3. R ESULTATS
3.1.2. Cahier des charges
Le travail bibliographique a permis de spécifier les caractéristiques de l’olfactomètre. L’adaptation et l’amélioration des caractéristiques relevées de la bibliographie ont permis de définir le cahier des charges de l’olfactomètre (Figure 16). Les premières adaptations ont été les suivantes :
Le dispositif doit être :
- démontable pour permettre une récupération plus facile des larves et un nettoyage efficace ; - imperméable à l’eau, au CO2 et aux VOCs ;
- opaque, gardant l’obscurité à l’intérieur. Ceci évite l’ajout de housse épaisse pendant l’expérimentation, et une probable variabilité ;
- fait de matériaux résistants à l’usure et au nettoyage fréquent, pour s’adapter à des tests en routine et donc une fréquence importante d’utilisation ;
- fait de matériaux autre que le verre qui est facilement cassable, tel que l’inox et/ou un polymère résistant
- résistant aux cycles d’autoclavage 3.1.3. Olfactomètre fabriqué par AFU
Après réalisation du cahier des charges, du choix des matières, de l’adaptation des dimensions et validation du plan, un prototype de l’olfactomètre a été fabriqué par usinage (Figure 17). Le prototype est fait de plusieurs pièces amovibles en inox et polymère noir opaque, étanches lorsqu’elles sont assemblées grâce aux joints toriques et gardant l’obscurité à l’intérieur. Les pots de cultures sont ronds et non carrés comme ils étaient prévus dans le cahier des charges, car cela facilitait l’usinage par AFU, et facilitera le nettoyage après chaque test.
Figure 20 : Pourcentages d’azote (a) et de carbone (b) des parties foliaires du maïs, en fonction des conditions de culture du maïs (non-stérilisée, stérilisée, fertilisée), obtenus par analyse CHN.
Figure 19 : Moyennes des masses fraîches foliaires (a) et moyennes des longueurs foliaires (b) en fonction des conditions de culture du maïs (non-stérilisée, stérilisée, fertilisée).
1 2 3
Figure 18 : Image des plants de maïs de 28 jours, 21 jours après repiquage, représentatifs de chacune des trois conditions : (1) 4 plants de la condition non-stérilisée, (2) 4 plants de la condition stérilisée, (3) 4 plants de la conditions fertilisée (Photos : PG).
a b
a b
GALLAIS Perrine| Conception d’un olfactomètre permettant de cribler des substances d’origine naturelle, actives sur les larves de taupin, dans l’objectif de développer un produit de biocontrôle 27
3.2. Validation de l’olfactomètre
Afin de valider l’olfactomètre, une détermination des conditions optimales de culture du maïs a d’abord été effectuée. Des tests avec les larves de taupin ont ensuite été réalisés dans les pots de culture de maïs, pour vérifier leur comportement naturel en conditions expérimentales. Enfin, pour vérifier la présence des VOCs de référence dans les racines de maïs (Cf. Matériels et méthodes), des analyses chromatographiques ont été effectuées.
3.2.1. Définition des conditions d’attaque des larves sur les racines de maïs en pot
Pour définir les conditions optimales de culture, trois conditions ont été testées (non-stérilisée ; stérilisée ; fertilisée) (Cf. Matériels et méthodes).
Dans un premier temps, le suivi phénotypique des parties foliaires, jusqu’au stade 5 feuilles, a été réalisé. L’observation à l’œil nu a révélé que les plants des essais se sont relativement bien développés, particulièrement ceux de la condition 3 (Figure 18, 3). A la fin de l’essai au stade BBCH15, une coloration rougeâtre a été observée sur les feuilles des plants, particulièrement ceux des conditions 2 (stérilisée) et 3 (fertilisée), témoignant d’un léger stress, probablement lié à une taille de pot trop petite, non adaptée pour ce stade de développement (les plants sont trop âgés).
La figure 19 montre les moyennes des masses foliaires fraîches et sèches (Figure 19a), ainsi que les résultats des longueurs foliaires du maïs (Figure 19b). Les masses fraîches et sèches sont en moyenne plus élevées pour les plants de la condition 3 (fertilisée). Les moyennes de longueurs foliaires sont aussi les plus élevées dans la condition fertilisée. Cette tendance est également observée pour les masses fraîches racinaires (graphique non présenté).
La figure 20 regroupe les résultats des analyses élémentaires CHN des parties foliaires. Le pourcentage d’azote (N) (Figure 20a) ainsi que le pourcentage de carbone (c) (Figure 20b) y sont représentés.
