levue frangalse des SGIEI|GES DE L'EAU,4 (19851 277-2f,2
Incidence de la mEthode d'extraction des nuclEotides ad6nyliques
sur les valeurs de la charge 6nerg6tique des peuplements microplanctoniques
C o n s e q u e n c e s o f a d e n i n e n u c l e o t i d e s e x t r a c t i n g m e t h o d o n p h y t o p l a n k t o n e n e r g y c h a r g e
C . A M B L A R D e t H . E L M A G O U R I *
R 6 s u m 6
A f i n d e c o n n a i t r e L ' i n c i d e n c e d e I a t e c h n i c l u e d ' e x t n a c t i o n s u r l e s r 6 s u L t a t s o b t e n u s , n o u s a v o n s r 6 a L i s 6 e n p a r a t L d t e d e s e x t r a c t i o n s a u T r i s b o u i I L a n t e t a u D . M . S . 0 d a n s L e c a d r e d ' u n e 6 t u d e s u r L e m i c r o p L a n c t o n d u I a c d ' A y d a t .
I L a p p a r a i t q u e l e s e x t r a c t i o n s a u D . 1 4 . S . 0 e t a u T r i s b o u i t t a n t a b o u t i s s e n t A d e s v a t e u r s s e n s i b L e m e n t 6 g a l e s l o r s q u e I t o n c o n s i d d r e t a s o m m e d e s n u c t 6 o t i d e s a d 6 n y L i q u e s
( I = A T P + A D P + A M P ) ; a l o r s q u e [ ' e x t r a c t i o n a u D . H . S . 0 e s t p o u r t a n t p L u s e f f i c a c e s i I t o n n e c o n s i d d r e q u e l e s c o n c e n t r a - t i o n s e n A T P . D e [ a m 6 m e f a g o n , [ e s v a l e u r s d e [ a c h a r g e 6 n e r - g 6 t i q u e ( C E ) o b t e n u e s a p r d s e x t r a c t i o n a u D . M . S . O . s o n t a s s e z n e t t e m e n t s u o 6 r i e u r e s a u x v a t e u n s o b s e r v 6 e s a p r d s e x t r a c t i o n a u T n i s b o u i [ l a n t .
C e p e n d a n t p o u r c h a c u n d e c e s 3 p a r a m d t r e s ( A T P , X e t C E ) , l e s v a r ^ i a t i o n s r e I a t i v e s d e c e s 2 s 6 r ' i e s d e v a t e u r s r e s t e s p a r a t -
t d I e s .
Summa ry
I n o r d e r t o k n o w t h e r e p e r c u s s i o n o f e x t r a c t i n g m e t h o d s o n a d e n i n e n u c I e o t i d e s c o n c e n t n a t i o n s a n d e n e r g y c h a r g e ( E C ) v a t u e s , w e h a v e r e a t i s e d e x t r a c t i o n s w i t h b o i t i n g T r i s a n d D N S 0 o n I a c u s t r i a n m i c r o p I a n k t o n i c o r g a n i s m s .
* L a b o r a t o i r e d e Z o o l o g i e - U , A ' F e r r a n d I T - B . P . 4 5 - 6 3 1 7 D
C . N . R , S . 1 3 8 - U n i v e r s i t 6 d e C l e r m o n t - A U B T E R E - F r a n c e ,
2 7 8 S e i e n c e s d e L t e a u 4 , n o 4
B o i L i n g T r i s a n d D M S O e x t r a c t i o n s L e a d t o a p p r e c i a b [ y e q u i v a - l e n t v a L u e s i f w e c o n s i d e r t h e s u m o f a d e n i n e n u c t e o t i d e s ( t = A T P + A D P + A M P ) ; a l t h o u g h D P I S O p r o c e d u n e is m o r e e f f e c - t i v e o n A T P c o n c e n t r a t i o n s . I n t h i s w a y e n e r g y c h a r s r e v a I u e s o b t a i n e d a f t e r D M S O e x t r a c t i o n a r - e h i g h e r t h a n b o i L i n g T r i s e x t r a c t i o n o n e s .
H o w e v e r fo r e a c h o n e o f t h e s e p a r a m e t e n s ( A T p , I , E C ) , n e L a t . i - v e s v a n i a t i o n s o f t h e t w o n a n g e r s o f v a I u e s a r " e p a r a [ [ e L .
1 - I n r n o p u c r r o N
D e p u i s p l u s i e u r s a n n 6 e s , I e d o s a g e d e 1 ' A T p a 6 t 6 l a r g e m e n t u t i l i s 6 t a n t e n l i m n o l o g i e q u ' e n o c 6 a n o g r a p h i e . M 6 t a b o l i t e s p 6 c i f i q u e d e l a m a t i e r e v i v a n t e , I ' A T P s e d 6 g r a d e d o n c , t r E s r a p i d e m e n t a I a m o r t d e s c e 1 l u 1 e s , c o n t r a i r e m e n t a d e n o m b r e u x p a r a m d t r e s e s t i m a t i f s c l a s s i q u e s ( c a r b o n e et azote organiques p a r t i c u l a i r e s , p r o t 6 i n e s e t g l u c i d e s p a r - t i c u l a i r e s , c h l o r o p h y l l e a , A D N . . . ) .
E n o u t r e , e t b i e n q u e s o u m i s d d e s variations s e l o n I ' 6 t a t p h y s i o l o - g i q u e d e s o r g a n i s m e s , I r A T P e s t e n q u a n t i t 6 r e l a t i v e r n e n t c o n s t a n t e d a n s I a c e l 1 u l e . C e s p r o p r i 6 t 6 s f o n t d e I ' A T p u n p a r a m C t r e e s t i m a t i f d e l _ a b i o m a s s e r n i c r o p l a n c t o n i q u e , a u s e n s s t r i c t d u t e r m e , p a r t i c u l i d r e m e n t i n t 6 r e s s a n t .
P a r a i l l e u r s I r A T P j o u e u n r 6 l e m a j e u r d a n s l _ e n 6 t a b o l i s m e c e 1 l u l a i r e , d a n s I a m e s u r e o r l i I c o n s t i t u e I ' i n t e r m 6 d i a i r e o b l i g a t o i r e d . a n s t o u s I e s p r o c e s s u s d e t r a n s f e r t d ' 6 n e r g i e c h i m i q u e . E n f i n s e l o n A T K I N S O N
( 1 9 6 8 ) 1 ' 6 t a t d r 6 n e r g i e d e I a c e l t u l e e s t a s s e z b i e n r e p r 6 s e n t 6 p a r I e n i v e a u d e r e m p l i s s a g e , e n l i a i s o n s p h o s p h a t e s r i c h e e n 6 n e r g i e , d u s y s t e m e A D P - A T P - A M P . P o u r mesurer cet "6tat d'5nergj.e", l a c h a r g e 6 n e r - g 6 t i q u e ( C E ) a 6t6 d6finie p a r I e r a p p o r t s u i v a n t :
CE = ATP + 7/2 pcP / EtP + ADP + AMP.
