Activité antifongique des huiles essentielles de trois plantes aromatiques : Lavandula stoechas L., Myrtus communis L., Pistacia lentiscus L.en vue d’une valorisation phytopharmaceutique

Travail réalisé dans laboratoire de la faculté SNV –Université de Jijel 1

République Algérienne Démocratique et Populaire تلا ةرازو

يملعلا ثحبلاو يلاعلا ميلع

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique يحي نب قيدصلا دمحم ةعماج

-لجيج

Université Mohammed-Seddik Benyahia-Jijel

Faculté des Sciences de la nature et de la vie ةايحلا و ةعيبطلا مولع ةيلك Département des de Sciences l’Environnement ةيحلافلا مولعلاو طيحملا مولع مسق et des Sciences Agronomiques

Mémoire de fin d’études

En vue de l’obtention du diplôme de Master Académique Filière : Sciences Agronomiques

Option : Phytopharmacie appliquée

Thème

Jury

:

Présenté par :

President: Mr _{Younsi S _ Remmit Khadidja}

Examinatrice : Mme _{Benabdelkader M _ Hezil Rabiaa}

Encadreur : Mr_{. Sebti M}

Session: Juin 2018 Numéro d’ordre:…

Activité antifongique des huiles essentielles de trois plantes

aromatiques : Lavandula stoechas L., Myrtus communis L.,

Pistacia lentiscus L.en vue d’une valorisation

phytopharmaceutique

Dédicace

Je dédie ce modeste travail

À ma très chère maman pour son soutien, son.

À mes frères et mes belles-sœurs. À ma grande famille,

mes amis et collègues sans préciser les noms afin de

n’oublier personne pour leurs encouragements et tous

ceux et toutes celles que j’ai involontairement omis de

citer et qui n’en demeurent pas moins chers. À ceux qui

ont contribué de prés ou de loin à l’élaboration de ce

travail.

Remerciements

Avant tout nous nous remercions ALLAH le tout puissant de nous avons accordé la santé, le courage et la patience pour toutes

ces longues années d’étude et pour la réalisation de ce mémoire que nous espérons être utile.

Nous tiens à exprimer nos profonds remerciements et nos vives reconnaissances à notre promoteur Monsieur Sebti Mohammed

qui a accepté de nous encadrer, pour nous conseiller et nous orienter tout au long de la réalisation de ce travail.

Nous remercions vivement les membres de jury : MmeBenabdelkader M. et Mr Younsi S

Nous sommes très honorées que vous avez accepté la présidence du jury de ce mémoire .Trouver ici l’expression de nos sincères

remerciements et soyez assurer de nos profondes gratitudes.

A toute personne ayant participé de prés ou de loin dans l’élaboration de ce travail, trouve ici l’expression de nos très vifs

D

édicaces

Rien n’est aussi beau à offrir que le fruit d’un labeur qu’on dédie du

fond du cœur à ceux qu’on aime et qu’on remercie en exprimant la

gratitude et la reconnaissance durant toute notre existence.

Je dédie ce modeste travail :

A mon chère père qui à veillée sur moi pendant toute ma vie.

A ma mère, sans elle, je n’aurais pas abouti à ce stade d’étude, que

Dieu puisse m’aider à l’honorer, la servir et la combler

A mon frère : Abd el-moumen

A mes sœurs : Karima, Chahrazad, Soumia

Et à toute ma famille et mes proches.

A tous mes amis: Amina, khaoula, Meriem, Imene, Badiaa, Siham,

Adila Selma, Mina, Meryama et soumia.

A notre encadreur M

_{Sebti Mohammed}

A ma chère binôme" Rabiaa"

A mes collèges de master 2 Phytopharmacie

Liste des Figures………..i

Liste des tableaux………...ii

Liste des Abréviations ………..ii

Introduction………....1

Partie I: Synthèse bibliographique

Chapitre I: Les biopesticides

I.2. Les types de biopesticides………...03

I.2.1. Biopesticides microbiens……….…...03

I.2.2. Biopesticides animaux ………..04

I.2.3. Biopesticides d’origine végétal ………...04

I.2.3.1. Les macérâtes………..……...04

I.2.3.2. Les décoctions et infusions………..04

I.2.3.3. Les huiles essentielles………...04

I.3. Usage des HE comme biopesticides………...…...05

I.3.1. Sur les insectes ………..05

I.3.2. Sur les adventices………05

I.3.3. Sur les microorganismes ………...05

I.4. Avantages et inconvénients des biopesticides ……….06

Chapitre II : Généralités sur les huiles essentielles

II.2. Définition………...07

II.3. Localisation des huiles essentielles dans la plante……….08

II.4. Propriétés physico-chimiques des HEs ………..08

II.4.1. Propriétés chimiques……….08

II.4.2. Propriétés physiques………...08

II.5. Composition chimique……….09

II.5.1. Composés terpéniques………..09

II.5.2. Les composés aromatiques ………..10

II.5.3. Les composés d’origines diverses……….10

II.6. Groupes chimiques des HEs………10

II.7.1. Distillation………...11

II.7.1.1. L’hydrodistillation………..11

II.7.1.2. Extraction par entraînement à la vapeur d’eau………...12

II.7.2. Expression à froid ……….12

II.7.3. Autre méthodes………...12

II.8. Méthodes d’analyses des huiles essentielles………13

II.9.1. Chromatographie en phase gazeuse (CPG)………13

II.9.2. Le couplage (CPG/SM)……….13

II.10. Role des huiles essentielles en phytoprotection………13

II.11. Activités biologiques des HEs………...14

Chapitre III: Les champignons phytopatogènes

III.2. Caractères généraux des champignons phytopathogènes………...16

III.3. Les principaux champignons phytopathogènes………..17

III.4. Quelques maladies fongiques des plantes………....18

III.5. Utilisation des HEs comme biofongicides………...……..19

III.6. Mode d’action des HES sur les champignons phytopathogènes ………..19

III.6.1.Perturbation de la membrane cellulaire, altération et inhibition de la formation de la paroi cellulaire………..…19

III.6.2.Dysfonctionnement de la mitochondrie fongique………..19

III.7. Rappel sur le Botrytis cinerea l’agent causale de la pourriture grise………..20

III.7.1. Pathologie causée par Botrytis cinerea………...………20

III.7.2. Position systématique et cycle biologique de Botrytis cinerea………...20

Partie II: Etude expérimentale

Chapitre IV: Matériel et méthodes

IV.2.Matériel végétal………...22

IV.2.1.Récolte et séchage………..22

IV.2.2. Etude caractéristiques des espèces sélectionnées ……….23

IV.2.2.1.Pistacia lentiscus L……….23

IV.2.2.2. Myrtus communis L……….…………..23

IIV.2.2.3. Lavandula stoechas L………...24

IV.3. Méthodes ……….25

IV.4. Matériel fongique ………...26

IV.4.1. Echantillonnage………....26

IV.4.2. Isolement de l’agent phytopathogène………...27

IV.4.3. Purification des isolats fongiques………...……27

IV.4.4. Identification des isolats fongiques……….27

IV.5. Tests antifongiques ………....29

IV.5.1. Méthode de contact direct………...…29

IV.5.1. Préparation des milieux de cultures contenant différentes concentrations d’huiles essentielles………...29

