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Etude de la coacervation complexe entre la
beta-lactoglobuline et la gomme d’acacia en solution aqueuse
Christophe Schmitt
To cite this version:
Christophe Schmitt. Etude de la coacervation complexe entre la beta-lactoglobuline et la gomme d’acacia en solution aqueuse. Autre. Institut National Polytechnique de Lorraine - INPL, 2000.
Français. �tel-00007723�
Institut National Polytechnique de Lorraine
Ecole Nationale Supérieure d’Agronomie et des Industries Alimentaires
Thèse pour obtenir le grade de
Docteur de l’Institut National Polytechnique de Lorraine Spécialité : Biotechnologies et Industries Alimentaires
présentée par
Christophe SCHMITT
Etude de la coacervation complexe entre la β-lactoglobuline et la gomme d’acacia en solution aqueuse
Soutenue publiquement le 27 octobre 2000 devant la commission d’examen :
Président : M. Joël Hardy, Professeur, INPL-ENSAIA, Nancy
Rapporteurs : M. Cees G. de Kruif, Professeur, NIZO food research, Ede, Pays-Bas M. Ilias Iliopoulos, Directeur de Recherche, ESPCI, Paris
Examinateurs : Mme Sylvie Turgeon, Professeure, Université Laval, Québec, Canada M. Denis Renard, Chargé de Recherche, INRA, Nantes
M. Christian Sanchez, Maître de Conférences, INPL-ENSAIA, Nancy
« Mais que se passe-t-il si, quand vous arrivez, il n’y a que du brouillard ? Vous pouvez toujours espérer ceci ou cela, vous pouvez toujours énoncer des théorèmes sur la topologie des lignes de partage des eaux ; mais si vous vous retrouvez dans une nuée où se condensent des formes vagues et où il vous est impossible de distinguer sol et ciel ? Toutes vos belles théories s’effondrent ! Voilà le genre d’aventure qui nous arrive de temps à autre ! »
(Richard Feynman, 1918-1988)
A mes grands-parents A mes parents A ma sœur
Avant-propos
Ce travail de recherche a été réalisé au Laboratoire de Physico-Chimie et Génie Alimentaires de l’Ecole Nationale Supérieure d’Agronomie et des Industries Alimentaires sous la direction de Monsieur Joël Hardy, Professeur à l’ENSAIA. Je tiens à le remercier pour la grande liberté d’action qu’il m’a accordée au cours de cette thèse, mais également pour les commentaires éclairés et les suggestions pertinentes dont il m’a fait part durant la rédaction de ce document.
Je tiens à remercier particulièrement Monsieur Christian Sanchez, Maître de Conférences à l’ENSAIA et co-directeur de cette thèse pour le soutien et pour la confiance qu’il m’a témoignés durant ces années passées au laboratoire. Je tiens à le remercier de m’avoir inculquer les principes qui sont à la base de toute démarche scientifique : la curiosité, la rigueur, la ténacité et l’humilité. Je le remercie pour les innombrables heures passées à discuter et à tenter de comprendre les résultats obtenus pour en arriver parfois à des considérations métaphysiques. Qu’il soit assuré ici de ma plus sincère reconnaissance.
Je remercie Monsieur Cees G. de Kruif, Professeur à l’Université d’Utrecht et responsable du département Product Technology au NIZO food research de Ede et Monsieur Ilias Iliopoulos, Directeur de Recherche à l’ESCPI de Paris pour l’honneur qu’ils m’ont fait en acceptant d’être les rapporteurs de ce travail. Je tiens également à remercier tout particulièrement Madame Sylvie Turgeon, Professeure à l’Université Laval de Québec et Monsieur Denis Renard, Chargé de Recherche à l’INRA de Nantes pour avoir accepté de faire partie de ce jury.
Je remercie également Monsieur Cees G. de Kruif pour m’avoir permis de passer deux mois au NIZO food research de Ede. Ils ont constitué pour moi une expérience riche en découvertes tant scientifiques que culturelles.
Je remercie ici également Messieurs Denis Renard et Paul Robert de l’INRA de Nantes pour m’avoir fait partager les mystères de la spectroscopie infra-rouge et de la diffusion de la lumière durant mon séjour à Nantes. Nos discussions sur l’apparition du pic d’absorbance du CO2 sur les spectres infra-rouges resteront pour moi un souvenir impérissable.
Je tiens également à remercier Alf Lamprecht, étudiant en thèse et Monsieur Claus- Michael Lehr, Professeur à l’Université de Saarbrücken pour m’avoir accueilli durant plus d’un mois au sein du Laboratoire de Biopharmacie et Pharmacie Galénique. Je remercie tout particulièrement Alf pour les heures que nous avons passées dans la bonne humeur à observer la structure des coacervats.
Je voudrais également remercier Monsieur Fabien Thomas, Directeur de Recherche au Laboratoire Environnement Minéralurgie de l’INPL-CNRS pour m’avoir permis de réaliser les mesures de mobilité électrophorétique. Je tiens également à le remercier pour les discussions que nous avons eus durant la préparation des publications.
Je remercie Monsieur Harry S. Rollema, Chercheur au NIZO food research pour sa grande sympathie et pour l’aide apportée dans la réalisation des spectres RMN de la gomme
d’acacia à la Faculté des Sciences de Nijmingen. Mes remerciements également à Monsieur Erik ten Grotenhuis, Chercheur au NIZO food research pour ses conseils dans la réalisation des mesures de diffusion de la lumière en milieu turbide.
Je tiens également à remercier ici Séverine Despond et Ghozlène Mekhloufi pour avoir choisi d’étudier la coacervation complexe durant leur DEA. Toutes deux sont pétries de qualités et travailler avec elles fut un bonheur. Que dire des séances hebdomadaires de course à pied et de badminton… Qu’elles trouvent ici le témoignage de mon indéfectible amitié.
Je remercie Madame Marie-Noëlle Maucourt pour sa sympathie et pour toute l’aide qu’elle m’a apportée durant cette thèse. Un grand merci également à Carole Pierret pour le sérieux et l’enthousiasme avec lesquels elle a accepté de réaliser des expériences complémentaires de turbidimétrie en fin de thèse. Je remercie Madame Angèle Colas pour sa gentillesse et sa disponibilité malgré les nombreuses tâches qui l’occupent. Je tiens également à remercier Madame Sylviane Lemaire pour sa bonne humeur, sa disponibilité et ses conseils avisés dans la recherche de nombreux articles et monographies.
