4. Activité spontanée de la cellule de Purkinje chez la souris normale éveillée 4 La cellule de Purkinje normale 4. Activité spontanée de la cellule de Purkinje chez la souris normale éveillée La cellule de Purkinje produit deux types de signaux bien distincts : Le spike simple et le spike complexe. La figure 4.1 illustre un enregistrement typique d’une cellule de Purkinje chez une souris normale éveillée. Le spike complexe peut aisément être discriminé des spikes simples, dans la décharge desquels il induit un silence, également appelé pause. Dans ce chapitre, nous envisagerons d’abord les caractéristiques de ces deux spikes pris isolément avant de décrire leurs différentes interactions. Figure 4.1 Enregistrement typique de la décharge spontanée d’une cellule de Purkinje sur une souris normale. Le spike complexe peut aisément être discriminé des spikes simples dans la décharge desquels il induit une pause. . 4.I. Le spike simple En l’absence de toute stimulation de l’animal, la cellule de Purkinje produit les spikes simples à une fréquence moyenne de 50 Hz, sous la forme d’un potentiel simple d’une durée d’environ 400 µs, et d’une amplitude d’environ 1 mV sur les meilleurs enregistrements in vivo. La fréquence moyenne de décharge des spikes simples peut cependant varier de 0 Hz à plus de 250 Hz (Lisberger & Fusch 1974) en fonction des entrées excitatrices (fibres parallèles) et inhibitrices (cellules en panier ou en étoile) de la cellule de Purkinje, mais également de son excitabilité intrinsèque. Le spike simple est généré au niveau du premier nœud de Ranvier (Clarck et al. 2005) suite à l’entrée rapide du cation sodium à travers les 4 La cellule de Purkinje normale 37 simples peut être qualifiée de tonique, quiescente (c’est-à-dire complètement absente) ou en bursting, c’est-à-dire en succession régulière de trains de durée relativement constante. La figure 4.2 illustre la transition réciproque de l’état tonique à l’état quiescent (A) et de l’état tonique à l’état de bursting (B). Un burst est illustré par la figure 4.2C. En dépit des variations importantes que peut présenter une même cellule de Purkinje dans la décharge de ses spikes simples au cours d’un enregistrement spontané, ou des alternances répétées entre ses périodes d’activité et de quiescence complète (Fig.4.2), la fréquence moyenne des spikes simples chez l’animal éveillé et non stimulé se situe aux alentours de 50 Hz dans les différentes espèces étudiées (Lisberger & Fusch 1974; Ghelarducci et al. 1975; Cheron et al. 1997; Schiffmann et al. 1999). Figure 4.2 (A) Alternance de périodes d’activité tonique et quiescente d’une cellule de Purkinje normale. (B) Transition de l’état de décharge tonique à celui de décharge en bursting. (C) Détail d’un burst de la cellule illustré en B. 4 La cellule de Purkinje normale Au contraire des enregistrements in vitro (Womack & Khodakhah, 2002) ou réalisés sur l’animal endormi (Schwarz & Welsh 2001; Servais & Cheron 2005), la décharge des spikes simples chez l’animal éveillé est typiquement arythmique. La figure 4.3 illustre un enregistrement typique d’une paire de cellules de Purkinje arythmiques et asynchrones (Fig. 4.3A), et l’autocorrélogramme de l’une des deux cellules (Fig. 4.3B), autocorrélogramme typique de la décharge spontanée d’une cellule de Purkinje chez une souris normale. Le pic central représente le nombre total de spikes pendant la durée de l’analyse, chaque spike étant ipso facto corrélé avec lui-même. Au-delà des deux premières vallées correspondant à l’intervalle de temps minimum entre deux spikes, l’autocorrélogramme est plat, ce qui signifie qu’aucune période de temps entre deux spikes ne prédomine pendant l’analyse. Nous verrons que ce caractère arythmique de la décharge des spikes simples est aboli dans de nombreux modèles de souris ataxiques. Figure 4.3 (A) Enregistrement typique d’une paire de cellules de Purkinje normales sur une souris contrôle, distance entre les électrodes = 250µm. (B) Autocorrélogramme de la cellule illustrée en A, tracé inférieur. (enregistrement de 120 secondes, largeur des catégories = 1ms). (C) Cross-corrélogramme de la cellule illustrée en A, tracé inférieur, déclenché par la cellule du tracé supérieur (même paramètre qu’en B). Chez l’animal normal éveillé, les cellules de Purkinje sont également largement asynchrones (Cheron et