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Microencapsulation par coacervation complexe des
protéines du lactosérum et de la gomme d’acacia
Delphine Ach
To cite this version:
Delphine Ach. Microencapsulation par coacervation complexe des protéines du lactosérum et de la gomme d’acacia. Génie chimique. Université Claude Bernard - Lyon I, 2014. Français. �NNT : 2014LYO10186�. �tel-01127432�
N° d’ordre : 186-2014 Année 2014
THESE DE L’UNIVERSITE DE LYON
Présentée devant
L’UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1
Ecole Doctorale de Chimie de Lyon Pour l’obtention du
DIPLOME DE DOCTORAT
(arrêté du 7 août 2006) Spécialité Chimie
Soutenue publiquement le 6 octobre 2014 Par
Delphine ACH
Microencapsulation par coacervation complexe des
protéines du lactosérum et de la gomme d’acacia
Directeur de thèse : Monsieur Yves CHEVALIER
Jury : Professeur Marie-Alexandrine BOLZINGER Professeur Stéphanie BRIANCON
Monsieur Guy BROZE Professeur Odile CHAMBIN Monsieur Yves CHEVALIER Professeur Denis PONCELET
Présidente du jury Co-directeur de thèse Co-encadrant de thèse Rapporteur Directeur de thèse Rapporteur
UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1
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Remerciements
Cestroisannéesdethèseontétél’occasiondenombreusesrencontresetcollaborations,ilconvient donc de commencer ce manuscrit par des remerciements envers toutes les personnes ayant collaborédeprèsoudeloinàlaréalisationdecetravail.
Cetravailderecherches’estdérouléauseinduLAGEP.Jeremerciedoncsondirecteur,HatemFESSI, pourm’avoirpermisd’yeffectuercetravail.
Je tiens à exprimer toute ma gratitude à mes directeurs de thèse, Yves CHEVALIER et Stéphanie BRIANCON,pourleurencadrementdurantcestroisannéesetquelquesmois...Jelesremerciepour m’avoirconfiéceprojetderecherche,pourleursconseilsexpérimentauxetrédactionnels,ainsique pourl’autonomiequ’ilsm’ontlaissée,meformantainsiàlarecherche.
Je remercie également Yves MOREELS, Directeur Technique, et Alain GERMEAU, Directeur de la Recherche&Développementpourm’avoirdonnél’opportunitéd’effectuercestravauxderecherche en collaboration avec Prayon. Je tiens à remercier tout particulièrement Guy BROZE, Chargé de RechercheSénioretResponsableduprojetNutrition,pouravoircoͲencadréceprojetderecherche. JeremercieMmeOdileCHAMBINetMrDenisPONCELET,pouravoiracceptéd’êtrerapporteursde cetravail,etMmeMarieͲAlexandrineBOLZINGER,pourfairepartiedujurydethèse. Cetravailn’auraitpasétépossiblesansdiversescollaborations.J’exprimetoutemareconnaissance àVincentDUGASpourm’avoirinitiéeàl’électrophorèsecapillaire;OlivierMARCILLATpourm’avoir faitrevoirl’électrophorèseSDSͲPAGEetpourm’avoirfaitdécouvrirlafluorimétrie;AlainRIVOIREet JeanͲMarcGALVANpourlaréalisationdessuivisinsituaveclasondevidéo;SandraBALVAYpourles analyses sur lecteur de plaques, François PUEL pour ses précieux conseils concernant l’étude du procédéd’émulsification.
Un grand merci aussi aux stagiaires que j’ai encadré au cours de cette thèse: Aurélie, YanͲSiong, Séverine,Marine,Laure,Coraline,Elodie,RomyetYali.Jelesremerciepourletravailexpérimental réaliséainsiquepourl’intérêtqu’ilsontmanifestéàceprojet!
JeremerciechaleureusementtouslesmembresduLAGEPetplusparticulièrementNadia,JeanͲPierre et Jocelyne, pour leur bonne humeur, leur disponibilité et leur soutien. Je pense aussi à toutes les personnes rencontrées en salle conviviale avec qui j’ai passé d’agréables moments. Une pensée particulièrepourlesoccupantsdubureauG203quisesontsuccédésdurantmathèse:Sami,Basile, Audrey,Géraldine,Faïza,JessicaetLaure(lesdernièresquiaurontsubislestressdelarédactionmais
qui ont réussi à maintenir une bonne humeur quotidienne dans le bureau!). Une pensée pour les collègues thésards qui n’ont pas encore terminé: Fabrice, Barth, Angèle... Un merci aussi à mes partenairesdefootingdumidiVincent,ZigetSeb,quim’ontpermisdeconserverunespritsaindans uncorpssain!EtenfinungrosmerciàManelle,mabinômettedeTP,mapartenairedecourse,pour avoir partagé les bons et les mauvais moments pendant 3 ans, que de souvenirs au labo et en dehors…
Je pense également aux personnes que j’ai côtoyées à l’ISA lors de mes expérimentations en électrophorèsecapillaire,pluslonguesqueprévues:ClaireDEMESMAY,RachaetAudrey.
Je remercie aussi l’équipe Nutrition d’Engis: Carl SZÖCS, AnneͲCécile RIHON, Antoinette PRESTI, AudreyLERUITEetAdelineNAVARROpouravoirparticipéàl’avancementdeceprojetainsiquepour leur accueil chaleureux lors de mes visites en Belgique. Une petite pensée pour Claire avec qui j’ai passéd’agréablessoiréesàLiège.
Enfin je tiens à remercier ma famille, et plus particulièrement mes parents et ma Riri, pour leur soutiensansfailledurantceslonguesannéesd’études.Mêmesivousavezplusoumoinscomprisce quej’aifaitdurantcestroisannées,vousm’aveztoujoursencouragée,surtoutdanslaphasefinale… Et merci à Sébastien, pour être à mes côtés, pour sa patience lors des moments de stress et de doutes,pouravoiressayédemefaciliterlaviedurantcesderniersmois,etpouravoirspontanément proposédemerelireaucoursdelarédaction.Cettethèseestunpeulavôtre!
Thèse industrielle, contrat CIFRE entre le LAGEP et Prayon
Laboratoire d’Automatique et de Génie des Procédés (LAGEP)
Université Lyon 1 - LAGEP43 Boulevard du 11 novembre 1918 Bâtiment CPE-308G 69622 Villeurbanne Cedex
Prayon
Rue J. Wauters 144 4480 Engis BelgiumRésumé
Ce travail porte sur l’étude de la microencapsulation d’huile de lin par coacervation complexe des protéines du lactosérum et de la gomme d’acacia. Il se focalise sur la coacervation des protéines du lactosérum et de la gomme d’acacia en milieu aqueux ainsi que sur les mécanismes impliqués dans la formation des microcapsules par coacervation complexe.
La coacervation complexe est un phénomène de séparation de phase associative induit par des interactions électrostatiques entre deux polymères. Le couple de polymères le plus utilisé en coacervation complexe est le système gélatine/gomme d’acacia. Cependant, pour des raisons sanitaires et religieuses, l’utilisation de la gélatine devient controversée pour les applications alimentaires. Un substituant intéressant à la gélatine est constitué par les protéines du lactosérum ainsi que leur composant majoritaire, la bêta-lactoglobuline. L’étude de la composition du coacervat du système protéines du lactosérum/gomme d’acacia a été réalisée lors de ce travail. L’électrophorèse capillaire sur gel a été employée afin de quantifier la bêta-lactoglobuline et l’alpha-lactalbumine dans le coacervat. L’influence du ratio protéine/polysaccharide et du pH sur la composition du coacervat a été étudiée.
Bien que le procédé d’encapsulation par coacervation complexe soit connu depuis de nombreuses années, les mécanismes conduisant à la formation des microcapsules restent peu décrits. Le procédé d’encapsulation par coacervation complexe conduisant à la formation des microcapsules est composé de plusieurs étapes nécessitant chacune d’être examinée. L’étape d’émulsification a lieu en régime d’écoulement intermédiaire. La modélisation en régime turbulent rend compte des résultats expérimentaux et pourrait être utilisée pour une transposition d’échelle.