Je tiens à remercier Marine, Marie-Laure, Philippe et Cyril pour les fous-rires et agréables moments passés au laboratoire et ailleurs. Merci également à Cristina, Claude, Raquel, Michel, Pierre, Benjamin et Excellent pour leur bonne humeur et leur amitié. Je tiens également à saluer ici Gilles, Patricia et Erika rencontrés aux Pays-Bas et avec lesquels j’ai passé des journées mémorables. Je ne saurais oublier la fine équipe des administrateurs de l’association ARIA : Isabelle, Sophie, Lionel, Claude, Silvère et Stéphane avec lesquels j’ai vécu des moments de joie et de stress intenses lors de la préparation des journées Biotechno.
Je souhaite à tous une pleine réussite future tant sur le plan scientifique que sur le plan humain.
Je remercie également tous membres du Laboratoire de Physico-Chimie et Génie Alimentaires grâce à qui ces quatre années ont été pour moi riches d’échanges et d’anecdotes inénarrables.
Je salue également la sympathie des Enseignants-Chercheurs du service de Chimie de l’IUT de Nancy.
Je terminerais cet avant-propos en remerciant les organismes qui ont financièrement contribué à la réalisation de cette thèse avec en premier lieu les Ministères de l’Education Nationale et de la Recherche, l’Académie d’Agriculture de France (Fondation Jean et Marie- Louise Dufrenoy), l’Union Européenne (Programme COST) et enfin l’Office Allemand d’Echanges Universitaires (DAAD).
Sommaire
Avant-propos ... 4
Sommaire ... 6
Nomenclature... 11
Introduction ... 15
Chapitre 1 Revue bibliographique... 19
1 Stabilité des mélanges de biopolymères... 19
1.1 Approche thermodynamique... 19
1.1.1 L’entropie combinatoire de mélange ... 19
1.1.2 Contribution interactionnelle... 20
1.1.3 L’effet de volume libre... 21
1.1.4 Séparation de phase dans les mélanges de biopolymères... 21
1.1.5 Différenciation macroscopique entre séparation de phase ségrégative et associative ... 22
2 La coacervation complexe... 25
2.1 Historique de la coacervation complexe ... 25
2.2 La coacervation complexe : modèles théoriques ... 26
2.2.1 Théorie de Voorn et Overbeek (1957)... 26
2.2.2 Théorie de Veis et Aranyi (1960) ... 27
2.2.3 Théorie de Nakajima et Sato (1972) ... 28
2.2.4 Théorie de Tainaka (1979, 1980)... 28
3 Nature des interactions entre les constituants d’un coacervat ... 29
3.1 Interactions électrostatiques... 29
3.2 Interactions non-électrostatiques ... 32
3.2.1 Liaisons hydrogènes... 33
3.2.2 Interactions hydrophobes... 34
3.2.3 Liaisons covalentes ... 35
4 Paramètres physico-chimiques et physiques influençant la formation des coacervats... 36
4.1 Influence du pH... 37
4.2 Influence de la force ionique... 41
4.3 Influence de la densité de charge des macromolécules ... 44
4.4 Influence de la masse moléculaire des biopolymères ... 45
4.5 Influence du ratio massique protéine : polysaccharide ... 46
4.6 Influence de la concentration totale en biopolymères... 48
4.7 Influence des paramètres physiques sur la coacervation complexe... 48
4.7.1 Température ... 48
4.7.2 Pression... 50
4.7.3 Agitation et temps d’agitation ... 51
5 Mécanisme de formation et structure des coacervats ... 52
5.1 Mécanisme de formation des coacervats ... 52
5.2 Structure des complexes macromoléculaires et des coacervats... 55
6 Conclusion ... 58
Chapitre 2 Caractérisation préliminaire de la β-lactoglobuline et de la gomme d’acacia utilisés dans cette étude... 60
1 Présentation des biopolymères utilisés ... 60
1.1 La β-lactoglobuline... 60
1.1.1 Structures primaire, secondaire et tertiaire de la β-lactoglobuline ... 61
1.1.2 Structure quaternaire de la β-lactoglobuline... 62
1.1.2.1 Influence du pH... 62
1.1.2.2 Influence de la force ionique... 63
1.1.2.3 Influence de la température... 64
1.1.2.4 Rôle biologique et autres propriétés physico-chimiques de la β-lactoglobuline... 64
1.2 La gomme d’acacia ... 65
1.2.1 Composition chimique de la gomme d’acacia ... 66
1.2.2 Structure de la gomme d’acacia... 66
1.2.3 Principales propriétés physico-chimiques de la gomme d’acacia... 68
1.2.4 Rôle biologique et autres propriétés de la gomme d’acacia... 69
2 Matériels et méthodes de caractérisation des biopolymères... 69
2.1 Matériels ... 69
2.2 Méthodes... 70
2.2.1 Analyses physico-chimiques et contrôle de la pureté des poudres de β-lactoglobuline et de gomme d’acacia ... 70
2.2.1.1 Analyses physico-chimiques... 70
2.2.1.2 Contrôle de la pureté des poudres de β-lactoglobuline et de gomme d’acacia. 70 2.2.1.2.1 Chromatographie haute performance en phase inverse de la β-lactoglobuline ... 70
2.2.1.2.2 Spectre RMN C13 de la gomme d’acacia ... 71
2.2.2 Structure et caractéristiques physico-chimiques des dispersions de β-lactoglobuline et de gomme d’acacia ... 71
2.2.2.1 Préparation des dispersions de β-lactoglobuline et de gomme d’acacia... 71
2.2.2.2 Solubilité des dispersions de β-lactoglobuline et de gomme d’acacia ... 72
2.2.2.3 Mesure de la taille et de la distribution de taille des agrégats de β-lactoglobuline ... 72
2.2.2.4 Mesure de la masse moléculaire de la β-lactoglobuline et de la gomme d’acacia... 73
2.2.2.5 Détermination des rayons hydrodynamiques de la β-lactoglobuline et de la gomme d’acacia... 73
2.2.2.6 Détermination de la mobilité électrophorétique des dispersions de β-lg et de
gomme d’acacia... 74
3 Résultats et discussion ... 75
3.1 Analyses physico-chimiques et pureté des macromolécules ... 75
3.2 Solubilité des macromolécules ... 77
3.3 Caractérisation des différentes dispersions obtenues : détermination des masses moléculaires, rayons hydrodynamiques et diamètre des agrégats protéiques... 80
3.3.1 Gomme d’acacia ... 80
3.3.2 β-lactoglobuline ... 84
3.4 Mobilité électrophorétique des dispersions de BLGagr, BLG et gomme d’acacia ... 88
4 Conclusion ... 91
