19 2. Hypothèses et objectifs de travail De la tortue au singe en passant par le rat, le cochon d’Inde, le lapin, le chat et le pigeon, de nombreux animaux ont servi de modèles expérimentaux aux électrophysiologistes pour une meilleure compréhension du cervelet. Pour d’évidentes raisons de miniaturisation du matériel qu’elle nécéssite, la souris a historiquement beaucoup moins contribué à l’étude in vivo du fonctionnement cérébelleux. L’avènement de la biologie moléculaire et la création d’animaux génétiquement modifiés ainsi que le perfectionnement des techniques d’enregistrement et de miniaturisation ont permis à la souris d’occuper progressivement une place de choix dans l’animalerie de l’électrophysiologiste. L’étude des souris mutantes déficientes en telle ou telle protéine, parfois même un niveau d’un seul type cellulaire présente en effet une opportunité exceptionnelle de mieux comprendre le fonctionnement et les dysfonctionnements du cortex cérébelleux. Cette compréhension passe ipso facto par l’étude de l’animal dans les conditions les plus physiologiques qui soient, c’est-à-dire vivant, éveillé, et idéalement, libre de ses mouvements. Au cours de ce travail, nous rapporterons les résultats d’enregistrements simples ou multiples des cellules de Purkinje et de Golgi et du potentiel de champ local chez la souris éveillée. Ces enregistrements se réalisent soit au repos, soit lors d’imprégnations pharmacologiques locales ou générales, soit encore lors de la stimulation tactile de l’animal. Nous étudierons donc le fonctionnement du cortex cérébelleux via l’enregistrement de sa seule sortie, c’est-à-dire la cellule de Purkinje, mais également via l’évaluation de la coordination motrice et de l’apprentissage moteur qu’il peut engendrer. Si ces deux approches, électrophysiologique et comportementale, peuvent être effectuées sur les mêmes animaux, leur réalisation simultanée en est toujours au stade de mise au point. Nous verrons à la fin de cette thèse les développements en cours pour lever cette dernière restriction. Nous exposerons les résultats obtenus sur des souris normales, mais également sur différents modèles de pathologies cérébelleuses, modèles définis par l’absence d’une protéine spécifique ou par la ressemblance voulue avec une pathologie humaine. En effet, l’hypothèse générale qui sous-tend la réalisation de ce travail est que la décharge spontanée de la cellule de Purkinje constitue le reflet de l’activité intrinsèque de la cellule pondérée par l’intégration 2 Hypothèses et objectifs de travail.. des différentes entrées excitatrices et inhibitrices, activité sur laquelle se construira la réponse de la cellule de Purkinje à un besoin d’adaptation exigé par un comportement moteur. Cette réponse de la cellule de Purkinje constitue le produit final de l’intégration par le cortex cérébelleux d’une entrée sensori-motrice. Dans notre hypothèse, le déséquilibre induit par une mutation génétique ou une agression toxique dans la régulation de la décharge des cellules de Purkinje est susceptible de se traduire dans la décharge spontanée de la cellule, et ce, tant dans la fréquence de décharge que dans la rythmicité ou la régularité de celle-ci. L’étude de plusieurs modèles pathologiques ne réside pas dans la constitution d’un catalogue plus ou moins exhaustif associant déficit génétique ou agression toxique à telle ou telle anomalie, de toute façon le plus souvent aspécifique, de la décharge des cellules de Purkinje. Outre l’intérêt de mieux comprendre la physiopathologie de différentes conditions impliquant le cervelet, étudier les conséquences en terme de fonctionnement et d’efficacité du cortex cérébelleux dans différentes conditions pathologiques l’affectant réside dans la possibilité d’identifier différents patterns de fonctionnement associés à différents degrés d’ataxie. En effet, nous savons que les troubles de la coordination motrice observés dans les différents modèles de souris mutantes vont de la discrète altération des performances mesurées par certains tests bien précis à l’ataxie sévère évidente à l’œil nu lors de la simple observation de l’animal déambulant dans sa cage. Au cours de ce travail, nous décrirons dans un premier temps la décharge au repos de la cellule de Purkinje