Etude écologique en immunofluorescence de Rhizobium japonicum dans le sol et la rhizosphère

HAL Id: hal-02725291

https://hal.inrae.fr/hal-02725291

Submitted on 2 Jun 2020

HAL is a multi-disciplinary open access

archive for the deposit and dissemination of

sci-entific research documents, whether they are

pub-lished or not. The documents may come from

teaching and research institutions in France or

abroad, or from public or private research centers.

L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est

destinée au dépôt et à la diffusion de documents

scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,

émanant des établissements d’enseignement et de

recherche français ou étrangers, des laboratoires

publics ou privés.

Etude écologique en immunofluorescence de Rhizobium

japonicum dans le sol et la rhizosphère

Jean Claude Cleyet-Marel, Yves Crozat

To cite this version:

Jean Claude Cleyet-Marel, Yves Crozat. Etude écologique en immunofluorescence de Rhizobium

japonicum dans le sol et la rhizosphère. Agronomie, EDP Sciences, 1982, 2 (3), pp.243-248.

�hal-02725291�

Etude

_écologique

en

immunofluorescence

de

Rhizobium

japonicum

dans le sol

et

la

_rhizosphère

Jean-Claude CLEYET-MAREL Yves CROZAT

I.N,R.A., Laboratoire de Recherches sur les Symbiotes des Racines, 9, Place Viala, F 34060

Montpellier-Cedex.

( *

) E.S.A., 24, rue _{Auguste-Fontenau,} F 49044 _Angers.

RÉSUMÉ La technique des _anticorps

_{marqués (immunofluorescence)}

a _{été utilisée pour l’étude de} la

_persistance

et de la Ecologie,

compétition

dans le sol de Rhizobium japonicum. La même

technique

a

permis d’apprécier

la

multiplication

Rhizobium

_j

_a

_p

_on

_i

_cum

_,

de Rhizobium dans le sol

_{rhizosphérique}

et dans le

_rh

_i

_zo

_p

_lan

_.

ImmunoJluorescence

,

’

Les

_populations

de R. _japonicum, souches _GZet _G3se maintiennent à un haut niveau

_{(10’ bactéries/g}

de

_sol)

S

ol,

pendant tout le temps de

_{l’expérimentation.}

Rhizosphère,

Lorsque 2 souches sont introduites _{simultanément,} on _{n’observe pas de}

_{compétition saprophytique}

entre

Rhizo

p

lan.

!!’ celles-ci dans le sol. L’étude de R. _japonicum dans la

_rhizosphère

montre que seule la

plante

hôte de

_soja,

var.

tzo!<M.

« Chippewa

nodulante », possède dans le sol

_proche

de ses racines une

_population

de Rhizobium

_plus

importante

que dans le sol normal.

Dans une

_{expérimentation}

_portant sur le

_rhizoplan,

4 cultivars de

_soja

sont testés. Les résultats montrent _que R. Japonicum est 100 à 1 000 fois

_plus

abondant dans le

_rhizoplan

_{que dans le sol} ne _{portant pas de}

_{végétation.}

Nous

_{suggérons qu’au}

cours de la

_{multiplication}

de Rhizobium dans le

_{rhizoplan, l’équilibre}

entre 2 souches

peut être modifié et une souche stimulée

_{préférentiellement}

à l’autre.

SUMMARY

Ecological study of

Rhizobium

_japonicum

in the soil and the

_{rhizosphere by}

the

immunofluores-Ecology, cence method

Rhizobium japonicum,

The

_{fluorescent-antibody technique}

was used to

_{study persistence}

and

_cotnpetition

of Rhizobium japonicum

Immunofluorescence,

’

strains in soils at different _temperatures and to examine the effect of

_plants

on this bacterium in the e

Soil,

_he

rhizosphere

and

_rhizoplane.

The soil

_population

of R. _japonicum strains G2 and G3 remained the same

Rhizosphere

,

1

p

4

bac

(

a/

g

i

er

t

of

_{soil) throughout}

the

_experiment,

without _any

_{significant competition}

between the two

Rhizoplane.

