Conception d’un olfactomètre permettant de cribler des substances d’origine naturelle, actives sur les larves de taupin, dans l’objectif de développer un produit de biocontrôle

(1)

Cet engagement de non plagiat doit être inséré en première page de tous les rapports, dossiers, mémoires.

Je, soussigné (e) ………, déclare être pleinement conscient(e) que le plagiat de documents ou d’une partie d’un document publiés sur toutes formes de support, y compris l’internet, constitue une violation des droits d’auteur ainsi qu’une fraude caractérisée. En conséquence, je m’engage à citer toutes les sources que j’ai utilisées pour écrire ce rapport ou mémoire.

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ENGAGEMENT DE NON PLAGIAT

Perrine GALLAIS

(2)

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(3)

Mémoire de Fin d'Etudes

Master 2 Mention Biologie Végétale (BV) Parcours : Gestion de la Santé des Plantes (GSP)

Année universitaire 2019-2020

Conception d’un olfactomètre permettant de cribler des substances d’origine naturelle, actives sur les larves de taupin, dans l’objectif

de développer un produit de biocontrôle

Par : Perrine Gallais

Organisme d’accueil : Agro Innovation International – Groupe Roullier Centre Mondial de l’Innovation, Saint-Malo Maître de stage : Éric Nguema-Ona

Tuteur : Didier Peltier

Jury : Béatrice Teulat et Thomas Guillemette UFR Sciences

2 boulevard Lavoisier 49000 ANGERS

Centre Mondial de l’Innovation 18 boulevard Franklin Roosevelt 35400 SAINT MALO

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Mémoire de Fin d'Etudes

Master 2 Mention Biologie Végétale (BV) Parcours : Gestion de la Santé des Plantes (GSP)

Année universitaire 2019-2020

Conception d’un olfactomètre permettant de cribler des substances d’origine naturelle, actives sur les larves de taupin, dans l’objectif

de développer un produit de biocontrôle

Par : Perrine Gallais

Organisme d’accueil : Agro Innovation International – Groupe Roullier Centre Mondial de l’Innovation, Saint-Malo Maître de stage : Éric Nguema-Ona

Tuteur : Didier Peltier

Jury : Béatrice Teulat et Thomas Guillemette UFR Sciences

2 boulevard Lavoisier 49000 ANGERS

Centre Mondial de l’Innovation 18 boulevard Franklin Roosevelt 35400 SAINT MALO

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REME RC IEM ENTS !: -o

Je tiens tout d’abord à remercier mon maître d’apprentissage Eric Nguema-Ona pour sa confiance et cette année très enrichissante au sein de son équipe Stress Biotique.

Merci à Lisa Cabre pour ses démarches et conseils précieux depuis son arrivée dans l’équipe. Merci aussi à Geoffrey Heil, pour son aide dans certaines de mes expérimentations et ses connaissances apportées en entomologie.

Je souhaite également remercier Jean-Claude Yvin, qui m’a permis d’effectuer le stage de première année de master au sein du Laboratoire de Nutrition Végétale et de continuer en deuxième année de master par une alternance.

Ensuite, je remercie le personnel du laboratoire et des serres avec qui j’ai eu le plaisir travailler.

Je remercie mon tuteur de cette année d’apprentissage Didier Peltier, pour sa diligence et son encadrement tout au long du master Biologie Végétale en tant que responsable de promo.

Merci aussi aux enseignants impliqués dans leur travail, de m’avoir transmis leurs connaissances, souvent avec passion. Merci également aux intervenants extérieurs, d’avoir agrémenté toutes ces connaissances.

Un merci profond et sans mesure à mes camarades de promotion 2018-2020, pour leur humour dans la vie de tous les jours, leur bienveillance et leur humanité. Tant de souvenirs seront préservés de ces deux plus belles années d’études.

Je remercie mes colocataires, Elise, Madeleine, Antoine, Tristan, qui m’ont fait vivre une expérience hors du commun, avec une attention particulière pour Corentin, avec qui j’ai vécu d’innombrables fermetures de BU et de covoiturage parfois très atypiques et mouvementés.

Je veux aussi remercier mes amis d’enfance et membres de Ça Chill, présents depuis presque toujours, avec qui j’ai grandi, appris et évolué jusqu’ici. Merci pour leurs conseils, dans tous les domaines imaginables. Ma pensée se tourne vers eux en cette période désagréable car, même à si peu de kilomètres de distance, ils me manquent considérablement.

Merci à mon petit et grand amour Axel, d’être chaque jour à mes côtés et de me soutenir dans les bons moments comme les plus difficiles de la vie. Merci pour sa patience surdimensionnée et ses moments de folie, drôles et inexpliqués.

Enfin, j’adresse ma plus belle reconnaissance à ma famille, particulièrement mes deux grand-mères, Marie-Thérèse et Louise, qui embellissent tous les moments que je passe en leur présence. Je remercie mon cher frère, William, et ma jolie maman, Marie-Christine, pour ce qu’elle est, pour sa force, son soutien et ce qu’elle m’apporte depuis le début de mon existence.

Je réserve ces derniers mots à mon papa, Jacques, parti cette année et que je n’ai jamais assez remercié. Il m’a transmis sa passion pour le végétal, mais surtout, par l’espoir et son courage, une belle leçon de vie.

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Glossaire

Auxiliaire : Se dit d’un agent de lutte biologique (Arthropodes, agents pathogènes) utiliser pour contrôler les populations de ravageurs cibles.

Bioagresseur : Tout organisme vivant au dépend de la plante cultivée et causant potentiellement des pertes de récolte.

Composé allélochimique : médiateur chimique impliqué dans la communication entre espèce différente.

Composé organique volatil : Molécules organique ayant des caractéristiques physico-chimique lui permettant d’être volatilisé et véhiculée par l’air.

Entomopathogène : Se dit d’un organisme pathogène d’un insecte.

Enzyme : Protéine ayant la fonction de catalyser les réactions chimiques dans les cellules.

Kairomone : Composé allélochimique.

Macroorganisme : Organisme vivant visible à l’œil nu.

Médiateur chimique : Molécule émise par un être vivant et perçu par d’autre organisme.

Métabolite : Molécule synthétisée par un organisme vivant et contribuant à son fonctionnement propre ou à ses échanges avec l’extérieur.

Microorganisme : Organisme vivant non visible à l’œil nu.

Nématode : Ver rond tellurique de taille inférieure à 1 mm, causant pour certaines espèces des dégât sur les cultures.

Olfactomètre : Dispositif permettant d’évaluer le comportement de ravageur de culture face à des odeurs, VOCs ou des médiateurs chimiques.

Oomycètes : Microorganismes filamenteux aquatiques proches morphologiquement des champignons mais biologiquement proche des microalgues brunes.

Pathogène : Agent biologique responsable de maladie infectieuse (appelé phytopathogène lorsque cela concerne les plantes).

Pédofaune : Faune vivant dans les sols.

Phénotype : ensemble des caractéristiques ou des traits observables chez un individu dans un environnement donné.

Phéromone : Substance chimique semblable aux hormones, sécrétée par les être-vivants et certains végétaux.

Phytophage : se dit d’un animal dont le régime alimentaire est végétal.

Phytopharmaceutiques : Produit chimique utilisé pour prévenir ou soigner les maladies des végétaux.

Polyphage : se dit d’un organisme généraliste ayant un régime alimentaire varié.

Ravageur : se dit d’un macroorganisme (insecte) causant des dégâts aux cultures.

Rhizosphère : Partie du sol formée par les racines et les microorganismes présents, qui interagissent avec les plantes.

Tellurique : Relatif à la terre, au sol.

