T H E S E
pour l’obtention du Grade deD O C T E U R D E L ’ U N I V E R S I T E D E P O I T I E R S (Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées)
(Diplôme National – Arrêté du 7 août 2006)
Ecole Doctorale : Ingénierie Chimique, Biologique et Géologique Secteur de Recherche : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie
Présentée par
Céline CAMPS
Soutenue le 29 juillet 2008
Commission d’examen :
Mr D. MERDINOGLU, Directeur de Recherche INRA, Colmar Rapporteur
Mr C. ROTHAN, Directeur de Recherche INRA, Bordeaux Rapporteur
Mme M. BARTHE, Directrice du Service Technique du CIVB Examinateur
Mr R. LEMOINE, Directeur de Recherche CNRS, Poitiers Examinateur
Mr J-P. PEROS, Chargé de Recherche INRA, Montpellier Examinateur
Mr P. COUTOS-THEVENOT, Professeur, Université de Poitiers Directeur de thèse
Mr S. DELROT, Professeur, Université de Bordeaux 2 Directeur de thèse
Etude transcriptomique de la réponse
de la Vigne (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon)
au champignon ascomycète vasculaire Eutypa lata,
RESUME
Etude transcriptomique de la réponse de la vigne (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) au champignon ascomycète vasculaire Eutypa lata, responsable de l’eutypiose.
Parmi les nombreuses maladies affectant la Vigne, l’eutypiose est l’une des plus préoccupantes. Elle est présente dans les vignobles du monde entier et entraîne des pertes économiques significatives. Tous les cépages sont sensibles à l’eutypiose et le cépage Cabernet Sauvignon très fréquent dans le vignoble bordelais est particulièrement sensible. Il n’existe pas de méthode de lutte ou de technique de diagnostic non destructive efficace au vignoble. Enfin, la réponse de la vigne à l’infection par E. lata est encore mal connue.
Ce travail présente l’étude transcriptomique de la réponse de la vigne (Vitis vinifera cv. Cabernet sauvignon) au champignon vasculaire ascomycète Eutypa lata, responsable de l’eutypiose. Des plantes saines ou infectées expérimentalement avec E. lata ont été produites
in vitro et en serre. Au vignoble, des ceps ont été sélectionnés d’après l’historique des notations des symptômes d’eutypiose entre 2002 et 2006. L’ensemble des échantillons a été caractérisé par la notation des symptômes, le ré-isolement des champignons présent dans les parties lignifiées, et l’identification formelle du mycélium d’E.lata par PCR. Cette caractérisation a permis d’identifier trois types de plantes : infectées et présentant des symptômes (S+R+), infectées ne présentant pas de symptômes (S-R+) et saines (S-R-). L’expression génique a été étudiée à partir de feuilles prélevées dans les trois conditions expériementales sur ces différents types de plantes. Les puces à ADN utilisées permettent de suivre simultanément l’expression de 15000 gènes de Vigne. La comparaison entre les plantes infectées présentant des symptômes (S+R+) et les plantes saines (S-R-) in vitro, en serre et au vignoble, a permis de décrire la réponse de la vigne à l’infection par E. lata. Les gènes de défense sur-exprimés chez les plantes S+R+ sont particulièrement nombreux (21%). Un grand nombre des gènes identifiés (44%) sont déjà connus pour intervenir au cours d’une interaction plante/champignon. Les analyses transcriptomiques comparées entre plantes infectées sans symptômes (S-R+) et plantes saines (S-R-) en serre et au vignoble ont permis d’identifier 17 gènes potentiellement utilisables pour le développement d’un outil de diagnostic précoce et non destructif. Enfin, l’analyse combinée des résultats obtenus pour les comparaisons S+R+/S-R-, S-R+/S-R- et S+R+/S-R+ en serre et/ou au vignoble a permis l’identification des gènes pouvant être plus spécifiquement associés à la réponse à l’infection, à l’absence de symptômes ou à la présence de symptômes. Les profils d’expression de plusieurs de ces gènes candidats ont été confirmés par RT-PCR (transcription inverse-récation de polymerisation en chaîne) avec les échantillons utilisés pour les microarrays, et complétés avec l’analyse de feuilles de vignes infectées par d’autres champignons pathogènes de la Vigne (U. necator,
P. viticola, B. cinerea). Les résultats sont discutés en termes de réorientations du métabolisme cellulaire.
ABSTRACT
Transcriptomic study of grapevine response (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) to the vascular ascomycete fungus Eutypa lata, causing eutypiosis.
Among the numerous diseases affecting grapevine, eutypiose is very damaging. It is found in grape growing areas around the world and causes important economic losses. There is no known resistant cultivar and Cabernet sauvignon very frequent in Bordeaux vineyards is particularly sensitive to Eutypiosis. There is no treatment and no diagnostic tool for this disease.
This work describes the transcriptomic study of the grapevine response (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) to the vascular ascomycete fungus Eutypa lata, causing eutypiosis. Control and experimentally infected plants (with E. lata) were produced in vitro and in greenhouse. At the vineyard grapevines were selected based on historical notations symptoms of eutypiose between 2002 and 2006. Samples were characterized by symptoms notation, re-isolation of the fungus located in the lignified parts, and the formal identification of E. Lata mycelium by PCR. The characterization led to the identification of three types of plants: infected and showing symptoms (S+R+), infected and showing no symptoms (S-R+) and healthy (S-R-). Leaf samples collected on these different kinds of plants were used for microarray analysis in each condition. The side used allowed us to monitor simultaneously the expression of 15000 grapevine genes. The comparison between infected plants showing symptoms (S+R+) and healthy plants (S-R-) in vitro, in the greenhouse and in the vineyard allowed us to better describe the grapevine response to E. Lata infection. Many defence genes (21%) are over expressed in plants S+R+. A large number of differentially expressed genes (44%) were already identified as taking part in plant/fungus interactions, and other genes identified in this screening deserve attention. Comparison of transcriptomic data from greenhouse and vineyard plants infected without symptoms (S-R+) and healthy plants (S-R-), allowed us to identify 17 genes potentially useful for the development of an early and non-destructive diagnosis tool. Finally, the combined analysis of microarray data obtained for the comparisons S+R+/S-R-, S-R+/S-R- and S+R+/S-R+ in greenhouse and/or in vineyard led to the identification of genes that may be more specifically associated with the response to infection, or with the absence or presence of symptoms. The profiles of the candidate genes were controlled by RT-PCR with the same samples as those used for microarray studies and with leaf samples infected by other pathogens (U. necator, P. viticola, B. cinerea). The data are discussed in terms of alterations of cell metabolism.
REMERCIEMENTS
Je remercie Serge Delrot de m’avoir accueillie au sein de son laboratoire à Poitiers, puis à Bordeaux.
Je tiens à remercier mes directeurs de thèse Serge Delrot et Pierre Coutos-Thévenot qui m’ont confié ce travail de recherche et qui ont veillé à son bon déroulement, avec beaucoup d'intérêt et d'écoute.
Je remercie le Conseil Interprofessionnel du Vin de Bordeaux pour leur soutien financier. J'adresse mes remerciements à Christophe Rothan et à Didier Merdinoglu qui ont accepté d'examiner mon mémoire de thèse et d'en être les rapporteurs. Je remercie Rémi Lemoine, Jean-Pierre Péros et Muriel Barthe d'avoir accepté de faire partie de mon jury de soutenance. Je remercie également Chirstophe Rothan, Jean-Pierre Péros et Laurent Charlier pour avoir participé à mes différents comités de suivi de thèse.
Tout mes sincères remerciements à ceux qui ont directement contribué à ce travail de thèse : Pascal Lecomte pour son aide lors de la production et la caractérisation du matériel végétal, Christian Kappel pour l’analyse des données de microarrays, et Céline Léon qui m’a donné un bon coup de pouce pour les analyses RT-PCR.
Je remercie également Damien Afoufa-Bastien, David Lafarge, Philippe Cartolaro, Nathalie Ollat, Jean Pierre Péros, Stéphane Octave qui m’ont fourni, du matériel végétal (feuilles infectées avec Oïdium, Mildiou, Botrytis), des souches du champignon Eutypa lata ou des données de caractérisation. Je remercie Cindy Aknin de la plateforme de Montpellier et Yohann Petit de la plateforme de Bordeaux pour leur formation aux techniques d’étude du transcriptome.
