5. Activité spontanée des cellules de Purkinje chez les souris déficientes en protéines fixant le calcium. 5. Activité spontanée des cellules de Purkinje chez les souris déficientes en protéines fixant le calcium. 5.I. La régulation de la concentration intracytoplasmique en calcium ionisé dans la cellule de Purkinje Le rôle de la concentration intracytoplasmique en calcium ionisé dans l’excitabilité cellulaire et plus généralement, dans une série de mécanismes réglant le métabolisme de la cellule est établi depuis longtemps, et ce, y compris pour la cellule de Purkinje. Il est donc aisé de supposer que de nombreux mécanismes de puissances et de cinétiques différentes interviennent dans sa régulation. Certains de ces mécanismes ont d’ailleurs été bien caractérisés : les récepteurs AMPA (Llano et al. 1991) ainsi que les canaux calciques associés aux récepteurs de l’IP3 du réticulum endoplasmique (Kuwajima et al. 1992; Ogden et al. 1996) activés suite à la stimulation de récepteurs couplés aux protéines G comme les récepteurs métabotropiques du glutamate (mGluR), et probablement les récepteurs à la ryanodine (Llano et al. 1994), sont susceptibles d’augmenter la concentration intracytoplasmique en calcium ionisé. En outre, l’augmentation de cette dernière est elle-même susceptible d’entraîner la libération de calcium ionisé par le réticulum endoplasmique via le phénomène de calcium induced calcium release (Llano et al. 1994) via les récepteurs à la ryanodine, ou de l’inhiber par rétrocontrôle négatif (Mak et al. 1998). Par contre, les pompes ATPase du réticulum endoplasmique (SERCA) (Baba-Aissa et al. 1996) ou de la membrane plasmatique (PMCA) (Shull 2000), les pompes échangeuses Na/Ca de la membrane cytoplasmique et les protéines fixant le calcium (Schwaller et al. 2002) constituent des mécanismes susceptibles d’abaisser la concentration en calcium intracytoplasmique. Cette dernière dépend donc de nombreux mécanismes agonistes et antagonistes dont l’action équilibrée maintient dans les limites physiologiques précises indispensables au rôle régulateur complexe du calcium ionisé, la concentration au repos mais également les modulations 5 Etude de l’oscillation rapide 58 cytoplasmique en calcium ionisé, participent donc, en interaction avec d’autres mécanismes connus ou inconnus, au maintien d’un équilibre complexe, de sorte que la caractérisation in vivo de leur rôle exact au sein de ce dernier peut être singulièrement compliqué par la présence de mécanismes de compensation. Parmi les protéines fixant le calcium, la parvalbumine, la calrétinine et la calbindine semblent occuper une place prépondérante au sein du parenchyme cérébelleux en terme de capacité de chélation (Maruyama et al. 1984). Ces trois protéines appartiennent à la famille des « EF-hand », appellation dont l’origine réside dans l’orientation stérique des cinquièmes et sixièmes hélices alpha de la parvalbumine (Kawasaki et al. 1998). Quoique possédant ainsi une certaine proximité en terme de mécanisme chélateur et de contenu séquentiel en acides aminés, ces trois protéines se distinguent par leur localisation cellulaire, leur nombre de sites et leur cinétique de chélation. En effet, alors que la calbindine et la calrétinine comptent chacune 6 sites de fixation, la parvalbumine n’en compte que trois, chaque protéine comportant un site non fonctionnel, à l’exception de la calbindine qui en comporte deux (Haiech et al. 1979; Schwaller et al. 1997). En outre, alors que la calbindine semble confinée à la cellule de Purkinje, la parvalbumine peut également être détectée dans les cellules en étoile et en panier ainsi que dans certaines cellules de Golgi (Scotti et al. 1992), tandis que la calrétinine semble très spécifique des cellules granulaires, mais peut également être détectée dans les cellules en brosse, dans les cellules de Lugaro (Floris et al. 1994) et dans certaines fibres grimpantes ou moussues (Fortin et al. 1998). Outre les différences en terme de structure ou de localisation cellulaire, la cinétique de fixation du calcium semble constituer un élément majeur de différenciation entre la parvalbumine d’une part, et la calrétinine ou la calbindine d’autre part. En effet, la parvalbumine possède une forte affinité pour l’ion magnésium, celui-ci constituant pour le calcium un antagoniste réversible aux concentrations physiologiques (Haeisch et al. 1979). Le temps nécessaire à la dissociation du cation magnésium diminue d’un facteur 10 la constante de temps de l’association