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Liste des abréviations

CMI – Centre Mondial de l’Innovation

FAO – Food and Agriculture Organization

IPM – Integrated Pest Management

INRAE – Institut National de Recherche pour l’Agriculture, l’alimentation et l’Environnement (Fusion entre l’Inra et l’Irstea)

LNV – Laboratoire de Nutrition Végétale

PPP – Produit Phytopharmaceutique

SPME – Solid Phase-Micro Extraction

SN – Solution Nutritive

TIMAC – Transformation Industrielle du Maërl en Amendement Calcaire

VOC – Volatile Organic Compound

CHN – Carbon Hydrogen Nitrogen

(11)

Table des tableaux

Tableau 1 : Principaux insectes ravageurs des sols en France et méthodes de lutte ... 4

Tableau 2 : Familles de substances actives utilisées dans la cadre de la lutte chimique contre le taupin ... 8

Tableau 3 : Ennemis naturels dont certains pouvant être utilisés ou étudiés en tant qu’auxiliaires ... 10

Tableau 4 : Différents olfactomètres développés lors de travaux scientifiques ... 14

Tableau 5 : Ensemble des caractéristiques physiques et fonctionnelles d’olfactomètres d’intérêt. ... 18

Tableau 6 : Détails des conditions de culture testées pour l’étude ... 18

Tableau 7 : Ensemble des VOCs répertoriés, issus de la bibliographie ... 22

Tableau 8 : VOCs de référence analysés en GC-MS ... 30

Tableau 9 : VOCs de référence dans les échantillons de racines de maïs ... 30

Table des illustrations

Figure 1 : Centre Mondial de l’Innovation (CMI) du Groupe ROULLIER, Saint-Malo, vue des quais ... 0

Figure 2 : Centre Mondial de l’Innovation (CMI), Saint-Malo, vue sur l’entrée ... 0

Figure 3 : Agriotes sp au stade adulte (a) et au stade larvaire avancé (b). ... 6

Figure 4 : Cycle de développement d’Agriotes sp, court ou long selon l’espèce ... 6

Figure 5 : Dégâts et symptômes sur culture de maïs (a et b) engendrés par les larves de taupin. ... 6

Figure 6 : Répartition des 6 principales espèces de taupin, sur toutes les cultures françaises, de 2006 à 2014. ... 6

Figure 7 : Etapes de la mise en œuvre de la gestion intégrée des ennemis des cultures ... 10

Figure 8 : Vue d’ensemble des interactions trophiques médiées par les composés organiques volatiles (VOCs) ... 12

Figure 9 : Vue d’une parcelle dans laquelle sont apportés de façon endogène les glucosinolates ... 12

Figure 10 : Encapsulation d’extrait de neem, comportant la substance active azadirachtine, utilisée en AK. ... 12

Figure 11 : Schéma explicatif de la stratégie « Attract and Kill » ... 12

Figure 12 : Images des pots dans lesquels sont cultivés les plants de maïs pour l’étude ... 20

Figure 13 : Larve de taupin utilisée pour les inoculations dans les pots de maïs. ... 20

Figure 14 : Photo de pots contenant les plants de maïs, 7 jours après repiquage, le jour de l’inoculation ... 20

Figure 15 : Etapes de récolte des plants de maïs de 28jours ... 22

Figure 16 : Premier jet du cahier des charges réalisé pour la fabrication de l’olfactomètre ... 24

Figure 17 : Plan de l’olfactomètre élaboré par AFU, validé pour fabrication ... 24

Figure 18 : Image des plants de maïs de 28 jours, 21 jours après repiquage ... 26

Figure 19 : Moyennes des masses fraîches foliaires et longueurs foliaires du maïs ... 26

Figure 20 : Pourcentages d’azote (a) et de carbone (b) des parties foliaires du maïs ... 26

Figure 21 : Photo des plants de maïs, 12 jours après inoculation, représentatif de chacune des trois conditions ... 28

Figure 22 : Moyennes des masses fraîches foliaires (a) et des longueurs foliaires (b) ... 28

Figure 23 : Teneurs en chlorophylle (µg/cm²) obtenues par prélèvement Dualex ... 28

Figure 24 : Attaque (a) et morsures (b) de larves de taupin sur les grains des plants de maïs ... 28

Figure 25 : Nombre moyen de VOCs identifiés en GC-MS, en fonction des deux techniques de préparation ... 30

(12)

Table des matières

1. INTRODUCTION GENERALE ... 1

1.1. Le Centre Mondial de l’Innovation du Groupe Roullier ... 1

1.2. Contexte & enjeux ... 3

1.3. Les principaux bio-agresseurs des cultures françaises ... 5

1.3.1. Les micro-organismes phytopathogènes ... 5

1.3.2. Les macro-organismes phytophages ... 5

Les larves d’insectes ravageurs ... 5

1.4. Le taupin, présence préoccupante en France ... 7

1.4.1. Développement & écologie du taupin ... 7

Le stade larvaire ... 7

Écologie chimique des larves ... 9

1.4.2. Stratégies de luttes actuelles contre le taupin & limites ... 9

Lutte chimique ... 9

Lutte culturale ... 9

Lutte génétique ... 11

Lutte biologique ... 11

1.4.3. Alternatives aux PPP et perspectives contre le taupin ... 13

Substances actives d’origines naturelles ... 13

Composés organiques volatils d’origine végétale ... 15

1.5. Objectifs ... 17

2. MATERIEL &METHODE ... 19

2.1. Conception de l’olfactomètre ... 19

2.1.1. Définition du cahier des charges... 19

2.1.2. Conception et fabrication de l’olfactomètre par AFU ... 19

2.2. Méthodes de validation de l’olfactomètre ... 19

2.2.1. Méthode pour valider l’attaque des larves sur le maïs en conditions expérimentales ... 19

Détermination des conditions expérimentales de culture de maïs pour l’olfactomètre ... 19

Méthode de validation du comportement des larves face au maïs, en pots ... 21

2.2.2. Méthode pour valider la présence des VOCs dans les racines de maïs et leur diffusion dans l’olfactomètre ... 23

VOCs de référence ... 23

VOCs des racines de maïs ... 23

(13)

3. RESULTATS ... 25

3.1.1. Travaux bibliographiques ... 25

3.1.2. Cahier des charges ... 25

3.1.3. Olfactomètre fabriqué par AFU ... 25

3.2. Validation de l’olfactomètre ... 27

3.2.1. Définition des conditions d’attaque des larves sur les racines de maïs en pot ... 27

3.2.2. Attaque des larves sur les racines de maïs en pot ... 29

3.2.3. Validation de la présence des VOCs de référence dans les racines de maïs ... 31

Les VOCs de référence ... 31

Analyse de VOCs de maïs ... 31

4. DISCUSSION ... 32

4.2. Conditions optimales d’attaque du taupin sur le maïs ... 33

5. CONCLUSION ... 35

BIBLIOGRAPHIE ... 36

(14)

Figure 1 : Centre Mondial de l’Innovation (CMI) du Groupe ROULLIER, Saint-Malo, vue des quais (source : roullier.com)

Figure 2 : Centre Mondial de l’Innovation (CMI), Saint-Malo, vue sur l’entrée (M. Josse)

(15)

GALLAIS Perrine| Conception d’un olfactomètre permettant de cribler des substances d’origine naturelle, actives sur les larves de taupin, dans l’objectif de développer un produit de biocontrôle 1

1. Introduction générale

1.1. Le Centre Mondial de l’Innovation du Groupe Roullier

Le Groupe Roullier s’est fondé en 1959 sur les quais de Saint Malo. Le fondateur, Daniel ROULLIER, est parti de l’idée d’exploiter le maërl pour élaborer des fertilisants et des engrais pour le sol. Le maërl est un substrat riche en calcaire, magnésium et oligoéléments assimilables, venant d’accumulation de débris d’organismes marins comme les algues. Ainsi, la société TIMAC Agro, autrement dit : Transformation Industrielle du Maërl en Amendement Calcaire, voit le jour. D’un chiffre d’affaire de 2 milliards d’euros en 2018, le Groupe ROULLIER, international et indépendant, s’étend sur plus d’une centaine de pays et regroupe plus de 8300 collaborateurs (roullier.com).