Chapitre 3 Etude de la stabilité et de la structure des mélanges β-lactoglobuline/gomme d’acacia/eau : influence du pH, du ratio Pr : Ps, de la concentration totale et de la polydispersité ... 93
1 Introduction ... 93
2 Matériels et méthodes... 93
2.1 Matériels ... 93
2.2 Méthodes... 93
2.2.1 Etude macroscopique des mélanges β-lactoglobuline/gomme d’acacia/eau ... 94
2.2.1.1 Construction des diagrammes de phases ternaires... 94
2.2.1.2 Suivi de l’absorbance à 650 nm dans les mélanges β-lactoglobuline/gomme d’acacia/eau... 95
2.2.1.3 Détermination de la composition des phases après deux jours... 96
2.2.1.4 Observation visuelle des mélanges β-lactoglobuline/gomme d’acacia/eau... 96
2.2.2 Etude mésoscopique des mélanges β-lactoglobuline/gomme d’acacia/eau ... 96
2.2.2.1 Mobilité électrophorétique des mélanges β-lactoglobuline/gomme d’acacia/eau... 96
2.2.2.2 Taille et distribution de taille des particules ... 97
2.2.2.3 Morphologie et structure des particules dans les mélanges β-lactoglobuline/gomme d’acacia/eau ... 97
2.2.2.3.1 Microscopie optique à contraste de phase ... 97
2.2.2.3.2 Microscopie confocale à balayage laser ... 97
2.2.3 Etude moléculaire des mélanges β-lactoglobuline/gomme d’acacia/eau... 98
2.2.3.1 Spectroscopie Infra-Rouge à Transformée de Fourier... 99
2.2.3.2 Dichroïsme circulaire... 100
2.2.3.3 Spectroscopie de fluorescence frontale... 100
2.2.4 Analyse statistique... 101
3 Résultats et Discussion ... 101
3.1 Etude macroscopique des mélanges β-lactoglobuline/gomme acacia/eau ... 102
3.1.1 Diagrammes de phases ternaires à pH 4,2 ... 102
3.1.2 Influence du pH et du ratio protéine : polysaccharide (Pr : Ps) ... 104
3.1.2.1 Diagrammes de phases partiels... 104 3.1.2.2 Variation de l’absorbance des mélanges β-lactoglobuline/gomme
d’acacia/eau à 650 nm ... 106
3.1.3 Observation de la séparation de phase après deux jours et étude de la composition des deux phases obtenues... 109
3.1.3.1 Observation macroscopique de la séparation de phase... 109
3.1.3.2 Etude de la composition en β-lactoglobuline et en gomme d’acacia des deux phases à l’équilibre thermodynamique... 113
3.1.4 Conclusion de l’étude macroscopique de la séparation de phase dans les mélanges β-lactoglobuline/gomme d’acacia/eau... 118
3.2 Etude mésoscopique de la séparation de phase dans les mélanges β-lactoglobuline/gomme d’acacia/eau ... 119
3.2.1 Mobilité électrophorétique des particules obtenues dans les mélanges β-lactoglobuline/gomme d’acacia/eau ... 119
3.2.2 Tailles et distributions de taille des particules obtenues après séparation de phase dans les mélanges β-lactoglobuline/gomme d’acacia/eau... 120
3.2.3 Structure et morphologie des particules obtenues après séparation de phase dans les mélanges β-lactoglobuline/gomme d’acacia/eau... 124
3.2.3.1 Microscopie optique à contraste de phase ... 124
3.2.3.2 Microscopie confocale à balayage laser ... 128
3.2.4 Conclusion de l’étude mésoscopique de la séparation de phase dans les mélanges β-lactoglobuline/gomme d’acacia/eau... 135
3.3 Etude moléculaire de la séparation de phase ... 136
3.3.1 Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier... 136
3.3.2 Dichroïsme circulaire ... 140
3.3.3 Fluorescence frontale... 142
4 Conclusion de l’étude moléculaire de la séparation de phase dans les mélanges β-lactoglobuline/gomme d’acacia eau... 144
Chapitre 4 Approche cinétique de la stabilité et de la structure des mélanges β-lactoglobuline/gomme d’acacia/eau ... 145
1 Introduction ... 145
2 Matériels et méthodes... 145
2.1 Matériels ... 145
2.2 Méthodes... 146
2.2.1 Suivi de la cinétique de séparation de phase par diffusion dynamique de la lumière en milieu turbide... 146
2.2.1.1 Principe de la diffusion de la lumière en milieu turbide... 146
2.2.1.2 Dispositif expérimental... 147
2.2.2 Suivi de la séparation de phase par microscopie confocale à balayage laser .. 147
2.2.3 Suivi de la séparation de phase et de la structuration des mélanges par diffusion statique de la lumière aux petits angles... 148
2.2.3.1 Principe de l’étude des phénomènes de séparation de phase par diffusion de la lumière au cours du temps ... 148
2.2.3.2 Dispositif expérimental... 151
3 Résultats et discussion ... 152
3.1 Suivi de la structure au cours du temps des mélanges β-lactoglobuline/gomme
d’acacia/eau par diffusion dynamique de la lumière en milieu turbide (DLMT) ... 152
3.2 Suivi de la stabilité des mélanges β-lactoglobuline/gomme d’acacia/eau par microscopie confocale à balayage laser... 158
3.3 Etude de la cinétique de séparation de phase dans les mélanges β- lactoglobuline/gomme d’acacia/eau par diffusion statique de la lumière aux petits angles ... 168
4 Conclusion de l’étude cinétique de la séparation de phase dans les mélanges β-lactoglobuline/gomme d’acacia/eau ... 180
Conclusions et perspectives de l’étude ... 183
1 Résultats fondamentaux obtenus au cours de cette étude... 183
1.1 Influence des paramètres physico-chimiques sur la coacervation complexe entre la β-lactoglobuline et la gomme d’acacia ... 183
1.2 Structure et stabilité des particules formées... 183
1.3 Modifications de la structure moléculaire de la β-lactoglobuline ... 184
1.4 Cinétique de structuration des mélanges β-lactoglobuline/gomme d’acacia/eau ... 184
2 Validité des méthodes expérimentales utilisées... 185
3 Perspectives de cette étude... 185
4 Domaines d’application de cette étude ... 186
Références bibliographiques ... 187
Nomenclature
AED Analyse enthalpique différentielle
AG Fraction arabino-galactane de la gomme d’acacia AGP Fraction arabino-galacto-protéique la gomme d’acacia ASB Albumine de sérum bovin
ASH Albumine de sérum humain aw Activité de l’eau
BLG Dispersion de β-lactoglobuline native
BLGagr Dispersion de β-lactoglobuline contenant des agrégats C14TABr Bromure de tétradécyltriméthylammonium