Le suivi in situ du procédé d’encapsulation par coacervation complexe a été réalisé pour la première fois lors de cette étude. Il a été réalisé au moyen d’une sonde vidéo immergée dans le réacteur agité. Cette technique a permis de relever quatre étapes successives induites par l’abaissement du pH. Les influences des paramètres physico-chimiques (ratio protéine/polysaccharide et concentration totale en biopolymères) et des paramètres liés à l’étape de coacervation sur la formation des microcapsules ont aussi été étudiées au moyen de la sonde vidéo.
Mots clés
Coacervation complexe, encapsulation, protéines du lactosérum, électrophorèse capillaire, suivi in situ, émulsification.
Title
Microencapsulation by complex coacervation of whey protein and acacia gum
Abstract
This work deals with the study of linseed oil microencapsulation by complex coacervation of whey proteins and acacia gum. It focuses on the coacervation of whey proteins and acacia gum in aqueous medium as well as the mechanisms involved in the formation of microcapsules by complex coacervation.
Complex coacervation is an associative phase separation phenomenon induced by electrostatic interactions between two polymers. The most widely used pair of polymers in complex coacervation is the system gelatin / acacia gum. However, the use of gelatin is a matter of controversy for food applications. An interesting alternative to gelatin consists of whey proteins and their major component, beta-lactoglobulin. An investigation of the composition of the coacervate system whey protein / acacia gum was carried out during this work. Capillary gel electrophoresis was used to quantify beta-lactoglobulin and alpha-lactalbumin in the coacervate. The influence of protein / polysaccharide ratio and pH on the composition of the coacervate was studied.
Although the encapsulation process by complex coacervation has been known for many years, the mechanisms leading to the formation of microcapsules are not so much described. The encapsulation process by complex coacervation leading to the formation of microcapsules includes several stages that were examined. The emulsification step takes place in the intermediate flow regime. The modeling in turbulent regime accounted for experimental results and might be used for scaling-up the process.
In situ monitoring of the encapsulation process by complex coacervation was performed for the first time in this study. It was carried out using a video probe immersed in a stirred reactor. This technique identified four successive steps induced by lowering the pH: the emulsification of the oil, the formation of the coacervate, the adsorption of the coacervate on the oil droplets, the formation of an encapsulation shell. The influence of physico-chemical parameters (protein / polysaccharide ratio and total concentration of biopolymers) and parameters related to the coacervation step on the formation of microcapsules were also studied by using the video probe.
Key words
Complex coacervation, encapsulation, whey proteins, capillary electrophoresis, in situ monitoring, emulsification.
Tabledesmatières
REMERCIEMENTS...5 RESUME...9 ABSTRACT...11 TABLEDESMATIERES...13 TABLEDESILLUSTRATIONS...15 FIGURES... ...15 TABLEAUX... ...17 INTRODUCTIONGENERALE...21 CHAPITRE1:ETATDEL’ART...29 1.LACOACERVATIONCOMPLEXE...29 1.1.Rappelssurlesinteractionsprotéines/polysaccharides...29 1.2.Lephénomènedecoacervationcomplexe...31 1.3.Etudeapprofondiedelacoacervationcomplexedesprotéinesdulactosérumetdelagommed’acacia ... ...38 2.LAMICROENCAPSULATIONPARCOACERVATIONCOMPLEXE...45 2.1.Généralitéssurlamicroencapsulation...45 2.2.Lamicroencapsulationparcoacervationcomplexe...48 2.3.Problématiquesactuelles...57 3.LESMATIERESPREMIERESUTILISEESPOURCETTEETUDE...61 3.1.Lesprotéineslaitières...61 3.2Lagommed’acacia... ..62 3.3L’huiledelin... ...62 4.BILAN... ...64 4.1.Lacoacervationcomplexe...64 4.2.Lamicroencapsulationparcoacervationcomplexe...64 REFERENCES... ...66 CHAPITRE2:ETUDEDEL’INFLUENCEDESPRINCIPAUXCOMPOSANTSDESPROTEINESDULACTOSERUMSUR LESMECANISMESDECOACERVATIONCOMPLEXEAVECLAGOMMED’ACACIA...79 ABSTRACT... ...81 1.INTRODUCTION... ...82 2.MATERIALANDMETHODS... ...85 2.1.Materials... ...85 2.2.Preparationofpolymerssolutions...85 2.3.SDSͲPAGE... ...85 2.4.Capillarygelelectrophoresis(CGE)...86 2.5.Elisaquantitativeanalysisofcasein...86 2.6.Wheyproteinisolatecomposition...86 2.7.Wheyproteinisolatecomplexcoacervation...87 2.8EͲlactoglobulinandDͲlactalbumincomplexcoacervation...87 3.RESULTSANDDISCUSSION... ...87 3.1.Wheyproteinisolatecomposition...87 3.2.Complexcoacervationofwheyproteinisolate...91 3.3.EͲlactoglobulincomplexcoacervation...963.4.DͲlactalbumincomplexcoacervation...98 4.CONCLUSION... ...100 REFERENCES... ...101 CHAPITRE3:LEPROCEDED’ENCAPSULATIONPARCOACERVATIONCOMPLEXE:ETUDEAPPROFONDIEDE L’ETAPED’EMULSIFICATION...105 ABSTRACT... ...107 1.INTRODUCTION... ...108 2.MATERIALSANDMETHODS... .112 2.1.Materials... ...112 2.2.Preparationofemulsions...112 2.3.Preparationofmicrocapsules...112 2.4.Particlesizedistributionanalysis...113 2.5.Microscopicobservations...113 2.6.Viscositymeasurements...114 2.7.Interfacialtensionmeasurements...114 2.8.Insitumonitoringbyvideoprobe...114 3.RESULTSANDDISCUSSION... ...116 3.1.Influenceofemulsionprocessparametersono/wemulsiondropletsmeandiameter...116 3.2.Evidenceofformationofpolynuclearmicrocapsules...123 3.3.Evidenceofcoacervatedepositiononoildroplets...125 4.CONCLUSIONS... ...128 REFERENCES... ...129 CHAPITRE4:LESUIVIINSITUDUPROCEDED’ENCAPSULATIONPARCOACERVATIONCOMPLEXE...133 ABSTRACT... ...135 1.INTRODUCTION... ...136 2.MATERIALSANDMETHODS... .138 2.1.Materials... ...138 2.2.Preparationofpolymerssolutions...138 2.3.Videoprobecharacteristics...139 2.4.Preparationofmicrocapsules...139 2.5.Microscopicobservations...140 2.6.Particlesizedistributionanalysis...140 3.RESULTSANDDISCUSSION... ..141 3.1.Evidenceofsuccessivestepsofmicroencapsulationbycomplexcoacervation...141 3.2Influenceofthevideoprobe...143 3.3Influenceofthepurificationofwheyproteinsisolate...145 3.4Influenceofprotein:polysaccharideratio...146 3.5Influenceofbiopolymersconcentration...147 3.6Influenceofcoacervationconditions...148 4.CONCLUSIONS... ...150 REFERENCES... ...151 CONCLUSIONGENERALE...157 ANNEXE:PUBLICATIONSETCOMMUNICATIONSISSUESDECETRAVAIL...161
Tabledesillustrations
Figures