Le Groupe est spécialisé dans la nutrition des plantes, des animaux et des hommes. Au sein de celui-ci sont développées des activités autour de trois secteurs :

• Agrofourniture (fertilisants, spécialités zootechniques)

• Agrochimie (produits industriels, hygiène et détergence, plasturgie)

• Agroalimentaire (pâtisserie bretonne)

Le domaine historique est spécialisé dans la production végétale, répondant aux besoins des agriculteurs. Au CMI sont effectués des travaux sur les végétaux, algues et microalgues, pour élaborer ou améliorer de nouveaux engrais.

Basé à Saint Malo, le Centre Mondial de l’Innovation (CMI) rassemble environ 200 collaborateurs, dont chercheurs et ingénieurs de 15 nationalités différentes. Les locaux sont dotés de plusieurs laboratoires, l’un spécialisé dans le domaine du végétal et l’un dans le domaine de l’animal. Il comporte également un pôle microbiologie et un pôle chimie. Six serres automatisées y sont implantées, dont une de phénotypage et une autre de confinement, additionnées de quatre chambres de croissance, ayant la capacité de recréer différents climats pour étudier les plantes dans des contextes spécifiques de culture.

Au Laboratoire de Nutrition Végétale (LNV), le pôle biocontrôle et stress biotique se développe dont l’objectif est de comprendre les interactions entre les cultures et leurs bio-agresseurs, notamment les ravageurs et organismes pathogènes. Des travaux sont en cours pour rechercher des alternatives aux produits phytopharmaceutiques conventionnels (PPP).

(16)

(17)

1.2. Contexte & enjeux

Après 1945, l’amélioration des rendements est devenue l’élément clé de l’Agriculture, entraînant le développement des intrants, tels que les fertilisants, les produits phytopharmaceutiques (PPP), et la mécanisation. Ces méthodes, largement utilisées depuis plusieurs décennies, ont un impact majeur sur l’environnement et la santé humaine (Fauvergue et al., INRAE, 2020).

Cette prise de conscience a permis, en 2007, la mise en place du Grenelle Environnement, un processus de concertation sur les évolutions à considérer entre les activités humaines, notamment le domaine agricole, et l’environnement (Doré et al., 2016). A l’occasion de ce Grenelle, les plans Ecophyto I, II et II+

ont été successivement lancés en France (Ministère de l’Agriculture, 2018). Ils ont pour objectif de réduire de moitié l’utilisation des PPP pour 2025, selon la directive 2009/128/EC de la Commission Européenne, tout en gardant une stabilité économique agricole (Malausa et al., 2018 ; Journal officiel de l’UE, 2009).

L’aménagement des paysages agricoles et l’introduction de la lutte intégrée contre les ennemis des cultures, dont le biocontrôle, sont deux des stratégies importantes mises en œuvre. Le biocontrôle est un ensemble de méthodes visant à protéger les cultures par l’utilisation d’organismes vivants, tels que les micro-organismes et macro-organismes, ou de substances naturelles d’origine végétale ou animale comme les médiateurs chimiques et phéromones (Fauvergue et al., INRAE, 2020).

Ces changements de pratiques concernent l’ensemble des filières agricoles (Thibord et al., 2017). Les agriculteurs, industriels, chambres d’Agriculture, acteurs économiques et politiques, travaillent ensemble pour anticiper ces évolutions, trouver de nouvelles solutions et développer des alternatives toutes aussi efficaces, mais surtout plus respectueuses de l’environnement (Doré et al., 2016).

Comprendre la physiologie des plantes, des ravageurs de cultures et lutter contre ces bio-agresseurs est indispensable pour développer des méthodes de biocontrôle. C’est dans ce contexte que s’inscrit cette année de Master 2 Biologie Végétale en alternance au Centre Mondial de l’Innovation (CMI) du Groupe Roullier.

(18)

Tableau 1 : Principaux insectes ravageurs des sols en France et méthodes de lutte correspondantes recommandées. Ces ravageurs sont nuisibles au stade larvaire pour les grandes cultures et cultures maraîchères (Diverrès et Le Roux, Pôle Agronomie Productions Végétales).

(19)

1.3. Les principaux bio-agresseurs des cultures françaises

Les bio-agresseurs regroupent les phytopathogènes et les ravageurs invertébrés et vertébrés, affectant les semences, les parties aériennes ou racinaires des plantes, à des stades de développement plus ou moins avancés (Riba et Silvy, 1989).

1.3.1. Les micro-organismes phytopathogènes

Ces bio-agresseurs sont en partie représentés par les micro-organismes phytopathogènes. Ce sont les virus, bactéries, champignons et oomycètes. Ils sont responsables de maladies plus ou moins répandues en France, ayant parfois des conséquences économiques importantes. Par exemple l'helminthosporiose, causée par diverses champignons dont Drechslera teres, touche les cultures de maïs, mais c’est aussi la principale maladie de l’orge causant jusqu’à 35% de pertes de rendement en France (Arvalis, 2013).

1.3.2. Les macro-organismes phytophages

L’autre partie de bio-agresseurs est représentée par les macro-organismes phytophages. Ces ravageurs rassemblent les vertébrés herbivores tels que les oiseaux (notamment les étourneaux), ainsi que les mammifères, particulièrement les rongeurs (Riba et Silvy, 1989). Les gibiers quant à eux ne sont responsables de dégâts notables qu’en cas de surpopulation. Les macro-organismes phytophages rassemblent aussi des invertébrés. Les acariens posent problème pour les cultures et pour les denrées agricoles stockées.

Les nématodes, à kyste ou à galles, provoquent surtout des dégâts sur betteraves sucrières, pommes de terre, vignes et céréales (Bridge and L.Starr, 2007). Les mollusques comme les limaces effilochent les feuilles des cultures après la levée, notamment en maraîchage et cultures céréalières (Riba et Silvy, 1989). Enfin, les insectes ravageurs sont largement représentés par de nombreux ordres (énumérés dans le tableau 1). Ils sont nuisibles par l’action de s’alimenter sur les parties foliaires ou racinaires (Herrbach et al., 2013), au stade adulte ou bien larvaire. Leur comportement alimentaire, qui peut être de type piqueur-suceur (phloèmophage, xylèmophage, etc) ou broyeur, a souvent pour conséquence la vection d’agents pathogènes (virus et bactéries notamment), de l’insecte vecteur vers la plante hôte (Herrbach et al., 2013).

Généralement les ravageurs au stade larvaire sont les plus nuisibles (Balachowsky and Mesnil, 1935).

Les espèces telluriques les plus connues en France sont le taupin Agriotes spp, la tipule Tipula spp et Nephrotoma appendiculata (Chavalle et al., 2014) ou encore la mouche du chou Delia radicum (Van den Bosh and Welte, 2020), car elles sont présentes sur quasiment l’ensemble des parcelles françaises et parfois extrêmement polyphages (Tableau 1).

(20)

Figure 3 : Agriotes sp au stade adulte (a) et au stade larvaire avancé (b) (source : ARVALIS).

Figure 5 : Dégâts et symptômes sur culture de maïs (a et b) engendrés par les larves de taupin, et sur tubercules de pomme de terre (c) (sources : Arvalis (maïs), photo pommes de terre : ENO).