al. 2004). La figure 4.3C illustre le cross-corrélogramme de l’enregistrement simultané des deux cellules de Purkinje dont la décharge est illustrée à la 4 La cellule de Purkinje normale 39 4.II. Le spike complexe Le spike complexe est produite suite à l’activation glutamatergique de la cellule de Purkinje par une et une seule fibre grimpante au niveau de leurs nombreux contacts synaptiques (~1500), ce qui constitue un contact cellulaire extrêmement dense et étroit, non seulement du point de vue morphologique, mais également du point de vue fonctionnel. Ainsi, la décharge d’un potentiel d’action dans la fibre est toujours suivi d’un spike complexe (intervalle de sécurité élevé) (Eccles et al. 1966a). La fréquence de décharge des spikes complexes se situe entre 0.5 et 1 Hz (Lang et al. 1999; Schiffmann et al. 1999). Les spikes complexes d’une même cellule présente une rythmicité dont la fréquence est aux alentours de 10 Hz (Lang et al. 1999). Cependant, compte tenu de la faible fréquence de décharge des spikes complexes, des enregistrements extrêmement longs sont requis pour mettre en évidence cette rythmicité. Les spikes complexes des cellules situées dans l’axe antéro-postérieur présentent un certain degré de synchronie dont sont dépourvues les spikes complexes des cellules situées dans l’axe des fibres parallèles (Lang et al. 1999). Figure 4.4 (A) Spikes complexes d’une même cellule de Purkinje normale survenant en période quiescente. (B,C) idem. 4 La cellule de Purkinje normale L’enregistrement extracellulaire des spikes complexes montre un potentiel rapide, biphasique, (négatif puis positif), d’une durée d’environ 500ms, suivi d’un nombre variable de potentiels plus lents d’amplitude décroissante, la durée de l’ensemble variant entre 8 et 15 ms. Nous appellerons spikes secondaires ces potentiels plus lents. Seule une partie des spikes secondaires sont transmis dans l’axone des cellules de Purkinje vers les noyaux cérébelleux profonds (Khaliq & Raman 2005; Monsivais et al. 2005). La forme du spike complexe d’une même cellule est assez constante au cours d’un enregistrement, une légère variabilité pouvant être observée dans la partie terminale du spike. La figure 4.4 illustre cette légère variabilité dans la forme du spike complexe au cours d’un même enregistrement (3 cellules illustrées, A-C). Il semblait acquis que la partie initiale, rapide du spike complexe soit associée à une entrée rapide de sodium au niveau du soma suite à l’ouverture de canaux sodiques dépendant du voltage, tandis que les potentiels plus lents correspondraient à une entrée calcique au niveau dendritique, consécutive à l’entrée de calcium via des canaux calciques dépendants du voltage (Llinas & Sugimori 1980a et b). Cette conception classique de la composition ionique du spike complexe a cependant été récemment remise en cause, du moins en ce qui concerne les dépolarisations secondaires (Callaway & Ross 1997). De fait, la question, au demeurant essentielle, de la nature ionique des dépolarisations secondaires du spike complexe est actuellement en suspens (pour une revue, lire Schmoleski et al. 2002). Néanmoins, et quelles qu’en soient ses conséquences au niveau de l’enregistrement électrophysiologique, il est certain que le spike complexe s’accompagne d’une entrée massive de calcium dans la cellule (Callaway et al. 1995) et que cette entrée de calcium est capitale pour un certain nombre de mécanismes de régulation qui sont dépendants de ce cation, telle la dépression à long terme (LTD) de la synapse fibre parallèle-cellule de Purkinje (Ito 1989), la facilitation de la fonction des récepteurs GABA (Kano et al. 1992) ou l’activation des canaux potassiques dépendants du calcium (Sausbier et al. 2004). Ce rôle ubiquitaire de la variation de concentration calcique dans la cellule de Purkinje amène immanquablement à penser que la modulation de la variation de concentration intracytoplasmique en calcium ionisé lors du spike complexe constitue un mécanisme clef de la régulation de la décharge des cellules de Purkinje. En effet, au moins deux mécanismes différents de plasticité synaptique modulent l’entrée de calcium lors du spike complexe : l’inhibition de la cellule de Purkinje par les interneurones (Callaway 4 La cellule de Purkinje normale 41 4.III. Interactions entre les spikes simples et complexes 4.III.a. Régulation