entre la parvalbumine et le calcium. Si cette différence de cinétique ne va rien changer à la capacité totale de chélation et par la même à la concentration en calcium ionisé intracytoplasmique au repos, les modulations transitoires de la concentration calcique lors des potentiels d’action seront affectées de manière spécifique par la présence d’une protéine fixant le calcium rapidement ou lentement. En effet, dans la situation simple ou une entrée brève de calcium ionisé augmente rapidement la concentration de cet ion, générant ainsi un pic rapide et un retour lent selon une courbe biexponentielle, on peut 5 Etude de l’oscillation rapide imaginer qu’une protéine fixant le calcium rapidement absorbera le calcium au fur et à mesure que celui-ci rentre, diminuant ainsi l’amplitude du pic de concentration. Par contre, lors de la descente rapide de la concentration, la protéine relâchera rapidement le calcium qu’elle a fixé, ralentissant ainsi la partie initiale de la descente de concentration. Dans le cas d’une protéine fixant le calcium lentement, le pic de concentration ne sera pas affecté car l’ion magnésium n’aura pas le temps d’être déplacé avant le sommet du pic de concentration calcique. Par contre, ce sera chose faite lors de la première partie de la descente de concentration, et la protéine pourra ainsi fixer le calcium entré dans la cellule, accélérant ainsi la partie initiale de l’exponentielle décroissante. Enfin, lors de la phase ultime de la descente de concentration, la protéine relâchera lentement ses cations calcium, ralentissant ainsi la seconde partie de la descente. La présence d’une protéine fixant lentement le calcium modulera donc essentiellement la décroissance de la concentration calcique en accentuant le caractère biexponentielle de celle-ci (Lee et al. 2000; Caillard et al. 2002). Compte tenu du rôle majeur joué par les variations de la concentration en calcium ionisé lors des potentiels d’action, il est aisé de comprendre que l’absence d’une protéine fixant le calcium modulera de manière sélective l’excitabilité cellulaire. En outre, il a été démontré que la calbindine pré-synaptique intervenait dans le phénomène de paired-pulse facilitation (Blatow et al. 2003). Le caractère ubiquitaire de la parvalbumine, de la calbindine et de la calrétinine au sein des espèces animales (Moncrief et al. 1990) de même que l’extraordinaire constance de l’organisation cérébelleuse au travers de l’évolution relève l’intérêt de l’étude des protéines fixant le calcium sur le cervelet murin. C’est via l’utilisation de souris transgéniques que nous tacherons de mieux cerner le rôle des protéines fixant le calcium dans la physiologie cérébelleuse. 5.II. L’oscillation rapide des souris déficientes en protéines fixant le calcium Les premières souris déficientes en protéines fixant le calcium ont été décrites à la fin des années 90. Il s’agissait de souris complètement déficientes en calbindine (CB-/-) (Airaksinen et al. 1997) en calrétinine (CR-/-) (Schiffmann et al. 1999) et en parvalbumine PV 5 Etude de l’oscillation rapide 60 population neuronale spécifique (Bearzatto et al. 2005b) ont été générés. Afin de mieux comprendre le rôle des tampons calciques, différentes souris « double mutantes » ont été produites (Vecellio et al. 2002, Cheron et al. 2004). Certaines d’entre elles sont encore à l’étude et leurs résultats en attente de publication. Observées dans leur cage, les souris déficientes en protéine fixant le calcium ne présentent pas d’ataxie évidente, et ne peuvent être discriminées des animaux contrôles. Cependant, une fois soumis aux tests de coordination motrice, tels le runway ou le rotarod, les animaux mutants montrent une certaine différence avec leurs contrôles (Airaksinen et al. 1997; Schiffmann et al. 1999; Barski et al. 2003; Bearzatto et al. 2005b). Pour significative que soit cette différence, sa mise en évidence d’une part requière des tests adaptés et bien discriminants (ni trop faciles pour les mutants, ni trop difficiles pour les contrôles) et d’autre part est compromise par certains facteurs confondants, les mieux connus étant l’âge (Schiffmann et al. 1999) et la race (Bearzatto et al. 2005b) des souris. L’existence de ce déficit de coordination motrice a immédiatement suggéré que le fonctionnement du cortex cérébelleux des animaux mutants était altéré. Les premières études d’électrophysiologie in vivo sur les souris déficientes en protéines fixant le calcium ont été réalisées sur les souris CR-/- (Schiffmann