normale, et nous verrons par la suite comment s’en écartent celles de trois groupes de souris, à savoir les souris déficientes en protéines fixant le calcium, les souris chroniquement exposées à l’éthanol et les souris déficientes en canaux BK. Nous verrons que différents patterns de décharge des cellules de Purkinje peuvent être associés à différents degrés d’ataxie chez les animaux qui les présentent, et que cette possibilité de regroupement va au-delà de l’origine génétique ou toxique du dysfonctionnement cérébelleux. Nous identifierons ainsi trois patterns de décharge des cellules. Le premier, associé à des ataxies modérées, est caractérisé par la décharge rapide, rythmique et synchrone des cellules de Purkinje, causant l’apparition d’une oscillation rapide (~160 Hz) qui elle-même contribue à la synchronisation des cellules. Le deuxième, associé à des troubles très discrets de la coordination motrice, est défini par une décharge lente mais toujours arythmique des cellules de Purkinje. Le troisième, retrouvé uniquement chez la souris BK-/- sévèrement ataxique, est caractérisé par la décharge lente mais ultra rythmique de . 3 Méthodes 3.Méthodes 3.I. Enregistrements électrophysiologiques La technique d’enregistrement des cellules de Purkinje, de Golgi, et du potentiel de champ local sur souris éveillées se décompose en deux étapes distinctes: la préparation de l’animal et l’enregistrement proprement dit. 3.I.a. Préparation de l’animal. Cette étape est très stéréotypée et s’effectue selon le même protocole quelle que soit la méthode d’enregistrement subséquente (système Eckhorn ou microélectrodes de verre, cf. infra). 3.I.a.1. Anesthésie La souris est tout d’abord endormie au moyen d’une injection intrapéritonéale unique (seringue 1ml à tuberculine) de kétamine (Kétalar®, Pfizer, dilution 1/10 avec du sérum physiologique) 100mg/kg et de xylido-dihydrothiazine (Rompun®, Bayer, dilution 1/5 avec du sérum physiologique) 10 mg/kg. Ce type d’anesthésie permet une analgésie complète tout en conservant une respiration spontanée de l’animal. Les conditions d’analgésie sont vérifiées 15 minutes après l’injection (absence complète de réactions à la stimulation douloureuse par pincement de la queue) et régulièrement au cours de l’intervention. Si les conditions d’analgésie devaient s’avérer insuffisantes, une dose supplémentaire de 30 mg/kg de kétamine est alors administrée. 3 Méthodes 22 l’incision permet l’insertion des barres d’oreille. Une fois la fixation du museau réalisée, l’animal est ainsi placé en position opératoire dans un cadre stéréotaxique. 3.I.a.3. Mise en place de l’appareil de contention Deux vis distantes de 1 cm sont déposées tête en bas sur la ligne médiane du crâne. Au moyen de deux écrous, les deux vis sont solidarisées chacune à la partie horizontale et percée d’une pièce d’aluminium en L déplacée grâce à un micromanipulateur (Fig 3.1, partie supérieure). Deux vis dentaires (taille 5) sont alors insérées dans le crâne 5 mm en arrière et latéralement de la tête de la vis postérieure. L’électrode indifférente réalisée par la torsion d’un fil d’argent est ensuite mise en place par perforation de la partie postérieure de l’os pariétal, à proximité de la vis dentaire droite (Fig 3.1, partie inférieure). L’ensemble est ensuite solidarisé par du ciment dentaire. Cette étape peut s’avérer délicate, car l’écoulement de ciment liquide sur la pièce d’aluminium en L ou le long des barres d’oreilles rendra délicate la sortie de l’animal du cadre opératoire. Une fois le ciment complètement sec, les écrous supérieurs sont retirés, permettant ainsi l’éviction de la pièce d’aluminium. Figure 3.1 Mise en place de l’appareil de contention. Deux vis sont placées sur la ligne médiane ligne (partie supérieure). Deux vis dentaires ainsi qu’une électrode indifférente sont ensuite placées en arrière de la vis postérieure (partie inférieure). L’ensemble est ensuite solidarisé par du ciment de dentiste, puis l’animal est retiré du cadre après déplacement des écrous supérieurs. 