2-1 Techniques d’infection
2-1-1 Infection de plantules in vitro avec E. lata
Les plantules de Cabernet Sauvignon (CS) sont infectées expérimentalement avec la souche NE85-1 d’E. lata par simple frottement entre le haut de la tige sectionnée au ciseau et le mycélium obtenu après 10 à 15 j de culture sur milieu PDA (Potato dextrose agar) (Fig. 19). Des plantules dont la tige a simplement été sectionnée servent de témoin sain. En fonction des symptômes obtenus 7 semaines après l’infection, des pools de plantules ont été constitués. Certaines plantules ont été utilisées pour les ré-isolements, les autres ont été congelées dans l’azote et stockées à -80°C. Elles ont été utilisées pour l’analyse transcriptomique de
2-1-2 Infection de boutures en serre avec E. lata
Des boutures en serre ont été infectées avec la souche BX1-10 d’E. lata selon la technique mise au point par Chapuis (1995) et avec l’aide de Pascal Lecomte (Fig. 19). Cette technique consiste à infecter des boutures à deux yeux déjà racinées depuis deux mois. Pour ce faire, un trou de 2 mm de diamètre est percé jusqu'à la moelle, 2 cm en dessous de l'oeil sur l'axe orthoptique à l'aide d'une mini-perceuse munie d'une mèche stérilisée à la flamme. Ensuite, du mycélium d'E. lata est prélevé à l'aide d'un scalpel en raclant la surface d'une culture en pleine croissance. Ce mycélium est placé dans une fiole contenant de l'eau stérile, puis fortement agité afin d'homogénéiser la suspension. Enfin, 20 µL de cette suspension sont injectés à l'aide d'une pipette dans le trou d'inoculation qui est immédiatement recouvert de paraffine. Les boutures sont maintenues en serre (conditions contrôlées) jusqu’à l’apparition des symptômes de la maladie l’année suivante. Le matériel foliaire de chaque bouture est alors prélevé, immédiatement plongé dans l’azote liquide, puis congelé à -80°C en vue d’une analyse transcriptomique. Des ré-isolements ont également été effectués en utilisant les parties lignifiées pour vérifier l’état sanitaire des boutures.
2-1-3 Infection de feuilles détachées de vigne avec Plasmopara viticola
Les échantillons infectés par Plasmopara viticola ont été fournies par David Lafarge (UMR « Santé végétale », INRA de Bordeaux). Juste avant infection, des feuilles de Vigne du cépage Cabernet Sauvignon sont prélevées sur des boutures cultivées en serre. Elles sont déposées face supérieure vers le bas dans une boîte de Pétri. La suspension de spores est amenée à une concentration de 5000 spores par mL (quantification par comptage en cellule de Malassez) et conservée dans la glace jusqu'au moment de l'inoculation. L'infection se fait par dépôt de 4 gouttes de 15 µL par feuille, sur la face inférieure. Les feuilles sont maintenues dans une chambre de culture à 22°C sous une photopériode de 16 h de jour et de 8 h de nuit. Des pools de feuilles infectées avec différentes souches de mildiou (PAV 32, FEM 03, PIC 59, MIC 128, EAU 14, FET 03) ont été prélevés 12, 14, 16 j après l’infection, et des pools de feuilles saines ont également été préparés. Les feuilles prélevées sont immergées dans l’azote liquide et congelées. Les ARN extraits ont été utilisés pour l’étude en RT-PCR de la spécificité de réponse à E. lata pour les gènes candidats sélectionnés.
2-1-4 Infection de feuilles détachées de vigne avec Uncinula necator
Des feuilles du cépage Cabernet Sauvignon infectées par U. necator ont été fournies par Philippe Cartolaro (UMR « Santé végétale », INRA de Bordeaux). Des feuilles de Vigne pleinement développées sont prélevées sur des boutures cultivées en serre juste avant les infections. Après désinfection dans un bain d’hypochlorite de calcium (50 g.L-1) pendant 10 min, elles sont déposées dans des boîtes de Pétri sur milieu gélosé (15 g.L-1 d’agar et 30 mg.L-1 de benzimidazole), face supérieure vers le haut. Les boîtes sont placées dans une
tour d’inoculation en plexiglas sous une hotte à flux laminaire. Les conidies du champignon sont détachées de la feuille sporulante (après 12 j à 22°C) par un souffle d’air, puis inoculées à sec par gravité sur les feuilles à infecter. La densité de l’inoculum doit être comprise entre 600 et 800 conidies par cm2. Les feuilles infectées sont maintenues en chambre de culture à 22°C avec une photopériode de 16 h et une intensité lumineuse de 25 µE.m-2. Des pools de feuilles saines et infectées par la souche S071 ont été prélevées 12 et 14 j après l’infection et congelées. Les ARN extraits ont été utilisés pour l’étude en RT- PCR de la spécificité de réponse à E. lata pour les gènes candidats sélectionnés.