CE Chromatographie d’exclusion CHC Théorie de Cahn-Hilliard-Cook CMC Carboxyméthylcellulose
CPDMDAA Chlorure de poly(diméthyldiallylammonium) CS Cellulose sulfatée
Ct Concentration totale en biopolymères
D ou D0 Coefficient de diffusion des particules (m2 s-1) Dapp Diamètre apparent d’une particule (m)
DC Dichroïsme circulaire
DDL Diffusion dynamique de la lumière df Dimension fractale
DLMT Diffusion de la lumière en milieu turbide DMSO Diméthylsulfoxyde
ds Contribution de surface à la structure de l’interface DS Dextrane sulfaté ou décomposition spinodale DSLPA Diffusion statique de la lumière aux petits angles dv Contribution de volume à la structure de l’interface E Champ électrique (V m-1)
EEP pH d’équivalence électrique F(q) Facteur de forme en DSLPA FITC Fluorescéine isothiocyanate
g1(t) Fonction de corrélation de variation de champ électrique
g2(t) Fonction de corrélation de variation d’intensité diffusée en DLMT g2(∆t) Fonction de corrélation de variation d’intensité diffusée en DDL GP Fraction glyco-protéique de la gomme d’acacia
HMPA Polyacrylate de sodium modifié par greffage hydrophobe I(q) Intensité diffusée en DSLPA
Imax Maximum d’intensité diffusée en DSLPA Io Rigidité intrinsèque d’un polymère
kB Constante de Boltzmann (1,38 x 10-23 J K-1)
ko Paramètre intervenant dans le calcul de τ0 en DLMT l Longueur de corrélation dans une dispersion en DLMT (m)
l* Distance minimale de transport de la lumière donnant lieu à une rétro- diffusion en DLMT (m)
Mapp Masse moléculaire apparente (kg mol-1) MCBL Microscopie confocale à balayage laser MOCP Microscopie optique à contraste de phase n Indice de réfraction d’un milieu
NaHy Hyaluronate de sodium
NAPAMS Sel sodique de l’acide poly(2-acrylamido-2-méthylpropane sulfonique) NAPSS Sel sodique de l’acide polystyrène sulfonique
NC Nucléation et croissance
P(s) Probabilité pour que la lumière suive un trajet optique s en DLMT PAI Protéine agrégée insoluble
PAS Protéine agrégée soluble
pHc pH de formation des complexes macromoléculaires pHi pH isoélectrique d’une protéine
pHmorph pH de stabilisation des complexes macromoléculaires pHprecip pH de précipitation des complexes macromoléculaires pHφ pH de séparation de phase macroscopique
PNS Protéine native soluble
q Vecteur d’onde d’intensité diffusée (m-1) qmax Vecteur d’onde correspondant à Imax (m-1) R Constante des gaz parfaits (8,3144 J mol-1 K-1)
r Masse moléculaire d’un biopolymère (kg mol-1)
R(q) Facteur de linéarisation dans la théorie de Cahn-Hilliard-Cook Rh Rayon hydrodynamique (nm)
RITC Rhodamine B isothiocyanate RMN Résonance magnétique nucléaire
RP-HPLC Chromatographie liquide à haute performance en phase inverse s Trajet optique ou nombre de trajets optiques en DLMT
S(q) Facteur de structure en DSLPA SDS Dodécylsulfate de sodium
SFF Spectroscopie de fluorescence frontale
SIRTF Spectroscopie infra-rouge à transformée de Fourier T Température absolue (K)
t Temps (s)
TFA Acide trifluoroacétique tpm Tours par minute
TTAB Bromure de tétradécyltriméthylammonium V Volume total du mélange (m3)
Vi Volume molaire du composé i (m3 mol-1)
z Nombre de coordination dans la théorie de Flory-Huggins Zp Charge de la protéine (V)
µE Mobilité électrophorétique (m m V-1 s-1)
∆Ei Chaleur de vaporisation du composé i à pression nulle (J kg-1 K-1)
∆GM Variation d’énergie libre du mélange (J)
∆HM Variation d’enthalpie du mélange(J mol-1)
∆SM Variation d’entropie du mélange (J K-1)
∆ωij Variation de l’énergie d’interaction associé à la création d’un segment i-j dans la théorie de Flory-Huggins (J)
Λ Rayon d’un «patch » de densité de charge porté par une protéine ou longueur de corrélation d’un domaine structural en DSLPA (m)
α Indice de croissance de qmax selon une loi en puissance t α-la α-lactalbumine
β Constante instrumentale de DLMT ou indice de croissance de Imax selon une loi en puissance t
β-lg β-lactoglobuline
χij Paramètre d’interaction de Flory-Huggins entre des composés i et j δi Paramètre de solubilité du composé i
φ Fraction volumique
γ Pente de l’asymptote des fonctions normalisées de I(q) en fonction de q ou valeur de l’exposant du modèle de Furukawa
η Viscosité apparente (Pa s) ηs Viscosité du solvant (Pa s)
ϕi Fraction volumique du composé i
κ Paramètre électrostatique de Debye-Hückel
λ Longueur d’onde (m)
ν Vitesse des particules dans un champs électrique (m s-1)
θ Angle de diffusion de la lumière (rad) ou angle d’observation de la lumière diffusée
[θ] Ellipticité molaire (deg m2 mol-1)
σ Densité de charge d’un biopolymère (V m-2) σc Densité de charge critique (V m-2)
τ Temps de diffusion des particules (s)
τ0 Temps de corrélation correspondant à une diffusion simple de la lumière en DLMT (s)
τ1/2 Temps de demi-décroissance de g2(t) en DLMT (s) ξ Densité de charge linéaire d’un polymère (V m-1)
ζ Potentiel zéta (V)
Introduction
Environ 80% des produits alimentaires consommés aujourd’hui sont des mélanges complexes d’ingrédients tels que protéines, polysaccharides, lipides, minéraux, arômes, vitamines, conservateurs. Les propriétés intrinsèques de chaque molécule, mais surtout les différents types d’interactions déterminent la stabilité, la structure, la texture et les propriétés organoleptiques des produits. Parmi les molécules utilisées, les protéines et les polysaccharides jouent un rôle important car elles possèdent à la fois des propriétés nutritionnelles et techno-fonctionnelles importantes. Si l’on excepte le fait que leur polydispersité soit rarement prise en compte, les propriétés fonctionnelles des molécules prises séparément sont assez bien connues au niveau moléculaire. Il en va tout autrement lorsque l’on considère le rôle des interactions protéine-polysaccharide sur les propriétés fonctionnelles des systèmes multiphasiques obtenus comme les solutions, les gels ou les émulsions alimentaires.