C e p e n d a n t 1 a r 6 a c t i v i t 6 d e 1 ' A T p , s o n h y d r o l y s e r a p i d e a p r d s l a m o r t c e l l u l a i r e , I e t u r n - o v e r t r e s r a p i d e d e s n u c l 6 o t i d e s a d 6 n y l i q u e s e t l a s e n s i b i l i t 6 d e c e d o s a g e o b l i g r e n t I ' e x p 6 r i m e n t a t e u r d s u i v r e u n e m 6 t h o - d o l o g i e s t r i c t e e t p r 6 c i s e p o u r o b t e n i r d e s i n f o r m a t i o n s f i a b l e s , n o n b i a i s 6 e s p a r des artefacts r n € t h o d o l o g i q u e s . A c e s u j e t , d e n o n b r e u x a u t e u r s ( S U T C L I F F E et aL., 7 9 1 6 ; I ( A R L e t H o L M - H A N S E N , 1 9 7 8 ; PERRY ef,
aL., 1979 ; ROMANO, 7982 et 1985 ; JEWSON et DOKULIT,, 7982 ; AMBLARD,
1 9 8 3 ) s ' a c c o r d e n t A r e c o n n a l t r e q u e I ' e x t r a c t i o n e s t l e p o i n t t e p l u s d 6 l i c a t d e l a m 6 t h o d e d e d o s a g e d e s nucl6otides a d 6 n y l i q u e s . A u s s j _ , d e n o m b r e u x a u t e u r s o n t c o m p a r 6 l r e f f i c a c i t 6 d e l a r e p r o d u c t i b i l i t 6 d e d i f f d r e n t e s m d t h o d e s d ' e x t r a c t i o n ( H o L M - H A N S E N et BooTH, 1966 i
B A N C R O F T e t a L . , 7 9 7 6 ; T O B r N e t a L . , I 9 7 B ; B U L L E I D , L 9 7 B ; T Q U Z E L e t I4ORFAUX, 79?9 ; I"ARSON et OLSSON, 7979 i COLTN, 1979 ; JACKUBCZAK et L E C L E R C , 1 9 8 1 ; K U C N E R O W T C Z e t a L . , l 9 g 2 ; K O M T S A R C Z U C e t a L . , I g g 4 , e t c . p o u r une revue voir K A R L , 1 9 8 0 .
C e p e n d a n t , I a p l u p a r t d e c e s d t u d e s s e s o n t u n i q u e m e n t a d r e s s 6 e s a u x r 6 s u l t a t s c o n c e r n a n t 1 e d o s a g e d e I ' A T p , s a n s c o n s i d 6 r e r l e s r 6 a r r a n g e - m e n t s d e s n u c l 6 o t i d e s a d 6 n y l i q u e s i l , i n t 6 r i e u r d u p o o l e t d o n c l e s
Ertraetion des nueLdotides addnyLiques et charge dnergdtique 2 7 9
v a r i a t i o n s d e I a c h a r g e 6 n e r g 6 t i q u e , c o n s 6 q u e n c e s p o s s i b l e s d e I a m 6 t h o - d e d ' e x t r a c t i o n c h o i s i e .
E n c o n s 6 q u e n c e , a f i n d e c o n n a i t r e I ' i n c i d e n c e d e 1 a t e c h n i q u e d r e x -
traction sur: les valeurs des concentrations en ATP mais 6galement en
A D P , A M P e t d e l a c h a r g e 6 n e r g d t i q u e ' n o u s a v o n s r 6 a l i s 6 e n p a r a l l E l e d e s e x t r a c t i o n s a u T r i s b o u i l l a n t e t a u D M S O d a n s l e c a d r e d ' u n e 6 t u d e g l o b a l e s u r l e m i c r o p l a n c t o n d u l a c d ' A y d a t . C e s d e u x e x t r a c t a n t s o n t 6 t 6 c h o i s i s d a n s l a m e s u r e o r ) c e s o n t a c t u e f l e m e n t , l e s p l u s e m p l o y 6 s p o u r I ' 6 t u d e d e s p e u p l e m e n t s m i c r o p l a n c t o n i q u e s e n m i l i e u n a t u r e l ; n o t a m m e n t L e T r i s b o u i l l a n t q u i a f a i t I ' o b j e t d e t r e s n o m b r e u s e s a p p l i -
cations depuis les travaux de HoLM-HANSEN et BOOTH (1966)
2 - M E r H o D o L o c r E
1 - P r 6 s e n t a t i o n d e I ' 6 t u d e
E I I e a p o r t 6 s u r l e 1 a c d ' A y d a t ( 6 3 ) , l a c d c a r a c t d r e e u t r o p h e d o n t
les caract6ristiques morphom6triques ont 6t6 mentionn6es par MILLERIoUX
( 1 9 7 6 ) . L e s p r e l e v e m e n t s o n t 6 t 6 e f f e c t u 6 s a u p o i n t c e n t r a l d u l a c q u i p r 6 s e n t e u n e p r o f o n d e u r d e 1 5 m , e t a u x d i f f 6 r e n t s n i v e a u x s u i v a n t s : p r 6 s d e 1 a s u r f a c e , - ! , - 2 , - 4 , - 7 , - 1 0 n e t p r E s d u f o n d ) . L e s r 6 s u l - t a t s p r 6 s e n t 6 s i c i c o r r e s p o n d e n t a u n e s 6 r i e d e 1 0 c a m p a g n e s h e b d o m a - d a i r e s d e p r 6 l d v e m e n t s , r 6 a 1 i s 6 s d ' A v r i l i J u i n 1 9 8 4 , s o i t a u t o t a l 7 0 6 c h a n t i l l o n s .
2 - Pr€lEvements
L e s 6 c h a n t i l l o n s p r 6 l e v 6 s d l a b o u t e i l l e V a n D o r n e t p r 6 f i l t r 6 s s u r u n f i l t r e d ' o u v e r t u r e d e m a i l l e i l e 1 6 0 ]ln afin d ' 6 l i m i n e r I a p l u s g r a n d e p a r t i e d u z o o p l a n c t o n , s o n t t r a i t 6 s a u s s i r a p i d e m e n t q u e p o s s i b l e , e n
6vitant de leur faire subir des variations de temp6rature et de lumino-
s i t 6 t r o p i m p o r t a n t e s . E n e f f e t ' s i c e s v a r i a t i o n s s o n t t r e s m a r q u d e s
et prolong6es, les taux de nucldotides ad6nyliques peuvent varier de
f a g o n n o t a b l e ( H O L M - H A N S E N , 1 9 7 0 ) . P o u r c e l a , f e s f l a c o n s d e p r 6 l E v e m e n t s a u s s i t 6 t r e m p l i s , s o n t d i s p o s 6 s d a n s u n r 6 c i p i e n t c o n t e n a n t d e I ' e a u d
une temp6rature proche de celle du lac ; les 6chantillons provenant des
z o n e s l e s p l u s p r o f o n d e s 6 t a n t p a r t i e l l e m e n t r e c o u v e r t e s d ' u n e t o i l e
3 - E x t r a c t i o n
Q u e l q u e s d i z a i n e s d e m i n u t e s a p r d s 1 e s p r 6 l d v e m e n t s , l e s e x t r a c t i o n s
sont effectu6es dans le camion-laboratoire p1ac6 au boxd du lac.