Figure1.1:ReprésentationschématiquedesdifférentessituationsdemélangesprotéineͲpolysaccharideen milieuaqueux[d’aprèsMcClements2006]...30 Figure1.2:Schémareprésentantdescomplexesdegommed’acacia(rubanblanc)etdebêtaͲlactoglobuline (sphèresrouges).Lecomplexeestconsidérécommeunenouvelleentitécolloïdale[d’aprèsdeKruifet al.2004]....34 Figure1.3:InfluencedupHsurlerendementdecoacervationcomplexedansdesmélangesgélatine/gomme d’acaciaàuneconcentrationtotaleenpolymèresde1%(ronds:gélatineA,triangles:gélatineB,les gélatinesAetBdiffèrentparleurspointsisoélectriques)[d’aprèsBurgessetCarless1984]....35 Figure1.4:Influencedelaforceioniquesurlerendementdecoacervationcomplexedansdesmélanges gélatine/gommed’acaciaàunratioprotéine/polysaccharide1:1(ronds:gélatineA,triangles:gélatine B)[d’aprèsBurgessetCarless1984]....37 Figure1.5:ImagedecoacervatdebêtaͲlactoglobuline/gommed’acacia(1:1)obtenueparmicroscopie confocaleàbalayagelaser[d’aprèsSchmittetal.2001].Miseenévidencedelastructurevacuolisée. Barred’échelle=5μm....41 Figure1.6:Représentationschématiquedesdeuxtypesdemicroparticules....47 Figure1.7:Représentationschématiqueduprocédéd’encapsulationparcoacervationcomplexe[d’après RichardetBenoît2013]....50 Figure1.8:Représentationdestroistypesdecapsulespouvantêtreobtenusparcoacervationcomplexe [d’aprèsLemetteretal.2009].Photographiesd’expérimentationsréaliséesdurantlathèse....52 Figure1.9:Particulesd’alcoolstéariqueprésentantuneencapsulationincomplèteparlecoacervat gélatine/gommed’acacia[d’aprèsMadanetal.(1972)]....53 Figure1.10:Huileessentielled’orangeencapsuléeparducoacervatcomplexeWP/GA(a:grossesgouttes (50Ͳ200μm)obtenuesparagitationmagnétique;b:petitesgouttes(5Ͳ50μm)obtenuesavecun homogénéisateurrotor/stator[d’aprèsWeinbrecketal.2004f]....54 Figure1.11:Fractionpolysaccharidiquedelagommed’acacia:représentationWattleBlossom[d’après Thevenet2009]....62 Figure2.1:SDSͲPAGEelectrophoresisgelofwheyproteinisolate(ɴͲlg:ɴͲlactoglobulin,ɲͲlac:ɲͲlactalbumin, BSA:bovineserumalbumin,LF:lactoferrin)....88 Figure2.2:WPIsolution(5.5%)asafunctionofpH.FormationofprecipitatesbetweenpH5.2and4.1....89 Figure2.3:WPIelectrophoregramsobtainedbycapillarygelelectrophoresis(SDSͲMW).Evidenceoftwo peaksdisappearanceafteracidictreatment...90 Figure2.4:WPIelectrophoregramobtainedbycapillarygelelectrophoresis(SDSͲMW).Identificationofthe peaksofEͲlgandDͲlac....91 Figure2.5:WPI/AGcomplexcoacervationasafunctionofthePr:Psratio(1:1,2:1and4:1)andpH(between 5andaround2.5).Theturbidityapparitionisrepresentedbyxandthephaseseparationisrepresented byo....93Figure2.6:ProteinconcentrationinthesupernatantasafunctionofpHforthePr:Psratio1:1(A),2:1(B)and 4:1(C)[bluediamonds:EͲlgconcentration;redtriangles:DͲlacconcentration;dashedlines:initial proteinsconcentrations].pHvaluesarepresentedindescendingorderbecauseexperimentationswere performedbydecreasingthepHuponadditionofhydrochloricacid....95 Figure2.7:EͲlg(blue)andDͲlac(red)concentrationsinthesupernatantasafunctionofpHforthePr:Ps ratios(1:1:fullline,2:1:dashedline,4:1:dottedline)....96 Figure2.8:MacroscopicobservationsofɴͲlg/AGcomplexcoacervation.Solutionsat1%polymerswithPr:Ps ratioof2:1,betweenpH6.0andpH2.7,after24hofphaseseparation....97 Figure2.9:EͲlgconcentrationinthesupernatant,after24hofphaseseparationofEͲlg/AGsolutions,asa functionofpHforthePr:Psratio2:1.ThedashedlinemarksthefullconcentrationofEͲlg....98 Figure2.10:MacroscopicobservationsofDͲlac/AGcomplexcoacervation.Solutionsat1%polymerswith Pr:Psratioof1:1,betweenpH6.0andpH2.7,after24hofphaseseparation....99 Figure2.11:DͲlacconcentrationinthesupernatant,after24hofphaseseparationofDͲlac/AGsolutions,asa functionofpHforaPr:Psratioof1:1.ThedashedlinemarksthefullconcentrationofDͲlac....99 Figure3.1:ExperimentalsetͲupforthemicroencapsulationbycomplexcoacervationwiththeinsituvideo probe....116 Figure3.2:Sizedistributionsofo/wemulsionsdropletspreparedwithathreebladesmarinepropellerat rotationrateof800rpm(A)and1,200rpm(B).Emulsificationtimesof15min(bluediamonds),30min (greencircles),and45min(redtriangles)aregiven....118 Figure3.3:Evidenceofpolynuclearmicrocapsulesformation.A:pictureofwashedpolynuclearmicrocapsules (scalebar=300μm);B:comparisonbetweenemulsiondropletsandmicrocapsulesmeandiameters.124 Figure3.4:Microcapsulesformationbycomplexcoacervation.AtoD:photographsfromthevideo(scalebar =300μm);EtoH:schematicrepresentations.A/E:formationoftheemulsion;B/F:formationofthe coacervateintheaqueousphase;C/G:coacervatedepositionaroundoildroplets;D/H:final microcapsules....127 Figure4.1:ExperimentalsetͲupformicrocapsulesformationbycomplexcoacervationwithinsitumonitoring byavideoprobe....141 Figure4.2:Photographsextractedfromvideosillustratingthesuccessivestepsoftheencapsulationprocess bycomplexcoacervationasafunctionofpH.Emulsiont0:emulsionat1min,Emulsiont1:emulsionat
20min....143 Figure4.3:Microscopicobservationsofthemorphologyofmicrocapsulesduringtheirformationasa functionofpH.Comparisonbetweenexperimentswithandwithoutthevideoprobe....145 Figure4.4:Photographsextractedfromvideosofmicroencapsulationexperimentsbycomplexcoacervation betweenacaciagumandwheyproteinisolate(withorwithoutpurification).Comparisonof microcapsulesaspectasafunctionofpH....146 Figure4.5:Photographsextractedfromvideosofmicroencapsulationexperimentsbycomplexcoacervation betweenacaciagumandwheyproteinisolateatthreedifferentPr:Psratios.Comparisonof microcapsulesformationasafunctionofpH....147 Figure4.6:Photographsextractedfromvideosofmicroencapsulationexperimentsbycomplexcoacervation betweenacaciagumandwheyproteinisolate.MicrocapsulesformationasafunctionofpHatdifferent totalbiopolymersconcentrations(0.5,1and3%)...148
Figure4.7:Photographsextractedfromvideosofmicroencapsulationexperimentsbycomplexcoacervation betweenacaciagumandwheyproteinisolateatpH3.8(A:Stirringspeedduringcoacervationof 500rpm,B:stirringspeedduringcoacervationof250rpm)....150 Figure4.8:Photographsextractedfromvideosofmicroencapsulationexperimentsbycomplexcoacervation betweenacaciagumandwheyproteinisolateatpH3.8(A:progressiveadditionofacid,B:rapid additionofacid)....150
Tableaux
Tableau1.1:Paramètresétudiésaveclessystèmesprotéinesdulactosérum/gommed’acaciaetbêtaͲ lactoglobuline/gommed’acacia....39 Tableau1.2:Quelquesexemplesdecomposésencapsulésdansledomainealimentaire....46 Tableau1.3:Propriétésphysiquesdesprotéinesdulactosérum(d’aprèsKinghornetal.1995)....61 Tableau1.4:Compositionenacidesgrasdel’huiledelin[d’aprèsZovi2009]....63 Table3.1:Physicochemicalcharacteristicsoflinseedoiland3%(w/w)gelatinsolutionat55°C:density, viscosity,surfaceandinterfacialtension....117 Table3.2.Parametersoftheprocessmodeling....117INTRODUCTIONGENERALE
Introductiongénérale
L'encapsulation trouve ses applications dans de nombreux domaines techniques, et en particulier le domaine alimentaire où elle permet une stabilisation des matières encapsulées. L'encapsulationcombinedeuxdisciplinesdemanièreintime:laformulationetlegéniedesprocédés. Le développement d'un procédé d'encapsulation requiert une démarche complexe qui consiste à choisiruntypedeprocédé,définirlesmatièrespremièresutilisables,étudierleurformulationetle procédé d'encapsulation. Le procédé d'encapsulation par coacervation complexe est très attrayant par certaines de ses caractéristiques: il fait appel à une large palette de matières premières dont certaines sont d'origine naturelle; les conditions d'application du procédé sont plutôt douces (température ambiante ou modérée, pas de séchage); il n'implique pas de réactions chimiques en présencedesmatièresactivesàencapsuler.