Ces résultats mettent en évidence un rapport C/N moins important dans les plants de la condition fertilisée, lié à l’apport de nutriments via la solution nutritive.
Ces premiers résultats permettent de dire que le développement du maïs est avantagé lorsque les plants sont cultivés en substrat fertilisé.
Figure 21 : Photo des plants de maïs, 12 jours après inoculation, représentatif de chacune des trois conditions : (a) non-stérilisée et inoculée (b) non-stérilisée et non-inoculée, (c) stérilisée et inoculée, (d) stérilisée et non-inoculée, (e) fertilisée et inoculée, (f) fertilisée et non-inoculée (Photo : PG).
Figure 22 : Moyennes des masses fraîches foliaires (a) et des longueurs foliaires (b) en fonction des conditions de culture du maïs (non-stérilisée, stérilisée, fertilisée), et en fonction de l’inoculation ou non avec les larves.
Figure 23 : Teneurs en chlorophylle (µg/cm²) obtenues par prélèvement Dualex sur la face supérieure des feuilles de maïs, en fonction des conditions de culture.
a b c d
d e f
Figure 24 : Attaque (a) et morsures (b) de larves de taupin sur les grains des plants de maïs (Photos : PG).
1 cm a b
GALLAIS Perrine| Conception d’un olfactomètre permettant de cribler des substances d’origine naturelle, actives sur les larves de taupin, dans l’objectif de développer un produit de biocontrôle 29 3.2.2. Attaque des larves sur les racines de maïs en pot
L’objectif préalable était de déterminer les conditions optimales d’attaque de graines ou racines de maïs par les larves de taupin.
La figure 21 montre des plants de maïs de 21 jours, photographiés 7 jours après inoculation avec les larves de taupin. Les observations à l’œil nu, faites le jour de la récolte, ne permettent pas d’effectuer une première discrimination entre les plants non-inoculés et les plants inoculés, excepté pour la condition fertilisée (Figure 21).
Les histogrammes de la figure 22 montrent les moyennes de masses fraîches et de longueurs foliaires du maïs (Figure 22b), en fonction des trois conditions. Les moyennes des masses foliaires (Figure 22a) révèlent une différence entre les plants témoins non inoculés et les plants inoculés, plus accrue dans la condition fertilisée, avec des valeurs respectives de 11,3g et 7,6g (en vert). Les résultats des longueurs foliaires (Figure 22b) suivent la même tendance, mettant en avant une différences plus importante dans la condition fertilisée 3 (en vert), avec une moyenne de 69,3 cm pour les plants témoins et 63,0 cm pour les plants inoculés.
La figure 23 montre la teneur en chlorophylle des parties foliaires de plants de maïs, en fonction des conditions de culture. Une nouvelle fois, ces résultats mettent en évidence, une différence plus prononcée dans la condition fertilisée entre les plants témoins (moyenne de 22,1 µg/cm²) et les plants inoculés (moyenne de 14,3 µg/cm²). Par ailleurs, les plants inoculés de cette condition fertilisée, possèdent la teneur en chlorophylle la plus faible des trois conditions (Figure 23, en vert).
Enfin, le relevé de morsures des larves a permis de répertorier quelques attaquent de larves (Figure 24b), notamment sur une graine de plant inoculé de la condition fertilisée (Figure 24a).
Cette seconde partie de résultats permet de dire que l’inoculation des plants par les larves a un effet plus prononcé sur le développement du maïs lorsqu’il est cultivé en condition fertilisée.
Figure 25 : Nombre moyen de VOCs identifiés en GC-MS, en fonction des deux techniques de préparation d’échantillons : (bleu) racines fraîches broyées, (orange) racines congelées broyées, et en fonction des conditions de culture du maïs.
Tableau 9 : VOCs de référence dans les échantillons de racines de maïs, en fonction des trois conditions (non-stérilisée, stérilisée, fertilisée). Chaque cellule bleue représente la présence d’un VOCs de référence mentionné dans la première ligne du tableau.
VOCs Component RT Component Area Tableau 8 : VOCs de référence analysés en GC-MS, leurs temps de rétention et aires sous les pics correspondants, issus des chromatogrammes obtenus.