3 Méthodes 3.I.a.4. Exposition du cervelet Une injection de 0.2 ml de xylocaïne-adrénaline (Xylocaine®, Astra Zeneca, UK) est réalisée dans la profondeur des muscles de la nuque afin de compléter l’anesthésie générale par une analgésie locale, de tuméfier les muscles (ce qui facilite leur désinsertion) et de diminuer drastiquement les saignements per-opératoires inhérents à cette phase de l’intervention. L’insertion antérieure des muscles est ensuite sectionnée et la masse musculaire est rabattue en arrière, exposant ainsi la partie postérieure du crâne. La table osseuse est ensuite abrasée dans la quasi-totalité de sa profondeur par des mouvements latéraux de fraise dentaire. Les spicules osseux sont alors délicatement détachés à l’aide de la petite pince à griffe et de l’aiguille d’une seringue à tuberculine. Lors de cette dissection, il est indispensable de préserver la dure-mère, car celle-ci garantit une meilleure contention du tissu cérébelleux entre les enregistrements et une meilleure stabilité des électrodes. Une fois le cervelet exposé, celui-ci est couvert d’une pellicule de Bone Wax ® (Ethicon, Johnson & Johnson, USA) et l’animal est extrait du cadre opératoire. 3.I.a.5. Mise en place des électrodes EMG (facultatif) Lorsque l’étude des activités EMG est envisagée chez l’animal opéré (cf. stimulation des moustaches), une incision est pratiquée parallèlement à l’angle de la mâchoire à hauteur de la moustache et le muscle zygomaticus major est exposé. Cette étape se réalise avant la mise en place du ciment dentaire. L’électrode EMG bipolaire (acier galvanisé recouvert de téflon, 50 micromètres de diamètre) est insérée dans le muscle, celle-ci étant secondairement fixée au plan profond, puis passée à travers un tunnel sous cutané réalisé entre les deux incisions. L’électrode est ensuite solidarisée à l’appareil de contention lors de la mise en place du ciment dentaire. 3.I.a.6. Soins postopératoires L’animal est placé en position ventrale sur une plaque radiante à 37 degrés. Le réveil complet nécessite entre 2 et 4 heures, mais les enregistrements sont réalisés au moins 24 heures après l’intervention. 3 Méthodes 24 3.I.b. Enregistrements Une fois complètement réveillée, la souris est installée pour l’enregistrement de son activité cérébelleuse. La souris est placée dans le corps aménagé d’une seringue de 50 ml, la queue fixée par une bande autocollante à la paroi de la seringue. Dans un deuxième temps, la seringue est placée dans une boite métallique ouverte dans sa partie antérieure, et une bande autocollante supplémentaire vient prévenir les mouvements extrusifs des pattes antérieures. Une pièce d’aluminium en L, similaire à celle utilisée lors de la préparation chirurgicale, est fixée aux vis contentives par le truchement de deux écrous. Durant l’enregistrement, l’animal est donc immobilisé et non paralysé comme dans les premières études d’électrophysiologie in vivo sur les souris transgéniques (Grusser-Cornhels 1995). 3.I.b.1. Enregistrement par électrodes de verre Les électrodes sont obtenues par étirement progressif d’un capillaire de verre et remplie avec du NaCl 2M. L’impédance est mesurée et les électrodes sont utilisées si celle-ci est comprise entre 1.5 et 5 megaohms. L’électrode est entourée par une couche de papier aluminium, puis descendue sous contrôle microscopique au moyen d’un micromanipulateur manuel. Les avantages de cette méthode résident dans son coût démocratique, sa facilité d’utilisation et le contrôle tactile du micromanipulateur qu’elle permet. Ses inconvénients tiennent dans le caractère traumatique lié à l’épaisseur progressivement croissante de l’électrode et dans l’encombrement stérique induit par une seule électrode, ce qui limite à deux le nombre potentiel d’enregistrements simultanés. 3.I.b.2. Enregistrement par système Eckhorn Le système Eckhorn ® (Thomas Recording, Allemagne) (Eckhorn & Thomas 1993) permet la micromanipulation indépendante de 7 microélectrodes de tungstène (diamètre 80 micromètres, pointe de 25 micromètres) séparées de 250 micromètres l’une de l’autre. La figure 3.2 illustre une schématisation de cet appareil. Chaque microélectrode est solidarisée dans sa partie médiane à un élastique dont l’extrémité inférieure est fixée à la base du tube guide correspondant, et dont l’extrémité supérieure peut être mise sous tension grâce à une petite poulie motorisée, propre à chaque électrode, sur laquelle vient s’enrouler un fil mis en continuité avec la partie supérieure de l’élastique. En fonction