L’encapsulationparcoacervationcomplexeestunetechniquedéjàemployéedansl’industrie alimentaireafindeprotégerdesingrédientsfonctionnelstelsquelesprobiotiques,lesvitamines,les antioxydantsetlesacidesgras[ChampagneetFustier2007].Lacoacervationcomplexeconsisteen une séparation d'une solution de deux macromolécules en deux phases liquides. La phase la plus concentrée est la phase coacervée, l’autre phase étant la solution d’équilibre [Renard et Reddy 2007].Leprincipedecetteméthodeestbasésurladésolvatationpartiellededeuxcolloïdesetleur agrégationparabaissementdupH.Lacoacervationcomplexesembleparailleursêtreunetechnique très intéressante de microͲencapsulation, permettant d’atteindre des taux d’encapsulation élevés [Gouin2004].
L’huiledelinestunehuilericheenacidesgraspolyinsaturésomégasͲ3,indispensablespour lefonctionnementdel’organismequinepeutlessynthétiser.LesomégasͲ3sontaussiconnuspour leureffetantiͲinflammatoireainsiqueleureffetpositifsurlesystèmecardioͲvasculaire.L’huiledelin adoncunintérêtnutritionneletpourraitêtreconsomméecommecomplémentalimentairedansle cadre d’un régime à base d’omégasͲ3. De plus, il semblerait que dans la majorité des pays
développés il y ait une sousͲconsommation d’omégasͲ3 ; d’où l’intérêt d’en incorporer dans l’alimentation. Cependant cette huile est fortement oxydable car elle contient de nombreuses doublesliaisons.Elledoitdoncêtreprotégéeparlebiaisdel’encapsulationafindepouvoirprofiter desbienfaitsdesesomégasͲ3.
Lecoupledepolymèresleplusutiliséparleprocédédecoacervationcomplexeestlecouple gélatine/gomme d’acacia. Ce couple de polymère a d’ailleurs déjà été utilisé pour l’encapsulation d’huile riche en acides gras polyinsaturés [Lamprecht et al. 2001]. Cependant l’utilisation de la gélatine,d’origineanimale,pourdesapplicationsalimentairesdevientcontroverséeenraisondela transmission possible de maladies, dont l’Encéphalopathie Spongiforme Bovine. Un substituant intéressant à la gélatine est constitué par les protéines du lactosérum ainsi que leur composant majoritaire, la bêtaͲlactoglobuline. Depuis la fin des années 1990, la coacervation complexe des protéines de lait et de la gomme d’acacia a commencé à être étudiée. Les systèmes bêtaͲ lactoglobuline/gomme d’acacia et protéines du lactosérum/gomme d’acacia ont été décrits par Schmittetal.(1999,2000,2001et2005)etWeinbrecketal.(2003,2004a,b,c).Danscesétudes,les conditionsoptimalesdecoacervationontétéidentifiées.Lacompositionetlastructureducoacervat ontégalementétéétudiées.Enfinlemécanismedeséparationdephaseaétéexpliquéetdécoupé en plusieurs étapes [Sanchez et al. 2006, Mekhloufi et al. 2005]. En revanche, l’influence de la composition des protéines laitières sur la coacervation avec la gomme d’acacia n’a été que peu étudié.
Le procédé d’encapsulation par coacervation complexe est connu depuis des dizaines d’années[GreenetSchleicher1956],cependantpeud’étudesontétéréaliséessurlacompréhension de celuiͲci. L’étude de Madan et al. (1972) suggère deux mécanismes d’encapsulation et tente d’expliquerl’impossibilitéd’encapsulerdesparticulesdetaillesupérieureà335μm.Plusrécemment, Weinbrecketal.(2004d)ontsuggéréunmécanismed’encapsulationdifférentpourlespetitesetles grosses gouttes. L’influence des paramètres de procédé sur la morphologie et la taille des
microcapsules,aétédécriteparLemetteretal.(2009).Enfin,larevuebibliographiquedeDardelleet Erni (2013) apporte des informations intéressantes sur les phénomènes de mouillage contrôlant la formationdescapsules.Lemécanismedeformationdescapsulesestdoncglobalementconnu,mais ilrestedenombreusesquestionsouvertesàproposdesétapesduprocédéconduisantàlaformation desmicrocapsules.Ilestdoncutiled’approfondirlesétudessurlesmécanismes. Lesobjectifsdecetravailderecherchesontparconséquent: Ͳ d’encapsulerl’huiledelinparleprocédédecoacervationcomplexeenutilisantlesprotéines dulactosérumetlagommed’acaciacommepolymèresd’encapsulation Ͳ demieuxcomprendrelesmécanismesdecoacervationdesprotéinesdulactosérum
Ͳ etdemieux comprendrelesmécanismesdeformationdesmicrocapsulespar coacervation complexe.
Cemanuscritsedécomposeainsienquatrechapitres.
Le chapitre 1 fait une synthèse de l’état de l’art sur l’encapsulation par coacervation complexe. Dans un premier temps, le phénomène de coacervation complexe est présenté de manière générale, puis les exemples concernant la coacervation complexe des protéines du lactosérumetdelabêtaͲlactoglobulineaveclagommed’acaciasontdécritsplusendétail.Dansun deuxième temps, le procédé d’encapsulation par coacervation complexe est présenté avec ses problématiques actuelles. Les matières premières utilisées pour ce travail sont enfin brièvement présentées.
Le chapitre 2 (sous forme de publication) est une étude menée dans le but de mieux comprendrelephénomènedecoacervationcomplexeauseinducoupledepolymèreprotéinesdu lactosérum/gommed’acacia.Lesprotéinesdulactosérumutiliséesicisontunmélangecommercial appeléProlacta,composénotammentdebêtaͲlactoglobulineetd’alphaͲlactalbumine.L’étudedela composition du coacervat du système protéines du lactosérum/gomme d’acacia a été réalisée. L’électrophorèsecapillairesurgelaétéemployéeafindequantifierlabêtaͲlactoglobulineetl’alphaͲ
lactalbumine dans le coacervat. L’influence du ratio protéine/polysaccharide et du pH sur la compositionducoacervataétéétudiée.
Le chapitre 3 (sous forme de publication) s’intéresse à la première étape du procédé d’encapsulation, qui est l’étape d’émulsification. Pour cette étude nous avons utilisé le système gélatine/gommed’acacia,leplusutiliséencoacervationcomplexe.Desanalysesgranulométriqueset microscopiquesnousontpermisd’étudierlatailledesgouttesd’huilepuiscelledesmicrocapsulesen fonction des conditions d’émulsification. Il a été déterminé que cette étape d’émulsification se déroulait en régime d’écoulement intermédiaire. Cependant la modélisation en régime turbulent rendcomptedesrésultatsexpérimentauxetpourraitêtreutiliséepourunetranspositiond’échelle.