Conditions Répétitions Hexanal Heptanal 2-pentylfuran 2,6-nonadienal Trans-2-hexen-1-al R1
GALLAIS Perrine| Conception d’un olfactomètre permettant de cribler des substances d’origine naturelle, actives sur les larves de taupin, dans l’objectif de développer un produit de biocontrôle 31 3.2.3. Validation de la présence des VOCs de référence dans les racines de maïs
Des VOCs, connus dans la littérature comme attractifs pour le taupin, ont été achetés et utilisés comme référence. Ils ont été analysés en GC-MS (développement de méthode ; temps de rétention). Ce travail a permis d’analyser les VOCs produits dans les échantillons de maïs, dans les trois conditions, non stérilisée, stérilisées et fertilisée.
Dans le but de connaître la technique optimale de récolte des racines pour les analyses chromatographiques une première analyse a été effectuée. Deux techniques de préparation d’échantillons (racines fraîches broyées et racines congelées broyées) ont été testées pour comparer les VOCs identifiés.
L’histogramme de la Figure 25 montre la moyenne du nombre total de VOCs identifiés, de chacune des trois conditions, en fonction des deux techniques de préparation d’échantillons. Les résultats révèlent que le nombre moyen de VOCs est plus élevé dans les parties racinaires congelées puis broyées, dans les trois conditions (Figure 25, en orange).
Ces éléments permettent de retenir que le nombre moyen de VOCs est plus élevé dans les racines plongée dans l’azote liquide à la récolte, puis congelée et broyées pour les analyses.
Le tableau 9 regroupe les résultats de présence ou absence dans chaque plant, de chacun des VOCs de référence. Trois conditions y sont représentées : non stérilisée, stérilisée, fertilisée (première colonne), ainsi que les 8 répétitions par condition, correspondant chacune aux racines d’un plant de maïs, analysées en GC-MS (deuxième colonne du tableau). Lorsqu’un VOCs est identifié et donc présent dans les racines d’un plant, la cellule est colorée en bleu. Lorsqu’il n’est pas présent, le cellule apparaît en blanc.
Dans un premier temps, ces résultats mettent en évidence la présence de trois principaux VOCs : l’hexanal, présent dans tous les échantillons racinaires des trois conditions de culture ; l’heptanal, présent dans tous les échantillons sauf 1 de la condition non-stérilisée ; et le 2-pentylfuran présent dans ¾ des échantillons (condition non-stérilisée et stérilisé) ou plus (condition fertilisée) (Tableau 9).
Dans un deuxième temps, le tableau révèle la présence du 2,6-nonadienal et tran-2-hexen-1-al presque exclusivement dans la condition fertilisée, excepté un échantillon de la condition stérilisée contenant le trans-2-hexen-1-al.
Ces analyses permettent de valider la présence de trois principaux VOCs (hexanal, heptanal, 2-pentylfuran) dans l’ensemble des conditions. En revanche, la culture du maïs en condition fertilisée, pourrait influencée la présence du 2,6-nonadienal et du tran-2-hexen-1. Leur absence dans les autres systèmes racinaires pourrait être due également à un problème d’identification en GC-MS (même formule brute).
4. Discussion
Depuis presque 20 ans, une recrudescence des populations de taupins est observée dans les parcelles agricoles de France (Thibord et al., 2017). Cette tendance est en partie liée au retrait d’autorisation de molécules actives, efficaces mais dangereuse pour la santé et l’environnement. Des stratégies existantes, par exemple la fumigation, sont aussi retirées peu à peu. Certains insecticides ont été bannis, comme les néonicotinoïdes (European Commission, 2018; Jactel et al., 2019). D’autre deviennent inactifs par l’apparition de résistance chez les insectes ravageurs. Les produits phytopharmaceutiques de contrôle du taupin en culture de maïs ou de pomme de terre, sont utilisés en traitement des semences ou en micro-granulés (ARVALIS, 2020) disparaissent peu à peu. Les substances actives efficaces sur le taupin, encore approuvées en 2020 sont peu nombreuses : la cyperméthrine (BELEM 0.8MG et FURY GEO) et la lambda-cyhalothrine (KARATE 0.4GR et TRIKA EXPERT+), deux substances de la famille des pyréthrinoïdes, sont aujourd’hui autorisées (ANSES, 2020). Il donc est primordiale de faire avancer la recherche pour trouver de nouvelles alternatives relevant du biocontrôle (Barsics et al., 2013 ; La Forgia et al., 2019). C’est dans ce contexte agronomique, que le Centre Mondial de l’Innovation (CMI) du Groupe Roullier cherche à développer de nouveaux produits d’agrofourniture.