Je remercie chaleureusement mes collègues de bureaux et de paillasses poitevins et bordelais avec qui j’ai passé de très bons moments : merci Romain pour ton aide et tes nombreux conseils ; merci Christian, Sabine, Philippe, Thilia, Duyen, Ken, Cécile, Benoît, Julien, Manu, Marie-Thé pour votre bonne humeur, vos encouragements quotidiens, votre patience et votre écoute.
Je pense aussi aux autres membres des laboratoires de Poitiers et de Bordeaux qui ont rendu ces années très agréables, et aussi enrichissantes sur le plan personnel que professionnel. Enfin, j’adresse ma profonde reconnaissance et tout mon amour à mes parents et à Arnaud pour leur confiance et leur soutien inestimable.
LISTE DES ABREVIATIONS
A x (nm) absorbanceaa-dUTP 5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine 5’-triphosphate
ABA acide abscisique
ADN acide désoxyribonucléique
ADNc ADN complémentaire
AFLP amplified fragment length polymorphism
AGP arabinogalactane AJ acide jasmonique
ANA Acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D)
AOS active oxygen species (espèces réactives d’oxygène) ARN acide ribonucléique
ARNas acide ribonucléique anti sens
ARNm ARN messager
ARNt ARN de transfert
ARP auxin response protein (protéine de réponse à l’auxine) AS acide salicylique
ATA acide aurintricarboxylique
BET bromure d’éthidium
BDA black dead arm
B. cinerea Botrytis cinerea
BI feuilles de Cabernet Sauvignon infectées par Botrytis
BS feuilles de Cabernet Sauvignon qui ne sont pas infectées par Botrytis
CAV cellules associées aux vaisseaux
CS Cabernet Sauvignon
CTAB bromure d'hexadécyltriméthylammonium
cv. cultivar
CODIT compartmentalization of decay in trees
Cy3 Cyanine 3
Cy5 Cyanine 5
dATP déoxyadenosine triphosphate
dCTP déoxycytidine triphosphate
dGTP déoxyguanosine triphosphate
DMSO diméthyl sulfoxyde
Dnase désoxyribonucléase
dNTP désoxyribonucléotide
DO densité optique
DRE drought responsive element DTT dithiothréitol
EDTA éthylène diamine tétra-acétate
EF1αααα elongation factor 1 alpha (facteur d’élongation alpha 1)
EGFV écophysiologie et génomique fonctionnelle de la vigne
E. lata Eutypa lata
ELIP early light induced protein
E. orontii Erysiphe orontii
ENS Ecole Normale Supérieure EST expressed sequence tag
FunCat functional classification catalogue
GID1 gibberellin insensitive dwarf 1
GRP protéine riche en glycine
GO gene ontology
HPLC high performance liquid chromatography
HR hypersensitive response
HRGP glycoprotéine riche en hydroxyproline
HRP hypersensitivity related protein
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
ITS ribosomal DNA internal transcribed spacer
LAR local acquired resistance
LIMMA linear models for microarrays data
LTP lipid transfer protein
MI feuilles de Cabernet Sauvignon infectées avec le midiou
MS feuilles de Cabernet Sauvignon qui ne sont pas infectées avec le mildiou
MIPS Munich Information Center for Protein Séquences
NCBI National Center of Biotechnology Information
NPR1 necrosis inducing phytophtora protein1
OI feuilles de Cabernet Sauvignon infectées par l’oïdium
OS feuilles de Cabernet Sauvignon qui ne sont pas infectées par l’oïdium PAL phénylalanine ammonia lyase
PDA Potato Dextrose Agar
pb paire de base
PCR réaction de polymérisation en chaîne PMT photomultiplicateur
PR pathogenesis related PRP protéine riche en proline P. viticola Plasmopara viticola
P. parasitica Plasmopara parasitica
PVPP polyvinyl polypyrrolidone
q.s.p. quantité suffisante pour
RAPD random amplified polymorphism DNA
rpm rotation par minute
RT-PCR reverse transcription-PCR (transcription inverse-réaction de polymérisation en
chaîne)
SAGE serial analysis of gene expression
SAR systemic acquired resistance
SCAR sequence characterised amplified region
SDS sodium dodécyl sulphate SSC standard sodium citrate
SSH suppression subtractive hybridization
S+R+ plantes infectées par E. lata présentant des symptômes
S-R+ plantes infectées par E. lata ne présentant pas de symptômes
S-R- plantes saines
ST stilbène synthase TC tentative consensus
TIGR The Institute for Genomic Research
TIFF Tagged Image File Format
Tm température d’hybridation
Tris tri-(hydroxyméthyl) amino méthane
UV ultraviolet
U. necator Uncinula necator
X. campestris Xanthomonas campestris
SOMMAIRE
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE ... 1
1- La Vigne ... 1
1-1 Histoire de la viticulture... 1
1-2 La place de la France dans la viticulture mondiale ... 2
1-3 Taxonomie et biodiversité de la Vigne ... 3
1-4 Le cycle de développement de la Vigne... 4
1-4-1 Le cycle végétatif... 4
1-4-2 Le cycle reproducteur ... 4
1-4-2-1 La phase herbacée : De la floraison à la fécondation... 4
1-4-2-2 Développement de la baie de raisin ... 5
1-5 La baie de raisin : structure, croissance... 5
1-5-1 Structure de la baie de raisin... 5
1-5-2 Courbe de croissance de la baie de raisin ... 5
1-5-2-1 Phase I : Croissance et division cellulaire ... 6
1-5-2-2 Phase II : Période de latence... 6
1-5-2-3 Phase III : Grandissement cellulaire ... 6
2- Les principales maladies fongique de la vigne... 7
2-1 Les principales maladies fongiques non vasculaires ... 7
2-1-1 L’oïdium (Uncinula necator)... 7
2-1-2 Le mildiou (Plasmopora viticola)... 7
2-1-3 La pourriture grise (Botrytis cinerea) ... 8
2-2 Les principales maladies fongiques vasculaires ... 8
2-2-1 La maladie de Pétri ou Black Goo ... 8
2-2-2 Le Black Dead Arm (BDA) ... 8
2-2-3 Le syndrome de l’Esca... 9
2-2-4 L’eutypiose ... 9
3- Les caractéristiques de l’eutypiose...10
3-1 Impact de la maladie ...10
3-1-1 Répartition de la maladie dans le monde ...10
3-1-2 Importance de la maladie dans le vignoble français ...10
3-1-3 Impact économique de la maladie...11
3-1-4 Le caractère insidieux des symptômes de l’eutypiose ...12
3-1-5 Différence de sensibilité des cépages à l’eutypiose ...12
3-2 L’agent pathogène : E. lata ...13
3-2-1 Découverte et caractérisation de l’agent pathogène ...13
3-2-1-1 Découverte de l’agent pathogène ...13
3-2-1-2 La forme asexuée Libertella blepharis ...13
3-2-1-3 Cycle biologique de la forme sexuée vecteur de la maladie ...13
3-2-1-4 Différence d’agressivité des souches...13
3-2-1-5 Diversité génétique des souches ...14
3-2-2 Le mode d’action : production de toxines...14
3-2-2-1 L’eutypine ...15
3-2-2-2 Composés dérivés de l’eutypine ...15
3-2-2-3 Autres composés sécrétés par E. lata ...16
3-3 Méthodes de lutte ...17
3-3-1 Mesures prophylactiques ...17
3-3-2 Traitements phytosanitaires ...18
3-3-2-1 Lutte biologique : recherche d’antagonistes d’ E. lata ...18
3-3-2-2 Recherche de molécules de synthèse ...19
3-3-2-3 Recherche de molécules naturelles ...19
3-4 Diagnostic de la maladie ...20
3-4-1 Méthodes de biologie moléculaire ...20
4- Les mécanismes de défenses de la Vigne...23
4-1 Introduction...23
4-2 Les défenses de la Vigne...24
4-2-1 Les défenses constitutives ou préexistantes ...24
4-2-2 Les défenses induites ...24
4-2-2-1 Reconnaissance de l’agent pathogène ...24
4-2-2-2 Transduction du signal ...25
4-2-2-3 Activation de la synthèse de PR protéines...25
4-2-2-4 Activation de la synthèse de composés phénoliques (flavonoïdes, tannins, phytoalexines stilbéniques) ...26
4-2-3 L’organisation de la résistance dans le bois...27
5- Utilisation des méthodes d’analyse du transcriptome pour l’étude de l’interaction Vigne/champignon pathogène. ...29
5-1 Introduction...29
5-1-1 Développement des ressources de génomique structurale chez la Vigne ...29
5-1-2 Génomique fonctionnelle et méthodes d’analyse du transcriptome...30