Figure 4 : Cycle de développement d’Agriotes sp, court ou long selon l’espèce (source : Bayer CropScience, 2016)

Figure 6 : Répartition des 6 principales espèces de taupin, sur toutes les cultures françaises, de 2006 à 2014 (source : Thibord et al., 2017).

a b

c a

b

(21)

1.4. Le taupin, présence préoccupante en France

1.4.1. Développement & écologie du taupin

Le taupin est un insecte de la famille des Elatéridés et de l’ordre des Coléoptères (Furlan et al., 2004).

Il existe deux genres : Athous et Agriotes. Le genre Athous affecte surtout les cultures céréalières dont le blé, tandis que le genre Agriotes (Figure 3) affecte une gamme plus large de cultures (Blot et al., 1999 ; Chabert, 2015), notamment la pomme de terre Solanum tuberosum et le maïs Zea mays. Ce genre rassemble un nombre important d’espèces dont quelques-unes sont nuisibles. La durée du cycle de développement dépend de l’espèce, pouvant être long (5 ans) ou court (2 ans) (Figure 4). Les principales présentes en France sont A. lineatus, A. sputator, A. obscurus (nord) et de plus en plus A. sordidus (plus au sud) dont la prolifération pose problème due à son cycle de développement plus court (Thibord et al., 2017) (Figure 5).

Au stade adulte, le taupin (aussi appelé « Click beetle ») n’est pas nuisible pour les cultures (Traugott et al., 2008, 2015). Au printemps, après l’accouplement et la fécondation, la femelle pond dans la couche superficielle du sol (Furlan et al., 1996), sous les couverts végétaux gardant l’humidité, car les œufs et les nouvelles larves sont très sensibles à la dessication (Furlan et al., 2004). La période optimale d’éclosion des œufs est de fin mai à début juin.

Les larves, nommées « larve fil de fer », sont quant à elles responsables des dégâts dans les cultures (Figure 6). Même si la durée de cycle de développement est définie selon l’espèce, le nombre de degrés jour influence également le nombre d’années nécessaires pour compléter ce cycle (Furlan et al., 1998). Il y a sept à neuf stades larvaires, sur deux à quatre ans (Vernon and van Herk, 2013; Traugott et al., 2015), avant la nymphose. Chaque stade est constitué de 3 phases : le durcissement et assombrissement des mandibules, l’alimentation et la pré-mue. La phase d’alimentation est la plus dommageable pour les cultures, durant laquelle les larves creusent des galeries horizontales dans le sol pour s’alimenter des parties souterraines (semences, racines, collets, tubercules) (Thorpe et al., 1946 ; Chabert, 2015). Elle représente 20% à 30% du développement de la larve, selon les espèces (Evans and Gough, 1942; Furlan et al., 1998, 2004 ; ACTA, 2015).

De plus, les larves d’Agriotes se déplacent verticalement en fonction de l’humidité, de la température et du type de sol et en fonction des saisons (Furlan et al., 2004 ; Jung et al., 2014). En effet, elles ont généralement deux périodes d’activité par an, au printemps et en début d’automne (Traugott et al., 2015 ; Nordin, 2017). En dehors de ces périodes, elles stoppent leur activité, dû aux conditions environnementales (sécheresse et températures extrêmes) et se dirigent en profondeurs, pour y rester jusqu’au retour des conditions plus favorables qui leurs permettent de remonter vers la surface (Parker and Howard, 2001 ; Traugott et al., 2015).

(22)

Tableau 2 : Familles de substances actives utilisées dans la cadre de la lutte chimique contre le taupin, leurs modes d’application et les cultures cibles dans lesquelles ils sont appliqués (source : Barsics et al., 2013).

Famille de la

substance active Substance active Mode d'application (dans la lutte contre le taupin) Culture cible (dans la lutte contre le

taupin) Organochlorés Lindane Granulé - enrobage semence - traitement dans sillon Maïs - Blé - Orge

Metoxychlore Enrobage semence Blé

Aldrin Diffusion Pomme de terre

Organophosphates

Chlorpyrifos Amendement du sol ou local - traitement dans sillon -

enrobage semence - diffusion - exposition cutanée Pomme de terre - Maïs

Diazinon Enrobage - amendement du sol ou local Blé

Ethoprophos Granulé - diffusion Pomme de terre

Fonofos Diffusion Pomme de terre

Carbamates Aldicarb Diffusion Pomme de terre

Carbofuran Diffusion - granulé - traitement semence - traitement dans

sillon Pomme de terre - Maïs

Carbodan Traitement semence Tournesol

Thiofanox Diffusion Pomme de terre

Néonicotinoïdes

Imidacloprid Enrobage semence - application locale - exposition cutanée Maïs - Blé - Betterave sucrière - Pomme de

terre - Tournesol Acetamiprid Enrobage semence - amendement du sol ou local /

Clothianidin Amendement sol Blé

Thiacloprid Enrobage semence Pomme de terre

Thiamethoxam Amendement du sol ou local - enrobage semence Maïs - Blé - Tabac - Pomme de terre -

Tournesol Phenylpyrazole

Fipronil Enrobage semence - amendement du sol ou local - exposition cutanée

Maïs - Pomme de terre - Blé - Laitue - Betterave sucrière -

Tournesol

Spinosyne Spinosad Amendement du sol ou local /

(23)

GALLAIS Perrine| Conception d’un olfactomètre permettant de cribler des substances d’origine naturelle, actives sur les larves de taupin, dans l’objectif de développer un produit de biocontrôle 9 Des chercheurs ont prouvé que les larves de taupin détectaient leurs cultures cibles potentielle grâce au CO2 produit par les plantes lors de la respiration (Thorpe et al., 1946 ; Doane et al., 1975 ; Johnson and Gregory, 2006 ; Johnson and Nielson, 2012 ; Humbert et al., 2017). D’autres molécules, ayant des propriétés attractives ou répulsives et impliquées dans l’orientation des larves, ont été découvertes. Parmi elles : les composés volatils ou « VOCs », libérés par les racinaire d’espèces telles que l’orge, le maïs ou encore la pomme de terre (Barsics et al., 2012, 2014 ; Kabaluk et al., 2013 ; La Forgia et al., 2020).

Les VOCs, signifiant « Volatile Organic Compounds », sont des molécules organique ayant des caractéristiques physico-chimiques leurs permettant d’être volatilisées et véhiculées par l’air (Fauvergue et al., INRAE, 2020). Présent dans quasiment tous les milieux, les VOCs émis par les microorganismes et les plantes sont les plus abondants (Fauvergue et al., INRAE, 2020). En effet, les VOCs peuvent être produits par différents organes végétaux, dont le système racinaire (Rasmann et al., 2005 ; Delory et al., 2016), et sont impliqués dans l’interaction entre les organismes vivants du sol, l’attrait des pollinisateurs, la défense contre les phytophages et phytopathogènes (Dudareva et al., 2013). Ils se distinguent en trois grandes classes : les terpénoïdes, les benzenoïdes/phénylpropanoïdes et les dérivés d’acides gras (Knudsen et al., 2006 ; Fauvergue et al., INRAE, 2020).

1.4.2. Stratégies de luttes actuelles contre le taupin & limites

Depuis les années 40 et 50, la lutte chimique, fournissaient un contrôle suffisant dans les cultures (Ritter and Richter, 2013) (Tableau 2). Aujourd’hui, la plupart des produits chimiques comme les organochlorés (lindane), organophosphorés (chlorpyrofos), les carbamates, certains néonicotinoïdes, pyréthrinoïdes, etc, ne sont plus disponibles en Europe, lié à leurs impacts négatifs sur l’environnement et la santé (Barsics et al., 2013 ; E-phy, Anses, 2020). Suite à ces interdictions, les dommages dans les cultures, dus à la présence de taupins, ont augmenté (Ritter and Richter, 2013).

