Etude électrophysiologique de la cellule de Purkinje et du potentiel de champ local chez la souris éveillée, en conditions normales et pathologiques.

Etude électrophysiologique de la cellule de Purkinje et du potentiel de champ local chez la

souris éveillée, en conditions normales et pathologiques.

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Médicales

Dr Laurent Servais

Promoteurs

Professeur Guy Cheron

Laboratoire d’électrophysiologie Université de Mons Hainaut Mons, Belgique

Professeur Serge Schiffmann Laboratoire de neurophysiologie Université Libre de Bruxelles Bruxelles, Belgique

Année académique 2004- 2005

Etude électrophysiologique de la cellule de Purkinje et du potentiel de champ local chez la

souris éveillée, en conditions normales et pathologiques.

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Médicales

Dr Laurent Servais

Promoteurs Professeur Guy Cheron

Laboratoire d’électrophysiologie Université de Mons Hainaut Mons, Belgique

Professeur Serge Schiffmann Laboratoire de neurophysiologie Université Libre de Bruxelles Bruxelles, Belgique

Année académique 2004- 2005

Jury de thèse

Président : Professeur Philippe Lebrun (Faculté de Médecine-ULB) Secrétaire : Professeur Serge N. Schiffmann (Faculté de Médecine ULB) Co-promoteur : Professeur Guy Cheron (Faculté de Médecine-UMH)

Membres : Professeur Eric Brunko (Faculté de Médecine-ULB) Professeur Manuel Paiva (Faculté de Médecine-ULB) Professeur Massimo Pandolfo (Faculté de Médecine-ULB) Professeur Diedrik Zegers de Beyl (Faculté de Médecine-ULB) Experts extérieurs : Professeur Etienne Olivier (Faculté de médecine UCL)

Professeur Pierre-Paul Vidal (CNRS, Université Paris 5-France)

Remerciements

Remerciements

Les montagnards savent combien il est bon, une fois arrivé au sommet d’un pic, de suivre du regard la voie empruntée, de s’en remémorer les difficultés qui, au fur et à mesure que le petit morceau de chocolat et le thé chaud viennent restaurer la glycémie, apparaissent comme des anecdotes amusantes, voire des parties de plaisir. C’est à ce merveilleux exercice d’alchimie cérébrale que je vais m’atteler en évoquant le souvenir de la rencontre de ceux qui eurent directement ou indirectement une influence statistiquement significative (p<0.05, one- way Anova) sur l’existence et la réalisation de cette thèse. Qu’ils soient avant tout assurés du plaisir qui est le mien en les remerciant ici.

Je remercie d’abord mes parents, qui ont essayé de me transmettre une partie de leur goût pour la connaissance, la découverte et l’écriture. En écrivant ces lignes, j’entends à nouveau ma mère nous conter sur le chemin de l’école l’Iliade ou l’Odyssée. Dans nos jeux bien plus que dans nos disputes, ma sœur avait choisi d’être Pâris et, en toute simplicité, j’avais adopté le personnage d’Achille. Lorsque j’étais fatigué d’assiéger la citadelle de Priam, je me retirais sous ma tente et cherchais avec obstination deux cubes dont la somme eût pu être un cube, afin de contrarier mon père qui prétendait sans grand risque le contraire.

Je remercie aussi ma grand-mère, l’ineffable « mémé », qui nous transmettait avec une obstination et un dévouement qui tenaient amplement lieu de génie pédagogique ses connaissances d’institutrice. Je remercie aussi mes grands-pères, celui qui nous emmenait à l’étang des pêcheurs sans rien nous raconter, mais en nous laissant nous disputer et en nous donnant des bonbons à la menthe, et celui qui enfournait ses babas au rhum en récitant des vers d’Horace et de Virgile et qui jouait avec moi au scrabble, m’apprenant ainsi les wus, teks, leks, kas et autres zees.

De mes années d’école primaire, je retiendrai surtout celle passée dans la classe de Monsieur Delbrouck qui, via les injures du capitaine Haddock, enseignait à ses potaches l’orthographe pourtant difficile de « bachi-bouzouk » ou de « Tchouk-tchouk nougat ». C’est en repensant à cette époque que l’envie me vient de remercier Monsieur Eratosthène, trop tôt disparu, qui fut le premier scientifique à me faire rêver en calculant le rayon de la terre par l’

observation de la démarche nonchalante de camélidés débonnaires arpentant la piste Assouan-

Alexandrie, trois siècles avant notre ère. Je retiendrai encore les heures passées sur un Rubik

Remerciements cube avec Laurent Bodart, et son sourire amusé quand il me demandait à quelle heure très précisément les trois aiguilles d’une horloge se rejoignent entre 10 et 11 heures. Des enseignants qui se succédèrent pendant ma période de secondaire, je remercierai surtout le Père Legros. C’est lui qui nous mimait, en brandissant une immense latte, le combat furieux des Horace et des Curiace, c’est lui qui nous faisait rêver en nous lisant Salammbô dix minutes avant la fin du cours de français. C’est de cette époque que me vient l’envie enfin assouvie de remercier messieurs Baudelaire, Bach, Musset, Brassens, et tant d’autres que je ne citerai pas par manque de place, mais qui se reconnaîtront certainement. De mes premières années de médecine, je retiendrai l’accueil du professeur Wattiaux, et plus encore de sa collaboratrice, madame Thirion, au sein du laboratoire de chimie biologique des FUNDP. Je tiens à la remercier pour le temps qu’elle consacra à m’expliquer les rudiments de la recherche scientifique et de l’utilisation d’un ordinateur (elle se souvient certainement de mon terrible « double-clic »). De surcroît, elle m’a littéralement offert ma première publication sous forme d’abstract, dont la lecture me semble aujourd’hui encore complètement absconse… Je retiendrai également l’enseignement du professeur Zech, qui nous expliquait par d’incroyables fables et autres métaphores le comportement des virus, des champignons, des bactéries et des grands patrons de médecine interne. Je le revois, tirant sur sa bouffarde, me demander le plus sérieusement du monde de lui citer par ordre de fréquence décroissante les 23 germes susceptibles de provoquer une méningite…. En repensant à cette époque, l’envie me vient de remercier monsieur Robert Harvent, sans lequel mon intérêt pour le handicap mental serait probablement resté lettre morte. Sa continuelle bonne humeur, son inaltérable gentillesse et son humour subtil, dissimulés derrière son terrible handicap, furent les catalyseurs de mon intérêt pour la psychiatrie. Peut-être serais-je aujourd’hui psychiatre si un certain professeur Evrard n’avait pas donné sa dernière année de cours à l’UCL ? L’accueil du professeur Jean-Paul Roussaux dans le service de psychopathologie ainsi que la sympathie et la confiance qu’il me témoigna d’emblée en seraient certainement en grande partie responsables, tout comme d’ailleurs l’expérience de collaboration que j’y réalisai avec les docteurs Leach (alias « The consul », et futur correcteur en chef de ma prose anglophone) et Jacques, que je remercie pour leur amitié et leur confiance.

L’écoute successivement étonnée, amusée et finalement intéressée du professeur Kahn

Remerciements ce plan a pu globalement conserver jusqu’ici. L’aide du professeur Bernard Dan, alias « Le parrain », dans la réalisation de plusieurs publications ainsi que son accueil dans le service de neurologie pédiatrique furent plus que précieux, et je l’en remercie. Grâce, ou à cause de lui (c’est selon…) commença cette thèse. Les professeurs Guy Cheron et Serge Schiffmann furent des promoteurs attentifs et ouverts, dont la complémentarité parfaite ne frôlait que rarement l’antinomie. Je revois surtout Guy, un tournevis à la main, s’attaquant à un ordinateur ou un amplificateur en panne, ou retrouvant dans un coin du labo, « La » pièce,

« Le » petit bout de plasticine, l’appareil ésotérique à mes yeux qui manquait à une installation pourtant déjà fournie, voire pléthorique. Je relis surtout Serge, les commentaires en jaune sur mes drafts, ses critiques rarement complaisantes qui ne rendaient ses compliments que plus crédibles. Je remercie les donateurs de la Fondation Erasme et du Fond National de la Recherche Scientifique qui ont permis la réalisation de cette thèse.