5-2 Les principaux résultats concernant l’étude de l’interaction Vigne/champignon et utilisant les techniques d’analyses du transcriptome. ...30
OBJECTIFS DU TRAVAIL DE THESE ...33
1- Contexte ...33
2- Objectifs du travail de thèse...33
3- Stratégie expérimentale...34
MATERIELS ET METHODES...35
1- Matériel biologique ...35
1-1 Récolte de matériel au vignoble ...35
1-1-1 Prélèvement de matériel sur une parcelle eutypiosée ...35
1-1-2 Récolte de boutures de Cabernet Sauvignon...35
1-2 Culture in vitro de plantules de Vigne ...36
1-3 Culture du champignon E. lata ...36
2- Méthodes d’analyses biologiques ...36
2-1 Techniques d’infection...36
2-1-1 Infection de plantules in vitro avec E. lata ...36
2-1-2 Infection de boutures en serre avec E. lata ...37
2-1-3 Infection de feuilles détachées de vigne avec Plasmopara viticola...37
2-1-4 Infection de feuilles détachées de vigne avec Uncinula necator ...38
2-1-5 Infection de feuilles détachées de vigne par Botrytis cinerea...38
2-2 Caractérisation du matériel infecté par E. lata ...39
2-2-1 Notation des symptômes d’eutypiose ...39
2-2-2 Ré-isolement d’E. lata à partir de plantule in vitro...39
2-2-3 Ré-isolement d’E. lata à partir de matériel en serre et au vignoble ...40
3- Techniques de biologie moléculaire...40
3-1 Extractions et purifications d’acides nucléiques ...40
3-1-1 Extraction rapide d’ADN fongique...40
3-1-2 Extraction des ARN totaux des feuilles et de plantules de Vigne...40
3-1-3 Traitement des ARN totaux à la DNase...41
3-2 Transcription inverse...42
3-3 Analyse des acides nucléiques ...42
3-3-1 Amplification par PCR ...42
3-3-1-1 Identification d’E. lata...42
3-3-1-2 Identification d’ADN contaminant dans la préparation d’ARN ...43
3-3-1-3 Etude du profil d’expression des gènes candidats identifiés en microarray ...43
3-3-2 Dosage au spectrophotomètre ...44
4- Technique de microarrays ...44
4-1 Principe général de la technique ...44
4-2 Elaboration des lames microarrays ...46
4-3 Synthèse des cibles...47
4-3-1 Description générale ...47
4-3-2 Synthèse des cibles avec le kit Amino allyl MessageAmp TM II aRNA Amplification ...47
4-3-2-1 Synthèse du premier brin d’ADNc ...48
4-3-2-2 Synthèse du second brin d’ADNc ...48
4-3-2-3 Purification des ADNc ...48
4-3-2-4 Transcription des ADNc en ARN as ...48
4-3-2-5 Purification des ARNas ...49
4-3-2-6 Dosage des ARNas ...49
4-3-2-7 Couplage des cyanines sur le groupement amino-allyl ...49
4-3-2-8 Purification des ARNas marqués...49
4-3-2-9 Dosage des cibles ...50
4-4 Hybridation ...51
4-4-1 Prétraitement de lames...51
4-4-2 Préparation des cibles pour l’injection...51
4-4-3 Hybridation ...51
4-5 Scan des lames ...52
4-6 Quantification des spots ...52
4-7 Normalisation...53
4-8 Identification de gènes différentiellement exprimés ...54
4-9 Ré-annotation des séquences spottées sur les lames ...55
4-9-1 Mise à jour des annotations ...55
4-9-2 Catégories fonctionnelles...55
RESULTATS ET DISCUSSION...56
1- Interaction vigne /E. lata : Caractérisation du matériel...56
1-1 Caractérisation des plantules de Cabernet Sauvignon infectées expérimentalement avec la souche NE85-1 d’E. lata ...56
1-1-1 Notation des symptômes...56
1-1-2 Ré-isolement du champignon à partir de plantules ...57
1-2 Caractérisation des boutures de Cabernet Sauvignon infectées expérimentalement avec la souche BX1-10 d’E. lata ...58
1-2-1 Notation des symptômes...58
1-2-2 Ré-isolement du champignon ...58
1-3 Caractérisation de ceps de Cabernet Sauvignon au vignoble naturellement infectés par E. lata ...59
1-3-1 Notation des symptômes...59
1-3-2 Ré-isolement du champignon ...59
1-4 Identification formelle du mycélium d’E. lata par PCR ...60
1-4-1 Test de PCR directe avec un protocole d’extraction rapide de l’ADN fongique ...60
1-4-2 Test de PCR indirecte après re-isolement du champignon ...61
2- Mise au point de la technique et plan d’expérience des microarrays ...64
2-1 Mise au point de la technique microarray ...64
2-1-1 Extraction des ARN ...64
2-1-2 Marquage des cibles et hybridation des lames...65
2-1-3 Quantification du signal...66
2-2 Plan d’expérience pour l’analyse microarray de l’interaction Vigne/E .lata ...66
2-2-1 Trois conditions expérimentales : in vitro, en serre, au vignoble. ...66
2-2-2 Trois types de plantes S+R+, S-R+, S-R-. ...67
2-2-3 Trois comparaisons : S+R+/S-R-, S-R+/S-R-, S+R+ /S-R+. ...67
2-2-4 Analyse : « 1 comparaison et plusieurs conditions » ou « 3 comparaisons et 1 condition »...67
2-2-4-1 Analyse : « 1 comparaison et plusieurs conditions »...67
3- Identification de gènes différentiellement exprimés entre plantes infectées présentant des symptômes et
plantes saines...69
3-1 Identification des gènes différentiellement exprimés pour chaque condition ...69
3-2 Identification de gènes différentiellement exprimés en commun entre plusieurs conditions ...70
3-3 Classification fonctionnelle des gènes communs entre plusieurs conditions ...71
3-4 Description des gènes différentiellement exprimés entre plantes S+R+ et S-R- et communs entre plusieurs conditions...72
3-4-1 Les gènes impliqués dans le métabolisme ...72
3-4-1-1 Métabolisme extracellulaire ...72
3-4-1-2 Métabolisme des acides aminés...73
3-4-1-3 Métabolisme des phénylpropanoïdes...74
3-4-1-4 Métabolisme carboné...74
3-4-1-5 Métabolisme lipidique ...75
3-4-1-6 Autres gènes impliqués dans le métabolisme ...75
3-4-2 Les gènes impliqués dans la biogenèse de composés cellulaires ...76
3-4-3 Les gènes impliqués dans les réactions de défense ...77
3-4-4 Les gènes impliqués dans la régulation de l’activité des protéines ...79
3-4-5 Les gènes activateurs de la transcription...80
3-4-6 Les gènes impliqués dans les mécanismes de transport...80
3-4-7 Les gènes codant pour des protéines avec des domaines de fixation ...81
3-4-8 Les gènes impliqués dans l’interaction avec l’environnement...81
3-5 Validation de gènes candidats ...83
3-5-1 Bilan des résultats ...83
3-5-2 Etude du profil d’expression de quelques candidats par RT-PCR ...84
3-6 Conclusion du chapitre 3...85
4- Identification de gènes potentiellement utilisables comme outil de diagnostic précoce et non destructif ....86
4-1 Identification des gènes différentiellement exprimés entre plantes infectées sans symptômes et plantes saines, communs en serre et au vignoble...86
4-2 Descriptions des gènes différentiellement exprimés entre plantes infectées sans symptômes et plantes saines communs en serre et au vignoble...87
4-2-1 Description des gènes sur-exprimés chez les plantes S-R+ ...87
4-2-2 Description des gènes sous-exprimés chez les plantes S-R+ ...88
4-3 Conclusion du chapitre 4...90
5- Identification de gènes plus spécifiquement associés à l’absence de symptômes, à la présence de symptômes, ou de réponse à l’infection ...91
5-1 Identification de marqueurs fort différentiellement exprimés en serre ET au vignoble qui peuvent être plus spécifiquement associés à la présence, à l’absence de symptômes ou de réponse à l’infection ...91
5-1-1 Identification des gènes différentiellement exprimés en serre et au vignoble pour chaque comparaison...91
5-1-2 Identification des gènes différentiellement exprimés en serre et au vignoble qui sont communs entre comparaisons ...92
5-2 Etude de certains marqueurs forts plus spécifiquement associés à l’absence de symptômes ou à la réponse à l’infection ...94
5-2-1 Analyse du profil d’expression en RT-PCR de marqueurs forts potentiellement utilisables comme outil de diagnostic...94
5-2-2 Est-il envisageable d’utiliser les gènes identifiés dans cette étude pour le développement d’un outil diagnostique ?...96
5-2-2-1 Réponse quantitative/qualitative...96