Les techniques culturales sont également utilisées pour réguler les populations du ravageur. Labour, rotation, destruction précoce du couvert inter-cultural, chaulage, etc (cf. Tableau 1), chaque technique est généralement adaptée à la physiologie et l’écologie de l’espèce. Elle peut être similaire pour d’autres ravageurs (éviter l’implantation de la culture après une prairie par exemple), mais peut parfois être favorable au développement d’une autre espèce nuisible. Concernant Agriotes sp, la mise en place d’une bande enherbée peut favoriser la présence d’ennemis naturels (carabes, parasitoïdes, etc) mais peut également servir d’habitat écologique pour le taupin adulte, propice à son développement. De plus, un couvert inter-cultural mal choisi, peut également favoriser sa survie (Furlan et al., 2009). Il est donc indispensable d’évaluer l’état de la parcelle par un suivi continu (prélèvement de terre ou piégeage) et d’adapter les techniques à appliquer. Il est aussi nécessaire de faire évoluer ses techniques pour l’utiliser en tant qu’agent de contrôle efficace (Fauvergue et al., INRAE, 2020).

(24)

Tableau 3 : Ennemis naturels dont certains pouvant être utilisés ou étudiés en tant qu’auxiliaires dans la lutte biologique contre le taupin (sources : cf « références » dans le tableau).

Ennemis

naturels Nom

Genre espèce Impact sur la larve d'Agriotes Références

Prédateurs

Oiseaux

Ces prédateurs se nourrissent de l’insecte adulte et des larves mais ne régulent pas suffisamment les populations de taupins en parcelle infestée

Diverrès and Le Roux, 2012 Taupes

Souris

Carabes Se nourrissent des larves en surface ou faible profondeur – encore en cours d'étude

Fox and MacLellan, 1956

; Ritterand Richter, 2013 Agripnus murinus

(taupin rongeur) Mange certaines espèces de larves Agriotes - basé sur des

observations Ritter and Richter, 2013

Parasitoïdes (guêpes)

Paracodrus apterogynus Endoparasite des larves - pond ses œufs à l'intérieur de son corps

D'Aguilar et al., 1948 ; Ritter and Richter, 2013 Pristocera depressa Ectoparasite des larves - pond ses œuf à la surface de son corps

Champignons entomopathogènes

(EPF)

Zoophtora elateridiphaga Pathogène des larves A. sputator dans des essais en prairies

suisses - augmente le taux de mortalité des larves Keller et al., 1994

Metarhizium anisopliae

Pathogène de la larve A. lineatus et A. obscurus 3 semaines après inoculation causant pour certaines souches jusqu'à 70%

de mortalité et d'autres entre 90 et 100% - Efficace dans d'autres travaux en association avec le Spinosad

Ansari et al., 2009 ; Ericsson et al., 2007 ; Kabaluk and Ericsson,

2007 ; Ritter and Richter, 2013

Metarhizium brunneum Pathogène des larves - augmente le taux de mortalité en essai dans le sol

Razinger et al., 2018 ; Mayerhofer et al., 2017 ;

Eckard et al., 2017 ; Brandl et al., 2016

Nématodes entomopathogènes

(EPN)

Hexamermis sp. Pathogène de A. obscurus Doane et al., 1973

Heterorhabditis bacteriophora Pathogène grâce à la symbiose avec une bactérie toxique pour la larve A. lineatus - Cause jusqu'à 67% de mortalité

Ansari et al., 2009 ; Eidt and Thurston, 1995 Steinernema feltiae Pathogène pour la larve grâce à sa symbiose avec une bactérie,

mais des études ont montré une réponse immunitaire du taupin à l'attaque de cet EPN

Bactéries entomopathogènes

(EPB)

Photorhabdus luminescens Bactérie symbiotique de H. bacteriophora - favorise la virulence

de l'EPN auquel elle est spécifique par la libération de toxine Blackburn et al., 1998 ; Rahatkhah et al., 2015

Xenorhabdus nematophila Bactérie symbiotique de S. feltiae - favorise la virulence de l'EPN

auquel elle est spécifique par la libération de toxine Cho and Kim, 2004 ; Rahatkhah et al., 2015

Rickettsiella agriotidis Identifiée sur des larves Agriotes sp. en Allemagne - associée à la mortalité des larves - pathogénéicité en cours d'évaluation

Leclerque et al., 2011 ; Kleespies et al., 2012 ; Leclerque A., 2018

Figure 7 : Etapes de la mise en œuvre de la gestion intégrée des ennemis des cultures (source : MAPAQ, 2018).

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GALLAIS Perrine| Conception d’un olfactomètre permettant de cribler des substances d’origine naturelle, actives sur les larves de taupin, dans l’objectif de développer un produit de biocontrôle 11 La lutte génétique fait partie des solutions, en sélectionnant des espèces végétales résistantes aux espèces d’Agriotes, ou bien moins sensibles, synthétisant des molécules répulsives ou anti-appétantes, par exemple les glycoalkaloïdes (solanine ou chaconine) synthétisés par la pomme de terre (Jonasson and Olsson, 1994 ; Barsics et al., 2013). Concernant Agriotes spp, ce sujet fait l’objet de travaux à développer (La Forgia et al., 2020).

L’ARNi est un ARN double brin empêchant l’expression de gènes ciblés, est également une méthode utilisée (Rodrigues and Figueira, 2016 ; Mamta and Rajam, 2017). Dans certains pays la production les plantes transgéniques Bt (maïs et cotton), résistantes aux insectes lié à la production d’ARNi, est autorisée.

Cependant, en plus des problèmes éthiques concernant les OGMs, de plus en plus d’espèces résistantes apparaissent (Rodrigues and Figueira, 2016).

Des recherches sont également en cours sur l’application d’ARNi (ARNinterférent) dans les parcelles (C. King, 2018), et cette technique, spécifique à une espèce de ravageur, n’a pas d’effet sur les espèces non- cibles (Wang-Pruski. Pour le moment limitée, lié à l’instabilité de l’ARNi, elle pourrait être reconnue dans quelques années comme alternative aux pesticides (C. King, 2018).

La lutte biologique repose sur la réduction des populations de bio-agresseurs par l’utilisation d’ennemis naturels, aussi appelés auxiliaires des cultures (INRA Sciences, 2018). Ces auxiliaires sont mis à profit de trois manières différentes. La lutte biologique par acclimatation consiste à introduire un auxiliaire exotique de façon durable. La lutte biologique par augmentation implique de relâcher des auxiliaires dans les cultures dans le but de contrôler les bio-agresseurs pendant une période donnée. Enfin, la lutte biologique par conservation, met en jeu l’aménagement du paysage et la modification des pratiques culturales, dans le but de favoriser le développement des ennemis naturelles des bio-agresseurs (INRA Sciences, 2018 ; Fauvergue et al., INRAE, 2020).

Cette lutte biologique s’inscrit dans la lutte intégrée contre les ravageurs ou Integrated Pest Management (IPM) (Figure 7). D’après la FAO (Food and Agriculture Organization) c’est « la prise en compte de toutes les techniques de lutte disponibles et l'intégration des mesures appropriées qui découragent le développement des populations de ravageurs et maintiennent les pesticides et autres interventions à des niveaux économiquement justifiés et réduisent ou limitent au minimum les risques pour la santé humaine et l'environnement » (FAO, 2005). Actuellement, l’IPM contre le taupin n’est pas répandue en Europe mais fait l’objet de nombreuses recherche prometteuses (Furlan et al., 2014, 2017).