IV.5.1.2. Ensemencement et incubation des boites de pétri…...………29

IV.5.2. Paramètres étudiés……….…...30

IV.5.2.1. Evaluation de la croissance mycélienne....………...30

IV.5.2.2. Taux d’inhibition………....30

IV.5.2.3. Détermination de la vitesse de croissance mycélienne (VC)………..31

IV.5.2.4. Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI)………...31

Chapitre V: Résultats et discussion

V.2. Rendements………...32

V.3. Résultats d’analyse chimique des HEs………33

V.3.1. HE de Lavandula stoechas L……….………34

V.3.2. HE de Pistacia lentiscus L……….35

V.3.3. HE du Myrtus communis L………...36

V.4. L'identification de champignon phytopathogène………...36

V.5. Résultats des tests antifongiques……….37

V.5.1. Evaluation de la croissance mycélienne………...37

V.5.2. Vitesse de croissance mycélienne………..41

V.5.3. Taux d’Inhibition (TI)………...41

V.5.4. Détermination de la CMI………...42

V.6. Discussion ……….43

Conclusion et perspectives………...………...45

Références bibliographiques...46 Annexes

i

Liste des figures

Figure Titre de figure Page

01 Poils épidermiques sur le calice d’une Fleure 08

02 Glandes productrices d’huile essentielle 08

03 Formule chimique de l’isoprène 10

04 Appareillage utilisé pour l'hydrodistillation 11

05 Montage d'extraction des HEs par entrainement à la vapeur d'eau 12

06 Hyphes et spores du champignon Penicillium. 16

07 Cycle biologique de Botrytis cinerea 21

08 Carte de localisation géographique de Wilaya de Jijel 22

09 Photo de Pistacia lentiscus L. 23

10 Photo de Myrtus communis L 23

11 Photo de Lavandula stoechas L. 24

12 Dispositif d’hydrodistillation (Clevenger) 25

13 Appareil de chromatographie en phase gazeuse (CPG) 26

14 Fraises atteintes de maladies cryptogamiques 27

15 Photo de microscope optique 28

16 L’agent pathogène ensemencé dans les de pétrie contenants le MC sabouroud+ l’HE+ Tween

30

17 Huiles essentielles obtenues 32

18 Rendements en huiles essentielles des plantes étudiées 33 19 Chromatogramme d’huile essentielle de Lavandula stoechas L. 34 20 Chromatogramme d’huile essentielle dePistacia lentiscus L 35 21 Chromatogramme d’huile essentielle deMyrtus communis L 36 22 Caractérisation microscopique de Botrytis cinérea(x40) 37 23 Résultats obtenus de l’effet des HEs étudiées sur le Botrytis cinérea par la méthode

de contact

38

24 L’effet de dilution 0.05% des huiles essentielles sur le Botrytis cinérea 39 25 L’effet de dilution 0.25% des huiles essentielles sur le Botrytis cinérea 39 26 L’effet de dilution 0.5% des huiles essentielles sur le Botrytis cinérea 40 27 L’effet de dilution 0.75% des huiles essentielles sur le Botrytis cinérea 40 28 La vitesse de croissance mycélienne de B.Cinérea sous l’effet de différentes

concentrations en HEs de lavande, lentisque et myrte

41

ii

Abréviation Signification

% Pourcentage

ADN Acide désoxyribonucléique

AFNOR Association Françaises de Normalisation

ARN Acide Ribonucléique

B. cinerea Botrytiscinerea

CMI Concentration minimale inhibitrice

Co2 Dioxyde de carbone

CPG Chromatographie en phase gazeuse

DSA Direction des services agricoles

Fig figure

GABA Acide gamma amino-butyrique

g Gramme h Heure HE Huile essentielle L. stoechas Lavandulastoechas MC Milieu de culture Mm Millimètre M.communis Myrtuscommunis

Na2SO4 sulfate sodium

P. lentiscus Pistacia. Lentiscus

RHE Rendement d’huile essentielle SM Spectrométrie de masse

TI Temp d’incubation

TR Tempe de rétention VC Vitesse de croissance

iii

Liste des tableaux

Tableau Titre de tableau Page

01 Activités biologiques de certains composés terpéniques des HEs 14

02 Les principaux champignons phytopathogènes 17

03 Propriétés organoleptiques des l’huiles essentielles 32

04 Rendement en huile essentielle par rapport à la biomasse des trois plantes 33

05 Composition chimique de Lavandula stoechas L. 34

06 Composition chimique de Pistacia lentiscus L. 35

07 Composition chimique de Myrtus communis L. 36

08 Description des caractères macroscopiques et microscopiques du champignon obtenu

37

09 Croissance mycélienne (mm) de Botrytis cinérea en fonction du temps (absence des HEs)

Introduction

1

Introduction

L’agriculture est l’un des principaux secteurs d’activités qui contribue au développement socio-économique des populations. Elle emploie plus de 40 % de la population active dans le monde.Dans ce secteur, le maraichage occupe une place importante pour l’alimentation humaine (FAO, 2012). Cependant, la production de ces aliments est limitée par de multiples contraintes abiotiques et biotiques qui affectent les rendements et les opérations post-récoltes qui en découlent. La pression des ravageurs a été identifiée comme la contrainte majeure du fait des pertes de récoltes infligées aux maraichers (Kanda et al., 2014 ; Mondédji et al., 2015).

Des expériences ont été menées pour trouver des alternatives à la lutte chimique, qui présente beaucoup d'inconvénients et des dommages sur plusieurs domaines : agricole, sanitaire, environnemental, etc.

La lutte biologique contre les phytopathogènes par les HEs est l’une des solutions trouvées pour ce problème, dont plusieurs travaux de recherche ont noté leur activité antimicrobienne (Satrani et al., 2006 ; Kalemba et Kunicka, 2003 ; Amarti et al., 2010; Carson et Riley, 1995) et spécifiquement antifongique ( El Ajjouri et al., 2008; Bouaine, 2017).

Ainsi, pour améliorer les rendements et répondre à la demande des marchés sans cesse croissante, le recours à l’usage des pesticides de synthèse par les producteurs est quasiment systématique (Yarou et al., 2017).

Ces produits chimiques doivent être utilisés avec beaucoup de précautions au risque d’intoxication nuisible à l’homme, à l’animale, à la plante aussi bien qu’à l’environnement et demandent une durée de rémanence relativement longue (Impion, 2011).

A cet effet, touché par ces risques d’intoxication, une lutte biologique a été mise en place comme alternative à la lutte chimique ayant comme outils de base les biopesticides à base des micro- organisme, des végétaux et des substances naturelles.

L’une des causes principales des maladies des plantes est les champignons phytopathogènes, Ils causent de grandes pertes de rendement dans les champs et affectent la qualité des aliments en conservation (Laplace, 2006).

Les huiles essentielles avec leurs larges spectres d’action vis-à-vis d’un grand nombre d’espèces fongiques constituent une alternative très prometteuse, sans être une source de danger pour la santé humaine ou de pollution pour l’environnement (Broydé et Doré, 2013).

Dans ce travail, nous avons essayé de mettre en évidence l’activité antifongique de trois huiles essentielles (du myrte, lavande et lentisque) sur la croissance des moisissures de détérioration des

2

fraises, comme substances naturelles alternatives des produits chimiques utilisées dans le traitement.

Nous avons organisé notre travail en deux grandes parties:

 La partie I consiste à une simple synthèse bibliographique sur les biopesticides, les huiles essentielles et les champignons phytopathogènes des plantes utilisées.

 La partie II représente l’étude expérimentale et les méthodes analytiques de notre travail, Puis les résultats obtenus et leurs discussions.

 Enfin, notre travail est clôturé par une conclusion, suivis des références bibliographiques et des annexes.

Chapitre I Les biopesticides

3

Chapitre I : Les biopesticides I.1. Qu’est qu’un biopesticide

Schématiquement, le biopesticide est formé de « pesticide » qui veut dire « tuer les pestes », et du préfix « bio » qui signifie «vie » en grec (Impion, 2011).Les biopesticides, sont des organismes vivants ou produits issus de ces organismes ayant la particularité de supprimer ou limiter les ennemis des cultures. Les biopesticides sont l’objet d’un intérêt croissant de la part des exploitants, notamment dans le cadre de stratégies de lutte intégrée (Deravel et al., 2014).

