséssousagitationà120rpmàl’obscuritéetà
23°C pendant 2h afin de permettre aux cellules de «récupérer» de la sollicitation
mécanique due à l’aliquotage (PtaZFP2 revient à son niveau de base 2h après une
sollicitationmécanique(Martinetal.,2009)).Lesculturescellulairesontalorsétésollicitées
mécaniquementenaugmentantlavitessedel’agitationà325rpmsurunagitateurrotatif.
Lesautresconditionsdeculture(23°Cetobscurité)ontétémaintenuespendantladuréede
l’expérience.
Figure29:Représentationschématiquedupromoteuretdesdifférentesconstructionsutiliséespourl’étude
desrégionsrégulatricesdupromoteurdugènePtaZFP2.(a)Lepromoteurentieroudélétéàdifférentsniveaux estplacéenamontdesgènesrapporteursdelaGFP(GreenFluorescenceProtein,vert)etGUS(Glucuronidase, bleu).LeschiffresfontréférenceàlapositionparrapportaucodonATG(+1).(b)Amorcessensetconditionsde PCRutiliséespouramplifierlesdifférentesrégionspromotricesdélétéesdugènePtaZFP2.
Construction Séquencedel'amorceutilisée T°Cd'hybridation Ͳ1433àͲ1pb 5'ͲCACCATCCGTGTTATGAAAGTTTGAͲ3' 60°C Ͳ1010àͲ1pb 5'ͲCACCTGAAACCAGGTTAACCCGGAAͲ3' 60°C Ͳ512àͲ1pb 5'ͲCACCTTAATAGGGGTTTCTACATGAͲ3' 55°C Ͳ451àͲ1pb 5'ͲCACCGGTCGGACTTGCACTCAATATͲ3' 55°C Ͳ362àͲ1pb 5'ͲCACCCATCAATGACCGGATGTAATͲ3' 55°C Ͳ210àͲ1pb 5'ͲCACCCATAATTGCCCCTCAAGCAAAGͲ3' 55°C Ͳ160àͲ1pb 5'ͲCACCTCCTTCCAACCTTATAAATAͲ3' 55°C b a
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Commeprécédemment,desaliquotsde5mLdeculturecellulairede4joursontété
placésdansdestubesstérilesde15mLetlaisséssousagitationà120rpmàl’obscuritéetà
23°Cpendant2hafind’annulerlestressmécaniqueduàl’aliquotage(Martinetal.,2009).
Pourl’étudedesinhibiteurs,lescellulesontétépréͲtraitées1havecduLaCl3(Chlorure
delanthane,inhibiteurdescanauxcalciques,0,5mM),duGdCl3(Chloruredegadolinium,
inhibiteurdecanauxcalciquesmécanosensibles,1mM),duW7(NͲ(6Ͳaminohexyl)Ͳ5ͲchloroͲ
1Ͳnaphthalenesulphonamide, antagoniste des calmodulines, 200 µM), du W5 (NͲ(6Ͳ
Aminohexyl)Ͳ1Ͳnaphthalenesulfonamide, analogue du W7, 200µM), du DIECA
(DIEthyldithiocarbamicAcid,inhibiteurdela voiedesjasmonates,1,5mM)ouduDPI
(DiPhenyleneIodoniumchloride,inhibiteurdelaproductiond’EAO,100µM).Cesdifférents
produitsont été fournis par Sigma. L’agitation,l’obscurité et la température ontété
maintenuesduranttouteladuréeduprétraitement.Lescellulesontalorsétésoumisesou
non(témoins)àunesollicitationmécanique(agitationà325rpm).Alafindutraitement,
aprèssédimentationdescellulespendant30secondesà1minute,lemilieuestretirépar
pipetage.Lescellulesontétéplongéesdansdel’azoteliquideetconservéesàͲ80°Cjusqu’à
analyse.