’

strains. In the

_{rhizosphere experiment,}

only the host

_{legume (Glycine}

max, cv. «

Chippewa

w) supported high

h

populations

of strain _G3’ In another

_experiment

with four cultivars of _soybeans, the

_populations

of R.

jnponicum 102, 103 more numerous in the

_rhizoplane

soil than in normal soil. We suggest that the

multiplication

of Rhizobium in the

_rhizoplane

of the host

_plant

is an

_{important phenomenon,}

able to

_modify

the equilibrium between two specific strains and thus to favour better nodulation by one strain rather than another.

1. INTRODUCTION

La réussite d’une culture de

_légumineuse

nécessite la mise

en

_place

d’une association efficiente entre la

_plante

hôte et

la bactérie du genre Rhizobium.

Lorsque

le Rhizobium est absent du

sol,

l’inoculation des

semences

_peut

dans certains cas

_multiplier

le rendement par

deux ou trois. C’est le cas de la luzerne

_(Medicago

sativa

_L.)

en sol acide

_(O

_BATON

_,

₁₉₇₁₎

ou du

_soja

(Glycine

max L.

Merrill)

dans tous les sols

_français

_(L

_AGACHERIE

& OBA -TON

,

1973).

Par _{contre, pour} une

_légumineuse

donnée,

si le sol

contient

_déjà

des Rhizobium

_appartenant

à son _groupe

d’inoculation,

il

_peut

être difficile de faire former les

nodosités _par une souche nouvelle

_apportée

_{par inoculation.}

(JO

HNSON

et

al.,

1965 ; A

MARGER

,

1974).

La

_proportion

de

nodules formés par les souches réintroduites est

générale-ment faible

_(W

_EAVER

&

_F

_REDERICK

_,

_1974).

Pour mieux maîtriser le mécanisme

_global

de

_compétition

pour la

nodulation,

il est

_{indispensable}

de mieux connaître la survie dans le sol des bactéries incluses dans les

inocu-lums,

leur

_{multiplication}

dans la

_rhizosphère

de la

_plante

hôte et le

_pouvoir

infectif des différentes souches en

présence.

La survie et les

_phénomènes

de

_compétition

entre souches de Rhizobium

_japonicum

sont étudiés

_{principalement}

à l’aide de méthodes indirectes fondées sur

_l’aptitude

de ces

bactéries à former des nodosités

_(V

_INCENT

_,

_1974).

Les

_techniques

_{quantitatives}

en immunofluorescence

(S

CHMIDT

,

1974)

offrent

_l’avantage

d’être directes et de donner une estimation immédiate du nombre d’individus

de la

_technique

des

_{anticorps marqués}

(immunofluores-cence) :

- d’étudier l’évolution de différentes

populations

de R.

japonicum

dans 2

_sols,

- d’aborder les

problèmes posés

par l’étude de la

multiplication

de R.

_japonicum

dans la

_rhizosphère

de

plusieurs plantes

dont le

_soja

et de montrer les

_perspectives

offertes par la

technique

utilisée.

Il.

MATÉRIEL

ET

MÉTHODES

A.

_Préparation

des

_anticorps

fluorescents

Les souches de R.

_{japonicum G}

₂

₍₃₁₁

B 135 USDA

Beltsville)

et

_G

₃

₍₃₁₁

B 138 USDA

_Beltsville)

sont cultivées

sur milieu solide à base d’extrait de levure et de mannitol

(V

INCENT

,

1970).

Après

4-5

_jours

de culture à

28°,

les bactéries sont lavées 3 fois en eau

_{physiologique.}

Puis la

suspension

est

_ajustée

à 109bactéries/ml.

L’inactivation des

_{antigènes flagellaires (BUSHNELL}

&

S

ARLES

,

1939)

est assurée en chauffant les

_suspensions

pendant

1 h à 100 °C

_{(bain-marie bouillant).}

Les

_anticorps

sont

_marqués

à l’LT.C.F. selon la méthode décrite antérieurement

_(JOSS

_ERAND

& CLEYET

-M

AREL

,

1979).

Les antisérums sont

_préparés

sur des

_lapins

de 3-4 mois de race

_{néo-zélandaise,}

selon un

_protocole

_comprenant

2 séries

d’intra-veineuses terminées _par une

_injection

sous-cutanée

(1

er

jour :

0,5

ml

_{I.V. ;}

₂

_e

_{j :}

1 ml

_{I.V. ;}

₃

_e

_{j :}

_1,5

ml

_{I.V. ;}

4

à 6*= j : repos ; 7&dquo; j : 1,5 ml I.V. ; 8! j : 2 ml I.V. ; 9&dquo; j : 2 ml

I.V. + 2 ml

_S.C.).