L ' e x t r a c t i o n d o i t a b o u t i r i l a m i s e e n s o l u t i o n d e s n u c l 6 o t i d e s
addnyliques en respectant les conditions suivantes (DAUMAS, t973 ;
K A R L , 1 9 8 0 ) :
- Ia technique d ' e x t r a c t i o n d o i t p r o v o q u e r I ' 6 c l a t e m e n t d e s c e l l u l e s e t I a l - i b 6 r a t i o n c o m p l e t e d e s n u c l 6 o t i d e s a d 6 n y l i q u e s ,
2 8 0 Seienees de Lteau 4, no4
- les A'fPases et autres enzymes intracefl_ulaires d o i v e n t 6 t r e i n h i _ b 6 e s r a p i d e m e n t e t d e f a g o n i r r 6 v e r s i b l e ,
- le mirieu s o r u b i r i s a n t d o i t € t r e d ' u n e c o m p o s i t i o n p e r r n e t t a n t r a
conservation des nucl6otides ad6nyliques (pn = Z d g) sans perEur_
ber le dosage enzl.matique ult6rieur. Des conditions forcemenc
a l c a r i n e s , n o t a n m e n t . d o i v e n t 6 t r e 6 v i t 6 e s e n r a i s o n d e l a l a b i r i t 6 c h i m i q u e d e s n u c l 6 o t i d e s .
1 - Extraction au Tris bouiffant (HOLM-HAITSEIV et BOOTH, 1965)
L e s c e r r u r e s m i c r o p r a n c t o n i q u e s s o n t r e c u e i l l i e s s u r f i r t r e s a r t o r i - u s ( p o r o s i t 6 0 , 2 p m , d i a m d t r e 5 c m ) a p r d s u n e f i l t r a t i o n s o u s v i d e r 6 a r i s 6 e a v e c u n e p r e s s i o n t r € s f a i b l e e t t o u j o u r s i n f 6 r i e u r e d 1 0 0 m m d e U g .
La fil-tration doit 6tre arr6t6e avant que re firtre ne soit compldte-
m e n t s e c , c r e s t - d - d i r e a l o r s q u ' i l e s t e n c o r e r e c o u v e r t p a r u n e f i n e p e l l i c u r e d ' e a u . 1 1 e s t t r a n s f 6 r 6 d . a n s u n t u b e d e s s a i c o n t e n a n t 5 c c d e t a m p o n T r i s ( h y d r o x y m 6 t h y l - a m i n o m 6 t h a n e O , 0 2 M , p H 7 , 7 5 ) p r 6 a l a b l e m e n t c h a u f f 6 a 1 0 0 o C d a n s un bain-marie b o u i l l a n t .
L a d u r 6 e d e I'extraction e s t f i x 6 e d 5 m n , d u r 6 e a u t e r m e d e l a q u e l r e r r e x t r a i t e s t i m m 6 d i a t e m e n t r e f r o i d i , p u i s e n s u i t e c o n g e r 6 d a n s 1 ' a z o t e l i q u i d e .
2 - E x t r a c t i o n a u D M S O
L a c o n c e n t r a t i o n d e s c e l - I u l e s s u r f i l t r e s e r 6 a r i s e d a n s r e s m 6 m e s c o n d i t i o n s q u e c e l l e s d E c r i t e s p o u r I ' e x t r a c t i o n a u T r i s . L e f i r - t r e
est alors p1ac6 dans 1 tube bouch6 contenant 2 cc de DMSO (Dim6thyl_
s u l f o x i d e a 9 9 B M e r c k ) , t u b e q u i e s t a g i t 6 p e n d a n t 2 0 s e c o n d e s s u r
vortex. Deux minutes plus tard, 10 mI de tampon MOPS sont ajout6s dans
I e t u b e q u i e s t de nouveau agit6 s u r v o r t e x p e n d a n t 2 0 s e c o n d e s . L a
composition du tampon MOPS est Ia suivante :
- lllPOS Sigma (Morphalino p r o p a n e Sulfonic A c i i l ) 0 , O l M , - M g S O a 0 , 0 1 M .
L e p E d e c e t t e s o l u t i o n e s t a j u s t 6 i d e n m e n t , I t e x t r a i t e s t d ' a b o r d r e f r o i d i d a n s 1 ' a z o t e l i q u i d e s u r l _ e t e r r a i n .
3 - C h o i x du voLume de fiitration
7 , 4 a v e c N a o H 0 , 1 M . Corune pr6c6- d a n s u n e g l a c i E r e p u i s e n s u i t e
r r e s t a a l m i s q u e Ie rendement d.e r'extracti-on d e s n u c r E o t i d e s a d 6 n y - l i q u e s d 6 p e n d d u v o l u m e filtr6. A i n s i , S U r c L I F F E e t a L . , ( 1 9 7 5 ) q u i t r a v a i l l a i e n t s u r d e s e a u x c6tiEres r i c h e s e n m a t i d r e s e n s u s p e n s i o n , c o n s t a t e n t p a r e x e m p r e ' une perte d'ATp de t'ordre d e 1 0 i 5 0 E p o u r d e s v o l u m e s f i l t r 6 s a 1 l a n t d e 1 d 3 1 . K A R L e t HOLM-HANSEN (197g), P E P & Y E t A L . , ( 7 9 7 9 ) , A M B L A R D ( I g 7 g ) , R O M A N O (I g 8 2 ) , J E W S O N E t D O K U L I L
( 1 9 8 2 ) , P R I D M O R E e t a L . , ( t 9 9 2 ) f o n t d e s o b s e r v a t i o n s i d e n t i q u e s .
Deux explications, sans d.oute compl6mentaires, sont avanc6es pour
j u s t i f i e r l a b a i s s e d u r e n d e m e n t de 1'extraction l o r s g u e l e v o r u m e
filtrd augmente :
- d'une part I'adsorption d e s n u c r 6 o t i d e s s u r r e s p a r t i c u l e s d u s e s - t o n ' r a i s o n p o u r r a q u e l l e i l e s t p r 6 f 6 r a b l e d ' u t i l i s e r d e s f i t t r e s d e g r a n d d i a m d t r e ( p E R R y et aL., l g ] g ) ;
Ertraetion des rucl,/otides addnyLiques et eharge dnergdtique 2 8 1
- d'autre part, l'augrmentation du temps de filtration qui peut provo-
q u e r 1 a l y s e d e s c e l l u l e s ( H E N D Z E L et HEAIEY, 1984) ou un r6arrangement
des nucl6otides ad6nyliques i I'int6rieur du pool (KARL et HOLI4-HANSEN,
1978) .
E n c o n t r e - p a r t i e , I o r s d e p r 6 l B v e m e n t s r 6 a l i s 6 s e n n i l i e u n a t u r e l o t , 1 e p l u s s o u v e n t , l e s c e l l u l e s m i c r o p l a n c t o n i q u e s p r 6 s e n t e n t u n e r S p a r t i -
tion de type surdispers6 (FROIEfER, 1982) avec une varj-ance supdrieure
d 1 a m o y e n n e , p l u s l e v o l u m e d e f i l t r a t i o n e s t f a i b l e p l u s l e s p o s s i b i - l i t 6 s d ' e r r e u r s d ' 6 c h a n t i l l o n n a g e s o n t g r a n d e s .