et al. 1999; Cheron et al. 2000). Typiquement, ces souris présentent une augmentation de la fréquence des spikes simples ainsi qu’une diminution du silence et de la durée des spikes complexes. L’étude des souris dont l’expression de la calrétinine a été restaurée dans les cellules granulaires (Bearzatto et al. 2005b) démontrera par la suite que ces anomalies sont bien dues à une hyperexcitation des cellules de Purkinje par des cellules granulaires elles-même hyperexcitables (Gall et al. 2003). L’enregistrement de l’activité cérébelleuse des souris CB-/- et surtout des doubles mutants CB -/-CR-/- (Cheron et al. 2004) a attiré l’attention sur un phénomène déjà présent de manière moins évidente chez les souris CR-/- : l’oscillation rapide à 160 Hz. En effet, les souris CB -/-CR-/- et dans une moindre mesure, les souris CB-/- et CR-/- présentent au repos des épisodes d’oscillation rapide (de 120 à 220 Hz) du potentiel de champ local. La partie supérieure de la figure 5.1A,B illustre deux exemples d’oscillation rapide enregistrés sur une souris CB-/-CR-/-. Ces épisodes, qui peuvent durer des heures, alternent chez un même animal avec des périodes ou aucune activité oscillante ne peut être détectée. Les caractéristiques de l’oscillation à 160 Hz sont les suivantes (Cheron et al. 2004,2005; Servais et al. 2005b) : 5 Etude de l’oscillation rapide B. Synchronisation avec la décharge de nombreuses cellules de Purkinje, dont le spike simple survient préférentiellement dans la partie la plus déclive de l’oscillation, tandis que le spike complexe survient dans la partie ascendante. C. Inhibition lors du mouvement volontaire ou induit. D. Absence de synchronisation avec les cellules de Golgi. E. Présence de bouffées, ou spindles à une fréquence de 4 à 5 Hz. F. Association avec des décharges plus rapides, plus rythmiques et plus synchrones des cellules de Purkinje. G. Inhibition par les inhibiteurs des gap junction, des récepteurs GABAA et des récepteurs NMDA. Ces deux dernières caractéristiques amènent à considérer que différents éléments neuronaux interviennent dans la genèse et/ou le maintien de l’oscillation rapide. En effet, si les cellules de Purkinje sont nettement en phase avec le potentiel oscillant, elles sont néanmoins dépourvues des récepteurs NMDA et l’existence de gap junction à leur niveau est très controversée. L’effet inhibiteur de la carbenoxolone (inhibiteur des gap junction) et de la gabazine (inhibiteur GABAA) pointe plutôt le réseau d’interneurones inhibiteurs, ces derniers étant densément connectés par des gap junctions. Il faut cependant noter que la spécificité de la carbenoxolone pour les gap junctions n’est pas absolue, puisque des effets sur les canaux calciques dépendants du voltage ont, entre autres, été décrits (Vessey et al. 2004) La description de cette oscillation a amené une multitude de questions quant à son rôle (physiologique ou pathologique), sa genèse, son rapport avec la décharge des cellules de Purkinje, ses éventuelles projections extra-cérébelleuses, son existence dans d’autres modèles pathologiques ou physiologiques… Les expériences que nous décrirons dans ce travail s’attacheront à apporter des éléments de réponse à deux d’entre elles. 1. Quel est le rapport entre l’oscillation rapide du potentiel de champ local et la décharge rythmique et synchrone des cellules de Purkinje ? Les cellules de Purkinje génèrent-elles l’oscillation, ou sont-elles « emprisonnées » par celle-ci dans un mode de décharge rythmique ? 2. L’oscillation est-elle spécifique de la déficience en tampons calciques rapides, telles la calbindine ou la calrétinine, ou constitue-t-elle un état physiopathologique du cervelet, conséquence de différents processus 5 Etude de l’oscillation rapide 62 5.III. Rapport entre oscillation rapide et décharge des cellules de Purkinje Dans l’optique où l’oscillation rapide constituerait une manifestation pathologique associée au déficit de coordination motrice des animaux chez lesquels elle est enregistrée, différentes hypothèses peuvent expliquer son émergence et ses relations avec la décharge des cellules de Purkinje et le déficit de coordination motrice. Chez les souris déficientes en calbindine et/ou en calrétinine, une première hypothèse consiste à envisager l’oscillation comme un effet secondaire du changement quantitatif de décharge des cellules de Purkinje. En effet, l’augmentation de l’excitabilité intrinsèque des cellules granulaires (Gall et al. 2003) et/ou des cellules de Purkinje pourraient