Le chapitre 4 (sous forme de publication) décrit pour la première fois le suivi in situ du procédé d’encapsulation par coacervation complexe. Il a été réalisé au moyen d’une sonde vidéo immergée dans le réacteur agité. Cette technique a permis de relever quatre étapes successives induites par l’abaissement du pH. Les influences des paramètres physicoͲchimiques (ratio protéine/polysaccharideetconcentrationtotaleenbiopolymères)etdesparamètresliésàl’étapede coacervationsurlaformationdesmicrocapsulesontaussiétéétudiéesaumoyendelasondevidéo.
Enfindesconclusionsetperspectivessontproposéesàlafindecemanuscrit.
Références
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CHAPITRE1:
Etatdel’art
CHAPITRE1:Etatdel’art
Ce chapitre est composé de trois parties. La première partie décrit le phénomène de coacervationcomplexedemanièregénéraledansunpremiertempspuisexamineplusendétailsles systèmes protéines du lactosérum/gomme d’acacia et bêtaͲlactoglobuline/gomme d’acacia. La seconde partie présente le procédé de microencapsulation par coacervation complexe, les paramètres l’influençant et ses problématiques actuelles. Enfin, la dernière partie présente rapidementlesmatièrespremièresutiliséespourcetteétude.
ͳǤLacoacervationcomplexe
La coacervation complexe est une séparation de phase associative qui peut être observée dansunmélangedeprotéineetpolysaccharideenmilieuxaqueux.Elledonnelieuàlaformationde complexesélectrostatiquesprotéine/polysaccharide:lescoacervats.
1.1.Rappelssurlesinteractionsprotéines/polysaccharides
Lesprotéinesetlespolysaccharidessontdespolymèresd’originenaturellelargementutilisés dansl’industriealimentaire,notammentpourlesémulsionsetl’encapsulation[Matalanisetal.2011; Bouyer et al. 2011; Jones et al. 2010]. Ces polymères peuvent interagir par l’intermédiaire d’interactionsattractivesourépulsives,etainsiformerdessystèmesmonophasiquesoubiͲphasiques [McClements 2006]. Dans l’eau, le mélange de protéines et de polysaccharides peut conduire à quatre situations: la formation de complexes solubles, la coacervation ou précipitation, l’incompatibilitéthermodynamiqueetlacoͲsolubilité(Figure1.1).
Figure D protéine complex polymèr chargés solubilité concentr L types de séparatio 1.1:Représen 1.1.1 Deux types e/polysaccha xes solubles res portent positivemen é des deux rationenpro 1.1.2 Les mélange e séparation on de phase
ntationschém m 1.Lessystèm s de systèm aride. Dans dans la so une charge nt sur la pro biopolymèr otéineeten
2.Lessystèm
es de biopol n de phase e associative matiquedesdi milieuaqueux mesmonop mes monop le cas d’inte olution aque globale nég otéine. Dans
es en soluti polysaccaha
mesbiǦphas
ymères sont peuvent êtr e. La sépara
ifférentessitu x[d’aprèsMcC phasiques phasiques p eractions att euse. Ces c gative. Le p le cas d’int ion aqueuse arideestfaib siques t généralem re observés ation de ph uationsdemé Clements2006 peuvent êtr tractives on complexes s polysaccharid eractions ré e. CelleͲci ap ble[Dickinson ment soumis : la séparat ase ségréga langesprotéin 6] re obtenus peut obser sont observé de interagit pulsives on pparaît géné n2003]. à la sépara tion de pha tive intervie
neͲpolysaccha
dans un rver la form és lorsque
alors avec peut observ éralement lo
ation de pha ase ségrégat ent lorsqu’il arideen système mation de les deux des sites ver la coͲ orsque la
ase. Deux tive et la y a une
répulsion entre la protéine et le polysaccharide. Dans ce cas la protéine et le polysaccharide sont thermodynamiquementincompatibles.Aprèslaséparationdephaseonobserveunephasericheen protéineetunephasericheenpolysaccharide.Lesparamètresimpliquésdanscemécanismesontle pH et la force ionique. La séparation de phase associative, ou coacervation complexe, intervient quant à elle lorsqu’il y a des interactions favorables entre une protéine et un polysaccharide de charge opposées. Ces interactions peuvent être des interactions électrostatiques ou des liaisons hydrogènes. Il se forme alors des complexes macromoléculaires solubles qui interagissent pour former des agrégats électriquement neutres, puis des gouttelettes de liquide instables ou des précipités qui sédimentent pour former la phase coacervée contenant les deux polymères. La deuxième phase est riche en solvant et pauvre en polymères [Mc Clements 2006, Turgeon et al. 2003, Doublier et al. 2000,
Tolstoguzov 1997]. Ce mécanisme d’association entre protéine et polysaccharideestcontrôléparunmécanismederégulationdescharges[DaSilvaetJönsson2009].1.2.Lephénomènedecoacervationcomplexe
1.2.1.Définition
LacoacervationcomplexeestdéfiniecommeuneséparationdephaseliquideͲliquidedansun système colloïdal, induite par des interactions électrostatiques entre deux polymères de charges opposées[IUPAC,1997].Laphaselaplusconcentréeestlecoacervatetl’autrephaseestlasolution d’équilibre.Ladésolvatationsimultanéedesdeuxpolyélectrolyteshydrosolublesportantdescharges opposées est le plus souvent provoquée par une modification de pH du milieu aqueux [Richard et Benoît2013].Lecoacervatcomplexeestainsiforméparprécipitationdedeuxpolymèresdecharges électriquesopposéeseninteractionélectrostatique.
Le phénomène de séparation de phase dans une solution contenant des polymères de chargesopposéesaétédécritpourlapremièrefoisen1911parTiebackx.PuisBungenbergdeJong (1949) a introduit le terme de coacervation complexe et a posé les bases théoriques et expérimentalesduphénomèneaveclesystèmegélatine/gommed’acacia.
1.2.2.Lesmodèlesthéoriques
Plusieurs modèles ont été proposés à partir des années 1950 pour tenter d’expliquer le phénomènedecoacervationcomplexe.
La théorie de Voorn et Overbeek (1957) est basée sur les résultats expérimentaux de Bungenberg de Jong (1949) obtenus sur le système gélatine/gomme d’acacia [Overbeek et Voorn 1957]. La coacervation complexe entre la gélatine et la gomme d’acacia y est décrite comme un phénomènespontané.Cephénomènerésultedelacompétitionentrelesforcesélectrostatiquesqui tendentàrapprocherlesmoléculeschargées,etleseffetsentropiquesquitendentàleséloigner.Les polymères de charges opposées s’associent pour former le coacervat qui contient aussi des moléculesdesolvant(l’eau).Laprésencedesolvantdanslaphasecoacervéecontribueàaugmenter l’entropiedusystèmeen favorisantlesréarrangementsmoléculaires.Pourcesraisonslecoacervat estdenatureliquideettotalementréversible.Cettethéorieestbaséesurquelquespostulats:(1)les moléculespossèdentunechaînedésordonnée,(2)lesinteractionssolvant/solutésontnégligeables, (3)ladistributiondeschargesdanslemélangeesthomogène,(4)iln’yapasd’associationspécifique entre les polymères. Dans leur traitement théorique Voorn et Overbeek utilisent les équations de DebyeetHückelpourrendrecomptedesinteractionsélectrostatiquesetlathéoriedeFloryͲHuggins pourcequiconcerneleseffetsentropiques[OverbeeketVoorn1957].Ainsi,dansunsystèmebinaire composé d’un solvant et d’un biopolymère, les conditions critiques de compatibilité sont atteintes lorsqueʍ3rш0,53,donclorsqueladensitédechargeʍetlamassemoléculairerdubiopolymèresont suffisammentélevées[Schmittetal.2000a,Weinbrecketal.2004a].