On imagine facilement les compétences mathématiques et informatiques d’un jeune

médecin qui vient de passer deux années à soigner des bronchiolites et des diarrhées… Je suis

très reconnaissant au professeur Dumont pour ses explications patientes quant aux exposants

de Lyapounov, et à monsieur Didier Villers pour l’intérêt qu’il a porté à notre travail et les

compétences informatiques qu’il y a amenées, comme celles de David Calomme. Je remercie

pour leur confiance et leur enthousiasme les doctorants du laboratoire de Serge avec lesquels

une collaboration très fructueuse fut possible, à savoir Raphaël Hourez et Bertrand Bearzatto,

lui qui sait mieux que personne qu’il n’est pas nécessaire d’espérer pour entreprendre ni de

réussir pour persévérer, co-fondateur des sociétés belges d’oenoélectrophysiologie et de

plongée sous-marine en animalerie. Du laboratoire de neurophysiologie de l’ULB, je tiens

également à remercier tous ceux et celles qui m’apportèrent régulièrement ou ponctuellement

un coup de main, tels Alban de Kerchove d’Exaerde, Delphine Houtteman et Laetitia Cuvelier

pour l’histologie, Michèle De Baerdemaeker pour les démarches administratives et Huy

Nguyen Tran pour l’informatique. Du laboratoire d’électrophysiologie de Mons, je remercie

Pierre Kellidis et surtout Claude Warocquier, respectivement vicomte de la Souris et marquis

de l’Axolotl, qui furent au nettoyage de l’animalerie ce que Pedro Almadovar et Woody Allen

sont au cinéma : de grands artistes qui ont embelli mon quotidien, et que je remercie

chaleureusement. Je remercie également Vincianne Delvaux, Etienne Noël, Jacqueline Prévot

et Geneviève Lebrun, de l’Institut Provincial d’Hygiène, pour s’être penchés avec moi sur le

problème de l’alcoolémie murine, ainsi que Nicole Van Overvelt et Michèle Lebrun, de

l’hôpital Ambroise Paré, pour les dosages d’osmolalité. Je remercie chaleureusement Denise

Remerciements Kingwill, la seule et irremplaçable néo-zélandaise de Barsy, pour avoir régulièrement relu et corrigé mes articles en anglais, bravant ainsi par pure amitié ses convictions d’amie des bêtes.

Nous verrons dans le corps de cette thèse que différentes souris ont convergé de la Suisse, de l’Allemagne et des Etats-Unis vers le Borinage afin de prêter leur cervelet à la Science. Je remercie leurs éleveurs respectifs qui, outre la confiance qu’ils nous ont accordée en nous envoyant leurs animaux, nous ont éclairés de leurs connaissances pointues dans leurs domaines respectifs. Ainsi les professeurs Wagstaff (Virginie, USA), Sausbier (Tuebingen, Allemagne) et surtout Schwaller (Fribourg, Suisse). L’enthousiasme communicatif de ce dernier pour la parvalbumine (à prononcer absolument avec l’accent bernois) et l’intérêt qu’il a toujours porté aux résultats acquis sur ses souris ont constitué une motivation supplémentaire à réaliser le travail sur la double oscillation.

Je remercie les professeurs Brunko, Lebrun, Olivier, Paiva, Pandolfo, Vidal et Zegers de Beyl d’avoir accepté de constituer mon jury de thèse.

Enfin, je remercie Loïse, mon épouse, non pour ses innombrables qualités (elle n’a

aucun mérite, elle est née comme ça), mais pour la patience et la gentillesse dont elle a fait

preuve au cours de ces quatre années, en écoutant mes doutes, mes déceptions, mes angoisses,

mes coups de déprime et en se réjouissant de mes périodes pré-maniaques d’enthousiasme et

de réussite. Je remercie mon fils Julien pour ses innombrables sourires et éclats de rire qui

m’ont souvent fait oublier les cellules de Purkinje et pour avoir été (avec l’assistance de sa

maman), un enfant éveillé, certes (surtout à 6 h du matin), mais globalement respectueux des

périodes de travail et de repos de son papa.

.

Ce travail synthétise les publications suivantes

Servais L, Bearzatto B, Hourez R, Dan B, Schiffmann SN, Cheron G (2004) Effect of simple spike firing mode on complex spike firing rate and waveform in cerebellar Purkinje cells in non-anesthetized mice. Neurosci Lett 367:171-176. Annexe 1

Servais L, Cheron G (2005) Purkinje cell rhythmicity and synchronicity during modulation of fast cerebellar oscillation. Neuroscience in press. Annexe 2

Servais L , Bearzatto B, Schwaller B, Dumont M, De Saedeleer C, Dan B, Barski JJ, Schiffmann SN, Cheron G (2005) Mono- and dual-frequency fast cerebellar oscillation in mice lacking either parvalbumin and/or calbindin D-28k. Eur J Neuroscience in press.

Annexe 3

Servais L, Bearzatto B, Delvaux V, Noël E, Leach R, Brasseur M, Schiffmann SN, Cheron G (2005) Effect of chronic ethanol absorption on Purkinje and Golgi cell firing in vivo and on motor coordination in mice. Brain research in press. Annexe 4

Ainsi que les travaux sur l’alcoolisme foetal, dont les résultats, présentés aux réunions de la Société Européenne de Neurologie Pédiatrique, sont en cours de rédaction.

Servais L, Bearzatto B, Hourez R, Dan B, Schiffmann SN, Cheron G (2004) Cerebellar Dysfunction in Fetal Alcohol Syndrome. Rev Neurol 39s:886.

Servais L, Bearzatto B, Hourez R, Dan B, Schiffmann SN, Cheron G (2005) To breastfeed or

not to breastfeed: That is the question. Rev Neurol 40s:10

Table de matières.

Table des matières

1. Introduction : Le cervelet...1

1.I. Position anatomique ...1

1.II. Organisation anatomique et fonctionnelle ...2

1.II.a. Division antéro-postérieure ...2

1.II.b. Division sagittale...3

1.III. Afférences ...3

1.III.a. Les afférences médullaires...3

1.III.a.1. Le faisceau spinocérébelleux postérieur (de Flechsig) ...3

1.III.a.2. Le faisceau cunéocérébelleux...4

1.III.a.3. Le faisceau spinocérébelleux ventral (de Gowers)...4

1.III.a.4. Le faisceau spinocérébelleux rostral...4

1.III.b. Les afférences réticulaires ...4

1.III.c. Les afférences pontines...5

1.III.d. Les afférences olivaires ...5

1.III.e. Les afférences vestibulaires ...5

1.III.f. Les autres afférences...6

1.IV. Efférences...6

1.IV.a. Les efférences vermiennes...6

1.IV.b. Les efférences paravermiennes...6

1.IV.c. Les efférences hémisphériques ...7

1.V. Les pédoncules cérébelleux...7

1.VI. Anatomie vasculaire ...7

1.VII. Histologie...8

1.VII.a. La cellule de Purkinje ...9

1.VII.b. Les grains ...10

1.VII.c. La cellule de Golgi...11

1.VII.d. La cellule en panier...12

1.VII.e. La cellule en étoile ...13

1.VII.f. La cellule de Lugaro...13

1.VII.g. La brosse unipolaire...13

1.VIII. De la structure à la fonction...15

2. Hypothèses et objectifs de travail...19

3.Méthodes...21

3.I. Enregistrements électrophysiologiques ...21

3.I.a. Préparation de l’animal. ...21

3.I.a.1. Anesthésie...21

3.I.a.2. Exposition du site opératoire ...21

3.I.a.3. Mise en place de l’appareil de contention ...22

3.I.a.4. Exposition du cervelet ...23

3.I.a.5. Mise en place des électrodes EMG (facultatif)...23

3.I.a.6. Soins postopératoires...23

Table de matières.