mener à une augmentation de la rythmicité et de la synchronie de ces dernières via une augmentation de leur fréquence, donnant ainsi naissance à une oscillation rapide. Stratton et al. (1988) ont en effet décrit une relation étroite entre rythmicité et fréquence des cellules de Purkinje. Dans cette optique, l’oscillation rapide serait donc un effet secondaire de l’augmentation de fréquence des spikes simples qui constituerait le primum movens des anomalies électrophysiologiques et comportementales. Un mécanisme similaire a été décrit à l’état normal dans l’hippocampe entre une oscillation rapide du potentiel de champ et l’activité synchrone des cellules pyramidales (Jones et al. 2000). Une autre hypothèse est de considérer l’oscillation rapide elle-même comme la cause de la synchronisation des cellules de Purkinje dans un mode de décharge rapide et rythmique. Dans cette hypothèse, l’oscillation « emprisonnerait » les cellules de Purkinje dans une décharge rythmique et synchrone, rendant leur comportement moins adaptable en fonction des entrées sensori-motrices, menant ainsi à l’ataxie. Une relation similaire a été mise en évidence dans l’amygdale latérale et dans le cortex perirhinal, où les neurones présentent une modulation dans leur probabilité de décharge en relation avec une oscillation du potentiel de champ (Collins et al. 2001). Ces deux hypothèses ne sont cependant pas mutuellement exclusives. En effet, dans le mécanisme des ripples néocorticaux, Grenier et al. (2003) ont proposé un mécanisme de cercle vicieux dans lequel une oscillation rapide reflète l’activité synchrone des neurones néocorticaux, mais simultanément, participe à la genèse et à la synchronisation des potentiels d’action des neurones adjacents, constituant ainsi le cercle vicieux. La compréhension des mécanismes liant l’oscillation rapide aux différents paramètres qui caractérisent la décharge des cellules de Purkinje, à savoir la fréquence, la rythmicité et la synchronie, passe par l’étude simultanée de ces paramètres pendant l’émergence, l’inhibition 5 Etude de l’oscillation rapide ou la modulation de l’oscillation rapide. Si nous ne connaissons pas de substance ou plus généralement de moyen susceptible d’engendrer de novo une oscillation rapide dans un cervelet préalablement non-oscillant, nous savons que les micro-injections de carbénoxolone (inhibiteur des gap junctions), d’APV (inhibiteur des récepteurs NMDA) ou de gabazine (inhibiteur des récepteurs GABAA) dépriment transitoirement l’oscillation rapide (Cheron et al. 2004). Malheureusement, si l’enregistrement continu d’un potentiel de champ pendant la réalisation d’une micro-injection à proximité de l’électrode d’enregistrement est techniquement réalisable chez l’animal éveillé, l’enregistrement pendant plusieurs minutes d’une ou de plusieurs cellules de Purkinje est nettement plus compliqué, compte tenu du déplacement possible de l’électrode lors de l’injection ou lors de mouvements de l’animal. Par ailleurs, rien ne peut garantir que la concentration de substance injectée sera la même aux différents sites d’enregistrement, ce qui peut compromettre l’interprétation des résultats dans le cadre d’une étude sur les interactions entre synchronie, rythmicité et oscillation. En effet, la substance injectée pourrait atteindre plus rapidement sa concentration efficace au niveau de l’un ou l’autre site d’enregistrement, compliquant ainsi l’interprétation du décours temporel des évènements. Une manière de contourner le problème des gradients de concentration consiste à injecter la substance non pas directement dans le parenchyme cérébelleux, mais par voie générale, en prenant soin d’utiliser une molécule qui diffuse uniformément et facilement dans le système nerveux central. Le second avantage des injections par voie générale est d’éviter les mouvements de tissus consécutifs à l’effet mécanique des micro-injections. Enfin, en utilisant des molécules présentant un effet anesthésiant, nous pourrons assurer une meilleure qualité des enregistrements multiples sur une longue période de temps. La kétamine et le pentobarbital présentent dans cette optique un profil idéal. Ces deux molécules diffusent en effet aisément et uniformément dans le système nerveux central (Saubermann et al. 1974; Blednov & Simpson 1999) et présentent un effet anesthésiant. Le pentobarbital potentialise les récepteurs GABAA et augmente la perméabilité cellulaire à l’anion chlorure, ce qui hyperpolarise la membrane neuronale (Olsen & Snowman 