LathéoriedeVeisetAranyi(1960)estfondéesurlacoacervationdedeuxtypesdegélatine de charges opposées dans des conditions de faible densité de charge des biopolymères, où ʍ3r < 0,53, quand la théorie de Voorn et Overbeek n’est pas applicable [Veis et Aranyi 1960, Veis 1963, Veisetal.1967].Danscettethéorielacoacervationcomplexeestconsidéréecommeunphénomène endeuxétapesplutôtqu’unphénomènespontanéenuneseuleétape.Dansunpremiertempsles
molécules de gélatine s’agrègent par des interactions électrostatiques pour former des agrégats neutres de faible entropie. Puis ces agrégats se réarrangent lentement afin de former la phase coacervée.Lemécanismeestconduitparl’augmentationd’entropiedueàlaformationducoacervat par interaction aléatoire des agrégats. De plus, le terme électrostatique de la théorie de Voorn et Overbeekestremplacéparuntermedépendantdelaconcentrationetdeladensitédechargedes polymères[Schmittetal.2000a,Weinbrecketal.2004a].
La théorie de Nakajima et Sato (1972) est basée sur la coacervation complexe entre des polymères d’alcool polyvinylique de charges opposées [Nakajima et Sato 1972]. Elle constitue une adaptationdelathéorie deVoornet Overbeek enincluantle termed’interactionde FloryͲHuggins entre les deux polymères. Les auteurs sont cependant en accord avec l’hypothèse de Voorn et Overbeek qui stipule que les charges sont réparties uniformément entre les phases diluée et concentrée[Schmittetal.2000a,Weinbrecketal.2004a].
La théorie de Tainaka (1979Ͳ1980) est la plus récente développée pour la coacervation complexe.ElleconstitueuneadaptationdumodèledeVeisetAranyi.SelonTainakalemoteurdela séparationdephaserésidedanslesinteractionsélectrostatiquesattractivesquisontfavoriséespar l’augmentation de la masse moléculaire des polymères et par l’augmentation de leur densité de charge [Tainaka 1979, 1980]. Cette théorie permet également d’expliquer le phénomène de suppressiondelacoacervationàforteconcentrationtotaleenbiopolymères.LathéoriedeTainaka est plus générale que les précédentes, elle est ainsi applicable aux systèmes à densité de charge faible et élevée. Ce modèle décrit correctement le phénomène de coacervation complexe pour un grandnombredesystèmes[Schmittetal.2000a,Weinbrecketal.2004a].
1.2.3.Formationetpropriétésducoacervat
Lacoacervationcomplexeestunphénomènedeséparationdephaseassociativeinduitpar desinteractionsélectrostatiquesentreaumoinsdeuxpolymères,généralementuneprotéineetun polysaccharideportantdeschargesopposées[Cooperetal.2005].Maisd’autresinteractionsfaibles,
tellesqu decoace Formatio L de l’un d crée alo neutres formatio et de m 1998, To d’abord dupH. Figure1 (sphèr Paramèt P principa biopolym uelesliaison ervatscompl ondescomp Lacoacervat des deux po ors des inter montrantun ondecomple olécules de olstoguzov 1 sousforme 1.2:Schémar resrouges).L tresinfluenç Plusieurs fa ux sont le mères. shydrogène lexes[Turgeo plexes tioncomplex olymères lais ractions élec neinteractio exesinsolub solvant, le c 1997]. D’apr depetitesg représentant ecomplexee antlaforma cteurs phys pH, la force esetlesinter onetal.200 xeseproduit sse les deux ctrostatiques onattractive blesquiform coacervat [D ès Arshady outtes,puis descomplexe stconsidéréc tiondescoa icoͲchimique e ionique, le ractionshyd 07]. tlorsqu’und polymères s qui condu (Figure1.2) mentalorsde De Kruif et a (1990), les g cesgouttes esdegomme commeuneno 2004]. acervats es intervien e ratio prot rophobes,p déplacement avec des cha isent à la fo ).L’associatio esgouttesliq al. 2004, Do gouttelettes grossissent d’acacia(ruba ouvelleentité nnent dans éine/polysac euventcont dupHvers arges électri ormation de ondecesco quidescomp ublier et al. de coacerv etcoalescen anblanc)etd écolloïdale[d’ la formatio ccharide et tribueràlaf lepointisoé iques oppos e complexes omplexescon poséesdesp 2000, Schm vat apparaiss ntparlamod debêtaͲlactog ’aprèsdeKru
on du coace la concentr
ormation
électrique ées. Il se solubles nduitàla olymères mitt et al. sent tout dification globuline ifetal. ervat, les ration en
L effet,les portent pointiso parBurg limitée L’influen égaleme polymèr direlav signeop Figure1 d’acacia D’après
plusieurs lasolutio complex Le pH est le sinteraction des charges oélectrique( gessetCarle (Figure 1.3) nce du pH s ent été étud res est nulle valeurdepH pposé. 1.3:Influence àuneconcen AetBd de Kruif et sétapesdép oncontientl xessolublese e principal p nsentreprot s électriques (pI)delapro ess(1984).Le , ce qui dé sur la mobi diée par Bu correspond pourlaque edupHsurle ntrationtotale diffèrentparl t al. (2004), pendantesd lesdeuxpoly estobservée aramètre in téinesetpoly opposées, c otéine.L’infl evolumema émontre la s ilité électrop urgess et Ca au pH d’éq llelesdeux rendementd eenpolymère eurspointsis , la formati upH.Parex ymèressolub eàpHc=pHc nfluençant le ysaccharides c’estͲàͲdire uencedupH aximaldeco sensibilité d phorétique arless (1986 quivalence é polymèresp ecoacervatio esde1%(rond soélectriques) on du coac xemple,pour blessansint critique(pH5,5 e phénomèn ssontobserv lorsque le p Hsurlevolu oacervataét de la coacer des coacerv 6). Le pH o lectrique (EE portentune oncomplexed ds:gélatineA [d’aprèsBurg cervat comp runeprotéin eractions.En 5).Puis,ena e de coacer véeslorsque H de la solu umedecoacéobservésu rvation com vats gélatine
ù la mobilit EP) des deux
chargeélec dansdesméla A,triangles:g gessetCarless lexe peut ê neavecunp nabaissantle baissantdav rvation comp ecesdeuxp ution est infé cervataété urunegamm mplexe enver e/gomme d’ té des méla x polymères ctriqueégale ngesgélatine gélatineB,les s1984]. être décomp pId’environ epH,laform vantagelep plexe. En olymères érieur au observée medepH rs le pH. ’acacia a anges de s, c’estͲàͲ emaisde /gomme gélatines posée en 5,àpH7 mationde H,àpH੮1
(pH4,7),uneséparationdephaseestobservéeentreunephasediluéeetunephaseconcentréeen
polymères.Finalement,enabaissantencorelepH,àpH੮2(pH2,5),lescomplexessontsupprimésen
raison de la neutralisation du polysaccharide
.
Ces étapes ont également été décrites par Liu et al. (2010) pour le système protéine de pois/gomme d’acacia, par Weinbreck et al. (2003a) pour le systèmeprotéinedelactosérum/gommed’acacia,etparChaietal.(2014)pourlesystèmealbumine desérumbovin/carraghénanes.Dansl’étudedeLiuetal.(2010)laformationdecomplexessolubles estobservéeàpHc=4,23,suiviedelaformationdecomplexesinsolublesàpH੮1=3,77.LaquantitémaximaledecoacervatestobservéeàpH3,60,etladisparitiondescomplexesàpH2,62(pH੮2).