La détermination du titre est effectuée

16 j après

la Fe

_injection

_par réaction

d’immunofluores-cence indirecte et une jre

_{ponction cardiaque}

est réalisée le

18

e

_jour

si le titre est

_égal

ou

_supérieur

à 1/1 200.

B. Etude de la survie de R.

_japonicum

dans le sol

1. Persistance des cellules vivantes

Deux sols sont _{utilisés pour} ce

_type

_{d’expérimentation :}

Sol M ou sol de la Station de la Valette à

_Montpellier

et sol L ou sol de

_grande

culture de la

région lyonnaise (tabl. 1).

Des

échantillons de _{500 g} de sol tamisés à 4 mm sont

ensemencés avec la ou les souches

_G,

et

_G

₃

et sont ensuite transférés pour incubation dans des

_{assemblages spéciaux}

ou

_assemblages

de « Léonard » couverts

_(V

_IN

_C

_ENT

_,

_1970).

Dans une Fe série

_{d’expériences,}

3 échantillons de sol

_M,

uniquement,

sont _{inoculés par}

_vaporisation

de la souche

_G

₃

à raison de 20 ml de

_suspension

_{bactérienne pour 500 g} de

sol.

Un 1er

_{échantillon,}

_{ayant reçu}

10

8

Rhizobiu:m,

est

_placé

à

4 °C _{tandis que le 2}e et le

₃

_e

_,

_{ayant reçu}

5. 10

1

Rhizobium,

sont

_placés

à 18 °C et 28 °C. Pour tous tes échantillons

l’humidité du sol reste constante au cours de l’incubation et voisine _{de 18 p. 100.}

Dans une 2csérie

d’expériences,

les 2 sols L et M sont inoculés simultanément et de

_{façon identique}

à celle décrite

précédemment

par les 2 souches de R.

japonicum, G

2

et

_G

₃

_,

puis

mis à

_incuber

dans des

_assemblages

de « Léonard » à

28 °C. Les

_comptages

des 2 souches sont réalisés sur les mêmes

_{prélèvements.}

L’évolution des

_populations

bactériennes introduites

_(G

₃

₎

est suivie dans le

_temps

en _{les dénombrant par} immunofluo-rescence sur membrane de

_filtration,

selon la

technique

décrite _{par S}CHMIDT

_(1974).

Pour

_chaque

échantillon mis à

incuber,

3

_{prélèvements}

sont

_effectués,

_{chaque prélèvement}

donnant lieu à un dénombrement.

Le mode de

_répartition

des bactéries sur les membranes

de filtration ainsi que la

précision

de l’estimation de leur nombre ont _{été décrits par ailleurs}

_(C

_LEYET

_-M

_AREL

&

CHESSEL,

1978).

2. Persistance des cellules mortes

Les Rhizobium

_{(souche G}

₃

₎

sont _{tués par passage des}

suspensions

bactériennes dans un bain-marie à 80 °C

pen-dant 3 mn. A

partir

de la

suspension rapidement

refroidie,

2

_{prélèvements}

sont effectués : le 1er est destiné à la vérification de la viabilité des cellules bactériennes _par

étalement en boîte de

_Petri,

le 2eest _{utilisé pour des frottis}

bactériens sur

_lesquels

sera testé le sérum fluorescent anti

G

3

.

Les 2 sols L et M sont inoculés avec une

suspension

de ces

_cellules,

l’évolution de leur nombre est _{suivi par} immunofluorescence.

C. Etude de l’influence de la

_plante

sur les

_populations

du sol

_{rhizosphérique}

1. La

_rhizosphère

sensu stricto

Des échantillons de 1

_kg

de sol

_M,

inoculés avec la souche

G

3

,

sont introduits dans des

_pots

et ensemencés avec les

graines

de

_{plusieurs plantes}

à raison de 3

_graines

_par

_pot

dans le cas du

_soja

_(cv.