D e p l u s , s i 1 ' o n d 6 s i r e q u a n t i f i e r I ' e n s e m b l e d e s n u c l 6 o t i d e s a d 6 n y l i q u e s , u n e q u a n t i t 6 m i n i m a l e d e c e s n u c l 6 o t i d e s e s t n 6 c e s s a i r e
dans chaque extrait pour que les transformations enzymatiques
A.tvlP + ADP + ATP se d6roulent normalement (KIMMICH et aL., 1975 ; KARL
e t H O L M - H A N S E N , 1 9 7 8 ) .
Le choix du vol-ume de filtration doit donc r6pondre i ces deux objec-
t i f s c o n t r a d i c t o i r e s . E n c o n s d q u e n c e , e t c o n s i d 6 . r a n t d r u n e p a r t q u e I e l a c d ' A y d a t , l a c E c a r a c t € r e e u t r o p h e , e s t a s s e z c h a r g 6 e n m a t i E r e o r g a - n i q u e p a r t i c u l a i r e , d ' a u t r e p a r t l a s e n s i b i l i t 6 d e l a m 6 t h o d e d e d o s a g e d e s n u c l 6 o t i d e s a d d n y l i q u e s , I e v o l u m e d e f i l t r a t i o n a 6 t 6 f i x 6 i 5 0 o u 2 0 m 1 s e l o n I ' a b o n d a n c e d u m i c r o p l a n c t o n - C e t t e a b o n d a n c e e s t e s t i m 6 e
de fagon approximative soit par Ia mesure de la profondeur de dispari-
t i o n d u d i s q u e d e S e c c h i , s o i t p a r u n e "filtration a b l a n c " a v a n t l e d 6 b u t d e s e x t r a c t i o n s . D a n s t o u s 1 e s c a s , l a d u r 6 e d e l a f i l t r a t i o n n e d o i t p a s e x c 6 d e r q u e l q u e s d i z a i n e s d e s e c o n d e s .
4 - Conservation des extraits
L e s e x t r a i t s s o n t c o n s e r v 6 s a - 2 0 o c p o u r u n e p 6 r i o d e p r 6 c 6 d a n t l e d o s a g e e n z y m a t i q u e t o u j o u r s i n f 6 r i e u r e d 4 8 h e u r e s .
5 - Dosage enzgmatique
_ Le dosage est r6alis6 par la m6thode d la lucifSrase (STREHLER et
T O T T E R , 1 9 5 2 ) a p r d s c o n v e r s i o n d e I ' A M P e t d e I ' A D P e n A T P ( P R A D E T ,
1967) selon un protocole exp6rimental d6crit par ailleurs (AMBLARD,
1 9 7 9 ) . C e s . t r a n s f o r m a t i o n s e n z y m a t i q u e s s o n t e f f e c t u 6 e s s e l o n l - e s
Squations suivantes :
ADP + phospho6not pyruv... ....W*jT4
M g ' K
ATP
2 ADP
Ad6nvlate kinase*
AMP + ATP
Mg
t P r r n r r r r a f o K i n a c o .
A d 6 n y l a t e k i n a s e
L L Z . / . t . J U i L L Z . / . . + . J
S i g m a r 6 f . P 1 5 0 6 S i g m a r 6 f . t ' l 3 0 0 3
2 8 2 Sciences de L'eau 4, no4
S u r c h a q u e e x t r a i t , i l e s t d o n c n 6 c e s s a i r e d e r 6 a l i s e r t r o i s d o s a g e s d i f f 6 r e n t s :
- un dosage sans aucune transformation enzymatique pour obtenir la
q u a n t i t 6 d ' A T P ,
- un dosage aprCs transformation enzymatique par Ia pyruvate kinase
p o u r o b t e n i r l e s q u a n t i t 6 s d ' A T p e t d ' A D p ,
- enfin apr6s transformations enzymatiques par 1a pyruvate kinase et
I r a d 6 n y l a t e k i n a s e o n o b t i e n t l a s o m m e d e s 3 n u c l 6 o t i d e s : I = A T P + A D P + A M P .
L a s o l u t i o n e n z y m a t i q u e l - u c i f 6 r i n e - l u c i f 6 r a s e ( F L E 50 Sigma), n6ces- s a i r e i l a r 6 a c t i o n d e b i o l u r n i n e s c e n c e e s t p r 6 p a r 6 e c o m m e I e p r 6 c o n i s e n t K A R L e t H O L M - H A N S E N ( 1 9 7 8 ) . L a q u a n t i f i c a t i o n d e 1 ' 6 m i s s i o n d e l u m i e r e e s t r 6 a 1 i s 6 e g r 6 c e a u n p h o t o m d t r e P i c o - A T P ( J o b i n e t Y v o n ) e n n e c o n s i -
ddrant que Ia hauteur du pic initial obtenu immEdiatement apres le m6lan-
g e d e s r d a c t i f s .
E n f i n t o u t e s l e s p o s s i b i l i t 6 s d ' i n h i b i t i o n d e 1 ' 6 m i s s i o n l u m i n e u s e s o n t c o r r i g 6 e s p a r I r e m p l o i s y s t 6 m a t i q u e d e s t a n d a r d s i n t e r n e s .
6 - Pr6cision des mesures
E 1 I e a 6 t 6 c a l c u l 6 e d p a r t i r d e p r 6 l d v e m e n t s e f f e c t u 6 s s u r c e l a c . I e x t r a c t i o n s a u T r i s b o u i l l a n t e t 8 e x t r a c t i o n s a u D M S O o n t 6 t 6 r 6 a l i - s 6 e s s u r d e u x p r 6 l d v e m e n t s d i f f 6 r e n t s s e l - o n I e p r o t o c o l e e x p 6 r i m e n t a l d 6 c r i t c i - d e s s u s .
L e s r 6 s u l t a t s o b t e n u s ( t a b l e a u 1 ) m o n t r e n t q u e , p o u r l e s e x t r a c t i o n s a u T r i s b o u i l l a n t e t a u D M S O , I e s c o e f f i c i e n t s d e v a r i a t i o n o b t e n u s p o u r I ' A T P , I | A D P e t 1 a s o m m e des nucl6otides a d 6 n y l i q u e s
( I = ATP + ADP + AMP), compris entre 7 et 1C t, sont satisfaisants.
D a n s 1 e s 2 c a s , l a meilleure r e p r o d u c t i b i l i t 6 e s t o b t e n u e p o u r l a s o r n m e d e s n u c l 6 o t i d e s a d 6 n y l i q u e s ( X ) . Ce r6sultat m e t e n 6 v i d e n c e 1 e s r 6 a r r a n g e m e n t s d I r i n t 6 r i e u r d u p o o l d e s n u c l 6 o t i d e s a d 6 n y l i q u e s q u i
affectent chaque nucl6otide sans en modifier notablement Ia somme.