La force ionique a également un rôle important dans la formation du coacervat, car elle affecte la charge des polymères. Une force ionique très faible ou très élevée entraîne une suppressiondesinteractionsélectrostatiquesentreprotéineetpolysaccharide
[deKruifetal.2004]. L’addition de sels entraîne la diffusion des charges à la surface des polymères, ce qui réduit l’attraction entre les deux polymères et ainsi la coacervation [Burgess et Carless 1984]. Lorsqu’une quantitésuffisantedeselestajoutée,lacoacervationestcomplètementsupprimée(Figure1.4).La suppressiondelacoacervationcomplexeentrelesprotéinesdulactosérumetlagommed’acaciaa égalementétéreportéepouruneconcentrationenselde70mM[Weinbrecketal.2003a].L’étude de Chai et al. (2014) sur la coacervation complexe de l’albumine de sérum bovin et des carraghénanesamontréquel’additiondeselnécessited’abaisserdavantagelepHpourobserverles interactions entre les biopolymères, conduisant à la coacervation.La force ionique influence par conséquentlaformationdesmicrocapsules[JunͲxiaetal.2011,TsungetBurgess1997].Figure gélatin phénom correspo cas de s albumin entraîne bêtaͲlact plus gro observé excès,la quedec pHdépe e1.4:Influen ne/gommed’
Le ratio pro ènedecoac ondàunéqu systèmes où edesérumb eunediminu toglobuline/ s et plus no que, dans l aprésenced coacervat.Il endant[Wein ncedelaforce acaciaàunra otéine/polys cervationcom uilibredesch ù la neutral bovin/poly(d utiondelafo /gomme d’ac ombreux lors e cas du sys dechargesno estànoter nbrecketal. eioniquesurl atioprotéine/ [d’aprèsB saccharide e mplexe.Ene hargesentre isation est o dimethyldiall ormationde cacia, Schmi sque la prot stème gélati onͲneutralisé quel’effet 2004f,JunͲx erendement /polysaccharid BurgessetCar est aussi un effetilexiste elaprotéine obtenue po lylammonium ecoacervat[
itt et al. (20 téine est en
ine/gomme éesentraîne duratiopro xiaetal.201 decoacervat de1:1(ronds: rless1984]. n paramètre unratiopro etlepolysac ur des ratio mchlorure)), [Kaibaraeta 001) ont obs excès.
En re d’acacia, lo elaformatio otéine/polysa 1]. ioncomplexe :gélatineA,tr e à prendre téine/polysa ccharide[Liu os 1:1 (par ,toutratios al.2000].Daservé la form evanche Siow rsque l’un d ondeplusde accharidesu edansdesmé riangles:géla en compte accharideop uetal.2009] exemple le supérieurou nslecasdu mation de p w et Ong (2 des polymère ecomplexes urlacoacerv langes atineB) e dans le ptimalqui ].Dansle système inférieur système précipités 2013) ont es est en ssolubles vationest
Enfin la concentration en polymères peut être un paramètre important de la coacervation complexe car une concentration optimale existe, où la coacervation complexe est maximale [Weinbrecketal.2003a].
Le phénomène de coacervation complexe semble en revanche indépendant de la température[Kaibaraetal.2000,Weinbrecketal.2004b].
Caractéristiquesducoacervat
Le coacervat est une phase liquide où les protéines et polysaccharides diffusent indépendamment [Weinbreck et al. 2004c]. La structure des coacervats est dynamique, les interactions augmentent avec la densité de charge et diminuent par l’augmentation de la force ionique[deKruifetal.2004].
D’un point de vue rhéologique le coacervat se comporte plus comme une dispersion visqueusedeparticulesquecommeunesolutiondepolymèresviscoélastiquesconcentrée[deKruif
etal.2004].
La composition des coacervats est principalement déterminée par la densité de charge des deux polymères. La neutralité des charges est quasiment atteinte à un pH spécifique pour chaque ratioprotéine/polysaccharide.Deplus,mêmelorsqu’ilyaunlargeexcèsdel’undesdeuxpolymères, lescomplexesrestentfaiblementchargés[deKruifetal.2004].Gummeletal.(2007)ontmontréla stœchiométrie de charge à l’intérieur des gouttelettes de coacervat, grâce à une expérience spécifiquedemarquage.
1.3.Etudeapprofondiedelacoacervationcomplexedesprotéinesdulactosérumetdela gommed’acacia
Le phénomène de coacervation complexe entre les protéines du lactosérum, ou la bêtaͲ lactoglobuline,etlagommed’acaciaestétudiédepuisplusieursannées.Letableau1.1reprendles
paramètres étudiés avec ces deux systèmes. Il est à noter que les protéines du lactosérum sont majoritairementcomposéesdebêtaͲlactoglobuline(détailsplusloindanscechapitre). Tableau1.1:Paramètresétudiésaveclessystèmesprotéinesdulactosérum/gommed’acaciaetbêtaͲ lactoglobuline/gommed’acacia.
Références Systèmeétudié Méthodesd’études Paramètresétudiés
Schmittetal. 1999 BêtaͲlactoglobuline/ gommed’acacia Mobilitéélectrophorétique, mesuredetaillepardiffusion laser,diagrammesdephase, dosagesdespolymères EffetdupH,dela concentrationtotaleen polymères,duratio protéine/polysaccharide, compositiondesdeux phases Schmittetal. 2000b BêtaͲlactoglobuline/ gommed’acacia Diagrammesdephase, mobilitéélectrophorétique, mesuredetaillepardiffusion laser,observations microscopiques Caractérisationdes agrégatsdebêtaͲ lactoglobuline(ɴͲlg),effet desagrégatsdeɴͲlgsurla coacervation Schmittetal. 2001 BêtaͲlactoglobuline/ gommed’acacia Observationsmacroscopiques, microscopieconfocaleà balayagelaser,spectroscopie enondediffusée Structureducoacervat, stabilitédesdispersionsde coacervat Sanchezetal. 2002 BêtaͲlactoglobuline/ gommed’acacia Microscopieconfocaleà balayagelaser,diffusion statiquedelalumièreaux petitsangles Effetduratio protéine/polysaccharide surlastructureetla cinétiquedeformationdu coacervat Weinbrecketal. 2003a Protéinesdulactosérum (WPI)/gommed’acacia Turbidité,diffusiondela lumière(statiqueet dynamique),diagrammesde phase,conductivité EffetdupH,effetdela forceionique,effetdela concentrationtotaleen biopolymères,composition desWPI, Weinbrecketal. 2004c Protéinesdulactosérum (WPI)/gommed’acacia RMN,fluorescence, spectroscopieenonde diffusée,spectrophotométrieà transmission Structureducoacervat, diffusiondespolymères danslecoacervat Weinbrecketal. 2004e Protéinesdulactosérum (WPI)/gommed’acacia Observationsmacroscopiques, déterminationdelaquantité d’eaudanslecoacervat, dosagesdespolymèrespar HPLC,diffractiondesrayonsX auxpetitsangles(SAXS) EffetdupH,delaforce ioniqueetduratio protéine/polysaccharide, cinétiquedelaséparation dephase,compositiondu coacervat
Tableau1.1(suite):Paramètresétudiésaveclessystèmesprotéinesdulactosérum/gommed’acaciaetbêtaͲ
lactoglobuline/gommed’acacia.
Références Systèmeétudié Méthodesd’études Paramètresétudiés
Schmittetal. 2005 BêtaͲlactoglobuline/ gommed’acacia Titragecalorimétrique,diffusion dynamiquedelalumière, mesuresdetensionsinterfaciales, formationdemousses Effetdutempssurles propriétésinterfacialesdes coacervats,effetdutemps surlastabilitédemousse stabiliséespardu coacervat Mekhloufietal. 2005 BêtaͲlactoglobuline/ gommed’acacia Diffusiondynamiquedela lumière,mobilité électrophorétique,turbidité, microscopieàcontrastedephase, dichroïsmecirculaire Identificationdes transitionsdepH,structure descoacervats Sanchezetal. 2006 BêtaͲlactoglobuline/ gommed’acacia Diffusionstatiquedelalumière auxpetitsangles Identificationdes transitionsdephaselorsde l’acidification Aberkaneetal. 2010 BêtaͲlactoglobuline/ gommed’acacia Titragecalorimétrique,diffusion dynamiquedelalumière, mobilitéélectrophorétique, turbidité,microscopieoptique Etudedesparamètres thermodynamiques Kleinetal. 2010 Protéinesdulactosérum (WPI)/gommed’acacia Tensiondesurface,mobilité électrophorétique,conductivité électrique,microscopieconfocale àbalayagelaser,analyse calorimétriquedifférentielle Tensiondesurfaceet conductivitéélectriqueen fonctionduratioPr:Pset delaconcentrationtotale enpolymères 1.3.1.BêtaǦlactoglobuline/gommed’acacia LacoacervationcomplexedelabêtaͲlactoglobulineetdelagommed’acaciaaétéétudiéeen détailparSchmittetal.(1999,2000b,2001et2005)etquelquesautresauteurs(Tableau1.1).