3.II.a. Analyse des cellules de Purkinje ...26

3.II.a.1. Amplitude et durée des spikes simples...26

3.II.a.2. Fréquence ...27

3.II.a.4. Rythmicité ...27

3.II.a.5. Durée des spikes complexes ...28

3.II.a.6. Silence des spikes complexes ...28

3.II.a.7. Forme des spikes complexes ...28

3.II.a.8. Index de synchronie ...29

3.II.a.9. Rapport à la phase...29

3.II.b. Analyse du potentiel de champ local...29

3.III. Techniques annexes en électrophysiologie ...30

3.III.a. Micro-injections ...30

3.III.b. Injections péritonéales ...30

3.III.c. Stimulations ...31

3.IV. Comportement ...31

3.IV.a. Acquisition du réflexe de clignement, ou « Blink test » ...32

3.IV.b. Le test du rotarod ...33

3.IV.c. Le test du runway...33

3.V. Immunohistochimie ...34

4. Activité spontanée de la cellule de Purkinje chez la souris normale éveillée...36

4.I. Le spike simple...36

4.II. Le spike complexe...39

4.III. Interactions entre les spikes simples et complexes ...41

4.III.a. Régulation de la fréquence de décharge des spikes simples par les spikes complexes...41

4.III.b. Régulations de la rythmicité des spikes simples par les spikes complexes ...42

4.III.c. Régulation de la fréquence de décharge des spikes complexes par les spikes simples ...42

4.III.d. Régulation de la forme du spike complexe par le spike complexe précédent ...45

4.III.e. Régulation de la forme du spike complexe par le spike simple ...49

5. Activité spontanée des cellules de Purkinje chez les souris déficientes en protéines fixant le calcium...57

5.I. La régulation de la concentration intracytoplasmique en calcium ionisé dans la cellule de Purkinje ...57

5.II. L’oscillation rapide des souris déficientes en protéines fixant le calcium ...59

5.III. Rapport entre oscillation rapide et décharge des cellules de Purkinje...62

5.III.a. Action de la kétamine et du pentobarbital sur l’oscillation rapide...65

5.III.b. Effet de la kétamine et du pentobarbital sur la décharge des cellules de Purkinje en absence d’oscillation ...67

5.III.c. Effet du pentobarbital sur l’interaction cellule de Purkinje-LFPO. ...70

5.III.d. Effet de la kétamine sur la synchronie des cellules de Purkinje ...73

5.III.e. Effet du pentobarbital sur la synchronie des cellules de Purkinje ...74

5.IV. Etude du potentiel de champ local et de la décharge des cellules de Purkinje chez les souris déficientes en tampons calciques lents. ...82

5.IV.a. Décharge des cellules de Purkinje des souris PV

...83

5.IV.b. Potentiel de champ local chez les souris PV

...84

5.IV.c. Etude de la double oscillation des souris PV

CB

...90

6. Effet de l’exposition chronique à l’éthanol sur la décharge des cellules de Purkinje et sur la

coordination motrice...99

Table de matières.

6.I. Effets de l’ingestion chronique d’éthanol chez les souris adultes...101

6.I.a. Animaux ...101

6.I.b. Coordination motrice ...103

6.I.c. Electrophysiologie ...106

6.I.d. Histologie ...107

6.II. Effets de l’exposition éthylique par voie transplacentaire...110

6.II.a. Animaux...111

6.II.b. Coordination motrice ...111

6.II.c. Acquisition du réflexe de clignement ...113

6.II.d. Histologie...114

6.II.e. Electrophysiologie ...115

6.III. Effets de l’exposition éthylique via la lactation ...117

6.III.a. Animaux...117

6.III.b. Coordination motrice...117

6.III.c. Histologie...119

6.III.d. Electrophysiologie...119

7. Etude de l’activité cérébelleuse des souris BK

...125

7.I. Rôle des canaux BK et SK dans la décharge de la cellule de Purkinje in vitro...125

7.II. La souris BK

...127

7.II.a. Activité spontanée des cellules de Purkinje des souris BK

. ...128

7.II.b. Etude du potentiel de champ local chez les souris BK

...132

7.II.c. Synchronisation de l’oscillation dans les plans frontal et sagittal...134

7.II.d. Rapport entre la décharge des cellules de Golgi et l’oscillation lente...135

7.II.e. Réponses des cellules de Purkinje des souris BK

à une stimulation sensori- motrice ...137

8. Discussion et perspectives ...142

9. Références bibliographiques ...149

10.Liste des abréviations...162 Annexe 1 Publication 1

Annexe 2 Publication 2

Annexe 3 Publication 3

Annexe 4 Publication 4

Annexe 5 Curriculum vitae

Annexe 6 Résumés

...

I INTRODUCTION

1 Introduction

1. Introduction : Le cervelet

Le cervelet est un organe fascinant. Fascinant d’abord pour sa beauté formelle, pour le découpage minutieux de son parenchyme, pour l’expansion majestueuse de l’arbre dendritique de ses cellules de Purkinje. Fascinant ensuite pour la remarquable préservation phylogénétique de sa cytoarchitecture. Fascinant enfin pour les interrogations, voire les débats passionnés qui entourent toujours sa fonction exacte. Classiquement impliqué dans les comportements moteurs et l’équilibre, la fonction du cervelet a plus récemment été démontrée dans bien d’autres domaines, tels le langage (Chen & Desmond 2005), l’angoisse (Sachetti et al. 2005), le rire ou les larmes paroxystiques (Parvizi et al. 2001), l’excrétion (Blok et al.

1997) et l’éjaculation (Holstege et al. 2003). Si le cervelet semble être indispensable à de nombreux comportements animaux et humains, il peut apparaître également complètement inutile, puisqu’il n’est pas exceptionnel de découvrir fortuitement une agénésie cérébelleuse complète chez un sujet d’apparence normal. Dans ce chapitre introductif, nous reverrons succinctement quelques notions anatomiques, histologiques et cytologiques susceptibles de contribuer à une meilleure compréhension des résultats expérimentaux et de leur interprétation ¹ .

1.I. Position anatomique

Le cervelet est situé derrière le tronc cérébral, dans la fosse postérieure, à hauteur du

quatrième ventricule dont il est séparé par les voiles médullaires supérieurs et inférieurs. Ce

dernier contient les plexus choroïdiens du quatrième ventricule et met en communication

l’espace arachnoïdien et ventriculaire via les trous de Magendie et de Luchka. Ce rapport est

important pour comprendre pourquoi une masse cérébelleuse peut rapidement causer une

hypertension intracrânienne non communicante. En haut et en avant, le cervelet est séparé des

1 Introduction

2 lobes occipitaux qui le recouvrent par la tente du cervelet, qui délimite ainsi la fosse postérieure.

1.II. Organisation anatomique et fonctionnelle

Le cervelet est composé d’un manteau cortical plissé qui recouvre une substance blanche au sein de laquelle se trouvent les noyaux cérébelleux profonds. Le cortex cérébelleux peut être compris dans une organisation rostro-caudale, plutôt descriptive, ou dans une organisation sagittale, plutôt fonctionnelle (Figure 1.1).

Figure 1.1. Vue supérieure du cervelet « déplié ». Le cervelet présente une division en lobules dans le sens antéro-postérieur et une division dans plan sagittal en vermis et hémisphères.

1.II.a. Division antéro-postérieure

Elle est essentiellement anatomique. Les lobules, numérotés de 1 à 10 dans le sens

antéro-postérieur, sont séparés par des sillons horizontaux. Le cervelet est divisé en trois

parties : Le lobe flocculonodulaire (lobule 10) contenant le nodulus et le flocculus, le lobe

antérieur (lobules de 1 a 5) et le lobe postérieur (lobules de 6 à 9), séparé du précédent par la

scissure primaire et lui-même séparé en deux parties (entre les lobules 7 et 8) par le sillon

circonférentiel de Vicq d’Azyr.

1 Introduction 1.II.b. Division sagittale

Elle est plutôt fonctionnelle. On distingue dans le cortex, de dedans en dehors, le vermis, le paravermis ou lobe intermédiaire et les hémisphères. Ces structures se projettent respectivement sur les noyaux fastigiaux, interposés et dentelés. Le nodulus se projette quant à lui sur le noyau de Deiters, ou vestibulaire latéral, qui, s’il constitue fonctionnellement un noyau cérébelleux profond, n’en est pas moins « délocalisé » dans le tronc cérébral. Le noyau fastigial est fonctionellement divisé en deux parties, une partie rostrale impliquée dans le contrôle de la musculature somatique et une partie caudale impliquée dans le contrôle des mouvements oculaires. Les enregistrements réalisés dans l’interpositus ont démontré son implication dans le contôle des muscles antagonistes et dans le traitement du feed-back sensoriel lors de l’exécution d’un mouvement. Le rôle de l’interpositus dans l’apprentissage moteur, comme par exemple l’acquisition du réflexe de clignement, fait l’objet d’intenses controverses. Le noyau dentelé intervient dans l’initiation du mouvement.