_{« Chippewa}

nodulante » et « non

nodulante

_{»), 10 graines}

dans le cas du blé

(Triticum vulgare

L.,

cv. « Talent » et « Maris

_{Huntsmann »)}

et 30

_graines

dans le cas du

_dactyle

(Dactylis glomerata L.).

Après

2 mois de culture en serres, les

plantes

sont

prélevées

et la fine couche de sol

_qui

adhère fermement aux

racines est

_prélevée

_par un

_lavage

et une

_agitation

modérée dans l’eau

₍₁₅

mn sur un

_agitateur

rotatif à axe

_horizontal).

Nous obtenons ainsi la fraction de sol

_{correspondant}

à la

rhizosphère

proprement

dite telle que l’ont définie DOM

-MERGUES & MANGENOT

_(1970).

A

_partir

de la fraction

_obtenue,

2

_{prélèvements}

sont effectués. Le 1er est destiné à un dénombrement de R.

japonicum

par immunofluorescence sur membranes de filtration et le 2eà un dénombrement de la microflore totale

en boîtes de Petri sur un milieu à la

_gélose

nutritive

_(Bio

Mérieux).

Dans le cas du sol non

_{rhizosphérique,}

les échantillons sont aussi

_répartis

en 2 lots : dénombrement par immunofluorescence et dénombrements sur boîtes de Petri.

2. Le

_rhizoplan

Des échantillons de sol M

_{(1 kg)}

sont tamisés à 4 mm

et inoculés avec la souche

_G

₂

_.

On utilise 4

_génotypes

de

soja :

«

Hodgson

_», « Giessen 454-69 _», «

Fiskeby

_», « Chin

Chuan ».

Avant le

_semis,

les

_graines

sont _{stérilisées par}

_trempage

pendant

60 mn dans une solution

_{d’hypochlorite}

de calcium

(10

g dans 150 cm3 d’eau

_distillée)

_puis

rincées 5 à 6 fois

dans de l’eau stérile. Chacun des

_pots

contient 4

_{plantes ;}

3

_pots

témoins sans couvert

_végétal

sont

_placés

dans les mêmes conditions. _{Il y} a 3

_{répétitions}

_par essai.

Au stade 4-5 feuilles

_(début

du

_remplissage

des

_gousses),

on

_prélève

les

_plantes

entières. Le

_système

racinaire est

préalablement

lavé et

_agité

modérément dans l’eau comme

pour l’étude de la

rhizosphère.

Le matériel

_végétal

issu de

cette lre

_opération

est

_placé

dans des bouteilles contenant

150 ml d’eau

distillée,

puis

soumis à une

_agitation

vigou-reuse

(30

mn sur un

_agitateur

rotatif à axe

_vertical).

Cette

opération

a _pour but d’extraire la microflore

_présente

à la surface des racines et de travailler

_uniquement

avec le

rhizoplan

tel que celui-ci a été défini par DOMMERGUES

& MANGENOT

_(1970).

Le dénombrement des Rhizobium s’effectue en immunofluorescence sur membrane de

filtra-tion

_après

élimination des

_particules

de sol.

III.

RÉSULTATS

A basse

_{température,}

4 °C

_{(fig. la),}

le nombre de

Rhizobium ne cesse de décroître en raison sans doute de

l’absence de

_{multiplication,}

de la mortalité naturelle et de la

prédation

par des

organismes

unicellulaires. A 18 °C et

28 °C

_(fig.

lb et

_lc),

on observe au cours des 10

_premiers

jours

une

_augmentation

sensible du nombre de bactéries

introduites. Il est à noter _que

_{l’augmentation}

du nombre de

Rhizobium est d’autant

_plus

_importante

_{que la}

_température

d’incubation est

_plus

élevée.

Lorsque

2 souches sont introduites simultanément dans

un sol

_(fig.

2a et

_2b),

leurs

_populations

évoluent de

_façon

identique.

Cette _{évolution n’est pas la même dans les sols} L

et M. Contrairement à ce

_qui

se _{passe dans le sol}

_M,

on

n’observe pas, dans le sol

L,

d’augmentation

du nombre de Rhizobium au cours des 10

_premiers

_jours

d’incubation.

Les résultats du tableau 2 montrent _{que les corps}

bacté-riens tués se maintiennent à un niveau élevé

_pendant

6 à 9

_jours.