Elle fait également l’objet de nombreux travaux en recherche et développement d’alternatives aux PPP dans le cadre de la lutte contre le taupin (Thibord et al., 2017). Prédateurs, bactéries, champignons et nématodes entomopathogènes (La Forgia and Verheggen, 2019), sont étudiés pour évaluer l’effet de leur introduction dans les communautés d’Agriotes, en tant qu’organismes auxiliaires (Tableau 3).

(26)

Figure 8 : Vue d’ensemble des interactions trophiques médiées par les composés organiques volatiles (VOCs) libérés par les plantes (Delory et al., 2016).

Figure 11 : Schéma explicatif de la stratégie « Attract and Kill » (AK) utilisant comme appât le CO2 et comme insecticide la substance active azadirachtine (source : The University of Applied Science Bielefeld).

Figure 9 : Vue d’une parcelle dans laquelle sont apportés de façon endogène les glucosinolates, par bio-fumigation (photo : Division de la recherche des Fermes Cavendish, 2015).

Figure 10 : Encapsulation d’extrait de neem, comportant la substance active azadirachtine, utilisée en stratégie AK dans la lutte contre le taupin (Humbert et al., 2018).

(27)

GALLAIS Perrine| Conception d’un olfactomètre permettant de cribler des substances d’origine naturelle, actives sur les larves de taupin, dans l’objectif de développer un produit de biocontrôle 13 1.4.3. Alternatives aux PPP et perspectives contre le taupin

L’objectif de la stratégie est de réguler au maximum l’abondance des populations de taupins dans les parcelles impactées (Thibord et al., 2017). Actuellement des méthodes relevant du biocontrôle sont en cours, notamment l’utilisation de substances actives naturelles (INRA-Arvalis, 2009 ; Ritter and Richter, 2013).

Les plantes produisent des substances chimiques impliquées naturellement dans le dialogue moléculaire. Certaines molécules leurs permettent de se protéger et de se défendre contre les bio-agresseurs, de façon directe : toxicité et/ou propriété répulsive envers la larve phytophage ; ou bien indirecte : recrutement d’ennemis naturels des larves (Rassman et al., 2005 ; Delory et al., 2016). Elles peuvent aussi servir de signal de défense pour les plantes avoisinantes (Delory et al., 2016) (Figure 8). Ces composés, naturellement présents chez certaines espèces de plantes, ont un intérêt particulier dans le développement de méthodes de lutte contre le taupin.

Par exemple, les glucosinolates sont synthétisés chez les Brassicacées telles que la moutarde brune Brassica juncea, moutarde blanche Sinapis alba, radis fourrager Raphanus sativus, etc (Thibord et al., 2017).

Leur dégradation dans l’environnement, par hydrolyse enzymatique, amène à la synthèse d’isothiocyanates (ICT) ayant des propriétés répulsives et/ou insecticides (Romanowski et al., 2000), c’est le cas de la sinigrine dégradées en isothiocyanates d’allyl (ANSES, 2013). Pour lutter contre le taupin ces substances actives sont utilisées en bio-fumigation dans les parcelles infestées de façon endogène (couvert interculturaux) (Figure 9) ou exogène (application par épandage par exemple).

L’azadirachtine, produite par le margousier d’Inde Azadirachta indica (Cherry and Nuessly, 2010 ; Humbert et al., 2017), est utilisée expérimentalement pour ses propriétés insecticides, dans la stratégie

« Attract and Kill » (AK), dont l’efficacité a été démontrée par de nombreux travaux. Cette stratégie consiste à attirer un ravageur cible par le CO2 ou substances attractives, puis de le détruire par un agent insecticide, ici l’azadirachtine (Vernon et al., 2015 ; Humbert et al., 2018) (Figure 10 et 11). Certaines huiles essentielles ont également des propriétés répulsives (Barsics et al., 2013). L’enrobage des semences, l’application locale ou en sillon dans les cultures sont des techniques qui mettent en œuvre l’utilisation de ces substances actives.

C’est une transition vers des techniques alternatives qui permet de limiter, en quantité, l’apport de produits chimiques synthétiques dans les parcelles infestées (Barsics et al., 2013).

(28)

Tableau 4 : Différents olfactomètres développés lors de travaux scientifiques sur le comportement de ravageurs du sol, dont la larve de taupin (sources : cf « sources » du tableau).

Olfactomètre développé Sources Etudes

Thorpe et al., 1946

Orientation et morsures des larves dans le sable en fonction des solutions

testées

Rasmann et al., 2005

Recrutement des EPN par les racines de maïs attaquées par insectes

herbivores

Barsics et al., 2012, 2015 Essai double-choix des larves en fonction des

VOCs testés

Gfeller et al., 2013

Essai double-choix des larves en fonction du stade de développement

de la plante cible

La Forgia et al., 2019

Essai double-choix des larves en fonction des variétés de maïs (VOCs

plus ou moins libérés)

(29)

GALLAIS Perrine| Conception d’un olfactomètre permettant de cribler des substances d’origine naturelle, actives sur les larves de taupin, dans l’objectif de développer un produit de biocontrôle 15 Les recherches menées jusqu’à aujourd’hui concernent surtout les organismes nuisibles de surface et des parties aériennes des cultures. En effet, de nombreuses molécules attractives sont actuellement connues, comme les médiateurs chimiques (phéromones ou kairomones). L’intérêt aujourd’hui se porte sur le développement de méthodes adaptées aux ravageurs telluriques.

Les VOCs, évoqués dans la partie 1.4.1, identifiés dans le cadre d’études sur le comportement du taupin, ont des propriétés différentes. Certains sont attractifs, d’autres répulsifs ou recruteurs d’ennemis naturels (Barsics et al., 2012, 2013, 2017 ; La Forgia et al., 2020). Des études récentes ont permis de mettre en évidence le 2-pentylfuran (Barsics et al., 2012) ou encore quelques aldéhydes (Gfeller et al., 2013 ; Barsics et al., 2017 ; La Forgia et al., 2020), libérés initialement ou en réponse de défense contre la larve de taupin, par les racines d’orge et de maïs.

Pour vérifier le comportement des larves face aux non-VOCs ou VOCs, les chercheurs ont développé des dispositifs appelés olfactomètres (Tableau 4). Concernant les composés non-VOCs, l’olfactomètre a d’abord permis à Thorpe et son équipe (1946) de démontrer que l’orientation des larves était influencée par la présence de ces composés, comme l’acide aspartique, asparagine, acide glutamique, glutamine, etc (Thorpe et al., 1946). De plus, Jonasson et Olsson (1994) ont mis en évidence que les larves étaient capables d’éviter les plants de pomme de terre trop riche en glycoalkaloïdes (solanine et chaconine), composés leurs étant indigestes (Barsics et al., 2013). Concernant les VOCs, de nombreux travaux ont permis de montrer l’effet attractif du CO2, libéré par les racines, sur le taupin (Thorpes et al., 1946 ; Doane et al., 1978 ; Barsics et al., 2013). Rasmann et son équipe (2005) ont également développé un olfactomètre, cette fois, pour démontrer que les racines de maïs attaquées par la Chrysomèle du maïs, recrutait les EPN tels que Heterorhabditis megidis (Tableau 4).

Ces composés volatils ont été identifiés grâce à des techniques de chromatographie à phase gazeuse (GC-MS). Leurs effets sur le comportement des larves a ensuite été évalué, grâce au système d’olfactomètre à « double-choix » qu’ils ont développé (Gfeller et al., 2013 ; Barsics et al., 2015 ; La Forgia et al., 2020) (Tableau 4).