5-2-2-2 Spécificité de réponse...96
5-3 Identification de marqueurs différentiellement exprimés en serre OU au vignoble qui peuvent être spécifiquement associés à la présence, à l’absence de symptômes ou de réponse à l’infection ...98
5-3-1 Identification des gènes différentiellement exprimés en serre OU au vignoble qui sont communs entre comparaisons ...98
5-3-2 Classification fonctionnelle des gènes associés à la réponse à l’infection...99
5-3-3 Classification fonctionnelle des gènes associés à l’absence de symptômes ...100
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES...103
1- Originalité du travail réalisé...103
2- L’étape de caractérisation du matériel végétal est primordiale ...104
3- Une meilleure compréhension des mécanismes de réponse de la vigne à l’infection par E. lata ...104
4- Identification de gènes potentiellement utilisables pour le développement d’un outil de diagnostic précoce et non destructif...107
5- Quelles étapes pour l’application d’un test de diagnostic de l’infection par E. lata ?...108
5-1 Essai au vignoble ...108
5-2 Essai en cinétique...108
5-3 Analyse protéomique ...108
6- Des plantes résistantes à l’eutypiose ? ...109
7- Perspectives générales...109
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
1- La Vigne
La Vigne (Vitis vinifera) est une plante grimpante pérenne à croissance indéterminée, capable de se multiplier par voie sexuée, par bouturage ou par greffage (Gary et al., 2003). La Vigne est cultivée pour ses fruits charnus : les baies de raisin. Ces dernières permettent la préparation de jus de raisin, l’élaboration de vins, la distillation de liqueurs (armagnac, cognac, porto) ou peuvent être consommées comme fruit frais ou secs. La constitution d’un vignoble nécessite du temps : il faut attendre 3 ans pour obtenir les premiers fruits, 10 à 12 ans pour avoir un rendement significatif, et 25 ans pour arriver à la pleine production. La qualité organoleptique augmente avec l’âge du cep.
1-1 Histoire de la viticulture
L’histoire de la Vigne accompagne depuis longtemps celle de l’Homme. Les premières traces de ceps de vigne, découvertes dans l’actuelle Géorgie, datent de plus de 7000 ans (Rowley et
al., 2003). A partir de la Géorgie, la culture de la Vigne se serait répandue dans tous les pays tempérés depuis l’Inde jusqu’à l’Occident Européen (Enjalbert, 1975). Les premières fresques représentant des procédés de vinification ont été retrouvées en Egypte dans des lieux de sépulture datant de 3000 ans avant JC. La Grèce, en partie grâce à ses contacts avec l’Egypte, adopta la culture de la Vigne, la vinification et le commerce du vin (vers –2000 avant JC) (Johnson, 1990). Les Grecs, au cours de leurs nombreux voyages, implantèrent la Vigne dans tout le bassin méditerranéen et louèrent les bienfaits du vin sous le culte du dieu Dionysos. Quelques siècles plus tard, les Romains poursuivirent le développement de la viticulture, en honorant Bacchus, dieu de la Vigne et du vin (Meheut et Griffe, 1997). L’expansion de l’Empire Romain permit de répandre la culture de la Vigne en Sicile et dans l’Italie du Sud, puis dans les régions méditerranéennes d’Espagne et de France, jusqu’à atteindre les rivages de l’Atlantique. Ce n’est qu’en 600 avant JC que la Vigne apparaît en Gaule celtique, où les Gaulois améliorent les procédés de vinification. La viticulture s’est ensuite épanouie sous le règne des Mérovingiens et des Carolingiens qui firent une grande consommation de vin (Méheut et Griffe, 1997). C’est entre l’Empire Romain et le Moyen-âge que naissent en France les plus célèbres vignobles : le Bordelais au Ier siècle, la Bourgogne au IIème siècle, le Rhin et la Moselle au IVème siècle, la Vallée de la Loire et l’Alsace au IXème siècle.
Au Moyen Age, le vignoble et les vins entrent dans une phase d’essor grâce au christianisme. L’ancienne France monarchique fixe définitivement l’entretien des vignobles comme culture traditionnelle (Jacquemont, 1993). A partir du XIIème siècle, la consommation de vin se généralise. Les vignobles continuent de s’étendre dans toute la France, puis progressivement à la Germanie et aux pays du Danube (Enjalbert et Enjalbert, 1987). A la fin du XIXème siècle, la Vigne disparaît presque totalement des vignobles français et européens. Ce désastre fut causé par l’importation accidentelle, en provenance d’Amérique du Nord, d’un minuscule puceron, Phylloxera vastatrix, qui se nourrit des racines de la Vigne. Finalement, la réimplantation de ces vignobles fut possible grâce au greffage de l’espèce Vitis vinifera sur des porte-greffes américains de l’espèce Vitis labrusca naturellement résistants à l’insecte.
1-2 La place de la France dans la viticulture mondiale
La Vigne est une des espèces fruitières les plus cultivées dans le monde. Le vignoble mondial s’étend sur les cinq continents et sa surface est de 8 millions d’hectares (rapport de l’OIV : Organisation Internationale de la Vigne et du Vin, 2007). La majorité des surfaces viticoles mondiales sont situées en Europe (59%), le reste étant réparti entre l’Asie (22%), l’Amérique (12,5%), l’Afrique (4,9%) et l’Océanie (0,7%) (OIV, 2007). La production annuelle mondiale de vin est estimée à 287,3 millions d’hl (OIV, 2007). L’Europe, avec environ 74% de cette production occupe une place prépondérante (OIV, 2007). Cependant, l’augmentation régulière de la production des pays dits du Nouveau Monde (USA, Argentine, Chili, Australie et Afrique du Sud) est à signaler (OIV, 2007).
La superficie du vignoble français est d’environ 850 000 ha, soit 1,7% du territoire. On y distingue 14 grandes régions viticoles: Alsace, Beaujolais, Bordelais, Bourgogne, Champagne, Jura, Savoie, Languedoc, Roussillon, Provence, Corse, Sud-Ouest, vallée de la Loire, vallée du Rhône (Malnic, 2004). Avec 60 millions d’hl produits chaque année, la France est le premier producteur mondial de vin. La viticulture représente 14% de la production agricole française, ce qui la situe au 2ème rang des productions nationales après les céréales. Elle génère 8,4 milliards d’euros chaque année. Les exportations de vins représentent 5,3 milliards d’euros, soit le troisième excédent commercial français après l’aéronautique et l’automobile (Malnic, 2004).
1-3 Taxonomie et biodiversité de la Vigne
La Vigne, plante Angiosperme Dicotylédone appartient à l’ordre des Rhamnales et à la famille des Vitacées. Cette famille compte 19 genres (Galet, 2000), parmi lesquels seul le genre Vitis contient les espèces utilisées pour la production viticole (Olmo, 1978 ; Bouquet et Boursiquot, 1996). Le genre Vitis est divisé en deux sous-genres Muscadinia et Euvitis (Fig. 1). Ils se distinguent en fonction des caractéristiques anatomiques, cytologiques et morphologiques (Mullins et al., 1992). Le sous-genre Muscadinia comporte trois espèces diploïdes (2n=40), originaires des Etats-Unis. Seule l’espèce Muscadinia rotundifolia est cultivée et s’avère résistante à un grand nombre d’agents pathogènes. Le sous-genre Euvitis, pour « vraies vignes », comprend une soixantaine d’espèces diploïdes (2n=38) qui sont classés en quatre groupes, en fonction de leurs origines géographiques (Huglin et Schneider, 1998) :
Les Vignes américaines présentent une bonne résistance aux pathogènes et sont aujourd’hui utilisées comme porte-greffe dans 85% du vignoble mondial. Au XIXème siècle, leur introduction en Europe véhicule successivement l’oïdium (1845) (Viala,1910), le phylloxéra (1868) (Pouget, 1990), le mildiou (1878) et le black rot (1885).