de la fréquence de décharge des spikes simples par les spikes complexes La décharge d’un spike complexe est suivie par un silence des spikes simples, silence dont la durée moyenne est de 20 ms (Sato et al. 1992) (Fig. 4.1). La cause de ce silence est à rechercher soit dans l’entrée massive de Ca++ lors du spike complexe ou dans une activation par la fibre grimpante des cellules de Golgi et des cellules en panier qui inhibent respectivement les cellules granulaires et les cellules de Purkinje. Suite à ce silence, le rythme de décharge des spikes simples est augmenté dans 71 % , inchangé dans 25 % et diminué dans 4% des cas (Sato et al. 1992). L’entrée de calcium se produisant pendant le spike complexe va contribuer à ralentir à plus long terme la fréquence de décharge des spikes simples. En effet, comme nous l’avons signalé plus haut, cette entrée de calcium est indispensable au fonctionnement de deux processus inhibiteurs, la LTD de la synapse fibre parallèle-cellule de Purkinje (Ito 1989) et la facilitation de la fonction des récepteurs GABA (Kano et al. 1992). L’existence de ces deux mécanismes constitue l’explication communément admise pour comprendre l’augmentation importante de la fréquence des spikes simples lors de la destruction (Colin et al. 1980) ou de l’inactivation (Montarolo et al. 1982; Cerminara & Rawson 2004) de l’olive bulbaire. Miall et al. (1998) et Kenyon et al. (1998) ont également proposé que la décharge de base en spike complexe soit bien plus qu’un bruit de fond, et constitue via l’entrée de calcium qu’elle implique une condition indispensable pour conserver une fréquence de spikes simples dans les limites physiologiques. En effet, en l’absence de stimulation par la fibre grimpante, l’entrée parallèle induit une potentiation à long terme (LTP). Par contre, lors de l’activation concomitante de la fibre parallèle et de la fibre grimpante, c’est une LTD qui se produit. Miall et al. (1998) et Kenyon et al. (1998) ont ainsi proposé que la finalité de la décharge au repos des fibres grimpantes soit d’éviter l’induction d’une LTP de la synapse fibre parallèle-cellule de Purkinje, et donc l’emballement des cellules de Purkinje. Nous verrons au cours de ce travail comment nos expériences s’intègrent dans cette hypothèse. 4 La cellule de Purkinje normale 4.III.b. Régulations de la rythmicité des spikes simples par les spikes complexes Schwartz et Welsh (2001) ont montré que la stimulation du cortex moteur (zone TM1) entraînait dans les 200 ms l’apparition d’une rythmicité et d’une synchronie dans la décharge des spikes complexes. Au contraire, les spikes simples présentent une rythmicité augmentée dans les 80 ms qui suivent la stimulation, rythmicité rapidement abolie lors de l’apparition de la synchronie des spikes complexes. L’abolition de la rythmicité des spikes simples dans les 50 ms qui suivent la survenue d’un spike complexe, soit dans la cellule étudiée, soit dans une cellule voisine a amené ces auteurs à suggérer que la rythmicité des spikes simples étaient dynamiquement contrôlée par la synchronie des spikes complexes. Sur une préparation de rat anesthésiés au pentobarbital, Cerminara & Rawson (2004) ont montré qu’une disparition des spikes complexes engendrée par microlésion de l’olive inférieure causait une augmentation importante de la régularité des spikes simples. Ces résultats ont malheureusement été acquis sur des rats anesthésiés à la kétamine ou au pentobarbital. Nous verrons dans la suite de ce travail que ces deux substances modifient profondément la rythmicité et la synchronie des cellules de Purkinje. 4.III.c. Régulation de la fréquence de décharge des spikes complexes par les spikes simples Les noyaux cérébelleux profonds se projettent sur l’olive bulbaire dont ils inhibent les neurones. Dés lors, la destruction des fibres cérébello-olivaires engendre une augmentation de la décharge des spikes complexes (Bengtsson et al. 2004). Il est dés lors probable qu’une diminution de fréquence des spikes simples, en diminuant l’inhibition des noyaux cérébelleux profonds, engendre une diminution de l’activité olivaire et dés lors une diminution de la fréquence de décharge des spikes complexes. Ceci a amené Miall et al. (1998) a testé l’hypothèse selon laquelle l’augmentation de la fréquence de décharge des spikes simples puisse, au repos, prédire la