(30)

(31)

1.5. Objectifs

L’objectif de ce stage, réalisé en deuxième année de Master BV Gestion de la Santé des Plantes en alternance, au LNV (Laboratoire de Nutrition Végétale) du CMI (Centre Mondial de l’Innovation), est de concevoir un olfactomètre permettant d’évaluer l’effet de substances d’origine naturelle actives sur le taupin du maïs au stade larvaire. L’olfactomètre permettra ultérieurement de cribler ces substances en leur attribuant les propriétés d’attractivité, de répulsion ou insecticide.

Le travail pour atteindre cet objectif est divisé en plusieurs étapes :

1- Concevoir un olfactomètre adapté à l’étude du comportement des insectes ravageurs telluriques des cultures et particulièrement des larves de taupin.

2- Valider l’olfactomètre fabriqué, en montrant que les larves attaquent leur plante cible, en conditions expérimentales et en vérifiant la diffusion des VOCs à l’intérieur de l’olfactomètre, permettant l’attraction des larves de taupin.

3- Tester en routine, grâce à l’olfactomètre validé, l’effet de produit de biocontrôle sur le comportement de larves de taupin (attractif – répulsif – neutre).

(32)

Tableau 5 : Ensemble des caractéristiques physiques et fonctionnelles d’olfactomètres d’intérêt, développés lors d’études scientifiques sur le comportement des larves de taupin. En orange sont surlignées les caractéristiques retenues pour l’étude (sources : cf « sources » dans le tableau) (PG).

Condition 1 Condition 2 Condition 3

Terreau/Vermiculite non autoclavé Plant arrosé avec

eau osmosée

Terreau/Vermiculite autoclavé Plant arrosé avec

eau osmosée

Terreau/Vermiculite autoclavé Plant arrosé avec solution nutritive Nom abrégé Non-stérilisée Stérilisée Fertilisée

Répétition 8 répétions / condition

Modalité

Tableau 6 : Détails des conditions de culture testées pour l’étude.

(33)

2. Matériel & Méthode

2.1. Conception de l’olfactomètre

2.1.1. Définition du cahier des charges

Un travail bibliographique a été réalisé afin de rassembler les caractéristiques requises pour concevoir un outil (olfactomètre) qui permet de tester des substances actives d’origine naturelle sur les larves de taupin. Le produit de ce travail a permis de retenir les caractéristiques et les conditions optimales de l’étude (Tableau 5). Cette démarche a permis de construire un cahier des charges, inspiré initialement d’un olfactomètre conçu par Rasmann et son équipe (2005) (Cf. Tableau 4).

2.1.2. Conception et fabrication de l’olfactomètre par AFU

Pour la fabrication de cet olfactomètre complexe, non vendu dans le commerce, l’entreprise AFU a été sollicitée. Basée à Saint-Malo, AFU est spécialisée en conception de mécanique de précision ainsi qu’en impression 3D métal. Premièrement, une étude et une mise en plan ont été réalisées. Après plusieurs échanges et modifications, le projet et le plan ont été validés par un accord collectif. Ainsi la réalisation complète d’un prototype a été lancée, par fabrication en usinage.

2.2. Méthodes de validation de l’olfactomètre

Pour valider l’usage ultérieur de l’olfactomètre comme outil de criblage de molécules naturelles actives sur le taupin, plusieurs étapes ont été nécessaires : i) valider l’attaque de larves de taupin sur le maïs ou extrait attractif de maïs, dans l’olfactomètre ; ii) valider la capacité de diffusion des VOCs, dans l’olfactomètre.

2.2.1. Méthode pour valider l’attaque des larves sur le maïs en conditions expérimentales Afin de déterminer les conditions optimales de la culture au sein de l’olfactomètre, un essai en pot a été effectué. Ensuite, pour s’assurer que les larves se comportent naturellement face à cette plante cible, en conditions expérimentales, des tests avec larves ont été effectués en pot. Ces tests comportementaux seront réalisés au sein de l’olfactomètre, lors de sa réception.

Des essais de culture ont été réalisés pour définir les conditions optimales de croissance du maïs.

Chaque essai comprend 3 conditions avec 8 répétitions (correspondant à un plant de maïs dans un pot) (Tableau 6). Les conditions de culture sont les suivantes :

- Terreau/Vermiculite (50/50) + arrosage eau osmosée

- Terreau/Vermiculite (50/50) autoclavé* + arrosage eau osmosée - Terreau/Vermiculite (50/50) autoclavé* + arrosage solution nutritive

*Pour éliminer les microorganismes susceptibles d’interférer lors des tests comportementaux, et éviter toute contamination des larves.

Le substrat est autoclavé en cycle solide, 30 minutes à 121°C.

(34)

Figure 13 : Larve de taupin utilisée pour les inoculations dans les pots de maïs (a).

Image d’un pot dans lequel chacune d’entre elles est stockée avant l’expérimentation en serre de confinement (b) (Photos : PG).

Figure 14 : Photo de pots contenant les plants de maïs, 7 jours après repiquage, le jour de l’inoculation avec les larves de taupin (Photo : PG).

Figure 12 : Images des pots dans lesquels sont cultivés les plants de maïs pour l’étude (Photo : PG).

b a

1 cm

(35)

GALLAIS Perrine| Conception d’un olfactomètre permettant de cribler des substances d’origine naturelle, actives sur les larves de taupin, dans l’objectif de développer un produit de biocontrôle 21 Pour chaque essai, des semences de maïs de la variété MAESTRO ont été semées en plaques de 40 trous. Les plaques ont été placées en chambre de croissance, 16h de jours et 8h de nuit, 20-21°C. Une semaine après le semis, les jeunes plants ont été repiqués en pots de culture rectangulaires (75x75x100mm) (Figure 12), de taille semblable à celles prévus dans l’olfactomètre. Les plants en pot ont été placés en serre régulée, puis arrosés 3 fois par semaine d’eau osmosée ou d’une solution nutritive spécifique à la culture de maïs (protocole de la station de fertilisation), selon la modalité.

Un suivi phénotypique a été réalisé (photos à j0, j+7, j+14, j+21 post-repiquage). Au stade 5 feuilles (BBCH 15), le système racinaire de chaque plant a été récolté pour des analyses de VOCs en GC-MS. La partie foliaire a été récoltée, mesurée et pesée, puis séchée à l’étuve pour des analyses élémentaires CHN. L’analyse élémentaire permet de mesurer la quantité d’azote et de carbone présent dans 2,5 mg de matière sèche végétale. Cette valeur traduit la capacité de la plante à absorber l’azote minéral par ses racines et le carbone minéral par la photosynthèse, afin de produire sa biomasse.

Les larves de taupin ont été fournies par Cotésia, à raison d’un envoi de 20 larves par semaine, de taille optimale pour les tests comportementaux (de 15 à 20mm) (La Forgia et al., 2020) (Figure 13a). Ces larves ont été stockées individuellement, pour éviter le cannibalisme (Rabb et al., 1963; Furlan et al., 1998) dans des boîtes de 250mL remplies de moitié d’un substrat terreau/vermiculite (50/50) légèrement humidifié (R. Schelkens, 2019). Des graines d’orge et de blé d’hiver, préalablement trempée, ont été semées dans chaque boîte (~10/boîte) et recouvertes d’une fine couche de substrat. Une semaine après le semis, une larve a été ajoutée par boîte (R. Schelkens, 2019) (Figure 13b). Les boîtes contenant les larves ont été stockées en chambre de croissance (20-21°C) à l’obscurité.

Un essai a été lancé pour vérifier la capacité des larves à attaquer le maïs en pot, dans les conditions d’expérimentation, en serre de confinement. Cet essai comprend les mêmes conditions de culture que les précédents, à l’exception que chaque condition ait été divisée en deux groupes : 1) Plants « non inoculés » ; 2) Plants « inoculés ». Pour l’inoculation, deux larves par pot ont été ajoutées, dans trois pots de chaque condition. Chacune des trois conditions contenait donc : 5 plants témoins non inoculés (=5 répétitions) et 3 plants inoculés (=3 répétitions). Un morceau de papier aluminium a été placé à la surface des plants inoculés, pour éviter que les larves ne s’échappent, et des plants témoins, pour garder les mêmes conditions (Figure 14).