Les Vignes asiatiques comprennent une dizaine d’espèces non résistantes aux maladies. Certaines, comme Vitis amurensis sont utilisées dans les programmes de croisements interspécifiques pour leur résistance au froid (Galet, 2000).
Les Vignes tropicales, moins communes ne seront pas détaillées.
La Vigne européenne ne comprend que l’espèce Vitis vinifera. On distingue cependant la Vigne sauvage (silvestris) et la Vigne cultivée (sativa) (Huglin et Schneider, 1998). Pour s’assurer de la production de raisins et de vins de qualité, l’Homme a progressivement domestiqué la Vigne sauvage (Vitis vinifera silvestris), en sélectionnant uniquement les plantes hermaphrodites. Ce caractère génétique a donc été fixé chez la vigne cultivée Vitis
vinifera sativa (Johnson, 1990). Aujourd’hui, la Vigne cultivée présente un polymorphisme remarquable, et le nombre de variétés est estimée à 5000 (la plupart sont conservées dans les collections). Ces différentes variétés de vigne sont appelées cépages par les vignerons et cultivars (cv.) par les botanistes. En France, 249 cépages sont autorisés par la réglementation. Une quarantaine sont plus particulièrement utilisés et 12 d’entre eux couvrent 70% des vignobles : merlot, grenache, carignan, Cabernet Sauvignon, syrah, cabernet franc, gamay, cinsault et pinot noir en rouge, ugni blanc, chardonnay et sauvignon en blanc.
1-4 Le cycle de développement de la Vigne
Chaque année, la Vigne effectue au cours de son développement deux cycles en concurrence trophique (Fig. 2). Le cycle végétatif assure la pérennité du cep grâce au développement de l’appareil végétatif. Le cycle reproducteur permet la formation des fleurs, puis des fruits.
1-4-1 Le cycle végétatif
De novembre à février, la Vigne est en période de repos hivernal ou dormance. Au début du printemps, la reprise de l’activité végétative se manifeste par les « pleurs », correspondant à un écoulement de sève brute par les plaies dues à la taille (Huglin et Schneider, 1998 ; Galet, 2000). Le débourrement est la première manifestation visible de la reprise de la croissance. Il se caractérise par un gonflement du bourgeon latent, l’éclatement des premières écailles, le rejet de la bourre (ou coton), et l’émergence des premières feuilles. Il se produit de début mars à fin avril dans le vignoble bordelais (Blouin et Guimberteau, 2000). La phase de croissance se poursuit jusque fin juillet à début août. Elle se caractérise par l’allongement des rameaux, l’étalement et la croissance des feuilles. L’aoûtement débute au mois d’août et se poursuit jusqu’en novembre. Il s’accompagne d’une accumulation de réserves en amidon et en lignine dans les sarments, ce qui favorise la résistance des tissus au froid et pour permettre le début d’un nouveau cycle au printemps suivant (Bugnon et Bessis, 1968 ; Huglin et Schneider, 1998 ; Galet, 2000,2001).
1-4-2 Le cycle reproducteur
1-4-2-1 La phase herbacée : De la floraison à la fécondation
L’initiation florale se produit dans les bourgeons latents, l’année où ils sont formés, soit environ un an avant la floraison. La différenciation des fleurs commence au printemps, lorsque le bourgeon latent reprend son activité. Peu après le débourrement, les inflorescences se développent. La floraison a lieu entre mai et juin, et aboutit à la libération du pollen. Comme toutes les fleurs d’une inflorescence ne s’épanouissent pas en même temps, la fécondation s’étale sur une quinzaine de jours.
1-4-2-2 Développement de la baie de raisin
Dès que l’ovaire commence à se développer, on dit qu’il est noué, et l’ensemble de ce phénomène pour une grappe s’appelle la nouaison. Au mois d’août, les baies atteignent le stade de la véraison, qui marque la fin de la phase herbacée et le début de la maturation. Entre fin septembre et début octobre, les baies atteignent la pleine maturité et peuvent être vendangées. Le raisin entre ensuite dans une phase de surmaturation caractérisée par un flétrissement des baies.
1-5 La baie de raisin : structure, croissance
1-5-1 Structure de la baie de raisin
Le péricarpe, qui provient du développement de la paroi ovarienne, comprend la pellicule (épicarpe ou exocarpe), la pulpe (mésocarpe) et enfin l’endocarpe réduit à une simple paroi appliquée contre le tégument externe de la graine (Fig. 3). La pellicule qui enveloppe la baie est composée de plusieurs assises cellulaires (cuticule, épiderme et hypoderme). Elle est recouverte d’une poussière cireuse, la pruine, qui la rend imperméable. La majorité du poids de la baie à maturité (de 65 à 91%) correspond à la pulpe. Les pépins, qui proviennent du développement de l’ovule, contiennent un embryon, un albumen riche en réserves et le tégument qui sépare l’embryon de l’albumen. Le nombre de pépins est en général de quatre par baie, mais il peut y en avoir plus ou moins en fonction du nombre d’ovules fécondés.
1-5-2 Courbe de croissance de la baie de raisin
La courbe de croissance des baies de raisin peut être représentée par une double sigmoïde divisée en trois phases (Fig. 4) (Coombe, 1992; Kanellis et Roubelakis-Angelakis, 1993; Tattersall et al., 1997; Blouin et Guimberteau, 2000; Davies et Robinson, 2000). Durant les deux premières phases dont la durée totale est d’environ 60 j, la baie présente un fonctionnement de type herbacé. La dernière phase de croissance de la baie est initiée à partir du stade clé que constitue la véraison. La baie devient alors un véritable organe de stockage et commence à mûrir. La période de maturation s’étend de la véraison à l’état de maturité et dure de 40 à 50 j.
1-5-2-1 Phase I : Croissance et division cellulaire
La première phase dure environ 40 j après l’anthèse (épanouissement complet des fleurs). Cette phase est caractérisée par une croissance rapide et des divisions cellulaires intenses. Le poids et le volume des baies augmentent, et les acides organiques (acide tartrique et acide malique) s’accumulent en grande quantité. A ce stade, la baie de raisin atteint la grosseur d’un petit pois et contient beaucoup de chlorophylle. Elle reste dure, acide, amère, et ne contient pas plus de 150 mM d’hexoses (glucose, fructose) (Fillion et al., 1999). Durant cette période, les pépins atteignent presque leur taille finale.
1-5-2-2 Phase II : Période de latence
La seconde phase correspond à une période de latence qui peut durer de 10 à 20 j selon les cépages. C’est une période de faible croissance durant laquelle le poids et le volume des baies sont peu, voire pas, modifiés. A la fin de cette latence, les embryons se développent et la baie commence à perdre sa chlorophylle.
1-5-2-3 Phase III : Grandissement cellulaire
La véraison marque la fin de la phase herbacée et le début de la maturation. Le grain initialement vert et dur devient translucide chez les cépages blancs ou se colore chez les cépages rouges. Ce phénomène est brusque : un grain de raisin peut changer de couleur en une journée, et pour l’ensemble des grappes du vignoble la véraison dure une quinzaine de jours dans des conditions idéales. Le terme véraison est aussi utilisé pour décrire l’ensemble des changements physiologiques déclenchés à ce moment : ramollissement de la baie, augmentation rapide de volume, perte de chlorophylle, afflux massif de sucres et d’eau, chute de l’acidité, accumulation des anthocyanes et des polyphénols. Ces changements se traduisent par une augmentation rapide du volume de la baie. Cette troisième phase de croissance est uniquement due à des phénomènes de grandissement cellulaires. Les cellules de la pulpe accumulent une grande quantité d’eau et de sucres. Les quantités d’acides aminés et de composés phénoliques augmentent significativement, alors que la concentration en acides organiques diminue (Kennedy, 2002).