1.III. Afférences

Elles proviennent de la moelle, du tronc et des noyaux vestibulaires, et constituent les fibres moussues, ou de l’olive bulbaire, constituant alors les fibres grimpantes. Les fibres grimpantes se projettent directement sur les cellules de Purkinje, tandis que les fibres moussues se projettent sur les cellules granulaires.

1.III.a. Les afférences médullaires

1.III.a.1. Le faisceau spinocérébelleux postérieur (de Flechsig)

Les fibres sensitives (type Ia, Ib et II) en provenance des tendons et des muscles du

membre inférieur rentrent dans la substance grise médullaire par la corne postérieure, relaient

au niveau de la corne latérale dans la colonne de Clarke et montent dans le tractus

1 Introduction

4 1.III.a.2. Le faisceau cunéocérébelleux

Le faisceau cunéocérébelleux constitue l’équivalent du faisceau spinocérébelleux postérieur pour les membres supérieurs. Il est donc constitué des fibres sensitives en provenance des muscles et des tendons du membre supérieur et de la nuque. Sans relayer dans la moelle, ces fibres montent dans le faisceau cunéiforme pour relayer enfin dans le noyau cunéaire accessoire de Von Monakow, d’où elles suivent le trajet du faisceau spinocérébelleux postérieur.

1.III.a.3. Le faisceau spinocérébelleux ventral (de Gowers)

Il se distingue du faisceau spinocérébelleux postérieur par le fait que les fibres (type II et III) relaient au niveau de la corne latérale de la moelle avant de croiser par la commissure blanche antérieure et de remonter par le cordon latéral controlatéral vers les pédoncules cérébelleux supérieurs et finalement le lobe antérieur bilatéral, non sans avoir croisé une seconde fois au niveau du mésencéphale. A l’instar du faisceau spinocérébelleux postérieur, le faisceau spinocérébelleux ventral convoie les informations sensitives et proprioceptives des membres inférieurs.

1.III.a.4. Le faisceau spinocérébelleux rostral

Le faisceau spinocérébelleux rostral constitue l’équivalent du faisceau spinocérébelleux ventral pour les membres supérieurs. Les neurones, situés dans la partie postérieure de la colonne de Clarke ipsilatérale aux champs récepteurs, envoient leurs axones de manière bilatérale dans le lobe antérieur, via les pédoncules cérébelleux supérieurs et dans une moindre mesure, inférieurs.

1.III.b. Les afférences réticulaires

Elles se distribuent à l’ensemble du cortex cérébelleux. Elles sont issues

-du noyau réticulaire latéral (projection essentiellement ipsilatérale par les pédoncules

cérébelleux supérieurs sur le lobe antérieur),

1 Introduction -du noyau réticulaire du tegmentum pontin (projection controlatérale par les pédoncules cérébelleux moyens sur le lobe antérieur et sur les lobules VIIb et VIII),

-du noyau réticulaire paramédian (projection bilatérale sur le lobe antérieur, le vermis postérieur et le flocculus via les pédoncules cérébelleux inférieurs)

-des noyaux péri-hypoglosses (projection bilatérale sur le lobe antérieur et les lobules VIII et IX).

1.III.c. Les afférences pontines

Elles constituent une étape de la boucle cortico-ponto-cérébello-thalamo-corticale.

Cette boucle commence essentiellement au niveau des aires de Brodmann 4 et 6 (mais également des aires 1-3,5 et 7) qui se projette sur des bandes de neurones pontins orientées dans le sens rostro-caudal. Les neurones pontins se projettent essentiellement (~90%) sur l’hémisphère controlatéral (lobules IV-VII), via les pédoncules cérébelleux moyens.

1.III.d. Les afférences olivaires

Elles constituent une étape du tractus spino-olivo-cérébelleux. Les axones des neurones olivaires dénommés « fibres grimpantes » cheminent dans les pédoncules cérébelleux inférieurs pour se projeter directement sur les cellules de Purkinje du cortex hétérolatéral, suivant des bandes sagittales. Une fibre grimpante excite en moyenne 10 cellules de Purkinje.

1.III.e. Les afférences vestibulaires

1 Introduction

6 ipsilatéral, tandis que les afférences secondaires se projettent de manière plus diffuse et bilatérale sur l’ensemble du vermis, les noyaux fastigiaux et interposés et le lobe flocculonodulaire.

1.III.f. Les autres afférences

Le cervelet reçoit des afférences noradrénergiques du locus coeruleus (synapse avec la dendrite distale de la cellule de Purkinje) et sérotoninergiques des noyaux du raphe. Le cervelet reçoit également des projections directes et indirectes des noyaux des centres autonomiques, tels ceux du IX et du X. Le noyau fastigial reçoit des projections de l’hypothalamus.

1.IV. Efférences

1.IV.a. Les efférences vermiennes

Le vermis se projette sur le noyau fastigial qui se projette sur la réticulée et les noyaux vestibulaires après avoir croisé dans le cervelet pour la plus grande partie des fibres, formant ainsi le faisceau unciné puis les corps juxtarestiformes. Les neurones du vermis se projettent également sur les cellules olivaires qu’ils inhibent. Quelques cellules de Purkinje du vermis se projettent directement sur les noyaux vestibulaires latéraux.

1.IV.b. Les efférences paravermiennes

Le paravermis se projette sur le noyau interposé, ce dernier étant divisé en noyau

interposé antérieur et postérieur. Le noyau interposé se projette sur le noyau ventro-latéral du

thalamus et le noyau rouge hétérolatéral, dans sa partie caudale pour l’interposé antérieur et sa

partie médiane pour l’interposé postérieur.

1 Introduction 1.IV.c. Les efférences hémisphériques

Les cellules de Purkinje des hémisphères se projettent sur le noyau dentelé, étape de la boucle cortico-ponto-cérébello-thalamo-corticale avant le noyau ventro-latéral du thalamus hétérolatéral. Le noyau dentelé se projette également sur le noyau intralaminaire antérieur du thalamus, les noyaux oculomoteurs, l’olive bulbaire, le tegmentum et la réticulée bulbaire en suivant le faisceau central de la calotte.

1.V. Les pédoncules cérébelleux

Le cervelet est relié au tronc cérébral par les pédoncules cérébelleux qui convoient les afférences, destinées au cortex cérébelleux, et les efférences des noyaux profonds. On distingue

- Les pédoncules cérébelleux inférieurs (ou corps restiformes), qui contiennent le faisceau spinocérébelleux dorsal, le faisceau cunéocérébelleux ainsi que le faisceau olivocérébelleux controlatéral et les afférences du noyau réticulaire latéral.

- Les pédoncules cérébelleux moyens (ou brachium pontis), où transitent les afférences pontines.

- Les pédoncules cérébelleux supérieurs (ou brachium conjonctivum), qui contiennent les faisceaux spinocérébelleux ventral et rostral ainsi que les afférences du noyau réticulaire paramédian et la plupart des efférences cérébelleuses.

1.VI. Anatomie vasculaire

Le cervelet est irrigué par les artères cérébelleuses supérieures, moyennes et

1 Introduction

8 L’artère cérébelleuse supérieure irrigue la face supérieure du cervelet jusqu’au noyau dentelé et la face latérale de la protubérance, l’artère cérébelleuse moyenne irrigue le flocculus et donne naissance à l’artère auditive interne tandis que la PICA irrigue la face latérale du bulbe et la partie inférieure du cervelet.

La partie externe du cervelet est drainée par le sinus longitudinal supérieur, et la partie la plus interne se draine dans la grande veine de Galien.

1.VII. Histologie

Historiquement, le cortex cérébelleux a été décrit comme la succession de trois couches, moléculaire, ganglionique et granulaire, abritant les différentes cellules constituant le parenchyme cérébelleux : la cellule de Purkinje, les cellules granulaires, les cellules en panier et en étoile, les cellules de Golgi, les cellules de Lugaro et les cellules en brosse, la description, ou du moins l’intérêt porté à ces deux derniers éléments étant relativement plus récente.

La couche moléculaire, la plus externe, de 300 à 400 micromètres d’épaisseur, est essentiellement constituée par les fibres parallèles, issues de la bifurcation de l’axone des cellules granulaires et ne contient que deux types de cellules : les cellules en étoile et les cellules en panier, regroupées ainsi sous la dénomination d’ «interneurones inhibiteurs de la couche moléculaire ».