La grille de notation comprend plusieurs paramètres. Avant la récolte, un suivi phénotypique des plants a été effectué tous les 3 jours pendant 10 jours (prise de photos) et une analyse Dualex a permis de prélever la teneur en chlorophylle de chaque plant. Pendant la récolte, l’état des larves (vivantes ou non) et l’identification des zones d’attaque des larves ont été relevés. Enfin le nombre de morsures visibles a été compté.

(36)

a

c d

b

Figure 15 : Etapes de récolte des plants de maïs de 28jours, 21 jours après repiquage. Les racines sont retirées du pot (a), lavées (b et c), séparées des parties foliaires et pesées. 500mg sont broyés et ajoutés dans un flacon pour les analyses chromatographique (d) (Photos : PG).

Tableau 7 : Ensemble des VOCs répertoriés, issus de la bibliographie et impliqués dans l’interaction entre les larves de taupins et les racines d’orge ou de maïs.

(37)

GALLAIS Perrine| Conception d’un olfactomètre permettant de cribler des substances d’origine naturelle, actives sur les larves de taupin, dans l’objectif de développer un produit de biocontrôle 23 2.2.2. Méthode pour valider la présence des VOCs dans les racines de maïs et leur diffusion

dans l’olfactomètre

Afin de répertorier les VOCs produits et libérés par les racines de maïs, impliqués dans l’attraction et la répulsion des larves de taupin, un travail bibliographique a été réalisé (Tableau 7).

Cinq d’entre eux, attractifs, ont été sélectionnés et commandés au fournisseur Sigma-Aldrich : 2- pentylfuran, hexanal, heptanal, nonadienal et trans-2-hexen-1al. Pour analyser ces VOCs, une micro extraction sur phase solide (SPME) a été réalisée. Le principe consiste à absorber les molécules à analyser sur une fibre de silice fondue enrobée d’un polymère (Fauvergue et al., INRAE, 2020). Pour extraire le VOC, la fibre est placée dans le milieu aérien odorisé dans le flacon d’analyse. Ainsi le composé est absorbé, il est ensuite désorbé thermiquement dans un chromatographe en phase gazeuse et analysé.

Ces cinq VOCs de référence, ont été dilués d’un facteur 1000 dans de l’éthanol 96%, et 1 mL de solution a été analysé. L’extraction des composés sur la fibre SPME a été réalisée pendant 30 minutes à 30°C.

Il ont ensuite été injectés dans une colonne de 60 m avec un débit de 1,5 mL/min, pour une durée d’analyse de 35 minutes.

Pour vérifier la synthèse de ces VOCs par le maïs, les essais mentionnés en 2.2.1, ont été utilisés.

Une récolte des parties racinaires a été effectuée au stade 5 feuilles (BBCH 15) (Figure 15). Deux techniques de préparation d’échantillons de racines, destinés aux analyses GC-MS, ont été appliquées :

- Racines fraîches, nettoyées puis broyées à la main, ajouté au flacon

- Racines fraîches, nettoyées, mises dans l’azote liquide, congelées et broyées au Cryo Mill, poudre ajoutée au flacon

Les échantillons de racines ont été analysés en GC-MS selon le protocole décrit pour les VOCs de référence.

(38)

N° de la pièce 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nom de la

pièce Pot Couvercle Filtre Tube 4 Raccord Tube 6 Base centrale Embout Bouchon

Matière polymère ou inox

polymère ou inox

polymère ou

inox polymère ou inox polymère ou inox

polymère ou inox

Spécificité

Reçoit la plante ou le produit -

capacité d'y assembler le filtre - plus tard :

doit être fabriqué en 3

hauteurs différentes

Permet de limiter le passage des volatils - doit laisser passer la

plante

Evite le passage du ravageur dans le pot - Matière qui doit

éviter l'attaque du ravageur

Permet assemblage

du raccord au pot, par l'intérieur

Facilement démontable -

permet le prélèvement des

ravageurs

Permet assemblage du raccord à la base

centrale, par l'intérieur

Centre du dispositif où sont introduits les

ravageurs - Chacune des entrées menant aux tubes 6 doit pouvoir être fermée

par un bouchon étanche au niveau

de sa base

Empèche les ravageurs de s'échapper

Ferme le dispositif au

niveau de l'embout après introduction des ravageurs

Assemblage Fixé au tube 4

Assemblé au pot avec joint

torique

Assemblé au pot - doit pouvoir être inséré ou retiré

par le tube 4

Fixé au pot

S'emboîte dans le tube 4 jusqu'au pot où se situe le filtre S'emboîte dans le tube 6 jusqu'à

sa moitié

Fixé à la base centrale sur chacun des côtés

Fixée aux tubes 6 Fixée à l'embout

Fixé à la base centrale

Assemblé à l'embout

Dimensions

D50mm max H100mm/

H50mm/H35mm

D50mm

D35mm Maille : 0,036mm l0,042mm

D35mm

H30mm D34mm H60mm D35mm H60mm L35mm l35mm H60mm

D20mm

H20mm D20mm

Figure 16 : Premier jet du cahier des charges réalisé pour la fabrication de l’olfactomètre, revu et amélioré avec AFU. (a) croquis du dispositif ; (b) ensemble des caractéristiques correspondant à chacune des pièces du dispositif (PG).

Figure 17 : Plan de l’olfactomètre élaboré par AFU, validé pour fabrication (source : AFU).

a

b

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3. Résultats

3.1. Conception de l’olfactomètre

Dans le but de fabriquer un olfactomètre permettant de tester des biomolécules actives sur les larves de taupin, un cahier des charges a été conçu. Ce cahier des charges a été utilisé pour la fabrication de l’olfactomètre par l’entreprise AFU.

3.1.1. Travaux bibliographiques

Le cahier des charges a été conçu sur la base de la bibliographie. Les caractéristiques relevées ont été répertoriées dans le tableau 5 de la partie Matériels et méthodes.

3.1.2. Cahier des charges

Le travail bibliographique a permis de spécifier les caractéristiques de l’olfactomètre. L’adaptation et l’amélioration des caractéristiques relevées de la bibliographie ont permis de définir le cahier des charges de l’olfactomètre (Figure 16). Les premières adaptations ont été les suivantes :

Le dispositif doit être :

- démontable pour permettre une récupération plus facile des larves et un nettoyage efficace ; - imperméable à l’eau, au CO2 et aux VOCs ;

- opaque, gardant l’obscurité à l’intérieur. Ceci évite l’ajout de housse épaisse pendant l’expérimentation, et une probable variabilité ;

- fait de matériaux résistants à l’usure et au nettoyage fréquent, pour s’adapter à des tests en routine et donc une fréquence importante d’utilisation ;

- fait de matériaux autre que le verre qui est facilement cassable, tel que l’inox et/ou un polymère résistant

- résistant aux cycles d’autoclavage 3.1.3. Olfactomètre fabriqué par AFU

Après réalisation du cahier des charges, du choix des matières, de l’adaptation des dimensions et validation du plan, un prototype de l’olfactomètre a été fabriqué par usinage (Figure 17). Le prototype est fait de plusieurs pièces amovibles en inox et polymère noir opaque, étanches lorsqu’elles sont assemblées grâce aux joints toriques et gardant l’obscurité à l’intérieur. Les pots de cultures sont ronds et non carrés comme ils étaient prévus dans le cahier des charges, car cela facilitait l’usinage par AFU, et facilitera le nettoyage après chaque test.