2- Les principales maladies fongique de la vigne
2-1 Les principales maladies fongiques non vasculaires
2-1-1 L’oïdium (Uncinula necator)
L’oïdium, apparu en Europe vers 1847, est causé par un champignon ascomycète Uncinula
necator (forme parfaite ou sexuée). C’est un parasite obligatoire qui attaque tous les organes de la Vigne et peut entraîner des pertes de production très importantes et altérer la qualité des raisins. Les feuilles et les rameaux peuvent être contaminés pendant toute la phase de croissance, alors que la réceptivité des grappes est limitée à la période comprise entre le stade boutons floraux séparés et la fermeture de la grappe. Le premier signe visible sur les feuilles issues de bourgeons contaminés est une légère "frisure" (Fig. 5 A). Des taches vont apparaître, puis un mycélium blanchâtre envahit la face supérieure en provoquant un enroulement du bord du limbe vers le haut (limbe involuté) (Fig. 5 B). Les inflorescences et les grappes contaminées se recouvrent d'un feutrage blanc (Fig. 5 C). Sur les tiges, on note la présence de taches de teinte brune ou brun rouge.
2-1-2 Le mildiou (Plasmopora viticola)
Il s’agit d’une maladie due au champignon Oomycète Plasmopora viticola, d’origine américaine et identifié en France en 1879. C’est un parasite obligatoire de la Vigne qui se développe sur tous les organes herbacés et particulièrement ceux en voie de croissance. Les dégâts provoqués par le mildiou peuvent être catastrophiques sur la Vigne en période de végétation. Ils entraînent un affaiblissement de la plante, une perte de rendement et de la qualité de récolte. Après pénétration du champignon, les feuilles commencent à jaunir et des "taches d'huile" se forment sur les faces inférieures (Fig. 6 A). Les feuilles se couvrent ensuite d'un feutrage grisâtre (sporanges) (Fig. 6 B), présentent de nombreuses taches rouges ou brunes (Fig. 6 C) et tombent prématurément. Les jeunes rameaux et les vrilles atteints portent des taches brunes plus ou moins allongées. Les fleurs malades se reconnaissent au brunissement des inflorescences qui se couvrent de duvet (Fig. 6 D). Ces dernières peuvent être totalement détruites en se desséchant et en brunissant. Les grappes attaquées se recouvrent de fructifications blanches donnant un aspect grisâtre (Fig. 6 E), ou des taches brunes à violacée plus tardivement (Fig. 6 D).
2-1-3 La pourriture grise (Botrytis cinerea)
C’est une maladie très ancienne connue depuis l’Antiquité, qui est causée par le champignon ascomycète Botrytis cinerea (forme asexuée). Il s’agit d’un champignon ubiquiste, polyphage, se situant à la limite du saprophytisme et du parasitisme. Il est de plus nécrotrophe, et peut se
développer d’abord en saprophyte sur des tissus morts, avant de devenir parasite. Cette maladie affecte le rendement, la durée des travaux de cueillette (tri des vendanges) et la
qualité organoleptique du vin. Sur les jeunes rameaux, après l’infection, on observe une nécrose brune parfois recouverte de fructifications (Fig. 7 A). Au printemps, l’attaque des feuilles se manifeste par la formation de taches rouges brunes, à la périphérie du limbe (Fig. 7 B). Les inflorescences, une fois attaquées, se dessèchent et tombent. Le champignon
B. cinerea peut infecter les baies dès la véraison, et finit par envahir totalement la grappe qui se recouvre de conidiophores et prend une coloration marron (Fig. 7 C).
2-2 Les principales maladies fongiques vasculaires
2-2-1 La maladie de Pétri ou Black Goo
La maladie de Pétri est associée au champignon Phaeomoniella chlamydospora. Elle se manifeste principalement sur des vignes jeunes qui présentent un ralentissement de leur développement et des chloroses foliaires. Au niveau du bois, des coupes transversales de ceps montrent une zone circulaire noirâtre autour de la moelle et de nombreux points sombres répartis de manière concentrique (Fig. 8).
2-2-2 Le Black Dead Arm (BDA)
La maladie du Black Dead Arm (BDA) est actuellement mal connue car les champignons pathogènes intervenant dans cette infection ne sont pas clairement identifiés. Ils appartiennent au genre Botryospheria. Les symptômes de la maladie se traduisent au niveau du cep par la présence d’une bande brune située sous l’écorce. Cette bande peut aussi se former de part et d’autre d’une nécrose sectorielle (Larignon et al., 2002) (Fig. 9 A). Au niveau foliaire, des digitations rouges qui apparaissent entre les nervures se transforment en zones de nécrose à un stade plus avancé de la maladie (Fig. 9 B).
2-2-3 Le syndrome de l’Esca
Le syndrome de l’Esca implique un complexe fongique dont les participants ne sont pas encore tous connus : Fomitiporia punctata, Stereum hirsutum, Phaeoacremonium aleophilum,
Phaeomoniella chlamydospora, Eutypa lata. Au niveau du bois, des coupes transversales du ceps montrent une zone centrale claire et molle (amadou) entouré d’une zone brune dure et sombre (Fig. 10 C et D). Il existe deux formes de la maladie, une forme lente et une forme apoplectique. La forme lente se manifeste par l’apparition de symptômes foliaires sur une partie ou sur l’ensemble du pied. Il s‘agit de taches jaunâtres pour les cépages blancs (Fig. 10 A) ou rougeâtres pour les cépages rouges (Fig. 10 B), qui vont former des digitations entre les nervures. La présence d’un liseré jaune le long des nervures permet de distinguer ces symptômes de ceux du Black Dead Arm. La forme apoplectique ou foudroyante se manifeste en quelques jours voire en quelques heures et aboutit à un dessèchement rapide et complet des sarments et des grappes du pied malade.
2-2-4 L’eutypiose
L’eutypiose est une maladie de dépérissement, due au champignon ascomycète Eutypa lata. Dans les parties lignifiées, l’infection se traduit par des nécroses brunes sectorielles et bien délimitées présentant un aspect de pourriture sèche (Fig. 11 G et H) (Moller et al., 1978, Mahoney et al., 2003; Lecomte et al., 2000). Ces nécroses, liées à la progression localisée du champignon, peuvent entraîner la mort du bras ou du cep dans les 10 ans qui suivent l’infection initiale (Pascoe, 1999). Les symptômes de l’eutypiose au niveau du bois ne sont mis en évidence que par des coupes transversales des parties pérennes. A la surface du bois peuvent apparaître des zones bosselées noirâtres correspondant à la formation de spores (Courby, 1997). Les symptômes foliaires sont les plus visibles au début du printemps (Moller
et al., 1974). Ils correspondent à la nanification des sarments de l’année (Fig. 11 A et B): le bras malade présente un aspect buissonnant dû à un raccourcissement des entre-nœuds. Les feuilles de taille réduite, souvent enroulées ou déformées, présentent un aspect légèrement chlorotique, et sont crispées avec des nécroses marginales (Fig. 11 C et D) (Lecomte et al., 2000 ; Mahoney et al., 2003). Les inflorescences peuvent se nécroser ou se développer mais, dans ce cas, elles donnent des grappes pourvues d’un petit nombre de baies de petite taille (Fig. 11 E et F) (Fallot et al., 1997 ; Colrat et al., 1999). Ces symptômes caractéristiques de l’eutypiose peuvent être observés dans un premier temps sur un bras du cep.
3- Les caractéristiques de l’eutypiose
3-1 Impact de la maladie
3-1-1 Répartition de la maladie dans le monde
L’eutypiose est répertoriée sur 88 espèces de plantes ligneuses pérennes dicotylédones regroupées dans 52 genres et 27 familles (Carter et al., 1983 ; Carter, 1991 ; Bolay at al., 1985). Elle a notamment été observée sur le Citronnier (Kouyeas, 1978), le Pommier (Glawe
et al., 1983), le Pêcher (Carter 1982), l’Amandier (Carter 1982) et le Pistachier (Rumbos, 1986), l’Abricotier, le Cassissier, le Cerisier, le Noisetier, l’Olivier (Rumbos, 1993), le Tamaris et la Vigne.