On remarque 6galement que Ia reproductibilit6 semble, pour ces extrac-
t i o n s , l 6 g E r e m e n t m e i l l e u r e d a n s t e c a s d u D M S O p o u r l e s d o s a g e s d e L r A T P e t d e I ' A D P .
E n r e v a n c h e , q u e l q u e s o i t l r e x t r a c t a n t c o n s i d 6 r 6 , I a r e p r o d u c t i b i l i t 6 e s t n e t t e m e n t m o i n s b o n n e p o u r I ' A M p , l a d i f f 6 r e n c e 6 t a n t t r 6 s m a r q u 6 e d a n s l - e c a s d u D M S O . C e r6sultat n ' e s t p a s s u r p r e n a n t d a n s I a m e s u r e o r j . i I s ' a g i t l d d ' u n d o s a g e s u r d e s q u a n t i t 6 s a s s e z f a i b l e s , n 6 c e s s i t a n t I ' i n t e r v e n t i o n d e d e u x t r a n s f o r m a t i o n s e n z t m a t i s u e s .
Enfin, Iors du dosage enzymatique, chaque valeur de nucl6otide ad6ny-
Iique pr6sent6e dans cette 6tude correspond 5. une valeur moyenne obtenue
a p a r t i r d e 3 d o s a g e s e f f e c t u 6 s s u r l e m C m e e x t r a i t ( c o e f f i c i e n t d e v a r i a t i o n ( S t ) .
Ertractic:n des rueL,4otides addnyLiques et charge dnez'gdtique 2 8 3
TabLeau 1
Etude de La reproduetibiLhA du dosage des nucL2otides addnyliqtes aprDs ertraetionauTris btruiLLant et apr)s erttaetion au DMS)
N . A . e n
pr. r- t
valeur noyenne 14 Ecart-type
n = 8 o
t o 7 4 1 1 1
15A1 166
2 5 2 5 9
29L4 219
1 9 3 8 1 6 7
t 7 4 7 1 3 5
231 70
3 9 1 8 2 9 4
-"tft'J1'!": wiarion
Eeha.nLtl-l,on no 1 Extraction au
TRIS BOUILLANT
Echtnt&.Lon no2 Extraction au
DMSO
ATP
ADP
AMP
t
ATP
ADP
AMP
t
1 0 , 4 * 1 0 , 4 I 2 3 , 2 z ' t , 5
* 8 , 5 r 7 t 7 a 3 0 , 6 * 7 , 5 s
3 - REsulrnrs
1 - A n a l y s e q u a ' l i t a t i v e d e s p e u p l e m e n t s p h y t o p l a n c t o n i q u e s
Au cours de cette 6tude les peuplements phytoplanctoniques sont domi-
n 6 s p a r d e s a l g u e s d e l a C l a s s e d e s D i a t o m o p h y c 6 e s : M e l o s i r a i t a L i e a ,
AsterioneLLa formosa, FragiLaria erotonensis et CgcLoteLla eomta. A ces
principales espEces se joignent deux algues de grande taille : Ct'ypto-
monas ouata. (Cfasse des Cr)ptophyc6es) et Staurastmtn paz'adontn (Classe
des Zygophyc6es) .
Enfin lors des dernidres campagnes de pr6l6vementd, Ie peupl-ement se
diversifie avec le d6veloppement d.e Dietyosp\ne?iun pulcheLLwn (Classe
des Euchlorophyc6es) eL de Mict'oeystis aetwginosa (classe des cyanophy-
c 6 e s ) q u i s ' a j o u t e n t a u x e s p d c e s p r 6 c 6 d e n t e s .
N u c l 6 o t i d e s a d 6 n y l i q u e s
1 - A T P . A N P . A M P e t L
L e s r e s u l t a t s o b t e n u s ( f i g u r e 1 e t t a b l e a u 2 ) m o n t r e n t t r C s c l a i r e -
ment que les teneurs en ATP obtenues apres extraction au DMSo sont
syst6matiquernent sup6rieures d celles obtenues apr€s extraction au Tris
b o u i l l a n t ( i 3 exceptions p r d s s u r 7 0 v a l e u r s ) .
C e p e n d a n t , l e s 6 v o l u t i o n s d e s s 6 r i e s d e p r o f i l s v e r t i c a u x i s s u s d e c e s d e u x e x t r a c t i o n s s o n t p a r a l l d l e s e t d ' u n p o i n t d e v u e s t a t i s t i q u e ' i I e x i s t e u n e r e l a t i o n t r e s 6 t r o i t e e n t r e c e s d e u x g r o u p e s d e v a l e u r s p u i s - q u ' e l l e s s o n t l i 5 e s p a r u n e c o r r 6 l a t i o n l i n 6 a i r e p o s i t i v e , h a u t e m e n t s i g n i f i c a t i v e a u s e u i l 0 , 1 t ( f i q u r e 2 ) .
2 8 4 Seienees de L'eau 4, no4
u a a o
0 2 1 6 0
,|
2 L
7 t 0
r 5
I t
I
1 0
0 2 4 6
Figure 7
Pxofils oertieazu des eoneentrations en AW (x 103 pieomoles 7lr) PrdL)t;ements no7 d 70
- ertTaetion au Tyis bouiLlant ---- ertraetion au DMSj
2000 1@0 ATPT
Fiqure 2
ReLatictn entre Les eoneentrations en ATp (en piectmctLes Llr) issues dtune pant de LtertTaction au Tris bouiLLant
et dtaftre part de L?entraeti<tn au Dl4S0
ATPD
Ertraetit;n des ruteL1otides addnyliques et ehaz,ge dnergdtiqlLe 2 8 5
3000 AFo
. t t
a . a a a
o - .
o o t t t
t t t '
' t . t .
a t t a
- a t
q . " i -
. n = 0,848
a a
2000 aoo 4rF,
Figure 3 ReLation ent"e Les coneentrations en ADP
(en pieomoLes L:r) issues d.'une part de Lt ertraction au fuis boui.Llant
et dtautre part de L?estv,aetion au DMS)
Eigure 4 Relatictn ent?e Les eoncentrations en AMP
(en pieomoLes L:L ) i,ssues d?une part de L? ertraetion au ?yis bouilLant
et dtautre part de L|extraction au DMS)
- fnversement, les concentrations en ADP et en AMP obtenues apres
e x t r a c t i o n a u D M S O s o n t , I e p l u s s o u v e n t , a s s e z n e t t e m e n t p l u s f a i b l e s q u e c e l l e s o b t e n u e s a p r d s e x t r a c t i o n a u T r i s , c o m m e e n t 6 m o i g n e n t l e s v a l e u r s o b s e r v d e s ( t a b l e a u 2 ) . C e p e n d a n t , 1 a e n c o r e , i I e x i s t e u n e c o r r 6 l a t i o n l i n 6 a i r e p o s i t i v e e t h a u t e m e n t s i q n i f i c a t i v e a u s e u i l 0 , 1 t e n t r e l e s d e u x s 6 r i e s d e v a l e u r s ( f i q u r e 3 e t 4 ) . N o u s o b s e r v e r o n s , e n o u t r e , q u e c e t t e r e l a t i o n e s t a s s e z n e t t e m e n t m o i n s d t r o i t e p o u r l e s
concentrations en AMP.