Ce n’est

_qu’après

le 6e

_jour

_{que l’on}

_peut

noter une

diminution brutale du nombre d’individus. La détection des bactéries introduites devient alors très

_délicate,

leur nombre

se situant en dessous du seuil de sensibilité de la

_technique

d’observation

₍₁₀

₃

_bactéries/g

de

_sol).

A. La

_rhizosphère

Pour caractériser l’influence des

_plantes

sur la microflore

totale et sur Rhizobium dans leur sol

_{rhizosphérique,}

nous

avons calculé pour

_chaque

_plante

le

_rapport

R/S entre le

nombre de

_{microorganismes}

dans le sol

_{rhizosphérique (R)}

et dans le sol témoin

_(S).

Ces

_rapports

R/S sont

_présentés

dans la

_figure

_{3 ;}

ils

indiquent

que :

-

4 des 5

_plantes

étudiées ont à

_l’égard

de la microflore

- R.

japonicum

est 12 à 21 fois

_plus

abondant dans le sol

rhizosphérique

du

_soja

var.

_{« Chippewa}

nodulante _{» que}

dans le sol normal.

Il est _{toutefois délicat de comparer les}

_systèmes

racinaires des différentes

_plantes,

les

_rapports

terre sèche/racines

sèches

_(R

_I

₎

_{n’étant pas}

_identiques

_{(fig. 3).}

B. Le

_rhizoplan

L’intensité de colonisation du

_rhizoplan

est

théorique-ment

_exprimé

_par la densité de

_{microorganismes}

par gramme de racines

(DOMMERGUES, 1970)

soit

R

o

(tabl. 3).

La mise en

_suspension

de nouvelles

particules

de sol lors du

lavage

intensif des racines nous a conduits à

_exprimer

les résultats sous une 2cforme

_{(Rapports Rn/S).}

Les

quantités

relatives de terre

_prises

en

_compte

dans le

rhizoplan

sont

exprimées

par les

rapports

R,

(poids

de terre sèche mise en

suspension/poids

sec de

racines).

La définition de

R,

est

uniquement

opérationnelle

et se trouve entachée d’une certaine

_{imprécision puisque}

l’on ne connaît

_jamais

rapports

R,

étant

_cependant

relativement voisins

_(proche

de

l’unité)

pour toutes les

variétés,

il est

_possible

_{de comparer}

les différents résultats obtenus pour celles-ci.

Quel

que soit le mode de

_{représentation}

des résultats

_R

_o

ou

_Rn/S,

on

observe les mêmes tendances de stimulation.

Nous pouvons retenir deux groupes de cultivars pour le

soja :

- _«

Fiskeby

» et « Chin-Chuan » avec

_R

_o

de l’ordre de

10

1

_{(moyennes :}

_5,11.10

₆

et

_10,4.10

₆

_{respectivement}

pour les 2

_variétés),

Rn/S de l’ordre de 103

₍₁₂₆₅

et 2 609 en

moyenne dans les 2

cas).

- _«

Hodgson

» et « Giessen _»,

présentant

une

stimula-tion

_plus

_{faible ;}

_R

_o

de l’ordre de 105

_(6,4.10

₅

et

_5,3.10

₅

respectivement)

et Rn/S de l’ordre de 102

₍₁₆₂

et

_132,6).

IV. DISCUSSION

L’inoculation des semences de

_{légumineuses}

est

couram-ment réalisée

mais,

généralement,

seules l’infectivité et l’efficience des souches sont retenues comme critère de

sélection

_(LAGACH

_ERIE

et

al.,

1977).

Les résultats donnés dans cet article concernent

_plus

spécialement

la

_{compétence saprophytique}

et montrent _que

les 2 souches

_G

₂

et

_G

₃

se maintiennent à un niveau voisin de

celui de l’introduction dans les sols L et M incubés dans les conditions décrites et ce

_pendant

2 mois. Ces 2 mêmes souches sont d’ailleurs

_capables

de survivre

_pendant

plu-sieurs années dans des sols

_agricoles

en

_{place, qu’elles}

aient

été

_apportées

_{par inoculation directe des sols}

_(OBATON

&

G

IR

AUD,

1977)

ou par inoculation des

graines

de

soja

(L

AGACHERIE

,

1978).