De 50 à 70 micromètres d’épaisseur, la couche ganglionique est constituée d’une couche unique de cellules de Purkinje. Quelques cellules en panier peuvent être également observées entre les cellules de Purkinje. Dans la couche ganglionique transitent également les axones ascendants des cellules granulaires et descendants des cellules en panier ainsi que les dendrites des cellules de Golgi.

D’épaisseur variable (de 100 micromètres en profondeur et jusqu’à 500 micromètres

au sommet des folia), la couche granulaire est essentiellement constituée par les cellules

granulaires dont la densité atteint 2.400.000 par mm

. Les dendrites des cellules granulaires

prennent contact avec les fibres moussues au sein d’une structure particulière : les îlots ou

glomérules cérébelleux. La couche granulaire contient également les cellules de Golgi, les

axones des cellules de Purkinje, les brosses unipolaires et les cellules de Lugaro..

1 Introduction 1.VII.a. La cellule de Purkinje

Il s’agit de la seule sortie du cortex cérébelleux (fig. 1.2), et à ce titre, nous décrirons la cytoarchitecture du cervelet comme s’articulant autour de cette unité d’intégration finale.

La cellule de Purkinje est une grande cellule de 50 à 70 micromètres de diamètre vertical et de 30 à 35 micromètres de diamètre transversal. Les cellules de Purkinje se disposent en une couche monocellulaire à intervalle de 50 micromètres dans le plan longitudinal et 50 à 100 micromètres dans le plan transversal. L’unique axone de la cellule de Purkinje prend naissance directement à la base de la cellule (pas de cône pré-axonique), traverse la couche granulaire et pénètre dans la lamina medulla en direction des noyaux profonds. La dendrite prend quant à elle naissance au pôle opposé de la cellule et se divise rapidement en angle aigu en deux troncs d’où se subdiviseront dans le plan transversal les branches de l’arbre dendritique.

Les afférences excitatrices sont constituées par les fibres grimpantes et les fibres parallèles. Les fibres grimpantes sont issues des neurones de l’olive bulbaire. Chaque fibre grimpante se projette sur une dizaine de cellules de Purkinje qui ne reçoivent par contre qu’une seule fibre grimpante chacune. Le contact entre la fibre et la cellule est très étroit tant du point de vue morphologique que fonctionnel. Les fibres grimpantes envoient également des collatérales sur les cellules en panier et les cellules de Golgi. Les fibres parallèles constituent la deuxième afférence excitatrice de la cellule de Purkinje. Elles sont issues de la bifurcation de l’axone des grains et courent dans l’axe du folium dont elles constituent la plus grande partie de la couche moléculaire. Elles établissent des contacts synaptiques faibles (en passant) avec les arbres dendritiques des cellules de Purkinje à travers lesquels elles passent.

A l’inverse du système des fibres grimpantes où une et une seule fibre innerve une dizaine de cellules de Purkinje, L’arbre dendritique de chaque cellule de Purkinje est traversé par 200 à 300.000 fibres parallèles, chacune prenant contact avec un grand nombre de cellules de Purkinje.

Les afférences inhibitrices de la cellule de Purkinje viennent des cellules en étoile, des

cellules en panier, des cellules de Lugaro et des collatérales récurrentes des autres cellules de

Purkinje. Les cellules en étoile sont situées dans la couche moléculaire, et leur axone établit

1 Introduction

10 nombre de synapses. L’inhibition directe des cellules de Purkinje par les cellules de Lugaro a récemment été démontrée (Dean et al. 2003).

La cellule de Purkinje constitue la seule sortie du cortex cérébelleux. Les axones des cellules de Purkinje se projettent sur les noyaux cérébelleux profonds qu’ils inhibent. En outre, l’axone des cellules de Purkinje émet quelques collatérales récurrentes qui constituent les plexus infra- et supra-ganglionique, situés respectivement en dessous et au-dessus de la couche des cellules de Purkinje. Ces collatérales se projettent essentiellement sur les cellules de Golgi et les cellules en panier qu’elles inhibent, mais également sur les cellules de Lugaro et sur les autres cellules de Purkinje.

Figure 1.2. La cellule de Purkinje constitue la seule sortie du cortex cérébelleux. Elle inhibe les neurones des noyaux cérébelleux profonds. Elle est excitée par une fibre grimpante, issue de l’olive bulbaire et par les fibres parallèles issues de la bifurcation des axones des grains, eux-mêmes stimulés par les fibres moussues. La partie proximale de l’axone des grains situés en dessous de la cellule (segment ascendant) établit plusieurs contacts synaptiques avec la partie proximale de la dendrite de la cellule de Purkinje. Les terminaisons axonales sont symbolisées par

1.VII.b. Les grains

Tout à l’inverse des cellules de Purkinje, les grains sont de petites cellules (5 à 8

micromètres de diamètre) densément agencées en plusieurs couches, au cytoplasme étroit et

peu différencié. Ils peuvent posséder jusqu’à 7 dendrites qui s’épanouissent au niveau des

îlots ou glomérules cérébelleux. L’axone du grain traverse la couche granulaire et parcourt

dans la couche moléculaire un trajet plus ou moins inversement proportionnel à la profondeur

1 Introduction du grain dans la couche granulaire, les grains les plus superficiels engageant ainsi des contacts synaptiques avec la partie la plus distale des cellules de Purkinje. L’axone se divise alors en deux branches (bifurcation en T) qui constitueront une des nombreuses fibres parallèles qui parcourent le folium dans son axe longitudinal, sur une longueur comprise entre 2 et 3 mm.

Avant sa bifurcation, l’axone des grains engage des contacts synaptiques avec la partie proximale de la dendrite des cellules directement sus-jacentes.

Comme nous l’avons mentionné, les dendrites des grains s’épanouissent dans un enchevêtrement de rameaux qui s’allient à ceux des fibres moussues au sein des îlots glomérulaires. La synapse excitatrice à ce niveau est contrôlée par la terminaison axono- axonique gabaergique des cellules de Golgi. Les grains sont en outre inhibés par les cellules de Golgi et excités par les cellules en brosse au niveau de synapses axono-dendritiques.

La cellule de Purkinje constitue l’efférence principale des grains. Cependant, les fibres parallèles excitent également les cellules en étoile et les cellules de Golgi.

1.VII.c. La cellule de Golgi

La cellule de Golgi est une cellule de taille comparable à la cellule de Purkinje, située dans la couche granulaire. Ses dendrites traversent les couches granulaire et ganglionique, présentant sur cette portion de leur trajet un grand nombre d’épines dendritiques. Une fois dans la couche moléculaire, les dendrites se divisent dans tous les plans (à l’inverse de la cellule de Purkinje dont l’arbre dendritique est confiné au plan transversal) sur une distance en outre beaucoup plus importante que la cellule de Purkinje. Les branches de la couche moléculaire présentent beaucoup moins d’épines dendritiques que celles des couches granulaire ou ganglionique. L’axone naît généralement au pôle inférieur et se ramifie rapidement en une multitude de petits rameaux qui s’épanouissent au niveau des îlots cérébelleux sur une surface grosso modo correspondant à celle couverte par l’arbre dendritique. Les cellules de Golgi sont environ dix fois moins nombreuses que celles de Purkinje.

La cellule de Golgi est activée par des rameaux des fibres grimpantes et par ses

contacts axono-dendritiques avec les fibres parallèles. Elle est inhibées par les collatérales des

1 Introduction

12 Figure 1.3. La cellule de Golgi contrôle l’activation des grains (CG) par les fibres moussues (FM) via une synapse axono-axonale.

Elle est inhibée par des collatérales récurrentes des cellules de Purkinje (CP) et activée par les fibres parallèles (FP) et des collatérales des fibres grimpantes (FG). Les terminaisons dendritiques sont symbolisées par

1.VII.d. La cellule en panier

La cellule en panier est une cellule de taille intermédiaire entre celle de la cellule de

Purkinje et celle du grain (moyenne de 20 micromètres du corps cellulaire). Elle se trouve

dans la couche moléculaire, ou plus rarement entre deux cellules de Purkinje dans la couche

ganglionique. Les cellules en panier sont beaucoup plus fréquentes que les cellules de Golgi,

même légèrement plus nombreuses que les cellules de Purkinje. L’arbre dendritique se situe

dans la partie inférieure de la couche moléculaire et se ramifie dans le plan transversal,

comme celui de la cellule de Purkinje dont on peut cependant le distinguer par ses épines

dendritiques, plus rares, plus longues et plus étroites. L’axone de la cellule en panier vient

envelopper la cellule de Purkinje qu’elle inhibe. La cellule en panier est elle-même inhibée

par la cellule de Lugaro et par les collatérales récurrentes des cellules de Purkinje et excitée

par les rameaux des fibres grimpantes et par les fibres parallèles.