- Cons6quence directe d e s o b s e r v a t i o n s p r 6 c 6 d e n t e s , I a s o m n e d e s
nucl6otides ad6nyliques (E = ATP + ADP + AlulP) est du m€me ordre de
g r a n d e u r p o u r l e s d e u x e x t r a c t a n t s c o n s i d 6 r 6 s ( f i g u r e 5 e t t a b l e a u 2 ) . D ' a i l l e u r s , I r a p p l i c a t i o n d u t e s t t d e S t u d e n t n e p e r m e t p a s d ' a f f i r - m e r q u ' i 1 e x i s t e u n e d i f f 6 r e n c e s i g n i f i c a t i v e e n t r e c e s d e u x s 6 r i e s d e v a l e u r s ( t = f , O 2 p o u r 6 9 d d l , s e u i l d e s i g n i f i c a t i v i t 6 t = 1 , 9 9 a u s e u i l 0 , 5 ? ) .
n = 0 , 5 1 9
. a a . a s '
a a a
zd ti
Scienees de L'eau 4, no4
2 1 6 8 0
,|
2 L 7 1 0
2 1 6 8 2 t 6 8
1 5 1 2 L 7 1 0
2 t 6 8 4 6 8 2 4 6 6
2 t 6 8
2 t 6 8 2 t , 6 8
Figare 5
ProfiLs uertieats des coneentrations en nuclAotides .addnyLiques ( l : A f P + A D P + A I I P ) ( x 1 0 3 p t e o n o L e s L : r )
P?eLeDements n"l d 10 - ettyaetion au Tris bouiLLant
---- ert?aetirtn au DMS)
a
. i r . '
t . l r o
a
. . .
. t o .
. a o ' t
a
n = 0,954
4000
ligure 6
ReLation ent?e Les eoncentrations en nueLAotides addnyLiques ( L = A T P + A D P + A M P )
issues d?une paz,t de Ltertz'aetictn au Ttis bouiLLant et dtautre partdeL?ertractir.tn au DMSO (en pi.comoT,es L;t )
+
e&o
Entraetion des nueLdotides addnyliques et eharge dnez,gdtique 2 8 7
De plus, les 6volutions relatives de ces deux estimations sont tout d fait paralldles, et iI existe entre ces deux s6ries de valeurs une corr6l-ation lin6aire hautement significative au seuil 0,1 ? (figure 6).
PIus pr6cis6ment, nous observerons que cette relation apparait trds 6troite avec un coefficient de corr6lation sup6rieur d celui obtenu pour chacun des trois nucl6otides ad6nyliques pris s6par6ment.
TabLeau 2
VaLeurs moaennes, coeffieients de corrdLati.<.tn et 1quatictns des droites de rdgressictn pour Les teneu?s en nueLAotides addnyLiqtes
obtenues aprAs extracti<;n au TVis bouillant et exty,aetion au DMS)
P - - . . V a l e u r m o y e n n e t s x c r a c t r o n
n = 7 0
C o e f f i c i e n t d e c o r r 6 l a t i o n 6 9 d . d , t . s . 0 , 1 c = 0 , 3 8 6
E q u a t i o n d e l a d r o i t e d e r d g r e s s i o n
ATP P m . 1 - I
ADP
AMP
x
pn. 1- r
ADP/ATP
A}4PlATP
TRIS
DI.'!SO
T R I S
Dl{so
DMSO
T R I S
DMSO
TRIS
DMSO
T R I S
DMSO
T R I S DMSO
2564 3426 2549 t ' 7 L l 7 0 0
5AL2 5 4 8 0
1 ,0 3 o , 5 2
o , 2 s
0 , 1 1
0 , 6 6 0 , 7 8
o , 9 1 4
0 , 8 4 8
0 , 5 1 9
o , 9 5 4
o , 4 9 1
0 , 5 4 5
0 , 5 4 1
Y = 1 . 1 1 X + 5 7 1
Y = 0 , 6 8 X - 3 6
Y = 0 , 3 4 X + 9 9
Y = 0 , 8 6 y + 4 7 9
Y = 0 , 4 5 X + 0 , 5 8
Y - - O , 3 2 X + O , 2 2
Y = 0 , 6 5 X + 0 , 3 4
2 - I€s tapports ADP/ATP, AMP/ATP et charge 6nerg6tique
Q u e I q u e s o i t l e r a p p o r t c o n s i d 6 r 6 , u n e c o r r 6 l a t i o n l i n 6 a i r e p o s i t i v e e t h a u t e m e n t s i g n i f i c a t i v e a u s e u i l 0 , 1 B r e l - i e l e s d e u x g r o u p e s d e v a l - e u r s ( t a b l e a u 2 ) . C e p e n d a n t , I e s v a l e u r s d e s c o e f f i c i e n t s d e c o r r 6 I a - t i o n o b s e r v 6 e s s o n t , l o q i q u e m e n t / m o i n s 6 l e v S e s q u e c e 1 1 e s n o t 6 e s p o u r I T A T P , I ' A D P e t t .
On observe, notarilnent, que les charges 6nerg6tiques, obtenues aprds
e x t r a c t i o n a u D M S O s o n t a s s e z n e t t e m e n t s u p 6 r i e u r e s A c e l l e s o b t e n u e s a p r 6 s e x t r a c t i o n a u T r i s b o u i l l a n t . c e t t e d i f f 6 r e n c e e s t d e 1 ' o r d . r e d e
1 7 B ( c E T = 0 , 6 5 e t C E p = 0 , 7 8 ) m a i s l e s 6 v o l u t i o n s d e s d e u x s 6 r i e s d e v a l e u r s s o n t 6 g a l e m e n t p a r a l l 6 l e s ( f i g u r e 7 e t 8 ) .
2 8 B Scienees de L'eau 4, no4
07
06
(u
0
I
2
L
7 't0
1 5 0 1
I
I 7 1 0
Figure 7
Ptofils oev,ticanLxdespaleurs de La clnrge 1nergdtique CE = ATP + 1/2 ADP/ATP + ADP + AMP
P 4 1 ? L e D a n e n t s n - L a J U
- entTaetion anr. Ttis bouiLLant ---- entraetir,tn au DMS)
c E o
r =0,511
o.7 CEr
Figw,e 8
ReLatic.,n entre Les oaLeuys de La eharge dnergdtiqte (CE=ATP + 1./2 ADP/ATP + ADP + AMP) issues dtune parl: de L'ertracti,on cu Tz'is bc:uillant
et dtcu.tre part de Ltertv,aetictn au DMS) 0.7
0.6
Ertraetion des rnteldcttides addnALiques et chaz,ge 4nergdtiqte Zgg
4 - D r s c u s s r o N
Au terme de cette 6tude sur les peuplements microplanctoniques lacus-
tres, i1 apparait donc que les extractions au DMSO et au TRIS bouillant
a b o u t i s s e n t i d e s v a f e u r s s e n s i b l e m e n t 6 g a l e s l o r s q u e 1 ' o n c o n s i d B r e I a s o m m e d e s n u c l 6 o t i d e s a d 6 n y l i q u e s ( X ) .