survenue d’un spike complexe. Ces auteurs rapportent ainsi l’augmentation légère, mais significative de la fréquence de décharge des spikes simples 4 La cellule de Purkinje normale 43 l’inhibition des noyaux cérébelleux profonds et par conséquent une diminution de l’inhibition des noyaux olivaires. Figure 4.5 Simple spike activity time locked to complex spikes. (a) This record is the mean response of 9 blocks of trials from one cell. Each block (6-65 trials per block, median 13) was averaged, and the averaged values used for statistical testing. For display purposes only, the average data from the 9 blocks have been averaged together, and smoothed with a 20 ms box-car filter. Also for display only an artifact at t=0 has been removed before smoothing; this was due to the simple spike detector being triggered by the complex spike. Horizontal bars indicate the pair of intervals with the most significant increase in SS activity preceding the CS ; the area within the dashed box has been enlarged in the gray inset. (b) Averaged data from a group of 10 different Purkinje cells, in the same format (29-72 trials per cell, median 45) Reproduit de Miall et al, 1998. Nous n’avons pas pu confirmer cette observation en étudiant le comportement in vivo des cellules de Purkinje changeant de mode de décharge (Servais et al. 2004). Nous avons en effet sélectionné dans nos enregistrements réalisés sur souris normales C57Bl6J les cellules de Purkinje présentant un ou plusieurs passages du mode tonique au mode quiescent. Les critères d’inclusion pour cette recherche étaient d’observer sur une cellule de Purkinje en mode tonique un arrêt total de la décharge des spikes simples pendant plus de 10 secondes (avec conservation de la décharge des spikes complexes) puis une reprise de la décharge des spikes simples à la même amplitude et à une fréquence égale ou supérieure à 30 Hz. Seules les cellules de Purkinje dont l’amplitude du spike simple n’avait pas varié au cours de l’enregistrement furent donc analysées. Cette procédure a été adoptée afin que la disparition des spikes simples ne puisse être attribuée à un déplacement de l’électrode, et pour assurer 4 La cellule de Purkinje normale que l’ensemble de l’enregistrement a bien eu lieu en somatique, puisque les spikes simples ne remontent pas dans l’arbre dendritique de la cellule de Purkinje (Vetter et al. 2001). Quatorze cellules de Purkinje (enregistrées chez 6 souris) remplissaient ces critères et furent analysées. Aucune différence significative dans la fréquence des spikes complexes ne put être mise en évidence entre les périodes de décharge tonique et de décharge quiescente des spikes simples (0.51 ± 0.03 Hz et 0.49 ± 0.02 Hz, Test t de Student pour échantillon pairés). Ces résultats semblent en contradiction avec ceux rapportés par Miall et al. (1998). En effet, alors que selon ces auteurs, une augmentation de ~10 % de la fréquence de décharge des spikes simples pendant une période de 50 ms suffirait à prédire la survenue d’un spike complexe, nous n’avons pas observé la moindre diminution de la décharge des spikes complexes pendant l’arrêt total des spikes simples, arrêt pouvant durer plusieurs dizaines de secondes. Différents éléments peuvent expliquer cette contradiction. D’abord, les résultats de Miall et al. (1998) furent acquis sur des singes entre deux sessions expérimentales, et donc en état d’attente. A l’opposé, nos résultats concernent des souris en l’absence de toute stimulation expérimentale passée ou à venir. Cependant, la question fondamentale de savoir si la décharge en spikes complexes, et donc l’activité olivaire qu’elle reflète, est modulée par la décharge en spikes simples reste la même dans les deux paradigmes expérimentaux. Nous pensons que trois problèmes méthodologiques limitent l’interprétation des résultats de Miall et al. (1998) et doivent sérieusement tempérer l’hypothèse selon laquelle une augmentation de la fréquence des spikes simples pourrait prédire la décharge d’un spike complexe. Premièrement, les intervalles de 50 ms utilisés par Miall et al. pour comparer les fréquences de décharge sont pris différemment selon les cellules (pour certaines 100-150 ms avant le spike complexe, pour d’autres 150-200 ms). Compte tenu de la variabilité de décharge des cellules, il semble évident qu’en cherchant bien, même aux alentours