du degré de relâchement ou 3 Méthodes d’étirement de l’élastique, l’électrode peut coulisser dans son tube guide, à la vitesse et à la profondeur déterminée par l’examinateur. Figure 3.2 Représentation schématique du système « Eckhorn » en coupe longitudinale. Seule l’électrode 3 est représentée entièrement. L’avantage majeur de cette technique réside dans la possibilité d’enregistrer simultanément dans un axe déterminé et à des profondeurs connues sept activités indépendantes. Outre sa grande fragilité qui requière une expertise certaine pour sa mise en place, son utilisation et son entretien, le système Eckhorn a pour principal défaut d’être excessivement onéreux à l’achat et à l’utilisation. En effet, le coût de l’appareillage global est de 30000 euros et chaque électrode revient à 65 euros. Les problèmes technico-pratiques mettant en danger le précieux matériel sont cependant nombreux. La mise en place des 7 électrodes se traduit régulièrement par la perte de 1 à 3 électrodes qui se brisent lors de l’installation, les tubes guides se bouchent régulièrement (débris organiques et électrodes cassées), leur nettoyage étant parfois impossible mais toujours délicat, la micromanipulation 3 Méthodes 26 3.II. Analyse du signal Le signal enregistré est visualisé en continu sur oscilloscope après amplification de 1000 et filtrage entre 0.01 à 10 KHz. Les passages significatifs sont stockés sur bandes audio digitale 4 mm. Ensuite, ils seront transférés sur PC, et traités par le programme Spike 2 (CED ®, Cambridge, UK) après digitalisation à 10 KHz. 3.II.a. Analyse des cellules de Purkinje Une cellule de Purkinje est reconnue comme telle si et seulement si elle présente deux patterns de signaux stéréotypés distincts: le spike simple et le spike complexe. Le spike simple présente une amplitude de 0.5 à 1 mV et une durée variant de 200 à 500 microsecondes. Sa fréquence moyenne spontanée est de 50 Hz, mais la fréquence de décharge peut varier en raison du contexte fonctionnel entre 0 et 250 Hz. Le spike complexe est un signal plus long, d’une durée de 8 à 15 ms, composé d’un potentiel rapide initial de type négatif-positif, ou positif-négatif-positif, d’une durée de 350 à 700 microsecondes et d’une amplitude de 0.5 à 1mV, suivi de potentiels plus lents et d’amplitude plus faible. La fréquence de décharge des spikes complexes varie entre 0.2 et 2 Hz. Pour pouvoir affirmer avec certitude que ces deux signaux sont émis par la même cellule, il faut que le spike complexe induise un silence (durée moyenne de 20 ms, intervalle de 10 à 40 ms) dans la décharge des spikes simples. Les chiffres donnés dans ce paragraphe se rapportent à une souris normale au repos. Nous verrons que certaines mutations génétiques ou certaines interventions chez un même animal peuvent considérablement les modifier. Pour une même cellule de Purkinje, nous analyserons la durée, l’amplitude, la fréquence, la régularité et la rythmicité des spikes simples, la fréquence et la durée des spikes complexes, ainsi que le silence induit par les spikes complexes dans la décharge des spikes simples, et que nous appellerons silence des spikes complexes. En cas d’enregistrements multiples, nous analyserons la synchronie des cellules et leur relation avec la phase d’une éventuelle oscillation concomitante. 3.II.a.1. Amplitude et durée des spikes simples Elle se mesure sur la trace moyennée de 50 spikes simples. Ces paramètres seront assez peu utilisés, dans la mesure ou l’amplitude du spike simple est amplement dépendante 3 Méthodes de la distance entre l’électrode et la cellule, et que la durée du spike dépend des conditions de filtrage et à conditions égales, est largement semblable d’un type de souris à l’autre. 3.II.a.2. Fréquence Sauf mention contraire, nous entendrons par fréquence la fréquence moyenne du spike simple durant la totalité de l’enregistrement analysé. 3.II.a.3. Régularité La régularité est évaluée par le coefficient de variation (CV), défini par le quotient de la déviation standard de la série des périodes interspikes et de leur moyenne. 