E n r e v a n c h e I ' e x t r a c t i o n a u D M S O e s t p l u s e f f i c a c e s i 1 ' o n c o n s i d 6 r e
uniquement les teneurs en ATp. Cela signifie donc, qlre pour un meme taux
grlobal de nucl6otides ad6nyliques, Ies extractions au Tris et au DMSO
c o n d u i s e n t d u n e r 6 p a r t i t i o n d i f f 6 r e n t e d e s t e n e u r s r e l a t i v e s e n A T p , A D P e t A M P a I r i n t 6 r i e u r d ' u n m d m e p o o l .
C e s r 6 s u l t a t s s o n t 6 g a l e m e n t c o n f i r m 6 s p a r l r 6 v o l u t i o n d e s v a l e u r s d e l a c h a r g r e 6 n e r g 6 t i q u e i s s u e s d e c e s d e u x m o d e s d ' e x t r a c t i o n ; I ' e x t r a c - t i o n a u D M S O a b o u t i s s a n t a u x c h a r g e s 6 n e r g 6 t i q u e s l e s p l u s 6 1 e v 6 e s .
De Ia m6rne fagon, LARSSON et OLSSON (1979) rapportent des variations
importantes des teneurs en ATP, ADP et AMP dans des cultures d'algues
s e l o n I ' e x t r a c t a n t c o n s i d 6 r 6 , a l o r s q u e I a s o m m e d e s n u c l _ 6 o t i d e s a d 6 n y -
liques semble beaucoup plus constante. Par ailleurs KARL et HOLM-HANSEN
( 1 9 7 7 ) ont, dgalement, m i s e n 6 v i d e n c e d e s v a r i a t i o n s d e I a c h a r g e S n e r g 6 t i q u e s e l o n 1 a t e c h n i q u e d ' e x t r a c t i o n u t i l i s 6 e s u r d . e s 6 c h a n t i l - I o n s b e n t h i q u e s .
D e u x e x p l i c a t i o n s e s s e n t i e l - I e s , p e u t - e t r e c o m p l 6 m e n t a i r e s , p e u v e n t
€ t r e a v a n c 6 e s p o u r i n t e r p r 6 t e r n o s r 6 s u l t a t s .
T o u t d ' a b o r d , i l e s t p o s s i b l e g u e l ' e x t r a c t i o n t h e r m i q u e a u T r i s
bouillant ne d6truise pas compl€tement et/ou imm6diatement toutes les
A T P - a s e s p r 6 s e n t e s d a n s l e s e x t r a i t s , e t n o t a m m e n t I a p h o s p h a t a s e a l c a - l i n e , t r d s a c t i v e e n m i l i e u c a r e n c 6 e n p h o s p h o r e , e t q u i e s t s t a b l e a h a u t e t e m p 6 r a t u r e s e l o n l e s r d s u l t a t s d e K A R L e t C R A V N ( 1 9 8 0 ) . p l u s
r6cennnent, HENDZEL et HEALEY (1984) apportent, cependant, une restric-
tion aux observations pr6c6dentes d.ans Ia mesure orl ils montrent que,
d a n s l e u r c a s , I ' e f f e t d e I a p h o s p h a t a s e a l c a l i n e e s t n 6 g l i g e a b l e a p r d s e x t r a c t i o n a u T r i s b o u i l l a n t .
N6anmoins, I'activit6 des ATp-ases peut aboutir d une hydrolyse par-
t i e 1 l e d e I I A T P d a n s l - e s e x t r a i t s , q u i s e m a n i f e s t e p a r u n e E e n e u r en
ATP et une charge 6nerg6tique plus faibres alors gue ra so[une des nucr6o-
tides ad6nyliques reste sensiblement constante avec des teneurs en ADp
e t e n A M P s u r e s t i m 6 e s . P l _ u s p r 6 c i s 6 m e n t , I e f i l t r e c h a r g 6 d e s e s t o n q u e I ' o n i n t r o d u i t d a n s I e T r i s b o u i l l a n t p e u t c r 6 e r u n g r a d i e n t t h e r r n i q u e , d 6 j d 6 v o q u 6 p a r p l u s i e u r s a u t e u r s ( K A R L e, aL., 7 9 7 8 ; p E R R y et a.L., 1 9 7 9 ) q u i a b o u t i t a u n o n - b l o c a g e i m m 6 d i a t d e 1 ' a c t i v i t 6 e n z y m a t i q u e . L ' e f f e t d e c e g r a d i e n t t h e r r n i q u e e s t d ' a u t a n t p l u s i m p o r t a n t q u e l e f i l - t r e ( o u rr6chantilron e n g 6 n 6 r a 1 ) e s t c h a r g 6 e n p a r t i c u l e s o r g a n i q u e s o u i n o r g a n i q u e s .
L r e x t r a c t i o n c h i m i q u e a u D M S O , b e a u c o u p p l u s d r a s t i q u e , n , e s t p r o b a - b l e m e n t p a s s o u m i s e a ce type d'inconv6nient d a n s l _ a m e s u r e o r l I ' e f f e t
du DMSO sur les cellules est pratiquement imm6diat. Ajoutons Egalement
q u ' a u n i v e a u des seules teneurs en ATp, Irextraction d u D M S O e s t s a n s d o u t e p l u s e f f i c a c e , i n d 6 p e n d a m m e n t d e s p h 6 n o n E n e s d , h y d r o l y s e d e I ' A T p a u m o m e n t d e l ' e x t r a c t i o n , s u r 1 e s o r g a n i s m e s i p a r o i r 6 s i s t a n t e t e l s
que les bact6ries et les Diatorn6es presentes en quantit6 importante dans
2 9 0 Sciences de L'eau 4, no4
n o s p r 6 l e v e m e n t s . C O L r N ( 1 9 7 9 ) ' JAKUBCZAK et LECLERC (1981), KoMISARCZUK e t a L . , ( 1 9 8 4 ) rapportent d g a l e m e n t u n p l u s g r a n d e e f f i c a c i t 6 d e I ' e x - t r a c t i o n d e 1 ' A T P p a r I e D M S O .
La deuxieme hypothdse envisageable pour expliquer nos r6sultats,
r 6 s i d e d a n s I a p o s s i b i l i t 6 d ' u n e i n h i b i t i o n p a r t i e l l e d e s t r a n s f o r m a -
tions enzlmatiques AMP + ADP et/ou ADP + ATP dans les extraits au DMSO,
Iors du dosage enzymatique des nucl6otides ad6nyliques. Cette inhibition
p o u r r a i t s e t r a d u i r e p a r u n e s o u s - e s t i m a t i o n d e s t e n e u r s r e l a t i v e s e n A M P e t / o u A D P , e t a i n s i e x p l i q u e r q u ' a v e c d e s c o n c e n t r a t i o n s e n A T P p l u s 6 l e v 6 e s , L a s o m m e d e s n u c l 6 o t i d e s a d 6 n y l i q u e s e s t p r a t i g u e m e n t i d e n t i q u e A c e l 1 e r e n c o n t r E e d a n s l e s e x t r a i t s a u T r i s a l o r s q u e I e s v a l e u r s d e I a c h a r g e 6 n e r q 6 t i q u e s o n t a s s e z n e t t e m e n t s u P 6 r i e u r e s . ( I I c o n v i e n t d e r e m a r q u e r q u e c e t t e d e u x i d m e h y p o t h 6 s e , s i e l l e e s t v d r i f i 6 e , n ' e x c l u t e n r i e n I a p r e m i E r e c a u s e e x p l i c i t 6 e c i - d e s s u s ' d a n s l a m e s u r e o t ) e I I e n e j u s t i f i e p a s l e s p l u s f o r t e s c o n c e n t r a t i o n s d ' A T P m e s u r 6 e s d a n s L e s e x t r a i t s a u D M S O ) .