I.2. Les types des biopesticides

Les produits considérés comme des biopesticides par les agences de règlementation européennes et mondiales sont d’origines diverses. Ils peuvent être classés en trois grandes catégories, selon leur nature: les biopesticides microbiens, les biopesticides végétaux et les biopesticides animaux (Deravel et al., 2014).

I.2.1.Biopesticides microbiens

Cette catégorie comprend les bactéries, champignons, oomycètes, virus et protozoaires. L’efficacité d’un nombre important d’entre eux repose sur des substances actives dérivées des micro-organismes (Lepoivre, 2003).

 Bacteries

Les biopesticides à base de Bacillus thuringiensis sont les plus commercialisés. Ils ont une action insecticide (Deravel et al., 2014).

 Champignons

Certains champignons présentent des activités contre les bio-agresseurs et sont exploités en tant que biopesticides. Coniothyrium minitansest connu pour parasiter les champignons du genre

Sclerotinia spp, agents causales de la pourriture blanche de nombreuses cultures telle que la carotte

 Virus

Les Baculoviridae sont des virus à double brins d’ADN circulaire, Ils infectent les arthropodes insectes ou larves.

4

I.2.2.Biopesticides animaux

Ces biopesticides sont des animaux comme les prédateurs ou les parasites, ou des molécules dérivées d’animaux, souvent d’invertébrés comme les venins d’araignées, de scorpions, des hormones d’insectes, des phéromones (Goettel et al., 2001).

La coccinelle Rodolia cardinalis est l’insecte auxiliaire le plus connu contre la cochenille Icerya

purchasi.

I.2.3. Biopesticides d’origine végétal

Les produits extraits à partir des végétaux sont utilisé comme biopesticides contre les ravageurs pour leurs effets répulsifs, de contact ou fumigant (Hamdani, 2012). Il existe plusieurs formes :

I.2.3.1.Les macérâts

Un macérât 4c’est le produit obtenu d’une extraction à froid. Cette dernière consiste à émerger les feuilles sèches de plantes dans l’acétone (24h) puis, la filtration est effectuée sous vide, le filtrat recueilli est soumis à une évaporation sous vide dans un rotor vapeur à fin d’éliminer l’acétone. Le produit obtenu est un extrait. Cette technique est utilisée couramment dans l’extraction des terpènes, des alcaloïdes, des flavonoïdes, des acides gras, des amines, etc (Bouziane, 2012).

I.2.3.2.Les décoctions et infusions

La décoction la technique d’extraction d’une substance aromatique ou médicinale de plantes dont il faut faire bouillir la plante dans l’eau pour récupérer leur principe actif (Jangam et al., 2014).

L’infusion consiste à verser l’eau bouillante sur une quantité convenable de plantes (feuilles, fleurs, ou grains) dans un récipient et laisser extraire de quelque minutes à un quart d’heure (Isrine, 2001).

I.2.3.3.Les huiles essentielles

Les HEs des plantes sont extraits par nombreuses procédés d’extraction (hydrodistillation, expression à la vapeur d’eau, etc) et utilisées comme des biopesticides.

Le biopesticide d’origine végétale le plus utilisé est l’huile de neem, un insecticide extrait des graines d’Azadira chtaindica (Schmutterer, 1990).

Chapitre I Les biopesticides

5

I.3.Usage des HE comme biopesticides

Les huiles essentielles ont été testé sur différentes cibles en protection des cultures : les insectes, les micro-organismes (champignons et bactéries) les adventices et aussi en protection des semences (Furet et Bellenot, 2013).

I.3.1.Sur les insectes

Les activités des huiles essentielle décrites sur les insectes sont variées : larvicides, adulticides, répulsifs ou inhibiteurs de croissance.la plupart des huiles essentielles agissent en perturbant la structure de la membrane cellulaire, ou pareffets neurotoxiques due a des interactions avec des neurotransmetteurs tel que le GABA et l’octopamine par inhibition de l’acétyle- cholinestérase (Deravel et al., 2014).

I.3.2 Sur les adventices

Les études publiées sur l’activité des huiles essentielles comme herbicides sont nombreuse être couvrent généralement des tests d’inhibition de germination de graines. Celles paraissent les plus actives sont des huiles essentielles à phénols (thymols,carvacrol), à acétones (carvone , pulégone) ou étheroxydes (eucalyptol ou 1-8-cinéol)(Solty et al., 2013).

I.3.3.Sur les microorganismes

Plusieurs études ont montrées l’activité antibiotique des huiles essentielles sur les microorganismes pathogènes pour l’homme ou qui altèrent sa nourriture (activité antibactérienne (Carson et Riley, 1995),antivirale et antiseptique(Moro Buronzo, 2008) et antifongique(Lis-Balchin, 2002;Kalemba et Kunicka, 2003). Dont les huiles essentielles les plus efficaces sont riches en phénols (Thymols, Carvacrole, Eugénols ) ou en aldéhydes céramiques ,bien que quelque alcool montrent dans certains cas des activités intéressantes (Lang et Buchbauer, 2012).

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I.4.Avantages et inconvénients des biopesticides  Avantages

Les biopesticides présentent de nombreux avantages. Ils peuvent être aussi bien utilisés en agriculture conventionnelle qu’en agriculture biologique, certains permettent aux plantes de résister à des stress abiotiques et d’une manière générale, ils sont moins toxiques que leurs homologues chimiques ( Jovana et al.,2014).

 Certains biopesticides microbiens présentent des bénéfices supplémentaires à leur rôle de protection, Les champignons du genre Trichoderma ont la particularité de faciliter l’absorption d’éléments nutritifs du sol par les plantes (Harman, 2011).

 Des biopesticides, comme les pyrèthres, insecticides extraits de la plante Tanacetum (Chrysanthemum) cinerariaefolium ont une action rapide, une faible toxicité contre les mammifères ainsi qu’une faible persistance après leur application (Silverio et al., 2009).  Les biopesticides améliorent la qualité de vie de travailleurs et offrent aux consommateurs

des produits sains ;

 Leurs dégradation rapide diminue le risque de pollution environnementale ;  Ils diminuent ou éliminent l’utilisation des pesticides chimiques ;

 Inconvénients

Certains des avantages écologiques des biopesticides, comme leur faible rémanence ou le fait qu’un produit soit actif contre un faible spectre de nuisibles, peuvent être considérés comme des inconvénients. En effet, ces deux avantages écologiques combinés à leur activité souvent dépendante des conditions climatiques et environnementales rendent les biopesticides moins efficaces que leurs homologues chimiques (Jovana et al., 2014).

- Ils ont un effet drastique que les pesticides (plus d’application) ; - Leur activité est restreinte lors d’une grande pression du ravageurs ; - Efficacité pas toujours constante d’une production à l’autre.

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Chapitre II : Généralités sur les huiles essentielles II.1. Historique

Les essences végétales livrent progressivement leurs secrets depuis l’avènement de la chimie organique à la fin du XIXème siècle (Franchomme et Pénoèl, 1990). Mais ce n’est qu’au début du XXème siècle que les propriétés thérapeutiques des huiles essentielles (désormais HE) ont fait l’objet de recherches scientifiques. Le terme « huile essentielle » a été inventé par le médecin suisse Parascelsus Von Hohenheim pour désigner le composé actif d’un remède naturel (Guenther, 1948). Les HE et les extraits aromatiques ont été utilisés pour leurs propriétés antiseptiques.. Dans les vieux ouvrages de médecine, les résines aromatiques ou les HEs étaient les principaux composés actifs qui peuvent se retrouver dans les différentes drogues végétales, ayant des propriétés antiseptiques significatives. Dans les manuscrits les plus récents, l’utilisation des HEs dans l’aromathérapie laisse entrevoir une perspective d’alternative aux médicaments de synthèse (Blanc-Mouchet, 1987).