Les influences du pH, du ratio protéine/polysaccharide, de la concentration totale en biopolymères et de la force ionique sur la coacervation complexe du système bêtaͲ lactoglobuline/gommed’acaciaontétéétudiéesparSchmittetal.(1999).Lesinteractionsmaximales entreprotéineetpolysaccharideontétéidentifiéesàpH4,2pourunratioprotéine/polysaccharide 2:1.Ilaétéobservéquel’augmentationdelaconcentrationtotaleenbiopolymèresréduitl’influence dupHetduratioprotéine/polysaccharide.
Laprésenced’agrégatsprotéiqueslorsdelacoacervationcomplexedelabêtaͲlactoglobuline et de la gomme d’acacia modifie la structure, la taille et les propriétés de surface des coacervats
[Schmitt cohabite L labêtaͲl structure ratio1:1 d’acacia, empêche la gomm balayage gomme 1.5).Cet Figur confoc L été étud coacerva tetal.2000b entdespréci L’étudedeS actoglobulin edescompl 1.Lorsqu’iln , une couch entleurinte me d’acacia, elaseraper d’acaciason ttestructure re1.5:Image caleàbalayag Lespropriété diées par Sc ats sont util
b].Cesagrég ipitésetdes Sanchezetal neetlagomm exes.Laneu n’yapasass he de moléc eraction.Au le système rmisdeconf ntobtenusà eestobtenue edecoacervat elaser[d’apr ésinterfacia chmitt et al. isés pour fo gatsprotéiqu coacervats[ l.(2002)am med’acacia utralisationd sezdebêtaͲl cules de go contraire,lo e devient trè irmerqued pH4,2pour eparlacoale tdebêtaͲlacto èsSchmittet d’ lesdescom . (2005). Ce ormer une m uesentraînen [Schmitteta montréquel contrôlelac descharges lactoglobulin omme d’acac orsqu’ilyaa ès instable. egrandscoa rdesratiosp escencedec oglobuline/go al.2001].Mis ’échelle=5μ mplexesdebê es propriétés mousse, la st ntl’apparitio al.2001]. eniveaude cinétiquede estpluseffi nepourneut cia stabilise assezdebêt L’utilisation acervatsvac protéine/pol coacervatsp ommed’acaci seenévidence m. êtaͲlactoglob s évoluent a tabilité de c ondedispers neutralisatio séparation icaceavecle traliserlesc nt la surfac aͲlactoglobu n de la micr uolisésdeb ysaccharide luspetits[Sc a(1:1)obtenu edelastructu bulineetde au cours du elleͲci est m sionshétéro ondescharg dephaseain eratio2:1q chargesdela ce des coace ulinepourne roscopie con bêtaͲlactoglo de2:1et1: chmittetal. ueparmicros urevacuolisée gommed’a u temps. Lor meilleure lor gènesoù gesentre nsiquela u’avecle agomme ervats et eutraliser nfocale à bulineet :1(Figure 2001]. copie e.Barre caciaont rsque les sque des
coacervatsquiviennentd’êtreforméssontutilisésplutôtquedescoacervatsâgésde24h.Eneffetla structuredescoacervatestplusdynamiqueàt0etplusrigideàt24h.
Lescinétiquesd’organisationdephaseaucoursduphénomènedecoacervationcomplexedu systèmebêtaͲlactoglobuline/gommed’acaciaontétéétudiéesparSanchezetal.(2006).Leurétude conclut que le mécanisme de séparation de phase impliqué dans le phénomène de coacervation complexe du système bêtaͲlactoglobuline/gomme d’acacia est un mécanisme de nucléation et croissance.Parailleurs,sixtransitionsstructuralesinduitesparlepHontétémisesenévidencelors duphénomènedecoacervationentrelabêtaͲlactoglobulineetlagommed’acaciaauratio2:1.Ces phasessontlessuivantes:l’initiationdesinteractionsàpH4,9,l’agrégationdescomplexesàpH4,6, l’initiation de la séparation de phase à pH 4,4, la séparation de phase à pH 4,2, l’observation de gouttesdecoacervatssphériquesàpH4,etlamodificationmorphologiquedescoacervatsàpH3,8 [Sanchez et al. 2006, Mekhloufi et al. 2005]. Enfin les mécanismes thermodynamiques impliqués danslaformationdescomplexesdebêtaͲlactoglobulineetgommed’acaciaontétéétudiésàpH4,2. Deux étapes ont été identifiées. La première est exothermique, régulée par l’enthalpie, et correspond aux interactions électrostatiques. La deuxième est endothermique, régulée par l’entropie,etindiquelescontributionshydrophobesàlaformationdescomplexes[Aberkaneetal. 2010].
1.3.2.Protéinesdulactosérum/gommed’acacia
Le phénomène de coacervation complexe au sein du système protéines du lactosérum/gomme d’acacia a été étudié à partir des années 2000 par Weinbreck et al. (2003a, 2004c,d,e).
DemêmequepourlesystèmebêtaͲlactoglobuline/gomme d’acacia,leseffetsdu pH,dela forceionique,duratioprotéine/polysaccharideetdelaconcentrationtotaleenbiopolymèresontété étudiés sur la coacervation complexe du système protéines du lactosérum/gomme d’acacia [Weinbrecketal.2003a,2004e].
Les conditions de coacervation optimale du système protéines du lactosérum/gomme d’acaciaontétéidentifiéesauratioprotéine/polysaccharide2:1etàpH4,oùlaséparationdephase est la plus rapide et le volume de coacervat formé le plus grand. Dans ces conditions la phase coacervéeestdenseettrèsconcentrée.Lamodificationduratioprotéine/polysaccharidedécalele pHoptimal.CeluiͲciestplusélevélorsqueleratioestaugmenté,etviceͲversa.L’augmentationdela force ionique modifie la phase coacervée. CelleͲci devient moins concentrée, plus hétérogène et moins structurée [Weinbreck et al. 2004e]. Le ratio protéine/polysaccharide 3:1 a été étudié par Klein et al. (2010), sur le système protéines du lactosérum/gomme d’acacia à une concentration totalede10%.DanscetteétudelacoacervationcomplexeaétéobservéeentrepH3etpH5.Des interactionsfaiblesontétéidentifiéesentrepH5etpH7.
La coacervation complexe des protéines du lactosérum avec la gomme d’acacia a été comparéeàlacoacervationcomplexedescomposantsmajeursdesprotéinesdulactosérumavecla gomme d’acacia, à savoir la bêtaͲlactoglobuline et l’alphaͲlactalbumine. D’après la turbidité des mélangesobtenusenfonctiondupH,quiestsimilairepourlessystèmesbêtaͲlactoglobuline/gomme d’acacia et protéines du lactosérum/gomme d’acacia, il est conclu que les interactions entre les protéines du lactosérum et la gomme d’acacia sont majoritairement dues aux interactions entre la bêtaͲlactoglobulineetlagommed’acacia[Weinbrecketal.2003a].
Trois principales étapes ont été identifiées dans la formation des coacervats complexes. La premièrecorrespondàlaformationdecomplexessolubles.Ladeuxièmeétapeestlaséparationde phase. La dernière étape consiste à la suppression des interactions, et disparition des complexes [Weinbrecketal.2003a].
Ladiffusiondespolymèresdanslecoacervatdeprotéinesdulactosérum/gommed’acaciaa étéétudiéeparWeinbrecketal.(2004c).Leurtravailamontréqueladiffusiondespolymèresétaitla pluslenteaupHoùlesinteractionsélectrostatiquesétaientmaximales.Ilsontaussimisenévidence que la protéine et le polysaccharide se déplacent indépendamment dans la phase coacervée; la