de 150 ms avant un spike complexe, on puisse toujours trouver un intervalle pour lequel la fréquence est significativement plus haute ou plus basse que 225 ms plus tôt. Ensuite, durant un intervalle de 50 ms, on peut raisonnablement espérer qu’une cellule qui décharge à 50 Hz produira 2 ou 3 spikes. C’est évidemment très peu pour calculer une fréquence, et le chiffre obtenu variera de 30 à 50 % selon qu’une troisième ou une quatrième spike soit juste en dedans ou juste en dehors de l’intervalle. Cette notion d’augmentation de fréquence ne peut donc être comprise que dans un sens statistique, c’est-à-dire lors de la sommation de nombreux évènements. Or, 4 La cellule de Purkinje normale 45 celle supposée suffisante pour engendrer un spike complexe sont ubiquitaires. Autant dire que sur des tracés non moyennés, c’est à dire représentant la décharge réelle de la cellule, ces augmentations de fréquence des spikes simples sont si courantes que les spikes complexes devraient survenir au moins plusieurs fois par seconde, ce qui n’est pas le cas. Une explication plausible des résultats de Miall et al. résiderait plutôt dans la rythmicité intrinsèque (à 10 Hz) des spikes complexes, qui amènerait à considérer la période –150 ms pré-spike complexe à la période 50 ms post avant-dernière spike complexe, période pendant laquelle 70 % des cellules présentent une augmentation de décharge des spikes simples. Conscients du problème, Miall et al. ont exclu de l’analyse toute spike complexe survenant dans les 500 ms après une autre spike complexe. Cette précaution est cependant insuffisante. En effet, l’étude de Schwartz et Welsh (2001) parue deux années plus tard, a montré que la survenue d’un spike complexe dans une cellule voisine présentant une synchronie des spikes complexes avec la cellule étudiée était suffisante pour moduler la fréquence et la rythmicité des spikes simples de la cellule étudiée, même en l’absence de décharge en spike complexe de cette dernière. Ces différents éléments nous amènent à penser que l’hypothèse selon laquelle l’augmentation de décharge en spikes simples pourrait prédire la survenue d’un spike complexe ne repose pas sur des arguments expérimentaux. Ceci n’exclut cependant pas l’hypothèse selon laquelle une décharge chroniquement basse des spikes simples puisse entraîner une diminution de la fréquence des spikes complexes, comme l’ont suggéré les expériences de destruction du faisceau cérébello-olivaire (Bengtsson et al. 2004) ou, comme nous le verrons dans ce travail, l’étude des souris SCA type 1, des souris consommant chroniquement de l’éthanol et des souris BK-/-. 4.III.d. Régulation de la forme du spike complexe par le spike complexe précédent Compte tenu de l’origine supposée calcique des potentiels lents du spike complexe et du rôle majeur de cet ion dans la régulation de l’excitabilité cellulaire, l’intérêt des auteurs pour la forme du spike complexe s’est manifesté très tôt. Ainsi, en 1966, Eccles suggérait déjà que le nombre de potentiels secondaires du spike complexe constituait un témoin de l’excitabilité de la cellule de Purkinje (Eccles et al. 1966b). En 1986, Campbell et Hesslow ont montré chez le chat anesthésié que lorsqu’un spike complexe obtenue par stimulation de l’olive bulbaire suivait de moins de 100ms une autre spike complexe, l’amplitude et le nombre 4 La cellule de Purkinje normale des potentiels secondaires étaient augmentés (interprété comme une « paired pulse facilitation» (PPF)) (Campbell & Hesslow 1986). Par la suite, les études en patch clamp ont montré que la synapse fibre grimpante-cellule de Purkinje présentait une plasticité à court terme de type « paired pulse depression » (PPD), ce qui signifie que les potentiels excitateurs post synaptiques sont diminués lors de la deuxième stimulation d’une stimulation pairée. En 1998, Hashimoto et Kano ont démontré la nature postsynaptique de ce phénomène, et sa traduction en current clamp, a savoir une dépression de la post dépolarisation et une diminution du nombre de potentiels secondaires, et ce, pour des intervalles de stimulation pouvant atteindre 500 ms (Hashimoto & Kano 1998). Les observations de Campbell et Dans le document Etude électrophysiologique de la cellule de Purkinje et du potentiel de champ local chez la souris éveillée, en conditions normales et pathologiques. (Page 51-73)