II.2.Définition

On trouve dans la littérature et sur internet plusieurs définitions d’une huile essentielle. A fin d'être le plus exact possible, voici quelques-unes :

La norme AFNOR (2000) la définit comme : « une huile essentielle est un produit obtenu à partir d’une matière première végétale, soit par entrainement à la vapeur d’eau, soit par des procédés mécaniques à partir de l’épicarpe des Citrus, soit par distillation sèche».

Ce sont des liquides huileux aromatiques, volatils, caractérisés par une forte odeur, souvent colorés et généralement avec une densité inférieure à celle de l'eau. Ils peuvent être synthétisés par tout organe végétal (fleurs, bourgeons, graines, feuilles, brindilles, écorces herbes, bois, fruits et racines) et stockés dans des cellules sécrétoires, des cavités, des canaux, des cellules épidermiques ou des trichomes glandulaires (Labiod, 2016).

De point de vue chimique, une huile essentielle est un mélange complexe de composés naturels de structures organiques variées. Contrairement à ce que le terme pourrait laisser penser, les huiles essentielles ne contiennent pas de corps gras comme les huiles végétales. Le terme “huile” vient de leur caractère hydrophobe et de leur propriété de se solubiliser dans les graisses, alors que le terme “essentielle” fait référence a l’odeur dégagée par la plante productrice (Bruneton, 2009).

Chapitre II Généralités sur les huiles essentielles

8

II.3.Localisation des huiles essentielles dans la plante

Les huiles essentielles n’existent quasiment que chez les végétaux supérieurs. Elles sont produites dans le cytoplasme des cellules sécrétrices et s’accumulent en générale dans des cellules glandulaires spécialisées. Ensuite, elles sont stockées dans des cellules dites cellules à huiles essentielles (Lauraceae), dans des poiles sécréteurs (Lamiaceae), dans des poches sécrétrices (Myrtacée), dans des canaux sécréteurs (Astraceae) (Bruneton, 2009).

Elles peuvent être stockées dans tous les organes végétaux. Au niveau des fleurs (bergamotier, tubéreuse), des feuilles (eucalyptus, laurier noble, menthe poivrée), des écorces (cannelier), des bois (bois de rose, santal blanc), des racines (angélique), des rhizomes (curcuma, gingembre), des fruits (aneth, anis, badiane), et des graines (muscade, coriandre). Si tous les organes d’une même espèce peuvent renfermer de l'huile essentielle, la composition de cette dernière peut varier selon sa localisation (Bruneton, 2009 ; Figueredo, 2012).

Fig 01 : Poils épidermiques Fig 02 : Glande productrice Sur le calice d’une fleur d’huile essentielle (Porter, 2001) (Gasper et Jeeke, 2004)

.

II.4. Propriétés physico-chimiques des HEs : II.4.1. Propriétés chimiques

Les huiles essentielles sont des mélanges complexes et éminemment variables de constituants qui appartiennent à deux groupes caractérisés par des origines biogénétiques distinctes: le groupe des terpenoides, d’une part et le groupe des composés aromatiques dérivés de phenyl propane, beaucoup moins fréquents d’autre part (Bruneton, 1993).

II.4.2. Propriétés physiques Les huiles essentielles sont :

• Liquides à température ambiante.

9

• Très rarement colorées ;

• Leur densité est en général inférieure à celle de l’eau (sauf les huiles essentielles de sassafras, de girofle ou de cannelle qui constituent des exceptions) ;

• Elles ont un indice de réfraction élevé;

• Solubles dans les solvants organiques usuels ;

• Entrainables à la vapeur d’eau ;

• très peu solubles dans l’eau ;

• Sensibles à l'altération, elles ont tendance à se polymériser pour former des produits résineux (Charpentier et al., 2008).

II.5.Composition chimique

Les huiles essentielles sont des mélanges variables et complexes de différents composés Chimiques, dissous l'un dans l'autre, formant des solutions homogènes (Bruneton, 1993).

Les principaux constituants des huiles essentielles appartiennent de manière quasi exclusive, à trois catégories de composés caractérisés par des origines biogénétiques distinctes: composés terpéniques, aromatiques et variés (Bruneton, 2009).

II.5.1.Composés terpéniques

Les terpènes sont des hydrocarbures naturels, de structure cyclique ou de chaine ouverte leur formule brute est (C5HX)n dont le X est variable en fonction du degré d’instauration de la molécule et n prends des valeurs (1-8) sauf dans les polyterpènes. Du strict point de vue chimique, les terpènes apparaissent comme des polymères d’un carbure d’hydrogène diéthylénique, l’isoprène (C5H8) (Nazzaro et al., 2017).

Ils sont subdivisés selon le nombre d’entités isoprènes en monoterpènes formés de deux isoprènes (C10H16), les sesquiterpènes, formés de trois isoprènes (C15H24), les diterpènes, formés de quatre isoprènes (C20H32). Les tetraterpènes sont constitués de huit isoprènes qui conduisent aux caroténoïdes. Les polyterpènes ont pour formule générale: (C5H8)n où n peut être de 9 à 30. Les térpénoides sont des terpènes avec une ou plusieurs fonctions chimiques (alcool, aldéhydes, cétone, acide) (Bakkali et al., 2008).

Chapitre II Généralités sur les huiles essentielles

10

Fig 03: Formule chimique de l’isoprène (Bessedik, 2015)

II.5.2.Les composés aromatiques

Les composés aromatiques dérivent du phénylpropane (C6C3). Ils sont moins fréquents que les terpènes. Cette classe comprend des composés odorants comme la vanilline, l’eugénol, l’anéthol, l’estragol, Ils sont fréquemment rencontrées dans les HEs d’Apiaceae (anis, fenouil, persil, etc) et sont caractéristiques de celles de la vanille, de l’estragon, du basilic, du clou de girofle, etc. (Bruneton, 2009).

II.5.3.Les composés d’origines diverses

Ce sont des produits résultant de la transformation de molécules non volatiles entraînables par la vapeur d’eau. Il s’agit de composés issus de la dégradation d’acides gras, de terpènes. D’autres composés azotés ou soufrés peuvent subsister mais sont rares (Bruneton, 2009).

Compte tenu de leur mode d'extraction, les huiles essentielles peuvent renfermer divers composés aliphatiques, généralement de faible masse moléculaire, entraînables lors de l'hydro distillation. Ces produits peuvent être azotés ou soufrés

-Alcools : menthol, géraniol, linalol ; -Aldéhydes : géranial, citronellal ; -Cétones : camphre, pipéritone ; -Phénols: thymol, carvacrol ; -Esters : acétate de géranyle

-Ethers : R1-O-R2 (Inouye et Abe, 2003). II.6.Groupes chimiques des HEs

Le Lourn (1994) classe les HEs en trois grands groupes : les HE hydrocarburées, les HEs oxygénées et les HEs sulfurées.

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➢ Les HEs hydrocarburées

Elles contiennent surtout des terpènes ou carbures d’hydrogène, tels que le thyméne, le terpinéne, le ciméne, le limonène, les sesquiterpènes etc. exemples: HE de thym, d’origan, de citron, de cyprès.

➢ Les HEs oxygénées

Leur essences sont généralement solides .c’est le cas de l’essence de rose et de menthe. ➢ Les HEs sulfurées

Elles sont présentées dans plusieurs espèces de la famille des crucifères (choux, moutarde, etc.) mais aussi dans certaines liliacées (ail, oignon, etc.).