1982). Dans le cervelet, les récepteurs GABAA sont largement distribué sur tous les éléments neuronaux. Au niveau de la cellule de Purkinje, ils transmettent l’inhibition des interneurones de la couche moléculaire et des cellules de Lugaro. La kétamine quant à elle, est un inhibiteur des récepteurs NMDA. Dans le cortex cérébelleux ces derniers sont localisés au niveau des 5 Etude de l’oscillation rapide 64 par les fibres moussues. Ils sont également présents sur le versant présynaptique des synapse fibre parallèle-cellule de Purkinje et interneurone-cellule de Purkinje (Casado et al. 2002; Duguid & Smart 2004). Malgré la mise en évidence de quelques sous-unités des récepteurs NMDA au niveau des cellules de Purkinje de souris adultes (Thompson et al. 2000), il est communément admis que l’excitation des cellules de Purkinje par les fibres grimpantes et parallèles n’est pas transmise par les récepteurs NMDA, mais bien par les récepteurs AMPA. L’action inhibitrice de la kétamine sur les cellules de Purkinje (Sato et al. 1993) est donc probablement à mettre en relation avec la diminution de l’excitation de ces dernières par les fibres parallèles suite à la moins grande excitation des cellules granulaires par les fibres moussues. Il faut cependant se rappeler qu’utilisée à des doses anesthésiantes, en l’occurrence 100 mg/kg, la kétamine inhibe non seulement les récepteurs NMDA, mais présente d’autres effets, tels l’inhibition des acétylcholinesterase (Cohen et al. 1974), des transporteurs des monoamines (Smith et al. 1981) ou des récepteurs aux opiacés (Smith et al. 1980). Vu le mode d’action du pentobarbital et de la kétamine et compte tenu du fait que l’oscillation est inhibée par les inhibiteurs des récepteurs GABAA et NMDA, l’effet attendu de ces deux substances sur l’oscillation rapide est donc une inhibition par la kétamine et une potentialisation par le pentobarbital. Nous tenterons dans un premier temps de confirmer l’effet de ces substances sur l’oscillation rapide des souris CB-/-CR-/- (Servais & Cheron 2005a) Ensuite, nous étudierons l’effet de doses similaires sur la décharge cellulaire en absence d’oscillation. Enfin, nous étudierons l’évolution temporelle de l’oscillation rapide, de la synchronie et de la rythmicité cellulaire au moyen d’enregistrements multiples. Cette approche comporte deux problèmes méthodologiques. Le premier réside dans le fait que nous étudierons dans le cervelet l’effet d’une substance injectée par voie générale. Rien ne permet d’affirmer que l’effet que nous observerons est bien du à l’activité locale de la substance, et non à un effet réseau au niveau du système nerveux central, à commencer bien sûr par les effets non spécifiques de l’anesthésie générale. Ensuite, l’effet non spécifique de la kétamine à la dose utilisée nous empêchera de tirer des conclusions quant à son mode d’action. Afin de contourner ces deux problèmes, nous tenterons, par des micro-injections cérébelleuses de pentobarbital, de kétamine ou d’APV (un antagoniste spécifique des récepteurs NMDA) de reproduire sur des enregistrements simples l’effet que nous observerons lors de l’injection systémique de kétamine ou de pentobarbital. En effet, lors de l’enregistrement d’une seule cellule ou d’une seule oscillation au moyen d’une seule électrode, la difficulté technique des micro-injections est nettement moindre que lors 5 Etude de l’oscillation rapide d’enregistrements multiples, et le problème des gradients de concentration entre les différents sites d’enregistrement ne se pose pas. 5.III.a. Action de la kétamine et du pentobarbital sur l’oscillation rapide Nous avons injecté la kétamine ou le pentobarbital 10 minutes après le début d’un enregistrement simple d’une oscillation chez l’animal éveillé (n=5 pour chaque molécule, 6 animaux CB-/-CR-/- utilisés). La figure 5.1 illustre l’enregistrement d’une oscillation rapide et de son spectre de Fourier avant et 10 minutes après l’injection de kétamine (A) ou de pentobarbital (B). Après l’injection de kétamine, le pic principal du spectre de Fourier est réduit et déplacé vers la gauche, ce qui indique une inhibition et un ralentissement de l’oscillation. L’étude statistique des 5 expériences réalisées confirme cette observation (Fig. 5.1A,C,D) (One-way Anova, mesures répétées). Au contraire, après l’injection de Dans le document Etude électrophysiologique de la cellule de Purkinje et du potentiel de champ local chez la souris éveillée, en conditions normales et pathologiques. (Page 73-116)