De manière générale, les mélanges de biopolymères en solution aqueuse sont caractérisés par une instabilité due à une prévalence des contributions entropiques sur les contributions enthalpiques, du fait de la masse moléculaire élevée de ces macromolécules.
Cette instabilité se traduit macroscopiquement par une séparation de phase et conduit, en fonction de l’équilibre entre les différents types d’interactions solvant-solvant, solvant- biopolymère ou biopolymère-biopolymère, à deux phénomènes bien distincts. Lorsque les interactions solvant-biopolymère sont favorisées, les deux phases contiennent préférentiellement un des biopolymères présents initialement, le solvant étant quant à lui réparti de façon homogène dans les deux phases. Ce type de séparation de phase est appelé incompatibilité thermodynamique ou séparation de phase ségrégative. Si, en revanche, les interactions biopolymère-biopolymère sont favorisées, les biopolymères se trouvent concentrés dans l’une des deux phases, la seconde contenant principalement du solvant. On parle alors de coacervation complexe ou de séparation de phase associative.
La coacervation complexe n’est pas le cas le plus fréquemment rencontré dans les mélanges protéine-polysaccharide car il requiert des conditions strictes de compatibilité entre les macromolécules, permettant alors la formation de complexes macromoléculaires. Ceux-ci interagissent ensuite pour former des gouttelettes concentrées appelées coacervats. Les interactions protéine-polysaccharide rencontrées dans le cadre de la coacervation complexe sont majoritairement de nature électrostatique si bien que de nombreux paramètres physico- chimiques (pH, force ionique, densité de charge de biopolymères, ratio de mélange protéine- polysaccharide, concentration totale en biopolymères) et physiques (pression, température, agitation) influencent la formation des complexes macromoléculaires et des coacervats.
Bien qu’il s’agisse d’un mécanisme de séparation de phase peu répandu dans les mélanges biopolymèriques, la coacervation complexe fait l’objet d’un nombre croissant d’études fondamentales. En effet, l’étude des conditions de formation, de la structure et de la cinétique de structuration d’un coacervat « modèle », basé sur un système protéine/polysaccharide/solvant bien défini, contribuera à la compréhension des propriétés des macromolécules biologiques dans les systèmes auto-organisés. La meilleure connaissance de la coacervation complexe est en effet indispensable à l’étude des milieux biologiques, en particulier des mécanismes de formation et d’organisation des complexes entre des protéines (enzymes, histones) ou des acides nucléiques (ADN, ARN) dans un environnement rappelant celui du cytoplasme cellulaire. Si l’on considère les applications industrielles potentielles de
la coacervation complexe, la compréhension des mécanismes de formation des coacervats dans différentes conditions de milieu est essentielle si l’on veut prévoir et améliorer les propriétés techno-fonctionnelles des coacervats. En effet, il a été montré que les propriétés fonctionnelles des biopolymères complexés étaient supérieures à celles des biopolymères seuls et que les domaines d’utilisation de ces assemblages macromoléculaires complexes étaient multiples. Mis à part l’élaboration de nouveaux ingrédients alimentaires multifonctionnels, on peut citer la purification de molécules biologiques par précipitation, la micro- ou nano-encapsulation de principes actifs en pharmacie, médecine ou cosmétologie, la synthèse de vecteurs thérapeutiques, la synthèse de biomatériaux biocompatibles ou l’élaboration de biocapteurs.
Principales questions scientifiques posées
La coacervation complexe est à l’heure actuelle décrite comme un mécanisme de séparation de phase liquide-liquide résultant de la formation de complexes électrostatiques intramoléculaires entre des macromolécules. L’agrégation de ces complexes, initialement solubles, conduit à la formation de complexes intermoléculaires insolubles, qui après floculation et coalescence forment des gouttelettes liquides appelées coacervats. Les coacervats soumis à la pesanteur floculent et coalescent également pour aboutir à une séparation de phase macroscopique.
Nous pensons que cette vision globale et très schématique du phénomène de séparation de phase est beaucoup plus complexe lorsque l’on considère les mélanges de macromolécules biologiques en solution aqueuse. En effet, il faut alors tenir compte de l’effet de la polydispersité des biopolymères, de leur concentration totale dans le milieu et de l’effet combiné de ces deux variables sur la formation et la stabilité des coacervats.
Objectifs
Les objectifs principaux de ce travail sont acquérir des données fondamentales concernant la coacervation complexe dans un mélange protéine/polysaccharide/eau modèle.
Plus précisément, nous souhaitons étudier l’influence de la polydispersité et de la concentration totale en biopolymères sur la formation des coacervats, puis sur leurs propriétés structurales et leur stabilité au cours du temps.
Approche expérimentale
L’étude de la structure des coacervats et de la cinétique de la coacervation complexe que nous nous proposons de réaliser nécessite l’utilisation d’un nombre important de techniques expérimentales. Nous avons choisi celles-ci en les adaptant au niveau structural étudié, mais également en tenant compte des limitations expérimentales imposées par les différents systèmes : turbidité, concentration en biopolymères, taille des particules.
Pour notre étude, nous avons considéré un système ternaire modèle constitué d’une protéine de lait, la β-lactoglobuline, d’un polysaccharide végétal, la gomme d’acacia et du solvant le plus largement rencontré dans le domaine alimentaire, l’eau.