II.7. Les procédés d’extraction des huiles essentielles

Deux procédés sont principalement utilisés pour l'extraction des huiles essentielles :

La distillation et l’expression à la vapeur. L’extraction d’une huile essentielle est une opération capitale qui ne doit pas altérer sa qualité.

II.7.1.Distillation

Signale que le principe de la distillation repose sur la propriété qu’ont les huiles essentielles d’être volatiles sous l’effet de la chaleur, l’huile est alors entraînée par la vapeur d’eau. Après condensation, l’huile essentielle se sépare du distillat par décantation.

Il existe de type de distillation (Bruneton, 1999).

II.7.1.1. L’hydrodistillation

Selon Bruneton (2009), l’hydrodistillation consiste à immerger directement le matériel végétal à traiter (intact ou éventuellement broyé) dans un alambic rempli d’eau qui est ensuite porté à ébullition. Les vapeurs hétérogènes sont condensées sur une surface froide et l’huile essentielle se sépare par différence de densité. L’hydrodistillation peut s’effectuer sans ou avec retour d’eau dans le

Chapitre II Généralités sur les huiles essentielles

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Fig 04: Appareillage utilisé pour l'hydrodistillation (Chalchat et al., 1997) II.7.1.2.Extraction par entraînement à la vapeur d’eau

Dans ce système d’extraction, le matériel végétal est soumis à l’action d’un courant de vapeur sans macération préalable. Les vapeurs saturées en composés volatils sont condensées puis décantées. L’injection de vapeur se fait à la base de l’alambic (Richard et Peyron, 1992).

Fig 05: Montage d'extraction des HEs par entrainement à la vapeur d'eau (Bouaine, 2017).

II.7.2.Expression à froid

Le principe de l’extraction consiste à rompre les poches à essence par un moyen mécanique, pression, incision ou abrasion à froid. L’huile essentielle mélangée à l’eau cellulaire est séparé par décantation ou centrifugation.

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Le procédé classique consiste exercer sous un contact d’eau, une action abrasive sur la surface du fruit, après élimination des déchets solides, l’huile essentielle est séparée de la phase aqueuse par centrifugation. D’autres machines rompent les poches par dépression et recueillent directement l’huile essentielle, ce qui évite des dégradations liées de l’eau (Bruneton.1993).

II.7.3.Autres méthodes

• Hydrodistilation par micro-ondes sous vide

• Hydrodiffusion

• L’enfleurage

• Extraction par solvant

• Extraction au CO2 supercritique .

II.9.Méthodes d’analyses des huiles essentielles

L’analyse quantitative et qualitative des huiles essentielles fait appel à plusieurs techniques et méthodes. Parmi ces méthodes nous parlons sur les méthodes micro analytiques qui permettent l’identification et le dosage des produits même à l’état de traces. Ces méthodes consistent en l’utilisation des techniques de séparation et d’analyse des structures chimiques.

II.9.1.Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

La chromatographie en phase gazeuse CPG est une technique très répandue. Elle possède plusieurs avantages : sensibilité, polyvalence, rapidité de mise au point des analyses nouvelles et aux possibilités d’automatisation, qui augmentent plus son intérêt.

Elle s'applique principalement aux composés gazeux ou susceptibles d'être vaporisés par chauffage sans décomposition.

Le principe de la CPG est basé sur la séparation des différents solutés gazeux par migration différentielle le long de la phase stationnaire (Burgot et Burgot, 2011).

Malgré tout, ceci ne peut suffire à une bonne identification, sans l’apport du couplage entre la CPG et une technique d’identification spectroscopique: en général la spectrométrie de masse CPG/SM (Skoog et al., 2003).

II.9.2.Le couplage (CPG/SM)

La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse est une méthode d'analyse qui combine les performances de la chromatographie en phase gazeuse et de la spectrométrie de masse afin d'identifier et/ou de quantifier précisément de nombreuses substances. La

Chapitre II Généralités sur les huiles essentielles

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méthode est basée sur la séparation des constituants à l’aide de la CPG et leur identification par le biais de la SM (Derwich et al., 2010).

II.10. Role des huiles essentielles en phytoprotection

Le role biologique des huiles essentielles dans l’écologie et la phytoprotection est évident, par leur odeur elle interviennent dans la polinisation . Ainsi , elle jouent un role attractif ou répulsif vis-à-vis des prédateurs (hebivors ,insecte, etc.) (Isman, 2000).

Elle peuvent paralyser les muscles masticateurs des agrisseurs par les propriétés toxiques et inappétentes des substances qu’elle contiennent.

Elles protégent des cultures en inhibant la multiplication des bactéries et des champignons ainsi elle empechent la dissiccation de la plante (pert d’eau ) par évaporation excessiveve et protégent la plant contre la lumiére soit par diminution ou concentration (Isman, 2000).

Par ailleurs leur composés interviennent dant les réaction d’oxydo-réduction , comme donneurs d’hydrogéne . par exemple l’isopréne réagit rapidement avec l’ozone et les radicaux hydroxyles .Aussi , elle émettent l’excés de carbone et d’énergie (Sharkay et Sunsun, 2001).

II.10. Activités biologiques des HEs

Les huiles essentielles et leurs composants chimiques possèdent un large spectre d'activités biologiques incluant les activités antimicrobienne (Hanana et al.,2014 ; Hamrouni et al., 2014 ; Parveen et al., 2014 ), antioxydante (Arab et al., 2014), anticancéreuse (Millet, 2014), anti-inflammatoire (Kim et al.,2014), insecticide (Vera et al., 2014), sédatif, antispasmodique, anesthésiant local (Bakkali et al., 2008).

L’activité biologique d’une huile essentielle est en relation avec sa composition chimique (Renault et al., 2006)., dont ses commposés majoritaires comme les terpènes, les aldehyde, les phénoles souvent responsables de cette activité. Il est cependent que les composés minoritaires agissent de manière synergique et exercent une activité importante (Lahlou, 2004).

Tableau (01) : Activités biologiques de certains composés terpéniques des HEs (Bekhechi, 2008) .

Familles exemple Propriétés

Hydrocarbure aliphatique monoterpènes Limonène, α et β-pinène Fongistatique Bactériostatique Insecticide Nematicide

15 Antimutagenique Herbicide Stimulation générale Sesquiterpènes Bisabolème, α-humulème, β-caryophyllène (pin) Calmants Anti-inflammatoire Antiallergique Antibactériens et Antifongique

Phénols Thymol (thym)

Carvacrol (origan), Eugénol (clou de girofle) Antioxydant Stimulantes Antiseptiques Bactéricides Fongicides Antivirale Antiparasitaires Irritantes

Alcool Linalol (bois de rose),

Gerniol (palmarosa),

Anti-inflammatoire Antiseptiques Bactéricides Fongicides monoterpèniques Menthol (menthe

poivrée), citrnellol (citronelle) Antivirale Antiallergique Immunostimulants Neurotoxiques

Cétones Carvone (carvi),

menthone (menthe poivrée), camphre (romarin), thuyone (sauge). Calmantes Antivirales Antifongiques Neurotoxiques Antiépileptique Dépresseurs à dose Elevées

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Chapitre III : Les champignons phytopatogènes

Les champignons sont la principale cause de maladies chez les plantes et sont responsables d'environ 70 % des maladies des plantes cultivées. On estime entre dix mille et quinze mille espèces le nombre d'organismes du type champignons ou pseudo-champignons susceptibles d'infecter les plantes (contre une cinquantaine susceptibles d'infecter l'homme) (Catherine et Roger, 2005). III.1.Définition

Les champignons phytopathogènes sont des espèces de champignons parasites qui provoquent des maladies cryptogamiques chez les plantes. Ces champignons appartiennent aux différents groupes du règne des eumycètes ou « champignons vrais »: ascomycètes, basidiomycètes, chytridiomycètes, zygomycètes et deutéromycètes (champignons imparfaits).