Il est même

_possible

_{que pour} une

souche et un sol

_donnés,

la

_population

introduite se stabilise

à un seuil

_{d’équilibre}

selon un modèle

mathématique

du

type

logistique (C

ROZAT

,

1980).

L’immunofluorescence ne

_permet

_{pas de}

_distinguer

les

cellules vivantes des cellules mortes. D’une manière

géné-rale,

les bactéries sont décelées aussi

_longtemps

que les

structures

_{antigéniques}

sont intactes. La durée de

conserva-tion de ces structures est, dans nos conditions

expérimenta-les,

d’environ 15

_{jours. Après}

cette

_période,

seules les cellules vivantes seront dénombrées. Ces résultats sont en

accord avec ceux obtenus par BOHLOOL& SCHMIDT

(1973).

L’étude de la

_rhizosphère

s. str. met en évidence une

_plus

grande

abondance de R.

_japonicum

dans le sol adhérent aux

racines que dans le sol témoin. Parmi l’ensemble des

plantes

testées,

c’est la variété de

_soja

«

Chippewa

nodulante »

qui

exerce la stimulation la

_{plus importante.}

Nous pouvons

formuler

_{plusieurs hypothèses}

_quant

à

_l’origine

de celle-ci :

d’une

_part,

_après

2 mois de

_culture,

les

_plantes

de

_soja

portent

un

_grand

nombre de nodules bien

développés.

Etant

donné la relative

_pauvreté

du sol en azote

_minéral,

cette

abondante nodulation assure au

_soja

une nutrition azotée

supérieure

à celle des autres

_plantes,

_{avantage pouvant}

entraîner en retour une exsudation

_{plus importante}

de

métabolites azotés entre autres.

On

sait,

d’autre

_part,

_{qu’une proportion importante}

de cordons d’infection avortent et ne

_provoquent

pas

l’appari-tion de nodosités fonctionnelles

_(D

_ART

_,

_1974).

Il _y a

pourtant

eu au sein du

_végétal

un début de

_{multiplication}

intense et

_spécifique

de la bactérie infective. Si on

envisage

la

_desquamation

des

_poils

absorbants au cours de la croissance de la

_plante

et

_compte

tenu des

_{possibilités}

de survie de R.

_japonicum

dans le

sol,

il est

_logique

d’observer

un

_grand

nombre de ces bactéries dans la

rhizosphère

de la

plante

hôte. Ces 2

_hypothèses

ont

_déjà

_{été discutées par}

N UTMAN

_(1965).

Par ailleurs la

_possibilité

_{pour des}

_plantes

non

légumineu-ses de

_supporter

dans leur

_rhizosphère

des

_populations

importantes

de

Rhizobium

est un facteur

_pouvant

_expliquer

la

_dispersion

et la survie de Rhizobium en l’absence de la

plante

hôte

_(PARKER

et

al.,

1977).

Nous avons noté au cours de notre

_{expérimentation}

au

sujet

du

_rhizoplan

_{que l’intensité de la} stimulation varie pour un stade

_végétatif

donné selon le

_génotype

de la

_plante

hôte. Cette stimulation est

_{généralement}

_{forte ;}

nous avons

même constaté

_qu’il

existait une

compétition

intraspécifique

pour l’utilisation des substrats libérés par la

plante

(CROZAT, 1980).

La

_{multiplication}

différentielle de 2 souches dans la

rhizosphère,

bien que constituant une des

_phases

de la

compétence saprophytique

définie

_{par CHATE1. et al.}

_(1968),

est une

_étape

très

importante précédant

immédiatement la

phase

de

_compétition

pour l’infection telle

qu’elle

a été définie par AMARGER

_(1974).

Une meilleure connaissance de son mécanisme et de son

_importance

dans le

_phénomène

global

de la

_compétition

_{pour la nodulation} nous semble

indispensable

si on veut réintroduire avec succès dans le

sol,

de nouvelles souches de Rhizobium

_plus

efficientes.

Reçu le 10 avril 1981. Accepté le 5 novembre 1981.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Amarger N., 1974. Compétition pour la formation des nodosités sur

la féverole entre souches de Rhizobium leguminosarum apportées par inoculation et souches indigènes. C.R. Acad. Sci., Sér. D,

Paris, 279, 527-530.