Une stratégie nouvelle, issue de l’écologie chimique, consiste à utiliser des molécules volatiles attractives pour le taupin. Dans le cadre du développement de nouveaux produits de biocontrôle efficaces sur la taupin, l’objectif était de concevoir un olfactomètre permettant d’évaluer l’effet de ce type de substances actives sur le taupin du maïs, au stade larvaire. Pour mener à bien ce travail, les points sur lesquels j’ai travaillé ont été la conception du cahier des charges pour la fabrication de l’olfactomètre, puis, la détermination des conditions optimales de culture du maïs, adaptées à l’olfactomètre, favorisant l’attaque des larves et la présence de VOCs reconnus comme attractifs, dans le système racinaire.
4.1. Conception de l’olfactomètre
Les VOCs, composés organiques volatils, sont en partie produits par différents organes végétaux, dont le système racinaire (Rasmann et al., 2005 ; Delory et al., 2016). Les études récentes ont montré qu’ils étaient impliqués dans les interaction entre les racines de maïs et les larves de taupins (La Forgia et al., 2020). Pour développer de nouvelles stratégies de contrôle, ces VOCs font l’objet d’études du comportement des larves face à leur propriétés attractives ou répulsives. Ces travaux nécessitent l’utilisation d’un dispositif appelé olfactomètre.
N’étant pas commercialisé, cet olfactomètre a dû être conçu sur la base des caractéristiques décrites dans la bibliographique. Pour que le dispositif soit adapté à la physiologie de la larve de taupin (obscurité, T°, vitesse de déplacement, perception des odeurs, etc), ces caractéristiques ont été spécifiées pour construire le cahier des charges de l’olfactomètre.
GALLAIS Perrine| Conception d’un olfactomètre permettant de cribler des substances d’origine naturelle, actives sur les larves de taupin, dans l’objectif de développer un produit de biocontrôle 33 La fonction démontable de l’olfactomètre de Rasmann et son équipe (2005), est une caractéristique qui a été retenue, en revanche ses embranchements au nombre de 6 n’était pas une caractéristique essentielle. Concernant l’olfactomètre de Barsics (2014), l’idée de double-choix a été gardé, cependant le verre a été remplacé par une matière plus résistante à l’usure, opaque pour ne pas être contraint d’ajouter une housse au moment de chaque test. De plus, éviter un transfert de le plant de maïs du pot de culture à l’olfactomètre était d’intérêt pour l’étude, afin de limiter le stress infligé à la plante.
Ce cahier des charges a permis la fabrication de l’olfactomètre en usinage, par l’intermédiaire de l’entreprise AFU, spécialisée en mécanique de précision et impression 3D métal. Le processus a débuté par une validation du projet et plusieurs échanges, menant à des améliorations du cahier des charges. Après validation collective du plan proposé par AFU, la fabrication a été lancée. Dès livraison de l’olfactomètre, les premiers travaux auront pour but de valider son état physique. L’objectif sera ensuite de valider l’olfactomètre d’un point de vue fonctionnel. Ainsi, les tests effectués jusqu’à maintenant en pot, pourront être réalisés au sein du dispositif : tester en conditions optimales le comportement des larve, d’abord en présence de maïs, puis en présence des VOCs de référence (préalablement formulés). Avant ces tests, il sera nécessaire de vérifier la diffusion des VOCs racinaires et de référence (formulés) au sein de l’olfactomètre.
Quand la méthode sera mise en place, l’olfactomètre permettra de tester d’autres molécules à caractériser, active sur les larves de taupin. Il pourra également être décliner en versions différentes dans le but d’étudier d’autres ravageurs telluriques des cultures.
4.2. Conditions optimales d’attaque du taupin sur le maïs
Afin de préparer les expérimentations au sein de l’olfactomètre, des tests préalables ont été réalisés pour connaître les conditions de son utilisation. Ces tests ont permis de déterminer la condition de culture optimale du maïs, favorisant l’attaque des larves en conditions expérimentales et la présence de VOCs, connus pour leurs propriétés attractives sur les larves de taupin, dans les racines de maïs. La culture de maïs en condition fertilisée a été la plus favorable, notamment sur développement des plants et sur l’attaque des larves.