III.2.Caractères généraux des champignons phytopathogènes

Les champignons sont présents dans le sol, plantes, débris végétaux, lichen, parasites de l'homme, des animaux et des plantes. Une levure, eucaryote unicellulaire, est aussi un champignon. Les champignons phytopathogènes sont capables d'infecter n'importe quel tissu à n'importe quel stade de croissance de la plante, en suivant un cycle biologique complexe qui peut comporter des stades de reproduction sexuée ou asexuée (Garrido et al., 2012).

Les cellules des champignons (la plupart) sont arrangées dans une structure appelé le hyphe, et plusieurs hyphes font un assemblage qui s’appelle le mycélium.

Chapitre III Les champignons phytopathogènes

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 Tous les champignons sont hétérotrophes (ils doivent obtenir leur carbone des autres Organismes, vivants ou morts) et chimiotrophes.

 Certains champignons sont des «parasites obligatoires", ce qui signifie qu'ils peuvent compléter leur cycle de vie seulement en association avec un hôte vivant;

 La plupart des champignons sont aérobies, mais il y des espèces (comme les levures) qui font la fermentation sans oxygène (par exemple, dans la production du pain, du vin, et de la bière).

III.3. Les principaux champignons phytopathogènes

Selon une enquête internationale menée en 2012 auprès de mycologues par la revue Molecular

Plant Pathology, les dix espèces ou genres de champignons phytopathogènes les plus importants, en

tenant compte tant des aspects scientifiques qu'économiques. Ces organismes pathogènes, dont six sur dix attaquent plus spécifiquement les cultures de céréales, seraient les suivants (Louise et Dandurand, 2013).

¨Tableau (2): Les principaux champignons phytopathogènes (Louise et Dandurand, 2013) Agents causals Les maladies

Melampsoralini Agent de la rouille du lin

Ustilagomaydis Agent du charbon du maïs

Colletotrichumspp Agents des anthracnoses affectant de nombreuses plantes, notamment arbres

fruitiers et les plantes maraîchères.

Mycosphaerella graminicola,

Agent de la septoriose du blé

Blumeriagraminis, Agent de l'oïdium des céréales. Fusarium

oxysporum

Agent de la fusariose vasculaire qui affecte de nombreuses plantes cultivées.

Fusarium graminearum

Agent de la fusariose du maïs et de la fusariose ou gale du blé

Magnap- ortheoryzae

Agent de la pyriculariose du riz

Botrytis cinerea Agent de la pourriture grise

Puccinia spp Agent de rouille affectant notamment les Poaceae (dont les céréales et plus

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III.4.Quelques maladies fongiques des plantes

Les maladies cryptogamiques sont très diverses et sont classés selon le type de symptôme qu’elles produisent. Au sein de ces groupes, les microorganismes pathogènes peuvent être spécifiques à leur hôte. Ainsi, l’organisme responsable de l’oïdium chez les pommiers diffère des champignons de l’oïdium, apparemment identiques chez le prunier ou encore le rosier. D’un autre coté, le champignon de la pourriture grise, Botrytis cinerea, peut affecter différentes plantes et parties de plantes (Philippe,2004).

Parmi ces maladies on cite :

 Mildiou

Cette maladie cause des dégats consédérable dans des condition favorables , du fait qu’elle se propage à très grande vitesse, elle apparait sous forme de taches blanches soit à la face inferieure soit à la face superieure ou sur toutes les deux .Il existe deux sortes de mildiou et tous les deux sont des parasites obligatoir.

 Taveleures

Ce sont des taches pourvues de bords d’une tente differente de celle de la tache .Cette muance est caracteristiquede l’agent pathogéne et l’apparence morphologique est comme un œil (Prabhu et al., 1992).

 Pourritures

Les tissus tels que le parenchyme , le collenchyme et aussi d’autre partie de la plante comme les feuilles ,les fruits et les racines sont infectés et pourissent, eventuellement differentes coloration sont produites . ces pourritures sont selon leur couleur.Aussi, l’état de tissu infecté (comme tissu sec , tissu mou , tissu humide) est nommé comme différent pourritures.

 Flétrissement

c’est une infection vasculaire , le mycelium bloque les vaisseaux, au mème temps le champignon secréte des toxines affectant la vitalité des tissus donc la plante perd sa vigueur et devient molle ( Defranco, 1984).

Chapitre III Les champignons phytopathogènes

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III.5. Utilisation des HEs comme biofongicides

Dans le domaine phytosanitaire et agro alimentaire, les huiles essentielles ou leurscomposés actifs pourraient également être employés comme agents de protection contre les champignons phytopathogènes et les microorganismes envahissant la denrée alimentaire (Lis-Balchin, 2002). Les infections fongiques sont causées par des organismes eucaryotes et il est donc plus difficile de déterminer leur présence et l'application du traitement thérapeutique approprié par rapport aux infections bactériennes (Nazzaro et al.,2017)

La plupart des composés : aldéhydes monotèrpénique, les phénolpropane et les monotèrpènes constituent de très bons agents antifongiques, surtout le thymol, le carvacrol, et l’eugénole sont encore ici les composés les plus actifs.

Un grand nombre de composés volatiles ont été testés contre une large gamme de champignons : Candida (C.albicans), Aspergillus (A.neiger, A.fumigatus), Pénicillium

chrysogenum, et qui présente une activité antifongique (Roquebert, 2012).

III.6.Mode d’action des HEs sur les champignons phytopathogènes

III.6.1.Perturbation de la membrane cellulaire, altération et inhibition de la formation de la paroi cellulaire

La paroi cellulaire fongique joue un rôle important dans la croissance et la viabilité des champignons; donc elle peut être considérée comme une cible sélective pour les agents antifongiques sélectivement toxiques en raison de sa structure(le glucane, la chitine et le mannane, sont généralement considérés comme des cibles thérapeutiques (Nazzaro et al., 2017).

Les HEs sont capables de présenter une activité antifongique contre les champignons à travers les dommages de leur paroi cellulaire et de la membrane cellulaire à divers degrés, fuite du cytoplasme et partiellement par inhibition de la biosynthèse de l'ADN, de l'ARN, des protéines et du peptidoglycane (Nazzaro et al., 2017).

III.6.2.Dysfonctionnement de la mitochondrie fongique

Certaines huiles essentielles peuvent affecter l'efficacité mitochondriale en inhibant l'action

Deshydrogénases mitochondriales, impliquées dans la biosynthèse de l'ATP, telles que la lactate déshydrogénase, le malate déshydrogénase et succinate déshydrogénase (Nazzaro et al., 2017).

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III.7.Rappel sur le Botrytis cinerea l’agent causale de la pourriture grise

Botrytis cinerea est un champignon phytopathogène capable d’infecter une très large gamme

d’hôtes (polyphagie) et ainsi de s’attaquer à diverses plantes dès que les conditionsclimatiques lui sont favorables (Elad et al., 2004). La maladie se développe principalement sur les grappes de raisins, les petits fruits rouges, certains légumes (concombres, tomates) et

les fleurs d’ornement (Coley-smith et al., 1980). III.7.1.Pathologie causée par Botrytis cinerea

Botrytis cinerea est l’agent causal de la pourriture grise Ce pathogène est connu par

l’importance de dégâts économiques qu’il occasionne, son cosmopolitique, sa polyphagie, sa variabilité génétique et le développement rapide de souches résistantes.