Bohlool B. B., Schmidt E. L., 1973. Persistence and compétition

aspects of Rhizobium _japonicum observed in soil _by

immunofluo-rescence

_microscopy.

Soil Sci. Soc. Am. Proc., 37, 561-564.

Bushnell O. A., Sarles W. B., 1939.

_{Investigation}

upon the antige-nic

_{relationships}

_{among the root-nodule bacteria of the soybean,} cowpea, and

lupine

cross-inoculation groups. J. Bacteriol., 38, 401-410.

Chatel D. L., Greenwood R. M., Parker C. A., 1968.

_Saprophytic

compétence as an

_important

character in the sélection of Rhizobium

for inoculation. 9th Intern. _Congr. Soil Sci. Adelaide Trans., 2,

65-73.

Cleyet-Marel J. C., Chessel D., 1978. Méthode de dénombrement de Rhizobium japonicum par immunofluorescence. Analyse statisti-que des comptages. Ann. Phytopathol., 1978, 10

_(2),

219-231.

Crozat Y., 1980. Application de

_{l’immunofluorescence}

à l’étude de

l’écologie

de Rhizobium _japonicum. D.E.A. Université Claude

Bernard, Lyon 1.

Dart P. J., 1974. The infection process. In The

_{Biology of Nitrogen}

Fixation. _{(A. Quispel.}

_Ed.),

_{pp. 381-429.} North Holland Research

Monographs,

Frontiers of Biology.

Dommergues Y., Mangenot F., 1970. Ecologie microbienne du sol.

MASSON, Paris, 783 p.

Johnson H. W., Means U. M., Weber C. _R., 1965.

_Compétition

for nodule sites between strains of Rhizobium _japonicum

_applied

as

inoculum and strains in the soil. Agron. J., 57, 179-185.

Josserand A., Cleyet-Marel J. C., 1979. Isolation from soils of Nitrobacter and evidence for novel _serotypes using

immunofluores-cence. Microbiol. Ecol., 5, 197-205.

Lagacherie B., Obaton M., 1973. L’inoculation du

_{soja :}

résultats d’essais et orientation future du travail C.R. Acad. _Agric. Fr.,

67-77.

Lagacherie B., Hugot R., Amarger N., 1977. Sélection de souches de Rhizobium japonicum d’après leur

_{compétitivité}

pour l’infec-tion. Ann. agron., 28, 379-389.

Lagacherie B., 1978. Survie dans le sol des Rhizobium

_apportés

par inoculation des

_graines

de

_soja.

_Inf.

Tech. _{CETIOM, 62,} 11-15. Nutman P. S., 1965. The relation between nodule bacteria and the

legume

host in the

_rhizosphere

and in the process of infection,

in _Ecology

_of

Soil Borne Plant _Pathogens. K. F. Baker and W. C. _{Snyder, London,} 231-251.

Obaton _M., 1971. Influence de la

_{composition chimique}

du sol sur

l’utilité de l’inoculation des _graines de luzerne avec Rhizobium meliloti. Plant Soil,

Special

Volume, 273-285.

Obaton M., Giraud J. J., 1977. Etude de la survie des Rhizobium

japonicum dans le sol.

_Inf

Tech. _{CETIOM, 57,} 3-9.

Parker C. A., Trinick M. J., Chatel D. L., 1977. Rhizobia as soil

and _rhizosphere inhabitants, in A treatise on

_{dillitrogen fixation,}

Section IV, Agronomy and

_Ecology,

R.W.F.,

_Hardy

and

A. M. Gibson, London, 311-352.

Schmidt E. L., 1974. Quantitative

autecological

study of

microorga-nismes in soil _by immunofluorescence. Soil Sci., 118, 141-149.

Vincent J. M., 1970. A manual

_for

the practical study of root-nodule bacteria. Oxford, Edinburgh : Blackwell Sci. _Publ.,

_{164 p.}

Vincent J. M., 1974. Root nodule symbiosis with Rhizobium. In the

Biology of

Nitrogen Fixation.

_(A.

Quispel,

Ed),

p. 265-341. North-Holland Research _Monographs, Frontiers of

Biology.

Weaver R. W., Frederick L. R., 1974. Effect of inoculum rate on

competitive nodulation of Glycine max. Il Field studies. _Agron. J., 66, 233-236.