L’eutypiose est présente dans la quasi-totalité des vignobles du monde : Australie (Carter 1973), Nouvelle Zélande (Dey et al., 1976 ; Wenneker et al., 2006), Canada, Etats-Unis (Californie (Petzoldt et al., 1983 ; Moller, 1977), Oregon, Washington (Glawe et al., 1981), Michigan (Trese et al., 1980), New York (Moller et al., 1977 ; Uyemoto et al., 1976), Ontario (Moller et al., 1977)), Brésil (Paradela et al., 1993), Mexique (Teliz et al., 1979), Israël, Libye, Afrique du Sud (Berraf et al., 2005), Chine (Hua et al., 2007), Europe (Italie (Cortesi
et al., 2001), Espagne (Martin et al., 2007), Grèce (Kouyeas et al., 1976), Portugal, Allemagne (Cortesi et al., 2001 ; Fischer et al., 2003), Hongrie (Moller et al., 1980) et France (Chapuis, 1998 ; Bolay et al., 1977 ; Boubals, 1986)).
3-1-2 Importance de la maladie dans le vignoble français
En France, un observatoire national des maladies du bois de la Vigne a été créé en 2002. Ce dispositif pluriannuel couvre 753 parcelles réparties dans 18 vignobles et comprend 28 cépages différents. La notation des symptômes a été effectuée chaque année de 2002 à 2007 sur 300 ceps par parcelle. La synthèse nationale de l’observatoire indique que, tous cépages confondus, 55% des parcelles présentent au moins un cep avec des symptômes d’eutypiose (moyenne sur la période 2003-2007). La fréquence d’apparition des symptômes varie légèrement selon les années, allant de 48% en 2004, à 64% en 2003 (Fig. 12).
Le pourcentage annuel de pieds malades par parcelle (incidence) est évalué à 2,2% pour la période 2003-2007. Sur cette période, l’incidence la plus forte est trouvée pour 2003 (3,2%) et celle la plus faible pour 2006 (1,3%). Ce résultat doit être évalué à la hausse car le caractère insidieux des symptômes masque le niveau réel d’infection d’une parcelle, et peut fluctuer en fonction des cépages et des vignobles.
Les différentes régions viticoles françaises ne présentent pas le même profil de sensibilité à l’eutypiose (Fig. 13). L’encépagement, les variations climatiques et les pratiques culturales influencent cette répartition. Le faible taux d’expression de la maladie (10%) dans l’Est de la France (vignobles de Bourgogne, d’Alsace et de Champagne) s’explique par un climat continental moins favorable à l’eutypiose. Les régions méditerranéennes regroupent 36% des ceps sensibles, 22% pour le Languedoc-Roussillon et 14% pour la région PACA. Les régions viticoles de l’ouest du pays regroupent 51% des vignes sensibles à la maladie. Le cépage Ugni-Blanc particulièrement sensible à l’eutypiose est très présent dans le vignoble Cognaçais, ce qui ralentit les efforts pour lutter contre l’eutypiose. La région bordelaise (29%) est également concernée par l’eutypiose: le climat est très favorable à l’expression de la maladie, et le Cabernet Sauvignon (abondant dans ce vignoble) est aussi un cépage sensible.
3-1-3 Impact économique de la maladie
L’eutypiose entraîne une diminution importante des rendements (Munkvold et al., 1994 ; Creaser et al., 2001). En effet, dans les vignobles infectés par la maladie, le nombre de grappes par cep chute, du fait d’un dessèchement des inflorescences (Creaser et al., 2000 ; Ferreira, 1994 ; Hallen et al., 2001 ; Carter, 1988). En Californie, pour le cépage Chenin blanc, cette diminution se situe dans un intervalle de 30 à 60% selon l’importance de la maladie (Munkvold et al., 1994). Dans cette région, l’eutypiose entraîne une perte globale estimée à 260 millions de dollars par an (Siebert, 2000). En Australie, les diminutions de rendement pour les cépages Shiraz et Cabernet Sauvignon sont estimées à 30% voire 47% (respectivement à 850 et 740 kg/ha) (Wicks et al., 1999). Elles entraînent une perte d’environ 1000 à 2800 dollars par ha (Wicks et al., 1999). Dans la région de Bordeaux, les pertes pourraient aller jusqu’à 6000 euros/ha (perte de qualité, recépage, perte de rendement) dans les propriétés produisant du vin à forte valeur ajoutée, en cas d’expression maximale de la maladie (Dubos, 1996).
L’eutypiose entraîne une diminution de la qualité des vins. Les désordres physiologiques qu’elle entraîne affectent la maturation du fruit et la biosynthèse des composés impliqués dans l’arôme des vins (Wicks et al., 1999). Sur des cultures cellulaires de vigne, l’addition d’eutypine, une des toxines produite par le champignon responsable de l’eutypiose, affecte la voie de biosynthèse des anthocyanes. Ce mécanisme pourrait expliquer la diminution de la qualité des baies de raisin au vignoble (Afifi et al., 2003). En outre, l’eutypiose entraîne une diminution de la longévité des ceps (Munkvold et al., 1994), et le remplacement prématuré des souches mortes provoque un rajeunissement du vignoble préjudiciable à la qualité (Fallot
et al., 1997).
3-1-4 Le caractère insidieux des symptômes de l’eutypiose
Les symptômes foliaires se développent tardivement, plusieurs années (3 à 8 ans) après l’infection (Tey-Rulh et al., 1991 ; Duthie et al., 1991) ce qui rend le diagnostic de la maladie difficile à un stade précoce (Moller et al., 1978). La présence de symptômes sur un pied infecté n’étant pas systématique d’une année sur l’autre (Creaser et al., 2001), le niveau réel d’infection d’une parcelle ne peut être établie que par un suivi annuel des symptômes cep par cep (Fig. 14).
3-1-5 Différence de sensibilité des cépages à l’eutypiose
Plusieurs études ont mis en évidence la différence de sensibilité des cépages à l’eutypiose : au vignoble (Dubos, 1987 ; Boubal, 1986), lors d’essais expérimentaux en serre (Munkvold et
al., 1995 ; Peros et al., 1994 ; Chapuis et al., 1998 ; Sosnowski et al., 2007) et même sur des vitroplants de Vigne (Mauro et al., 1988). Une analyse statistique, effectuée par l’observatoire national des maladies du bois à partir des données de notations obtenues entre 2003 à 2007, a permis d’établir une classification des différents cépages en fonction de leur sensibilité à l’eutypiose (Fig. 15). Le Cabernet Sauvignon, qui fait partie des cépages très sensibles, présente en moyenne un taux d’incidence de la maladie de 8%. Il faut souligner qu’il n’existe pas de cépage résistant à l’eutypiose. Les cépages dits peu sensibles (ou tolérants) comme le Melon ou le Savagnin sont infectés par le champignon, mais ils semblent contenir sa progression et présentent peu de symptômes.
3-2 L’agent pathogène : E. lata
3-2-1 Découverte et caractérisation de l’agent pathogène 3-2-1-1 Découverte de l’agent pathogène
L’eutypiose est provoquée par le champignon ascomycète Eutypa lata, identifié formellement sur la Vigne par Moller et Kasimatis (1978). Dénommé à cette époque Eutypa armeniacae, le terme définitif d’Eutypa lata est donné par Rappaz (1984). Il existe deux formes du champignon : asexuée (ou forme imparfaite) et sexuée (ou forme parfaite).
3-2-1-2 La forme asexuée Libertella blepharis
La forme asexuée appelée Libertella blepharis est caractérisée par la présence de pycnides regroupées dans un stroma. Ces pycnides contiennent les pycnidiospores qui ne semblent pas jouer de rôle dans la propagation de la maladie (Cortesi et al., 2001) en raison de leur difficulté à germer et à donner du mycélium (Moller et al., 1978 ; Ju et al., 1991).
3-2-1-3 Cycle biologique de la forme sexuée vecteur de la maladie
La forme sexuée d’E. lata est le vecteur de la maladie. Le cycle biologique complet d’E. lata est présenté dans la figure 16. Les périthèces présents sur l’écorce du bois mort constituent la source de contamination. Ces périthèces contiennent des asques qui libèrent sous l’action de la pluie de grande quantité d’ascospores (Paillassa et al., 1992). Ces ascospores sont disséminées par le vent sur de très grandes distances (Ramos, 1975 ; Petzoldt, 1983). Les plaies de tailles et les blessures dues au gel sont les cibles des ascospores qui germent au niveau des vaisseaux du xylème. Par la suite, le champignon progresse de manière extrêmement lente dans le bois.