D e u x o b s e r v a t i o n s n o u s p e n n e t t e n t d ' e n v i s a g e r u n t e l p h 6 n o m 6 n e d ' i n - h i b i t i o n . D ' u n e p a r t l e s t e n e u r s e n A D P e t e n A M P a p r d s e x t r a c t i o n a u
DMSO sont faibles ce qui conduit d une somme de nucl6otides ad6nyliques
l 6 g 6 r e m e n t i n f 6 r i e u r e d c e t l e o b t e n u e a p r e s e x t r a c t i o n a u T r i s
( t a b l e a u 2 ) . D ' a u t r e p a r t , u n e p l u s g r a n d e v a r i a b i l i t 6 d e s t e n e u r s e n
AMP, aprCs extraction au DMSO, est observ6e dans les tests de reproduc-
t i b i l i t 6 ( t a . b l e a u 1) ce qui pourrait i n d i q u e r d e s t r a n s f o n n a t i o n s e n z y - m a t i q u e s p l u s o u m o i n s c o m p l e t e s . C e p e n d a n t , l - ' 6 t u d e r 6 c e n t e d e S E N H A J I
( 1 9 8 5 ) , e f f e c t u 6 e i p a r t i r d e s o l u t i o n s 6 t a l o n s d ' A T P , d ' A D P e t d ' A M P d e c o n c e n t r a t i o n c o n n u e , s e m b l e m o n t r e r q u ' i I n ' e x i s t e p a s d e d i f f 6 r e n c e
significative dans Ie rendement des transforrnatj.ons enzymatiques
AMP + ADP et ADP + ATP en pr6sence Tris ou de DMSO.
P r 6 c i s o n s e n f i n , q u e I e "stress d e f i l t r a t i o n " , q u i p e u t 6 g a l e m e n t a b o u t i r d l a b a i s s e d e s t e n e u r s e n A T P e t d e I a c h a r g e 6 n e r g 6 t i q u e ,
nota$ment lorsque Ie volume filtr6 est trop important (SUTCLIFFE et aL.'
7 9 7 6 ; K A R I , e t I I O L M - H A N S E N , 1 9 7 8 ; P E R R Y e t a L . ' 7 9 7 9 ; J E W S O I J e t D O K U L T L , 7 9 8 2 i P R I D M O R E E I A L . , 1 9 8 2 ; H E N D Z E L E t H E A f , E Y , 1 9 8 4 ) , N E
peut Ctre invoqu6 ici pour expliquer Ia diff6rence observ6e entre les
d e u x m o d e s d ' e x t r a c t i o n d a n s l a m e s u r e o r ) 1 e p r o t o c o l e e x p 6 r i m e n t a l s u i v i l o r s d e l a f r l t r a t i o n e s t s t r i c t e m e n t I e m 6 m e d a n s l e s d e u x c a s ,
avec notanment Ie m6me volume de filtration choisj- Ie plus restreint
p o s s i b l e .
selon diffdrents auteurs (LUNDTN et rHoRE, 1975 ; KARL et HoLM-HANSEN,
1 9 7 8 ) , I e c r i t 6 r e p o u r d 6 f i n i r u n e b o n n e m 6 t h o d e d ' e x t r a c t i o n , o u t r e s a r e p r o d u c t i b i l i t 6 , e s t I e n i v e a u d e s v a l e u r s d e l a c h a r g e 6 n e r g 6 t i q u e . C e I l e - c i e s t d ' a u t a n t p l u s 6 1 e v 6 e q u e I a m 6 t h o d e d ' e x t r a c t i o n e s t b o n n e . O n p e u t d o n c c o n c l u r e q u e , d a n s n o t r e c a s , i I e s t p r 6 f 6 r a b l e d ' u t i l i s e r I e D M S o c o m m e e x t r a c t a n t r m 6 m e s i L A R S S o N e t O L S S O N ( 1 9 7 9 ) a c l j o i g n e n t d l a c o n d i t i o n p r 6 c 6 d e n t e , 1 a n 6 c e s s i t 6 p o u r l r e x t r a c t a n t d e f o u r n i r u n t a u x g l o b a l 6 l e v 5 d e n u l 6 o t i d e s a d 6 n y l i q u e s .
Moyennant une m6thodologie rigoureuse, Ia pr6sente 6tude montre 6gale-
ment, que ces deux methodes d'extraction pr6sentent une bonne reproiluc-
t i b i l i t 6 e t d o n n e n t d e s v a r i a t i o n s r e l a t i v e s d e s t e n e u r s e n n u c l 6 o t i d e s a d 6 n y l i q u e s s e m b l a . b l e s e t q u i n e s o n t p a s m a s q u 6 e s p a r d e s d i f f 6 r e n c e s d ' o r i g i n e m 6 t h o d o l o g i q u e . N o u r r e m a r q u o n s d e p 1 u s , q u e c ' e s t I ' u t i l i s a - t i o n d e l a s o m m e d e s n u c l 6 o t i d e s a d 6 n y l i q u e s ( I ) q u i c o n d u i t a u x r 6 s u l - t a t s I e s p l u s f i a b l e s a v e c d e s v a l e u r s s e n s i b l e r n e n t d q u i v a l e n t e s p o u r I e s d e u x m o d e s d ' e x t r a c t i o n c o n s i d 6 r 6 s . C e r 6 s u l t a t m e t e n 6 v i d e n c e l e
Ertraetion des nucLdotides addnyliques et eLnrge 2nergdtiq,Le 2 9 1
f a i t q u e I ' e s t i m a t i o n d e ) l i n t E g r e u n e p a r t i e d e s v a r i a t i o n s d e c h a q u e n u c l 6 o t i d e a d 6 n y l i q u e , v a r i a t i o n s q u i p e u v e n t € t r e l e s c o n s 6 q u e n c e s 6 v e n t u e l l e s d e s t r e s s d ' o r d r e m 6 t h o d o l o g i q u e .
C e p e n d a n t , l e s r d s u l t a t s p r 6 c 6 d e n t s i n d i q u e n t c l - a i r e m e n t q u ' i I c o n v i e n t d e n e p a s t i r e r d r e n s e i g n e m e n t s d e I a c o m p a r a i s o n d e v a l e u r s d e c h a r g e s 6 n e r g 6 t i q u e s i s s u e s d e m o d e s d ' e x t r a c t i o n d i f f 6 r e n t s .
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