1 Introduction 1.VII.e. La cellule en étoile

La cellule en étoile est une petite cellule située dans les deux tiers externes de la couche moléculaire. Comme pour la cellule de Purkinje et la cellule en panier, la dendrite se divise dans le plan transversal, mais son arborisation couvre une surface bien inférieure à celle couverte par l’arbre dendritique de ces deux cellules.

Les cellules en étoiles sont excitées par les fibres parallèles au niveau de synapses axono- dendritiques. Elles sont inhibées par les rameaux récurrents des cellules de Purkinje au niveau des contacts axono-somatiques.

Les cellules en étoiles inhibent les cellules de Purkinje via le contact axono- dendritique qu’elles entretiennent avec elles.

1.VII.f. La cellule de Lugaro

Bien moins nombreuses que les cellules de Purkinje, les cellules de Lugaro se situent à la partie inférieure ou juste en dessous de la couche ganglionique. Les cellules de Lugaro se caractérisent par une sensibilité à l’action excitatrice de la sérotonine. Leur seule afférence connue est l’inhibition par les collatérales récurrentes des cellules de Purkinje.

La cellule de Lugaro inhibe la cellule de Golgi, les cellules en panier et les cellules de Purkinje. Les neurotransmetteurs sont la glycine et le GABA (Dumoulin et al. 2001).

1.VII.g. La brosse unipolaire

Pratiquement confinées aux aires de projection vestibulaire (lobe flocculo-nodulaire),

les brosses unipolaires possèdent un soma arrondi, une dendrite unique mais remarquable par

son épaisseur et sa terminaison en brosse, et un axone sinueux et arborisé qui s’épanouit en

rosettes dans la couche granulaire. La cellule en brosse est activée par les fibres moussues et

par les autres cellules en brosse. Elle se projette sur les dendrites des grains ainsi que sur les

brosses des autres cellules unipolaires (Dino et al. 2000). Les cellules en brosse semblent

1 Introduction

14 Figure 1.4. Différents éléments neuronaux complètent la cytoarchitecture cérébelleuse. Les brosses unipolaires sont activées par les fibres moussues au niveau de leur arborisation dendritique caractéristique. Elles se projettent sur les grains (CG) et sur les autres brosses unipolaires. La cellule de Lugaro inhibe les cellules de Purkinje (CP), les cellules de Golgi et les cellules en panier. Elles sont elles-mêmes inhibées par les collatérales récurrentes (CR) des cellules de Purkinje (CP). La cellule en panier ou «basket cell » est une cellule inhibitrice de la Purkinje. Sa décharge est activée par les fibres parallèles (FP), non représenté, et par des collatérales des fibres grimpantes. Elle est inhibée par la cellule de Lugaro et par les collatérales récurrentes des cellules de Purkinje. La cellule en étoile (CE) ou

« stellate cell » est une autre cellule inhibitrice de la cellule de Purkinje. Sa décharge est

activée par les fibres parallèles et inhibée par les collatérales récurrentes de la cellule de

Purkinje.

1 Introduction

1.VIII. De la structure à la fonction

L’histologie du cortex cérébelleux amène de précieux renseignements quant à son fonctionnement. En effet, le cortex cérébelleux peut être assimilé à une machine neuronale possédant une sortie unique (l’axone des cellules de Purkinje) et deux entrées (les fibres moussues et les fibres grimpantes). Une de ces entrées est extrêmement précise (une fibre grimpante contactant plusieurs cellules de Purkinje, mais une cellule de Purkinje ne recevant l’entrée que d’une seule fibre grimpante), l’autre est à la fois beaucoup plus diffuse et convergente, chaque fibre moussue étant susceptible d’activer indirectement un grand nombre de cellules de Purkinje via les fibres parallèles, une même cellule de Purkinje pouvant, par ce même réseau de fibres parallèles, être activée par un grand nombre de fibres moussues. Dans cette conception, la cellule de Purkinje revêt donc le rôle d’intégrateur final des deux entrées, dont elle capte tout à la fois l’amplitude et la coïncidence et dont elle transforme l’activité en signal de sortie sous la forme d’un train de spikes. L’interaction entre les deux entrées du cortex cérébelleux se réalise non seulement au niveau de la cellule de Purkinje, mais également en amont de celle-ci au niveau des différentes boucles illustrées à la figure 1.4. Il est aisé de comprendre que l’étude du fonctionnement du cervelet passe obligatoirement par la compréhension de l’intégration de ces deux signaux d’entrée en un signal unique de sortie.

L’organisation relativement simple et stéréotypée du cortex cérébelleux, décrite déjà en grande partie par Ramon y Cajal en 1911, pouvait laisser entrevoir l’espoir d’une compréhension rapide de la fonction du cervelet, et surtout, des mécanismes neuronaux élémentaires qui la sous-tendent. Malheureusement, près d’un siècle après les publications de l’anatomiste espagnol et un demi-siècle après les premières publications d’Eccles sur la physiologie cérébelleuse, les plus grandes controverses demeurent sur le rôle exact du cervelet, et plus encore sur la manière dont celui-ci s’organise et fonctionne. Historiquement, l’impressionnante organisation des fibres parallèles a laissé présager que ces dernières définissaient une organisation du cervelet dans le plan frontal (Braitenberg & Atwood 1958;

Eccles et al. 1967). Eccles et ses collaborateurs ont ainsi montré qu’une stimulation en surface

du parenchyme cérébelleux entraînait une excitation des cellules de Purkinje situées dans le

prolongement latéral de la stimulation (les cellules de Purkinje sur la « beam ») et une

1 Introduction

16 (Campbell & Hesslow 1986; Dunbar et al. 2004), peu d’études ont démontré l’organisation frontale d’une réponse à un stimulus plus physiologique, comme une stimulation électrique d’un nerf périphérique (Garwicz & Andersson 1992), ou mieux encore la stimulation tactile de champs récepteurs (Ekerot & Jorntell 2001). Au contraire, un certain nombre d’études (Shambes et al. 1978; Bower & Woolston 1983) tendent à montrer que la stimulation périphérique des champs récepteurs induit une réponse de « patch » de cellules de Purkinje, superposés à des « patch » de cellules granulaires sous-jacentes. Ces observations ont conduit certains auteurs à reconsidérer le rôle des synapses entre la partie proximale de l’axone des cellules granulaires et la partie proximale de la dendrite de la cellule de Purkinje (Bower 2002). Cette excitation directe des cellules de Purkinje par les cellules granulaires sous- jacentes laisse donc supposer une transmission radiale de l’information dans le cortex cérébelleux. Il faut également noter que si l’on considère l’autre système excitateur du cortex cérébelleux, à savoir celui des fibres grimpantes, on serait d’avantage tenté de comprendre le cervelet dans le sens antéro-postérieur, qui définit l’organisation de la projection des fibres grimpantes. En outre, l’activité des dites fibres grimpantes présentes une nette synchronie dans le plan sagittal, synchronie dont elle est singulièrement dépourvue dans l’axe des fibres parallèles (Lang et al. 1999).