2-1-5 Infection de feuilles détachées de vigne par Botrytis cinerea
Les ARN de feuilles de cépage Chardonnay infectées par B. cinerea ont été fournis par Damien Afoufa-Bastien de la FRE CNRS 3091, Université de Poitiers. Des vitroplants de Vigne cultivés sur milieu Mac Cown sont transférés en système aéroponique au stade 3-4 feuilles, avec des racines de 3 à 5 cm de long. Les jeunes plantules de Vigne sont placées sur un bac dans lequel une solution nutritive est délivrée par aspersion. Cette aspersion, grâce à une pompe (1000 L/h), crée un brouillard suffisant à leur bon développement. Le dispositif est placé dans un phytotron sous lampe à vapeur de sodium, à température et humidité constantes (respectivement 23°C et 75%). La souche 916 T (Transposa) cultivée sur milieu Malt-agar (10 g.L-1 ; 15 g.L-1), est placée entre 5 et 10 j à la lumière pour induire la sporulation. Une suspension de conidies de Botrytis cinerea est préparée stérilement, puis conservée dans la glace jusqu'au moment de l'inoculation. L'infection se fait par dépôt de 8,5 µL (1020 conidies) de cette solution par feuille. Des pools de feuilles saines (0 h) et des pools de feuilles infectées avec la souche 916 T sont prélevés après 24, 48 et 72 h de contact avec
2-2 Caractérisation du matériel infecté par E. lata
2-2-1 Notation des symptômes d’eutypiose
Les symptômes d’eutypiose sont évalués dans chaque condition expérimentale (Fig. 19).
- In vitro, on constate la formation d’une nécrose qui se localise quelques mm en dessous de la zone de contact entre la tige et le mycélium. Cette nécrose se développe spécifiquement sur le matériel infecté. La sévérité des symptômes apparus est évaluée pour chaque plantule : la note 1/1 correspond à une nécrose nette associée à des symptômes foliaires, la note 1/0 à une légère nécrose sans symptômes foliaires, et la note 0/0 est attribuée dans le cas où il n’y a pas de nécrose visible et pas de symptômes à foliaires.
- En serre, les symptômes d’eutypiose développés sont évalués selon l’échelle suivante : forts, moyens, légers, inexistants.
- Les symptômes d’eutypiose observés sur une parcelle expérimentale (Châteaux Cruzeaux) ont été suivis entre 2002 et 2006 par l’équipe de Pascal Lecomte. Ces observations ont été effectuées dans le cadre du programme de l’observatoire national des maladies du bois de la Vigne.
2-2-2 Ré-isolement d’E. lata à partir de plantule in vitro
Pour chaque type de plantules, infectées ou saines, des ré-isolements ont été effectués sur toute la hauteur de la tige, de façon à suivre la progression du mycélium (Fig. 19). Pour ce faire, on prélève en conditions stériles l’entre-noeud situé au niveau de la zone de mise en contact avec le champignon (I), ainsi que les entre-noeuds situés respectivement juste au-dessous de cette zone (I-1), trois entre-noeuds en-dessous (I-3), et cinq entre-noeuds en-dessous (I-5). Chacun d’eux est désinfecté dans une solution d’hypochlorite de sodium à 1%, puis rincé dans trois bains successifs d’eau stérile. Le fragment est ensuite découpé transversalement en deux morceaux et placé sur une boîte de Pétri contenant le milieu de culture du champignon (PDA) additionné de streptomycine (0,1 mg.mL-1). Lorsque le ré-isolement est positif, on observe après environ 10 j de culture, un mycélium typique d’E. lata qui se propage à partir des fragments de tige. Deux témoins négatifs sont constitués à partir d’entre-noeuds prélevés sur une plantule non infectée et frottés avec du mycélium. Ils subissent ensuite soit les étapes de désinfection et de rinçage, soit seulement l’étape de rinçage. Ils sont enfin placés sur le milieu de ré-isolement.
2-2-3 Ré-isolement d’E. lata à partir de matériel en serre et au vignoble
Les ré-isolements sont effectués en utilisant la partie ligneuse des plantes (Fig. 19). Une section longitudinale de cette dernière est effectuée pour vérifier la présence d’une lésion sectorielle caractéristique d’E. lata. La zone sélectionnée en bordure de nécrose est découpée en petits fragments cubiques de 2 à 5 mm de côté, à l’aide d’un sécateur désinfecté. Ces fragments sont ensuite immergés dans de l’hypochlorite de calcium à 2-3% pendant quelques secondes. Sous une hotte à flux laminaire, les fragments sont déposés dans des boîtes de Pétri (à raison de 5 par boîte). Le milieu de culture utilisé est composé de malt (15 g.L-1), d’agar (20 g.L-1), et un antibiotique antibactérien (chloramphénicol à 50 mg.L-1) est ajouté après autoclavage. La notation des résultats est réalisée après 10 j d’incubation à 22°C. Cette notation est vérifiée et ajustée si nécessaire au cours des 4 semaines suivantes. Les résultats sont exprimés en nombre de fragments infectés par E. lata par rapport au nombre total de fragments analysés.