3-2-1-4 Différence d’agressivité des souches
Des infections expérimentales de boutures de vignes avec des souches d’E. lata d’origine géographique différentes ont été conduites en serre. Elles mettent en évidence la différence d’agressivité des souches, qui se traduit par une capacité différente à produire des symptômes sur un cépage donné en conditions contrôlées (Péros et al., 1994 ; Péros et al., 2003 ; Sonowki et al., 2007).
3-2-1-5 Diversité génétique des souches
La diversité génétique des souches d’E. lata de différentes origines géographiques (Australie, Europe, Californie, Afrique du sud) a été étudiée grâce à différentes techniques : les isozymes (Peros et al., 1996), les marqueurs RAPD (random amplified polymorphism DNA) (Peros et
al., 1996 ; Peros et al., 1997 ; Peros et al., 1998 ; Péros et al., 1999 ; Péros et al., 1999 ; Peros
et al., 2003), les marqueurs AFLP (amplified fragment length polymorphism) (DeScenzo et
al., 1999), les séquences ITS (ribosomal DNA internal transcribed spacer) (DeScenzo et al., 1999), les marqueurs RFLP (restriction fragment length polymorphism) (Lardner et al., 2007).
Ces études ont montré une importante diversité génétique au sein et entre les différentes populations de l’agent pathogène, ce qui est compatible avec le mode de dispersion par voie sexuée du champignon (ascospores) (Peros et al., 1996 ; Peros et al., 1997 ; Peros et al., 1998 ; Péros et al., 1999 ; Péros et al., 1999 ; Peros et al., 2003 Lardner et al., 2007). Aucune corrélation n’a été observée entre les profils génétiques et le type d’hôte (Peros et al., 1996) , l’origine géographique des souches (Peros et al., 1996 ; Peros et al., 1997 ; Peros et al., 1998 ; Péros et al., 1999 ; Péros et al., 1999 ; Peros 2003 ; Lardner et al., 2007) l’agressivité des isolats (Peros et al., 2003 ; Péros et al., 1999 ) ou la production de métabolites secondaires (Lardner et al., 2007).
3-2-2 Le mode d’action : production de toxines
L’agent pathogène responsable de l’eutypiose attaque exclusivement le tronc et les bras des ceps, et il n’a jamais été observé dans les rameaux herbacés ou dans les organes qu’ils portent (Bernard et al., 1986). L’apparition de symptômes dans tout l’appareil végétatif implique la production de toxines. La toxicité du filtrat de culture du champignon a été mise en évidence pour la première fois sur des vitroplants de vigne (Mauro et al., 1988 ), puis sur des protoplastes de Cabernet Sauvignon (Tsoupas et al., 1988). Des études HPLC de ces filtrats de cultures ont permis d’identifier des métabolites secondaires produits par E. lata (Renaud et
al., 1989, Tsoupas et al., 1988 ; Tey Rulh et al., 1991 ; Molyneux et al., 2002) et d’étudier leur toxicité.
3-2-2-1 L’eutypine
L’hydroxy-4-(methyl-3-butène-3-ynyl-1)-3 benzaldéhyde (Fig. 17) a été caractérisé chimiquement par Renaud et al. (1989). La toxicité de cette molécule, baptisée eutypine, a été mise en évidence sur des feuilles et sur des protoplastes de feuille du cépage Cabernet Sauvignon (Tey-Ruhl et al., 1991). L’eutypine est transportée dans la sève brute, où elle est détectée spécifiquement dans les ceps infectés (Tey-Ruhl et al., 1991). Des feuilles de vitroplants traités avec de l’eutypine présentent des altérations ultra structurales semblables à celles observées sur des plantes atteintes d’eutypiose: hypertrophie des chloroplastes, dilatation des thylakoïdes, rétractation du plasmalemme (Deswartes et al., 1994 ; Philippe et
al., 1993). L’eutypine agit comme un agent protonophore et un découplant des phosphorylations oxydatives au niveau des mitochondries (Deswarte et al., 1996), des chloroplastes (Deswarte et al., 1994) et de la membrane plasmique (Amborabé et al., 2001).
Un mécanisme naturel de détoxication de l’eutypine en eutypinol a été mis en évidence dans des cellules de vigne. Cette activité est d’autant plus forte que les cellules proviennent de cépages peu sensibles à la maladie (Colrat et al., 1998). Ce processus de biotransformation est très rapide (Afifi et al., 2003). D’autres espèces végétales sont aussi capables de réduire l’eutypine. Parmi ces dernières, Vigna radiata présente la plus forte activité. A partir d’hypocotyles de Vigna radiata, une enzyme capable de réduire l’eutypine (ERE) a été purifiée (Colrat et al., 1999). L’ADNc de Vigna radiata codant pour cette enzyme a été cloné et code pour une protéine ayant les propriétés d’une réductase NADPH-dépendante (Guillen
et al., 1998). Une enzyme équivalente (Colrat et al., 1998) a été partiellement purifiée à partir de Vitis vinifera. Des cellules (Guillen et al., 1998), et des vitroplants (Legrand et al., 2003) de Vigne transformés avec le gène VR-ERE de Vigna radiata, résistent à une concentration d’eutypine de 300 µM.
3-2-2-2 Composés dérivés de l’eutypine
La découverte de souche d’E. lata californiennes virulentes sur la vigne et ne synthétisant pas l’eutypine dans leur milieu de culture confirme l’existence d’autres composés toxiques (Molyneux et al., 2002). Ces métabolites (Fig. 17) synthétisés par E. lata (eutypinol, benzofurane, chromanone, siccayne, eulatinol, eulatachromène) ont été mis en évidence (Renaud en 1985 ; Molyneux et al., 2002).
Certains de ces composés ont été synthétisés chimiquement et leur effet a pu être testé par application sur des disques de feuilles de Vigne (Smith et al., 2003 ; Mahoney et al., 2003).
L’eulatachromène présente une activité toxique supérieure à celle de l’eutypine. Le benzofurane (résultant de la cyclisation de l’eutypine) et l’eulatinol possèdent une activité
nécrosante. L’application d’eutypinol ou de la siccayne n’a pas d’effet sur les disques foliaires de Vigne.
Le mode d’action de ces composés a été étudié sur le modèle levure : la présence d’eutypine, de benzofuran, d’eulatinol dans le milieu de culture des levures est létal. L’eutypinol et l’eulatachromène agissent sur les mitochondries et provoquent une inhibition de la respiration, alors que la siccayne n’a pas d’effet (Kim et al., 2004).
Des études ont montré une production différente des métabolites secondaires en fonction des souches d’E. lata et du milieu de culture (Mahoney et al., 2003 ; Mahoney et al., 2005 ). Il n’y a pas de corrélation apparente entre le profil métabolique des souches et leur agressivité relative ou le type de cultivar (sensible ou tolérant) qui a servi à préparer le milieu de culture du champignon (Mahoney et al., 2005 ; Lardner et al., 2006).
3-2-2-3 Autres composés sécrétés par E. lata
Comme beaucoup de champignons associés à un dépérissement du bois, E. lata sécrète des enzymes hydrolytiques. La production de cellulases et de xylanases (English et al., 1978 ; Elghazali et al., 1992), de β 1,3 glucanases, de chitinases, de protéases (Schmidt et al., 1999), d’oxydases, de glycosidases et d’enzymes de dégradation de l’amidon (Rolshausen et al., 2008) a été mise en évidence à partir de cultures du champignon ou de bois de Vigne infectés.
L’activité de ces enzymes a été étudiée in vitro. La dégradation globale des lignocelluloses est principalement due à la cellulolyse, E. lata possédant une faible activité ligninolytique (Elghazali et al., 1992 ; English et al., 1978 ; Schmidt et al., 1999). De plus, la quantité de lignine dans le bois augmente d’autant plus que le cépage infecté est résistant (Rolshausen et
al., 2008). La faible activité ligninolytique pourrait expliquer la dureté des tissus nécrosés au niveau du bois, la lente progression (de 3 à 8 ans) du champignon avant l’apparition des symptômes, et la différence de sensibilité des cépages.