Le choix de la β-lactoglobuline s’explique pour plusieurs raisons. Il s’agit tout d’abord d’une protéine très largement utilisée comme ingrédient alimentaire du fait de ses propriétés tensio-actives et gélifiantes. D’autre part, on peut l’obtenir assez facilement en grandes quantités à un état de pureté élevé. De plus, la structure moléculaire de la β-lactoglobuline est
à l’heure actuelle très bien connue ce qui fait que nous pourrons suivre l’évolution de celle-ci après complexation avec la gomme d’acacia. Cette protéine possède également des propriétés d’association et d’agrégation importante, ce qui permet de pouvoir faire varier facilement sa polydispersité. Enfin, la β-lactoglobuline est bien connue dans notre laboratoire puisqu’elle a fait l’objet de deux thèses traitant de son interaction avec le chlorure de sodium (Fanni, 1987) et avec la vitamine C (Dai-Dong, 1990).
La gomme d’acacia a également été retenue du fait de son utilisation intensive dans l’industrie alimentaire car elle possède des propriétés interfaciales remarquables et une faible viscosité. De plus, la gomme d’acacia est historiquement liée à la découverte de la coacervation complexe entre biopolymères lors de son interaction avec la gélatine. Elle est d’ailleurs toujours largement utilisée dans un grand nombre de procédés d’encapsulation faisant appel au phénomène de coacervation complexe.
Plan de la thèse
Le document présenté ici se compose de quatre chapitres qui s’attachent à considérer un point précis de l’étude globale.
Ainsi, le chapitre 1 est essentiellement consacré à la revue bibliographique des études concernant la coacervation complexe. Il débute en rappelant les bases théoriques de la stabilité des solutions macromoléculaires, puis fait le point sur l’état des connaissances sur les types d’interactions se produisant dans les complexes protéine-polysaccharide, l’influence des paramètres physiques et physico-chimiques. La structure et la stabilité des coacervats sont ensuite évoquées.
Le chapitre 2 concerne la caractérisation des deux biopolymères utilisés dans cette étude.
Dans le chapitre 3, qui constitue une part importante de ce travail de thèse, nous avons étudié l’interaction entre les deux biopolymères en choisissant diverses échelles d’observation, en caractérisant la séparation de phase macroscopique, la structure et les propriétés de surface des coacervats ainsi que les modifications de structure de la β-lg.
Finalement, nous avons dans le chapire 4, caractérisé la stabilité des coacervats obtenus dans diverses conditions expérimentales en étudiant plus particulièrement l’influence de la polydispersité de la β-lactoglobuline sur la coacervation complexe.
Les chapitres 2, 3 et 4 contiennent une description détaillée des méthodes expérimentales utilisées, les résultats obtenus et la discussion de ceux-ci à la lumière des données bibliographiques disponibles.
En termes de valorisation de la recherche, cette étude a donné lieu aux publications et communications suivantes :
Revues internationales à comité de lecture :
Schmitt, C., Sanchez, C., Desobry-Banon, S. et Hardy J. (1998). Structure and technofunctional properties of protein-polysaccharide complexes. A review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 38, 8, 689-753.
Schmitt, C., Sanchez, C., Thomas, F. et Hardy., J. (1999). Complex coacervation between β-lactoglobulin and acacia gum in aqueous medium. Food Hydrocolloids, 13, 6, 483- 496.
Schmitt, C., Sanchez, C., Despond, S., Renard, D., Thomas, F. et Hardy, J. (2000).
Effect of protein aggregates on the complex coacervation between β-lactoglobulin and acacia gum at pH 4.2. Food Hydrocolloids, 14, 4, 403-413.
Schmitt, C., Sanchez, C., Lamprecht, A., Renard, D., Lehr, C.-M., de Kruif, C. G. et Hardy, J. (2001). Study of β-lactoglobulin/acacia gum complex coacervation by diffusing- wave spectroscopy and confocal scanning laser microscopy. Colloids and Surfaces B : Biointerfaces, 20, 3, 267-280.
Chapitre d’ouvrage :
Schmitt, C., Sanchez, C., Despond, S., Renard, D., Robert, P. et Hardy, J. (2001).
Structural modification of β-lactoglobulin as induced by complex coacervation with acacia gum. Dans E. Dickinson et R. Miller (Eds), Food Colloids : Fundamentals of Formulation, Cambridge : Royal Society of Chemistry, 323-331.
Communications orales dans des congrès internationaux avec actes :
Schmitt, C., Sanchez, C. et Hardy, J. (2000). Influence of the initial protein-aggregated state on the complex coacervation between β-lactoglobulin and acacia gum in aqueous media.
2nd International Symposium on Food Rheology and Structure, 12-16 Mars, Zürich, Suisse.
Schmitt, C., Sanchez, C., Despond, S., Renard, D., Robert, P. et Hardy, J. (2000).
Structural modification of β-lactoglobulin as induced by complex coacervation with acacia gum. Food Colloids 2000 : Fundamentals of Formulation, 2-5 Avril, Postdam, Allemagne.
Chapitre 1 Revue bibliographique
Les mélanges de biopolymères en solution aqueuse sont très souvent caractérisés par des phénomènes de compatibilité ou d’incompatibilité se traduisant par une séparation de phase macroscopique du système à plus ou moins long terme. La compatibilité ou l’incompatibilité entre les biopolymères proviennent de la faible entropie de mélange des composés macromoléculaires, qui ne peut compenser des valeurs même très faiblement positives de l’enthalpie de mélange, défavorables à la stabilité de celui-ci (Frugier, 1988).
1 Stabilité des mélanges de biopolymères
Afin de cerner plus en détail les différents paramètres déterminant les conditions de stabilité des mélanges biopolymériques, il est indispensable de rappeler les bases thermodynamiques ayant permis d’étudier et de prédire la stabilité des mélanges de biopolymères.