3.II.a.4. Rythmicité La rythmicité des spikes simples est mesurée au moyen d’un indice de rythmicité (Sugihara et al. 1995) calculé sur un autocorrélogramme réalisé sur un enregistrement de minimum 5000 spikes (largeur de 1.250 s, échantillonnage temporel d’une ms). Un exemple d’autocorrélogramme et des paramètres utilisés pour calculer l’indice de rythmicité est illustré par la figure 3.3. Figure 3.3 Représentation d’un autocorrélogramme sur lequel sont mesurés les paramètres nécessaires au calcul de l’indice de rythmicité. L’inverse de t définit la fréquence de rythmicité. 3 Méthodes 28 significatifs s’ils sont exclus de l’intervalle « ligne de base ± 2 déviation standard ». La ligne de base est définie comme le quotient du produit du carré du pic central et de la largeur de l’échantillonnage temporel divisé par la durée de l’enregistrement. La déviation standard par rapport à la ligne de base est évaluée sur la partie marginale de l’autocorrélogramme (entre 1 et 1.250 s). La fréquence de rythmicité est calculée comme l’inverse de la période entre deux pics de l’autocorrélogramme, en utilisant pour plus de précision, sauf mention contraire, un échantillonnage temporel de 0.2 ms dans a construction de l’autocorrélogramme. 3.II.a.5. Durée des spikes complexes Sauf mention contraire, la durée des spikes complexes sera mesurée sur le tracé moyenné des spikes complexes de l’enregistrement analysé. La durée est définie comme la période entre la première dépolarisation et le dernier spike secondaire. Les spikes secondaires sont comptés jusqu’à ce que leur amplitude soit inclue dans l’intervalle « ligne de base ± 1 déviation standard ». La déviation standard est évaluée sur la période [15-5] ms précédent la première dépolarisation du spike complexe. 3.II.a.6. Silence des spikes complexes Sauf mention contraire, la durée du silence des spikes complexes sera définie comme l’intervalle entre le début du spike complexe (sommet de la première déflexion négative) et le début du premier spike simple sur un enregistrement comportant au moins dix spikes complexes. Le silence se rapporte donc au silence le plus court enregistré et non à la moyenne des silences. 3.II.a.7. Forme des spikes complexes A partir du sommet de la première déflexion négative, les coordonnées dans le temps et en voltage des 5 sommets suivants sont mesurées et encodées, de sorte que tant la partie initiale que tardive du spike complexe puissent être décrites (Figure 3.4). Les sommets ultérieurs ne sont pas mesurés à cause de la trop grande variabilité interspike pour une même cellule de Purkinje. La forme peut être mesurée soit sur un enregistrement moyenné, soit, le plus souvent, sur des spikes individuels. 3 Méthodes Figure 3.4 Technique de mesure de la forme d’un spike complexe. La valeur en mV du premier pic négatif (correspondant à la première dépolarisation) est notée. Le sommet de c pic servira de référence pour la mesure des coordonnées en temps et en voltage des trois pics repolarisants (R1,R2,R3) et des deux pics dépolarisants (D2,D3) subséquents. 3.II.a.8. Index de synchronie Celui-ci se définit comme le quotient de la différence de l’amplitude du pic central du crosscorrélogramme et de sa ligne de base par le nombre total de spikes de la cellule dont la fréquence est portée en ordonnée. 3.II.a.9. Rapport à la phase Le tracé moyenné d’une cellule ou le tracé moyenné d’un enregistrement simultané du potentiel de champ en utilisant comme déclencheur la décharge de la cellule étudiée (en spike simple ou en spike complexe) peut mettre évidence une oscillation. La cellule sera alors dite en phase avec l’oscillation, et son rapport à la phase sera défini par l’occurrence de sa première déflexion négative. 3.II.b. Analyse du potentiel de champ local 3 Méthodes 30 ensuite divisée par l’aire sous la courbe de la fonction transformée de Fourier, ce qui définit l’indice d’oscillation. La fonction de cross-corrélation utilisée pour évaluer le déphasage et la corrélation entre deux signaux (α1, α2) pendant une fenêtre de temps T est la suivante dt t t T CCF ( ) 1 T( () 1)( 2( ) 2) 0 1 2 1 , 2 1α τ σσ α µ α τ µ α = ∫ − + − µi et σi sont la valeur moyenne et la variance de αi et τ est le déphasage entre les deux fonctions. 3.III. Techniques annexes en électrophysiologie Dans le document Etude électrophysiologique de la cellule de Purkinje et du potentiel de champ local chez la souris éveillée, en conditions normales et pathologiques. (Page 33-51)