A cette controverse au demeurant parfois virulente sur l’organisation fonctionnelle du

cervelet, se superpose un véritable affrontement entre deux écoles quant à son rôle exact dans

l’apprentissage moteur (Mauk et al. 1998). Marr (1969), Albus (1971) et Ito (1989) ont

successivement proposé puis affiné un modèle de l’apprentissage au centre duquel se trouve la

cellule de Purkinje et la plasticité synaptique de ses afférences excitatrices. En effet,

l’activation répétitive isolée des fibres parallèles entraîne une potentiation à long terme (LTP)

de la synapse fibre parallèle-cellule de Purkinje, tandis que la même activation couplée dans

un délai bien spécifique à l’excitation par la fibre grimpante entraîne une dépression à long

terme (LTD) de cette même synapse. Nous savons aujourd’hui que c’est l’entrée de calcium

causée par l’activation de la fibre grimpante qui conditionne la direction, excitatrice ou

inhibitrice, de cette plasticité synaptique (Coesmans et al. 2004). Dans ce contexte, le modèle

de Marr-Albus-Ito propose que l’apprentissage moteur élémentaire, dont l’archétype est

l’association du réflexe de clignement à un stimulus auditif, repose sur ces deux types de

plasticité. Dans cette hypothèse, le stimulus inconditionné (le jet d’air dans le réflexe de

clignement) serait convoyé par les fibres grimpantes, tandis que le stimulus conditionné (le

son) convergerait vers les mêmes cellules par le truchement des fibres moussues puis

parallèles. L’ association répétée dans une fenêtre temporelle précise de ces deux stimulus

1 Introduction entraînerait donc une LTD de la synapse fibre parallèle-cellule de Purkinje, et donc une désinhibition des noyaux cérébelleux profonds. Lors de l’extinction, c’est à dire lors de la présentation isolée et répétitive du stimulus conditionné (le son tout seul), une LTP s’instaurerait consécutivement à l’activation isolée des fibres parallèles, et ramènerait progressivement le gain de la synapse à son niveau de base. Un exemple d’expérience d’acquisition de ce réflexe est illustré à la figure 6.5.

Si le modèle de Marr-Albu-Ito s’est largement imposé dans la compréhension de certaines formes d’apprentissage moteur élémentaire, il semble aujourd’hui évident qu’il est insuffisant pour expliquer l’ensemble des paramètres inhérents à ces apprentissages. En effet, si la plasticité de la synapse fibre parallèle-cellule de Purkinje est indispensable à un conditionnement optimal, par exemple dans le cas du réflexe de clignement, il n’en reste pas moins qu’un apprentissage résiduel reste possible chez des souris dont cette plasticité est fortement altérée, voire absente, et que des lésions portant sur des structures autres que le cortex cérébelleux, en particulier l’interpositus, peuvent entrainer l’absence totale d’apprentissage, voire l’extinction de l’apprentissage réalisé. Nous reviendrons plus loin sur les différentes compréhension du rôle du cortex cérébelleux dans l’acquisition du réflexe de clignement. Une position extrême à ce sujet a longtemps été défendue par Rodolpho Llinàs, qui a résumé son opinion quant à l’hypothèse de l’apprentissage cérébelleux par un aphorisme dont la clarté dispute à la concision :

« Each time I hear that the cerebellum is a learning machine, I feel like vomiting » (Mauk et al. 1998).

Dans la conception de ce chercheur, la fibre grimpante ne joue aucunement le rôle

« d’enseignant », mais bien celui d’horloge interne au cervelet. En effet, elle transmettrait aux cellules de Purkinje la rythmicité à 10 Hz de l’olive, et la synchronisation dans le plan sagittal de leur activité rythmique permettrait le contrôle fin des mouvements précis, malgré l’hiatus évident entre leur fréquence de décharge (0.5 à 1 Hz) et la rapidité des mouvements contrôlés.

Ce serait donc la rythmicité et la synchronie de la décharge des neurones olivaires dans des phases précises du mouvement qui pourraient coder le contrôle de l’olive sur le cervelet. Dans ce codage, la dimension chaotique de l’oscillation des neurones olivaires à 10 Hz jouerait un rôle majeur dans l’optimalisation du transfert de l’information.

De manière un peu provocatrice, nous pouvons conclure de cette introduction qui si

1 Introduction

18

quelques faits expérimentaux susceptibles de contribuer à une meilleure compréhension du

fonctionnement cérébelleux, en conditions normales et pathologiques.

...

2 HYPOTHESES ET OBJECTIFS DE TRAVAIL

2 Hypothèses et objectifs de travail..

19

2. Hypothèses et objectifs de travail

De la tortue au singe en passant par le rat, le cochon d’Inde, le lapin, le chat et le pigeon, de nombreux animaux ont servi de modèles expérimentaux aux électrophysiologistes pour une meilleure compréhension du cervelet. Pour d’évidentes raisons de miniaturisation du matériel qu’elle nécéssite, la souris a historiquement beaucoup moins contribué à l’étude in vivo du fonctionnement cérébelleux. L’avènement de la biologie moléculaire et la création d’animaux génétiquement modifiés ainsi que le perfectionnement des techniques d’enregistrement et de miniaturisation ont permis à la souris d’occuper progressivement une place de choix dans l’animalerie de l’électrophysiologiste. L’étude des souris mutantes déficientes en telle ou telle protéine, parfois même un niveau d’un seul type cellulaire présente en effet une opportunité exceptionnelle de mieux comprendre le fonctionnement et les dysfonctionnements du cortex cérébelleux. Cette compréhension passe ipso facto par l’étude de l’animal dans les conditions les plus physiologiques qui soient, c’est-à-dire vivant, éveillé, et idéalement, libre de ses mouvements.

Au cours de ce travail, nous rapporterons les résultats d’enregistrements simples ou multiples des cellules de Purkinje et de Golgi et du potentiel de champ local chez la souris éveillée. Ces enregistrements se réalisent soit au repos, soit lors d’imprégnations pharmacologiques locales ou générales, soit encore lors de la stimulation tactile de l’animal.

Nous étudierons donc le fonctionnement du cortex cérébelleux via l’enregistrement de sa seule sortie, c’est-à-dire la cellule de Purkinje, mais également via l’évaluation de la coordination motrice et de l’apprentissage moteur qu’il peut engendrer. Si ces deux approches, électrophysiologique et comportementale, peuvent être effectuées sur les mêmes animaux, leur réalisation simultanée en est toujours au stade de mise au point. Nous verrons à la fin de cette thèse les développements en cours pour lever cette dernière restriction.

Nous exposerons les résultats obtenus sur des souris normales, mais également sur

différents modèles de pathologies cérébelleuses, modèles définis par l’absence d’une protéine

spécifique ou par la ressemblance voulue avec une pathologie humaine. En effet, l’hypothèse

générale qui sous-tend la réalisation de ce travail est que la décharge spontanée de la cellule

de Purkinje constitue le reflet de l’activité intrinsèque de la cellule pondérée par l’intégration

2 Hypothèses et objectifs de travail..

des différentes entrées excitatrices et inhibitrices, activité sur laquelle se construira la réponse de la cellule de Purkinje à un besoin d’adaptation exigé par un comportement moteur. Cette réponse de la cellule de Purkinje constitue le produit final de l’intégration par le cortex cérébelleux d’une entrée sensori-motrice. Dans notre hypothèse, le déséquilibre induit par une mutation génétique ou une agression toxique dans la régulation de la décharge des cellules de Purkinje est susceptible de se traduire dans la décharge spontanée de la cellule, et ce, tant dans la fréquence de décharge que dans la rythmicité ou la régularité de celle-ci. L’étude de plusieurs modèles pathologiques ne réside pas dans la constitution d’un catalogue plus ou moins exhaustif associant déficit génétique ou agression toxique à telle ou telle anomalie, de toute façon le plus souvent aspécifique, de la décharge des cellules de Purkinje. Outre l’intérêt de mieux comprendre la physiopathologie de différentes conditions impliquant le cervelet, étudier les conséquences en terme de fonctionnement et d’efficacité du cortex cérébelleux dans différentes conditions pathologiques l’affectant réside dans la possibilité d’identifier différents patterns de fonctionnement associés à différents degrés d’ataxie. En effet, nous savons que les troubles de la coordination motrice observés dans les différents modèles de souris mutantes vont de la discrète altération des performances mesurées par certains tests bien précis à l’ataxie sévère évidente à l’œil nu lors de la simple observation de l’animal déambulant dans sa cage. Au cours de ce travail, nous décrirons dans un premier temps la décharge au repos de la cellule de Purkinje normale, et nous verrons par la suite comment s’en écartent celles de trois groupes de souris, à savoir les souris déficientes en protéines fixant le calcium, les souris chroniquement exposées à l’éthanol et les souris déficientes en canaux BK.