1.1 Approche thermodynamique
L’approche la plus communément utilisée dans le traitement théorique des problèmes de stabilité des solutions biopolymériques découle de la théorie de Flory-Huggins (Flory, 1942 ; Huggins, 1942), développée à l’origine pour des mélanges de polymères fondus. Ainsi, si l’on considère un mélange de biopolymères avec un solvant, la stabilité du système obtenu dépend en vertu du Second Principe de la Thermodynamique de la variation de l’énergie libre du mélange ∆GM qui, pour que le mélange soit stable (monophasique), doit être négative et ne posséder qu’un seul minimum local selon l’équation (1.1) :
∆GM = ∆HM – T∆SM < 0 (1.1)
Les termes ∆HM et ∆SM représentent, respectivement, les variations d’enthalpie et d’entropie dues au mélange. T est la température absolue exprimée en K. La stabilité d’un mélange biopolymérique dépend donc principalement de la contribution des termes ∆HM et
∆SM dans l’équation (1.1). Cette contribution s’exprime principalement au travers de trois effets thermodynamiques qui sont l’entropie combinatoire de mélange, la contribution des interactions entre les molécules et l’effet de volume libre (Tompa 1956 ; Patterson, 1982).
Nous allons détailler ces différents effets en nous plaçant dans le cas simple d’un mélange binaire (solvant1-solvant2, solvant-biopolymère ou biopolymère1-biopolymère2), puis nous généraliserons les résultats obtenus aux mélanges biopolymériques ternaires.
1.1.1 L’entropie combinatoire de mélange
Dans l’approche proposée par Flory et Huggins, le volume total d’un mélange est assimilé à un réseau constitué d’unités répétitives appelées sites qui sont composées d’un cube d’arête a et de volume a3 (Flory, 1953). La somme des volumes de tous ces sites est égale au volume total du mélange et chaque site peut être occupé indifféremment par une molécule de solvant ou par un monomère constituant le polymère en solution. De ce modèle, il découle que l’énergie combinatoire de mélange, ∆SM, représente le nombre de positions différentes pouvant être occupées par les molécules à l’intérieur du réseau (mélange). En d’autres termes, l’état de désordre potentiel du mélange. Il va de soi que plus les molécules
considérées auront un volume voisin de a3, plus l’entropie combinatoire de mélange sera élevée. ∆SM peut alors être définie par l’équation (1.2) :
∆SM /RV = - [(ϕ1ln ϕ1)/V1 + (ϕ2lnϕ2)/V2] (1.2)
où ϕi est la fraction volumique du composé i dans le mélange, Vi son volume molaire, R la constante des gaz parfaits (8,3144 J.mol-1.K-1) et V le volume total du mélange. En considérant cette équation, on comprend aisément l’une des causes de l’instabilité des mélanges de biopolymères puisque dans ce cas Vi est élevé, ce qui entraîne une diminution de
∆SM et donc une augmentation défavorable de ∆GM. 1.1.2 Contribution interactionnelle
La contribution interactionnelle à l’énergie libre de mélange ou chaleur de mélange,
∆HM, repose sur l’existence de forces intermoléculaires répulsives (hydratation, répulsions électrostatiques ou stériques) ou attractives (interactions électrostatiques, hydrophobes, Van der Waals) entre les molécules et les atomes des différents constituants du mélange. Cette quantité peut être définie par l’équation (1.3) :
∆HM = V(δ1 – δ2)2ϕ1ϕ2 et δi = (∆Ei/Vi)1/2 (1.3)
où V est le volume total du mélange, ∆Ei la chaleur de vaporisation du composé i à pression nulle, Vi le volume molaire du composé i, δi le paramètre de solubilité défini par Scott et Hildebrand (1951). La valeur de ∆HM dépend principalement du terme (δ1 – δ2)2. Scott et Hildebrand ont étudié l’évolution de celui-ci dans différentes conditions de mélange.
Ils ont conclu que les forces dispersives (dipôle-dipôle induit) contribuaient toujours positivement à ∆GM (∆HM > 0). Dans ce cas, ∆HM ne contribue pas a la stabilisation du mélange. Dans de rares cas d’interactions faibles et non-spécifiques (transfert de charges, liaisons hydrogènes), ∆HM < 0 et le système se trouve stabilisé (Scott, 1949). Il faut noter que l’enthalpie de mélange peut également s’écrire sous la forme :
∆HM/RTV = [(z∆ω12)/kBTVs]ϕ1ϕ2 = (χ12/V1)ϕ1ϕ2 (1.4)
où z est le nombre de coordination (nombre de plus proches voisins du site du réseau considéré), Vs (= a3) le volume d’un site, kB la constante de Boltzmann (1,38 10-23 J.K-1) et
∆ω12 la variation de l’énergie d’interaction du système associée à la création d’une liaison de type 1-2 dans le mélange entre des segments des sites occupés par des composés 1 et 2, respectivement :
∆ω12 = ω12 – [(ω11 + ω22)/2] (1.5)
où ωij est l’énergie d’interaction entre des sites occupés par des composés i et j, χ12 est le paramètre d’interaction entre les composés i et j défini selon Flory et Huggins par :
χ12 = (z∆ω12r1)/kBT (1.6)
ri étant la longueur du composé i (nombre de sites par molécule). Si l’on combine les équations (1.2) et (1.4), on obtient pour ∆GM l’expression suivante :
∆GM/RTV = (ϕ1lnϕ1)/V1 + (ϕ2lnϕ2)/V2 + (χ12/V1)ϕ1ϕ2 (1.7)
Dans le cas des mélanges de biopolymères, V1 et V2 sont généralement élevés, la stabilisation entropique du système est alors négligeable et c’est alors le terme d’interaction χ12 qui contrôle la stabilité du mélange.
1.1.3 L’effet de volume libre
Cette contribution à l’énergie libre de mélange est liée à la variation de volume induite par le mélange des molécules constituant le mélange, généralement le solvant et le (ou les) biopolymère(s). Il représente l’influence de la différence entre les volumes libres du solvant et des biopolymères. Le volume libre du biopolymère est considéré comme très faible par rapport à celui du solvant du fait de la différence de taille entre les molécules. En conséquence, le mélange qui tend à rapprocher les molécules les unes des autres contribue négativement à ∆SM et ∆HM. Par convention, l’effet de volume libre est intégré dans le terme d’interaction χ12.