L’acquisition de cette résistance entraîne dans la pratique des pertes importantes de productivité et peut, ainsi, être à l’origine de difficultés économiques et sociales (Schwinn,1982 ; Köller et Scheinpflug, 1987).

III.7.2. Position systématique et cycle biologique de Botrytis cinerea

Le Botrytis cinerea se classe comme suit :

Règne : Fungi Division: Ascomycota Classe: Leotiomycetes Ordre: Helotiales Famille: Sclerotiniaceae Genre: Botrytis

Espèce: Botrytis cinerea

Ce champignon se manifeste dans la nature sous plusieurs formes différentes (Figure07) : mycélium, conidies (macro et microconidies), sclérotes et apothécies (forme ascosporées).

Chapitre III Les champignons phytopathogènes

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IV. Matériel et méthodes.

IV.1. Présentation de la zone d’étude

La Wilaya de Jijel est située au Nord de l'Algérie à environ 350 km à l'Est d'Alger, sur la longitude 05°47' Est et la latitude 36°50' Nord. La Wilaya de Jijel s’étale sur une superficie de 2398,69 km², avec une façade maritime de 120 km. Elle est limitée au Nord par la mer méditerranée, à l’Est par la Wilaya de Skikda, à l’Ouest par la Wilaya de Bejaia, au Sud Est par la Wilaya de Constantine, au Sud par la Wilaya de Mila et au Sud-ouest par la Wilaya de Sétif (DSA, 2015).

Fig 80: Carte de localisation géographique de la Wilaya de Jijel (DSA, 2015).

IV.2.Matériel végétal IV.2.1. Récolte et séchage

Les plantes étudiées (lavande, lentisque et myrte) ont été récoltées durant le mois d’avril 2018 de différentes régions : de Taher (Beni Matran), d’El-Milia et Sidi Abdelazziz dont on a utilisé seulement la partie aérienne (tiges, feuilles et fleurs).

L’identification des plantes est basée sur l’aspect morphologique des feuilles (formes) et des tiges, fleurs, etc. en utilisant le guide de la flore d’Afrique du nord de Quezel et Santa (1963) aussi en comparaison avec d’autres ouvrages et des travaux tels que (Benabide, 2000 ; Hélène, 2013). Le séchage de nos plantes a été fait à l'air libre, à l’ombre dans un endroit sec et aéré, à l'abri de l’humidité et de la lumière jusqu'à ce que les feuilles sont devenues cassantes, dont la durée du séchage est 15 jours pour la lavande, et 7 jours pour le myrte, alors qu’on a utilisé le lentisque à son état frais, puis ils ont été conservés jusqu’au moment d’utilisation.

Chapitre IV Matériels et méthodes

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IV.2.2. Etude caractéristiques des espèces sélectionnées

La classification des plantes étudiées est illustrée selon Quezel et Santana (1963) comme suit: IV.2.2.1.Pistacia lentiscus L.

 classification taxonomique

Fig 80: Photo de Pistacia lentiscus L.  Description botanique :

Pistacia lentiscus L. est un arbuste à feuilles persistantes, avec des parties mâles et femelles,

qui présente une forte odeur de résine, mesurant de 2 à 5 mètres. Il arrive à sa hauteur maximale à 40-50 ans. Dans les zones appropriées, qui lui permettent de pousser librement, il atteint souvent les 7 mètres de haut. IV.2.2.2.Myrtus communis L.  Classification Règne : Plante Embranchement : Magnoliphyta Class : Dicotylédone Ordre : Myrtales Famille : Myrtaceae Genre : Myrtus

Espèce : Myrtus communis L.

Fig 18: Photo de Myrtus communis L.  Description botanique :

Le myrte est un arbuste de 2 à3 m de hauteur , à feuilles opposées , ovales lancéolées aigues , entières , coriaces , persistantes , longues de 3 cm , large de 1cm , à nervation penné .Fleurs blanches de 10 à 15 mm de long, axillaires solitaires longuement pédonculées , odorantes ; calice à

Règne: Plante

Embranchement: Spermatophytes Sous

embranchement: Angiospermes

Classe: Dicotylédones Vraies Supérieures

Ordre: Sapindales

Famille: Anacardiaceae

Genre : Pistacia

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stigmate simple , ovaire inféré , fruits ovoides de la grosseur d’un pois chiche , à peine charnue , d’un noir bleuâtre à graines peu nombreuses (Beloued, 2005).

IV.2.2.3. Lavandula stoechas L.  Classification taxonomique Règne : Plantes

Sous règne : Plantes vasculaires Embranchement : Spermaphytes Sous embranchement : Angiospermes Classe : Dicotylédones Sous classe : Dialypétales

Ordre : Lamiales (Labiales) Famille : Lamiaceae

Genre : Lavandula

Espèce : Lavandula stoechas L.

Fig 11: Photo de Lavandula stoechas L.  Description botanique

Le genre Lavandula est un membre important de la famille des Lamiaecaes. Les espèces de

Lavandula sont largement distribuées dans la région méditerranéenne (Beloued, 2005).

Lavandula stoechas L. est un arbrisseau buissonnant pouvant atteindre 1 m de hauteur. Les

feuilles, linéaires et de couleur gris vert, ont une longueur variant entre 3 et 5 cm. Lors de la floraison, la plante développe de longs pédoncules non ramifiés terminés par des épis dont la couleurvarie du mauve pâle au violet (Lis-Bachlin, 2002).

Chapitre IV Matériels et méthodes

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IV.3.Méthodes

IV.3.1.Processus d’extraction des huiles essentielles

Il y a plusieurs méthodes d’extractions des H.E citées dans la littérature (voir chapitre II). La méthode d’extraction utilisée est l’hydrodistillation à l’aide d’un dispositif de type Clevenger d’une capacité de 300g de matériel végétal sec, la durée de distillation est comprise entre 1h 30 et 2 heures et 30 minutes.

 Mode opératoire

Une quantité de 150 g de matière végétale est transvasée dans un ballon de deux litres auquel un volume de 1500 ml d’eau distillée est ajouté et l’hydrodistillation se fait, en moyenne pendant deux heures. L’eau est portée à ébullition, la vapeur d’eau entraîne les molécules volatiles qui se condensent dans un réfrigérant et le mélange eau-huile est recueilli dans un ballon de 250 ml. La décantation se fait dans une ampoule à décanter d’un litre dans laquelle le mélange se sépare en deux phases non miscibles par la différence de leur densité. Une phase aqueuse (inférieure) et une phase huileuse (supérieure).Les huiles essentielles ainsi récupérées sont traitées sulfate du sodium (Na2SO4) afin d’éliminer l’eau susceptible d’avoir été retenue dans la phase organique. Elles sont conservées au réfrigérateur à 4°C dans des tubes bien bouchés à l’abri de la lumière et de la chaleur.

Fig 12: Dispositif d’hydrodistillation (Clevenger) IV.3.2. Analyse chimique des huiles essentielles

Il est indispensable pour certaines huiles essentielles de bien préciser le chimiotype car il peut conditionner l’activité et/ou la toxicité. L’analyse des huiles essentielles a été réalisée par la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG/SM). Ce couplage permet de déterminer simultanément le nombre de constituants de l’essence, leurs pourcentages

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respectifs, leurs ordres de sortie ainsi que structures (à la limité de ce qui est disponible dans la bibliothèque de l’appareil).

Les huile essentielle ont été analysé sur un chromatographe de type GMS Shimandzu gp 2010, équipé d’une colonne capillaire apolaire SE 30 couplé à un spectrographe de masse SM de même type chromatographe avec un détecteur à impacte électron 70ev, et de type EV.