Nous verrons que différents patterns de décharge des cellules de Purkinje peuvent être

associés à différents degrés d’ataxie chez les animaux qui les présentent, et que cette

possibilité de regroupement va au-delà de l’origine génétique ou toxique du

dysfonctionnement cérébelleux. Nous identifierons ainsi trois patterns de décharge des

cellules. Le premier, associé à des ataxies modérées, est caractérisé par la décharge rapide,

rythmique et synchrone des cellules de Purkinje, causant l’apparition d’une oscillation rapide

(~160 Hz) qui elle-même contribue à la synchronisation des cellules. Le deuxième, associé à

des troubles très discrets de la coordination motrice, est défini par une décharge lente mais

toujours arythmique des cellules de Purkinje. Le troisième, retrouvé uniquement chez la

souris BK

sévèrement ataxique, est caractérisé par la décharge lente mais ultra rythmique de

.

3 METHODES

3 Méthodes

3.Méthodes

3.I. Enregistrements électrophysiologiques

La technique d’enregistrement des cellules de Purkinje, de Golgi, et du potentiel de champ local sur souris éveillées se décompose en deux étapes distinctes: la préparation de l’animal et l’enregistrement proprement dit.

3.I.a. Préparation de l’animal.

Cette étape est très stéréotypée et s’effectue selon le même protocole quelle que soit la méthode d’enregistrement subséquente (système Eckhorn ou microélectrodes de verre, cf.

infra).

3.I.a.1. Anesthésie

La souris est tout d’abord endormie au moyen d’une injection intrapéritonéale unique (seringue 1ml à tuberculine) de kétamine (Kétalar®, Pfizer, dilution 1/10 avec du sérum physiologique) 100mg/kg et de xylido-dihydrothiazine (Rompun®, Bayer, dilution 1/5 avec du sérum physiologique) 10 mg/kg. Ce type d’anesthésie permet une analgésie complète tout en conservant une respiration spontanée de l’animal. Les conditions d’analgésie sont vérifiées 15 minutes après l’injection (absence complète de réactions à la stimulation douloureuse par pincement de la queue) et régulièrement au cours de l’intervention. Si les conditions d’analgésie devaient s’avérer insuffisantes, une dose supplémentaire de 30 mg/kg de kétamine est alors administrée.

3.I.a.2. Exposition du site opératoire

3 Méthodes

22 l’incision permet l’insertion des barres d’oreille. Une fois la fixation du museau réalisée, l’animal est ainsi placé en position opératoire dans un cadre stéréotaxique.

3.I.a.3. Mise en place de l’appareil de contention

Deux vis distantes de 1 cm sont déposées tête en bas sur la ligne médiane du crâne. Au moyen de deux écrous, les deux vis sont solidarisées chacune à la partie horizontale et percée d’une pièce d’aluminium en L déplacée grâce à un micromanipulateur (Fig 3.1, partie supérieure). Deux vis dentaires (taille 5) sont alors insérées dans le crâne 5 mm en arrière et latéralement de la tête de la vis postérieure. L’électrode indifférente réalisée par la torsion d’un fil d’argent est ensuite mise en place par perforation de la partie postérieure de l’os pariétal, à proximité de la vis dentaire droite (Fig 3.1, partie inférieure). L’ensemble est ensuite solidarisé par du ciment dentaire. Cette étape peut s’avérer délicate, car l’écoulement de ciment liquide sur la pièce d’aluminium en L ou le long des barres d’oreilles rendra délicate la sortie de l’animal du cadre opératoire. Une fois le ciment complètement sec, les écrous supérieurs sont retirés, permettant ainsi l’éviction de la pièce d’aluminium.

Figure 3.1 Mise en place de

l’appareil de contention. Deux vis sont

placées sur la ligne médiane ligne (partie

supérieure). Deux vis dentaires ainsi

qu’une électrode indifférente sont ensuite

placées en arrière de la vis postérieure

(partie inférieure). L’ensemble est ensuite

solidarisé par du ciment de dentiste, puis

l’animal est retiré du cadre après

déplacement des écrous supérieurs.

3 Méthodes 3.I.a.4. Exposition du cervelet

Une injection de 0.2 ml de xylocaïne-adrénaline (Xylocaine®, Astra Zeneca, UK) est réalisée dans la profondeur des muscles de la nuque afin de compléter l’anesthésie générale par une analgésie locale, de tuméfier les muscles (ce qui facilite leur désinsertion) et de diminuer drastiquement les saignements per-opératoires inhérents à cette phase de l’intervention. L’insertion antérieure des muscles est ensuite sectionnée et la masse musculaire est rabattue en arrière, exposant ainsi la partie postérieure du crâne. La table osseuse est ensuite abrasée dans la quasi-totalité de sa profondeur par des mouvements latéraux de fraise dentaire. Les spicules osseux sont alors délicatement détachés à l’aide de la petite pince à griffe et de l’aiguille d’une seringue à tuberculine. Lors de cette dissection, il est indispensable de préserver la dure-mère, car celle-ci garantit une meilleure contention du tissu cérébelleux entre les enregistrements et une meilleure stabilité des électrodes. Une fois le cervelet exposé, celui-ci est couvert d’une pellicule de Bone Wax ® (Ethicon, Johnson &

Johnson, USA) et l’animal est extrait du cadre opératoire.

3.I.a.5. Mise en place des électrodes EMG (facultatif)

Lorsque l’étude des activités EMG est envisagée chez l’animal opéré (cf. stimulation des moustaches), une incision est pratiquée parallèlement à l’angle de la mâchoire à hauteur de la moustache et le muscle zygomaticus major est exposé. Cette étape se réalise avant la mise en place du ciment dentaire. L’électrode EMG bipolaire (acier galvanisé recouvert de téflon, 50 micromètres de diamètre) est insérée dans le muscle, celle-ci étant secondairement fixée au plan profond, puis passée à travers un tunnel sous cutané réalisé entre les deux incisions. L’électrode est ensuite solidarisée à l’appareil de contention lors de la mise en place du ciment dentaire.

3.I.a.6. Soins postopératoires

L’animal est placé en position ventrale sur une plaque radiante à 37 degrés. Le réveil

complet nécessite entre 2 et 4 heures, mais les enregistrements sont réalisés au moins 24

heures après l’intervention.

3 Méthodes

24 3.I.b. Enregistrements

Une fois complètement réveillée, la souris est installée pour l’enregistrement de son activité cérébelleuse. La souris est placée dans le corps aménagé d’une seringue de 50 ml, la queue fixée par une bande autocollante à la paroi de la seringue. Dans un deuxième temps, la seringue est placée dans une boite métallique ouverte dans sa partie antérieure, et une bande autocollante supplémentaire vient prévenir les mouvements extrusifs des pattes antérieures.

Une pièce d’aluminium en L, similaire à celle utilisée lors de la préparation chirurgicale, est fixée aux vis contentives par le truchement de deux écrous. Durant l’enregistrement, l’animal est donc immobilisé et non paralysé comme dans les premières études d’électrophysiologie in vivo sur les souris transgéniques (Grusser-Cornhels 1995).

3.I.b.1. Enregistrement par électrodes de verre

Les électrodes sont obtenues par étirement progressif d’un capillaire de verre et remplie avec du NaCl 2M. L’impédance est mesurée et les électrodes sont utilisées si celle-ci est comprise entre 1.5 et 5 megaohms. L’électrode est entourée par une couche de papier aluminium, puis descendue sous contrôle microscopique au moyen d’un micromanipulateur manuel. Les avantages de cette méthode résident dans son coût démocratique, sa facilité d’utilisation et le contrôle tactile du micromanipulateur qu’elle permet. Ses inconvénients tiennent dans le caractère traumatique lié à l’épaisseur progressivement croissante de l’électrode et dans l’encombrement stérique induit par une seule électrode, ce qui limite à deux le nombre potentiel d’enregistrements simultanés.

3.I.b.2. Enregistrement par système Eckhorn

Le système Eckhorn ® (Thomas Recording, Allemagne) (Eckhorn & Thomas 1993)

permet la micromanipulation indépendante de 7 microélectrodes de tungstène (diamètre 80

micromètres, pointe de 25 micromètres) séparées de 250 micromètres l’une de l’autre. La

figure 3.2 illustre une schématisation de cet appareil. Chaque microélectrode est solidarisée

dans sa partie médiane à un élastique dont l’extrémité inférieure est fixée à la base du tube

guide correspondant, et dont l’extrémité supérieure peut être mise sous tension grâce à une

petite poulie motorisée, propre à chaque électrode, sur laquelle vient s’enrouler un fil mis en

continuité avec la partie supérieure de l’élastique. En fonction du degré de relâchement ou