Les masses foliaires et racinaires, et les longueurs foliaires étaient plus élevées pour les plants cultivés en condition fertilisée. Ces affirmations montrent donc une biomasse plus important fabriquée par les plants de maïs. Dans cette condition également, les analyses élémentaires ont montré un rapport carbone/azote plus faible dans les parties foliaires des plants. Ce résultat est lié à un pourcentage d’azote dans les feuilles plus élevé dû à l’apport de solution nutritive. Les attaques de larves ont eu un effet plus accrue sur le maïs de cette condition, comparé aux deux autres conditions (non-stérilisée et stérilisée), observable par une biomasse et une teneur en chlorophylle des parties foliaires, plus faibles. C’est aussi dans cette condition fertilisée que l’identification des VOCs en GC-MS a permis de valider la présence des 5 VOCs de référence, particulièrement du 2,6-nonadienal et du trans-2-hexen-1-al. Ces deux aldéhydes n’ont pas été identifiés dans les conditions non-stérilisée et stérilisée, excepté dans un seul échantillon (condition stérilisée).
La fertilisation apporte à la plante des nutriments nécessaires à la synthèse de composés essentiels pour son développement (formation de biomasse) (Recous et al., 2017). L’azote par exemple, participe à la biosynthèse de composés indispensables tels que les acides aminés et les acides nucléiques, et à la biosynthèse de métabolites secondaires (Meyer et al., 2008). Certains de ces métabolites interviennent dans les mécanismes de défense de la plante contre les bio-agresseurs, impliqués dans la résistance des plantes contre les phytopathogènes ou ravageurs (Meyer et al., 2008, Bénard, 2009). Au contraire, certains composés libérés dans le sol par les racines, via l’exsudat racinaire, peuvent avoir des propriétés attractives pour les ravageurs. C’est notamment le cas des VOCs (Barsics et al., 2013).
L’attaque des larves de taupin sur le maïs en pot, en condition fertilisée, a pu être favorisée par plusieurs facteurs dont : la présence de composés attractifs différents et la quantité de ces composées au niveaux du système racinaire. En effet les VOCs 2,6-nonadienal et trans-2-hexen-1-al ont été identifiés presque exclusivement dans la condition fertilisée, ce qui pourrait expliqué Ces paramètres nécessites d’être étudiés plus en détail, dans la suite de l’études pour arriver au fonctionnement optimale de l’olfactomètre.
GALLAIS Perrine| Conception d’un olfactomètre permettant de cribler des substances d’origine naturelle, actives sur les larves de taupin, dans l’objectif de développer un produit de biocontrôle 35
5. Conclusion
Le taupin est un véritable problème agronomique. Au stade larvaire, ce ravageur tellurique à la particularité d’être extrêmement polyphage et d’être présent sur l’ensemble du territoire français. Les produits phytopharmaceutiques, qui étaient jusqu’à ce jour efficaces contre le taupin, sont peu à peu retirés du marché.
Ceci est dû à l’interdiction de leurs substances actives déclarées comme dangereuses pour la santé et l’environnement. La lutte contre le taupin est de plus en plus difficile, et nécessite le développement de méthodes alternatives, utilisant des molécules d’origine naturelle, dont le mode d’action est plus ciblé et dont l’impact sur la santé et les écosystèmes est moindre.
Ces méthodes alternatives font l’objet de nombreuses recherches et leurs utilisations voient le jour petit à petit. Pour contrôler ces insectes ravageurs, des stratégies existent déjà. Par exemple, l’utilisation des phéromones (stratégie de confusion sexuelle) ou des kairomones, permet de lutter contre ces ennemis des cultures, en perturbant leur cycle de reproduction ou en agissant sur leur comportement (Malausa et al., 2018).
Cependant ces stratégies sont peu développées pour les ravageurs telluriques et encore à l’état de recherches. C’est pourquoi le Centre Mondial de l’Innovation du Groupe Roullier s’y intéresse. Grâce à l’olfactomètre fabriqué pendant l’étude, de nouvelles biomolécules pourront être testées. Ainsi cela permettra de formuler des produits de biocontrôle efficaces contre les larves de taupins, plus respectueux de l’environnement. Un des avantages de l’olfactomètre est qu’il pourra être déclinée pour l’étude ravageurs telluriques différents du taupin. En effet ils existent un nombre considérable d’espèces telluriques nuisibles.
Les espèces d’insectes les plus connues sont Diabrotica virgifera (chrysomèle du maïs), Delia platura (mouche du chou), Agrotis spp (noctuelle) et bien d’autres. Il suffira d’adapter les caractéristiques physiques de l’olfactomètre à la physiologie du ravageur en question.
Bien évidemment, si l’une des biomolécules testées s’avère efficace en olfactomètre, des expérimentations au champs seront envisageables.