Les conditions analytiques sont les suivants: température de la colonne 60°c à 18°c, jusqu’à 230°c, mode d’injection, split, split ratio 1 :40 volume injecté d’huile essentielle est 1ul le gaz vecteur est l’hélium (122.2kpa). Pour toutes les analyses, on injecte manuellement 0.2ul d’échantillon d’huiles essentielles pures.

Fig13: Appareil de chromatographie en phase gazeuse (CPG) IV.3.3.Détermination des rendements en huiles essentielles

Le rendement est défini comme étant le rapport entre la masse de l’huile essentielle obtenueet la masse du matériel végétal utilisé pour cent. Après récupération des huiles essentielles (AFNOR, 2000), le rendement est exprimé en pourcentage (%) et calculé par la formule suivante :

R

% = (m

/ m

) x100

R HE= rendement en huile essentielle en %.

mh =masse d'huiles essentielles récupérées en gramme (g).

mv = masse d'essai du matériel végétal en gramme (g) (Selvakumar et al., 2012). IV.4.Matériel fongique

IV.4.1. Echantillonnage

Les échantillons de fraise, infectées ont été collectés dans un champ à Tamila-Tassoust pour isoler le champignon pathogène l’agent causale de cette maladie. L’échantillonnage est réalisé

Chapitre IV Matériels et méthodes

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selon la procédure classique du choix aléatoire des fruits attaqués présentant des symptômes tels que la pourriture grise, la fusariose etc.

Fig 14: Fraises atteintes de maladies cryptogamiques

IV.4.2.Isolement de l’agent phytopathogène

Après récoltes de fraises atteintes de pourriture grise dans des cultures de fraises à Tamila (Tassoust) ; la recherche immédiate, sur les moisissures qui attaquent les fruits, a été réalisée à l’échelle du laboratoire dont, des morceaux d’écorce infectés sont détachés à l’aide d’une aiguille stérilisée par flambage et après trempage dans l’alcool chaque morceau est placé au centre d’une boite de pétrie contenant le milieu de culture Saboroud. Les boites ainsi préparées sontincubées à 25°C pendant 7 jours.

IV.4.3.Purification des isolats fongiques

Il consiste à transférer aseptiquement le microorganisme des isolats dominants obtenues dans l’étape précédente sur un milieu stérile pour l’isoler ou le maintenir en culture pure, il convient de prélever avec une anse stérile quelques spores ou un fragment mycélien et le transférer dans un milieu neuf (Botton et al., 1999).

Après purification, le champignon est isolé puis conservé à 4°C sur le même milieu de culture.

IV.4.4.Identification des isolats fongiques

L’identification est réalisée dans le but de classer les souches fongiques par genres et éventuellement par espèces. Donc elle fait appel à des critères d’identification des moisissures, qu’ils sont basés sur deux aspects :

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A : Aspects macroscopiques

L’analyse des boites s’effectue à l’œil nu, se basant sur des caractères morphologiques des colonies. On note:

- La Vitesse de croissance : en mesurant le diamètre de la colonie. - La Texture de colonie : velouté, laineux, poudreuse, etc.

- La Couleur : du recto et du verso de la boite de Pétri.

- La Pigmentation : présence ou l’absence d’un pigment diffusible dans le milieu. - La forme de colonie : régulier, irrégulier, dentelé, filamenteux, etc.

B : Aspects microscopiques

L’examen microscopique est basé sur des caractères plus loin de l’aspect morphologique, on mentionne les organes de reproduction, aspect du thalle (cloisonné ou non cloisonné), types de spores, disposition des spores, etc.

La préparation du matériel fongique pour l’observation microscopique est réalisée dans des conditions stériles comme suit :

- Prendre un fragment du thalle de la colonie à l’aide d’une anse de platine stérile, puis le disposer dans une goutte d’eau distillée sur une lame stérile.

- Dilacérer le fragment mycélien avec l’anse de platine pour le rendre moins dense et mieux observable.

- Recouvrir la préparation à l’aide d’une lamelle, puis la mise à l’observation sous microscope optique.

Les souches isolées ont été identifiées en se basant sur une bibliographie spécialisées dans l’identification des moisissures qui établit des clés de détermination complètes à partir des caractères culturaux et morphologiques, on cite: Botton et al., (1999).

Chapitre IV Matériels et méthodes

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IV.5. Tests antifongiques

Les méthodes du laboratoire qui permettent d’estimer les propriétés d’un produit in vitro sont nombreuses, mais elles reposent toutes sur le même principe, celui de confronter la substance antimicrobienne (fongicide, bactéricide, insecticide,…) et l’agent pathogène (champignons, bactéries, insectes,…) sur un support artificiel.

IV.5.1. Méthode de contact direct

La méthodologie qu’on a suivi pour l’évaluation de l’effet antifongique de l’huile essentielle extraite des Lavandula stoechas L., Myrtus communis L. et Pistacia lentiscus L. est la méthode de contact direct qui permet la mise en évidence de l’activité antifongique (fongistatique ou fongicide) de ces extraits (Fandohan et al., 2004).

 Principe de la méthode

L’huile essentielle à tester est incorporée à des concentrations variables dans le milieu de culture gélosé. Après solidification, le milieu est ensemencé et incubé.

IV.5.1.1.Préparation des milieux de cultures contenant différentes concentrations en HEs Compte tenu de la non miscibilité des huiles à l’eau et par conséquent au milieu de culture, une mise en émulsion de ces huiles a été réalisée par le tween 20 afin d’obtenir dans le milieu une répartition homogène des composés à l’état dispersé (Remmal et al., 1993 ; Satrani et al., 2001). La méthode utilisée est celle de Fandohan (2004) où les quatre concentrations sont obtenues par l’addition de 50, 250, 500 et 750l de chaque huile essentielle à 100ml de milieu de culture Saboroud dans un flacon plus 0.5ml de tween 20. Après agitation des flacons le milieu est coulé dans des boites de Pétri en plastique de 8cm de diamètre.

IV.5.1.2.Ensemencement et incubation des boites de Pétri

 Le mélange de chaque un milieu, est coulé à raison de 15ml dans des boites de Pétri de 0.8cm de diamètre.

 A l’aide d’une pipette pasteur stérile, nous découpons un fragment de culture fongique d’environ 0,8cm de diamètre à partir d’un tapis mycélien âgée de 7 jour, est déposé au centre de la boite de pétri.

 Nous opérons de la même façon pour chaque concentration d’huile essentielle, les boites de Pétri sont ensuite fermées hermétiquement incubées à25°C, pendant 7 jours.

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 Pour chaque concentration, 2 répétitions sont préparées de la même façon, afin deminimiser l’erreur expérimentale.

 Une boite de Pétri contenant 15ml de milieu Saboroud plus tween 20sans huile essentielle puis inoculées pour servir de témoin, la boîte de Pétri est mise à incuber à 25 °C pendant 7 jours.

Fig16: L’agent pathogène ensemencé dans les boites de Pétri contenants le MC (saboroud) + l’HE+Tween

IV.5.2.Paramètres étudiés

IV.5.2.1.Evaluation de la croissance mycélienne

La cinétique de croissance mycélienne a été évaluée toutes les 24 heures en mesurantla moyenne de trois diamètres perpendiculaires passant par le milieu de la rondelle.Cette lecture est toujours réalisée en comparaison avec les cultures témoins qu’elles sontdémarrées le même jour et dans les mêmes conditions.

Toute pousse même légère de chaque champignon sera considérée comme actionnégative c'est-à-dire que l’huile essentielle en question n’est pas inhibitrice vis-à-vis de lacroissance fongique.

IV.5.2.2.Taux d’inhibition (TI%)

D’après Doumbouya et al., (2012), les taux d’inhibition de la croissance par rapport autémoin, sont ensuite calculés selon la formule suivante :