1.1.4 Séparation de phase dans les mélanges de biopolymères
La séparation de phase macroscopique d’un mélange est obtenue lorsqu’une valeur critique de χ12 est atteinte. Celle-ci est obtenue pour les conditions critiques à partir de l’équation (1.7) :
(∂2∆GM/RTV)/ ∂ϕ22 = (∂3∆GM/RTV)/ ∂ϕ23 = 0 (1.8) si χ12 est indépendant de ϕ,
(χ12/V1)cr = 1/2[(1/ V1) + (1/ V2)]2 (1.9)
Dans un mélange binaire, la démixtion se produit donc lorsque χ12 > χ12cr. Si l’on considère un mélange solvant/biopolymère, V2 étant élevé, la valeur de χ12cr sera faible, ce qui explique que l’on peut observer une séparation de phase pour de très faibles variations positives de χ12 (Zeman et Patterson, 1972). Pour un mélange ternaire solvant1/biopolymère2 /biopolymère3, et si l’on se place dans le cas où les deux biopolymères ont la même taille (V2 = V3), le paramètre d’interaction biopolymère2/biopolymère3 qui contrôle la stabilité du système s’écrit :
χ23cr = 2/V2(1 - ϕ1) (1.10)
où ϕ1 est la fraction volumique du solvant. Il est ici clair que χ23cr n’atteint des valeurs élevées, et par conséquent produit un mélange thermodynamiquement stable, que pour des valeurs de ϕ1 proches de l’unité, c’est à dire pour des solutions macromoléculaires très diluées (Hsu et Prausnitz, 1974). Il est également remarquable que l’incompatibilité entre les molécules sera d’autant plus élevée que la masse moléculaire des biopolymères sera grande (V2 étant alors grand et par conséquent χ23 petit).
En considérant la variation de χ23 dans un mélange ternaire, il est possible de distinguer deux types de séparation de phase (Kötz et Beitz, 1997).
Dans le cas où χ23 est positif, ce qui traduit une répulsion nette entre les biopolymères en solution, les interactions de type solvant1/biopolymère2 et solvant1/biopolymère3 sont favorisées. Ce phénomène est principalement contrôlé par le volume exclu des macromolécules, qui les empêche d’arriver suffisamment près les unes des autres et d’interagir (Tolstoguzov, 1999). Le mélange se sépare alors en deux phases, chacune contenant préférentiellement l’un des deux biopolymères ainsi que du solvant. Cette séparation de phase a été historiquement qualifiée d’incompatibilité thermodynamique (Tolstoguzov, 1986), puis par la suite de séparation de phase de type ségrégative (Piculell et Lindman, 1992). Celle-ci est courante dans les mélanges de macromolécules de type protéine/polysaccharide que l’on utilise dans l’industrie alimentaire. Elle permet d’obtenir un grand nombre de produits possédant des structures et des textures différentes après traitement technologique des mélanges (Samant et al., 1993 ; Ledward, 1994 ; Tolstoguzov, 1997 ; Dickinson, 1998). Il est également intéressant de noter que ce phénomène de séparation de phase est également connu des biologistes. Il est alors dénommé « macromolecular crowding », car il est à l’origine des équilibres de partition des macromolécules (enzymes, phospholipides, ADN, polysaccharides) dans les différents compartiments cellulaires (Albertsson, 1971 ; Johansson et al., 2000).
Lorsque χ23 est négatif, traduisant une attraction nette entre les macromolécules, le mélange se sépare en deux phases, mais cette fois-ci les macromolécules se retrouvent concentrées dans une phase alors que la seconde phase est essentiellement composée de molécules de solvant. Historiquement, ce type de séparation de phase a été appelé coacervation complexe (Bungenberg de Jong, 1949). On l’a cependant, comme pour l’incompatibilité thermodynamique, rebaptisé séparation de phase associative (Piculell et Lindman, 1992). Ce type de séparation de phase fait alors référence à un phénomène de démixtion induite soit par des interactions directes (électrostatiques ou hydrogènes) entre les biopolymères, ce qui est le cas de la coacervation complexe, soit par des conditions de mauvais solvant, pour lesquelles aucune interaction n’est nécessaire entre les biopolymères.
1.1.5 Différenciation macroscopique entre séparation de phase ségrégative et associative
L’étude de la séparation de phase dans les mélanges de biopolymères se fait généralement par la construction de diagrammes de phases obtenus à l’équilibre thermodynamique du système (Reisman, 1970). Le même type d’approche est utilisé par exemple pour l’étude des propriétés des alliages métalliques ou des sols composés de plusieurs fractions minérales. Le diagramme de phases permet de localiser en fonction de différents paramètres physico-chimique ou physiques, tels que le pH, la force ionique, la température ou la pression la composition d’un mélange donné et de prévoir son évolution si l’on modifie par exemple cette composition.
A (100%)
C (100%) B (100%)
c a
b M
Figure 1.1 : Diagramme de phases pour un mélange ternaire ABC.
Le cas le plus classique d’utilisation du diagramme de phases dans les mélanges ternaires est de présenter celui-ci en deux dimensions, sous la forme d’un triangle équilatéral.
Chaque sommet du triangle représente alors une composition du mélange égale à 100% du composé considéré (Figure 1.1). Il est possible de représenter des mélanges contenant plus de trois composants en construisant par exemple un diagramme de phases pyramidal ayant pour base un triangle équilatéral (Thalberg et al., 1991).
Nous considérerons le triangle équilatéral puisqu’il est le plus couramment utiliser dans les mélanges de deux macromolécules dans un solvant. Dans ce cas, la hauteur du triangle possède la particularité de correspondre à la composition totale du mélange. La concentration relative de chaque composant varie entre 0 et 100% le long des côtés du triangle. Un mélange ternaire peut être visualisé par un point dans le triangle (M, Figure 1.1). La composition de ce point est obtenue en traçant les perpendiculaires du côté opposé au sommet duquel se trouve le composant dont on veut connaître la proportion dans le mélange. Etant donné que la hauteur représente la totalité du mélange, il suffit de connaître les proportions de deux composants pour obtenir celle du troisième qui est donnée par :
a + b + c = 100% (1.11)
Il est notable que ce type de diagramme permet d’obtenir les proportions relatives des différents composants, mais en aucun cas leur concentration réelle dans le mélange. Pour déterminer celle-ci, il convient de connaître les concentrations totales réelles des mélanges ayant donné lieu à la détermination des proportions relatives aux points considérés dans le diagramme.
Dans le cas d’un mélange ternaire subissant une séparation de phase macroscopique, il est possible de repérer sur le diagramme de phases toutes les compositions pour lesquelles le système passe d’un état monophasique à un état biphasique (visuellement ou par une méthode turbidimétrique par exemple). Toutes ces compositions permettent de placer les points qui forment la limite entre la zone monophasique et la zone biphasique (Figure 1.2). Cette
