MISE AU POINT DE THERAPIES ANTI-TUMORALES IMPLIQUANT DES VECTEURS PARVOVIRAUX ET LA FUSION DE CELLULES TUMORALES ET DENDRITIQUES

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DE MEDECINE

Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire (IRIBHM) Laboratoire de Cytologie et Cancérologie Expérimentale

MISE AU POINT DE THERAPIES ANTI-TUMORALES IMPLIQUANT DES VECTEURS PARVOVIRAUX ET LA

FUSION DE CELLULES TUMORALES ET DENDRITIQUES

SERVAIS Charlotte Thèse présentée en vue de l’obtention du grade légal de docteur en sciences biomédicales

Promoteur : Pr. Thierry Velu

Co-promoteur : Dr Annick Brandenburger

Année académique 2007-2008

Membres du Jury

Philippe LEBRUN (Président)

Thierry VELU (Promoteur et secrétaire)

Annick BRANDENBURGER (co-promoteur) Daniel CHRISTOPHE

Alain LE MOINE Martine PICCART

Dominique STEHELIN (membre externe)

Carine MICHIELS (membre externe)

Je souhaite remercier le «Fonds pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et dans

Mes remerciements s’adressent également à la « Fondation David & Alice Van Buuren »,

qui m’a permis, par l’octroi de son prix, de terminer ma thèse dans de bonnes conditions.

RESUME

L’immunothérapie anticancéreuse est basée sur la capacité du système immunitaire à reconnaître les cellules tumorales comme étrangères et à les éliminer. Les stratégies immunothérapeutiques abordées dans ce travail, incluent l’activation du système immunitaire par l’expression de facteurs immunomodulateurs (l’interleukine-2) via l’utilisation d’un vecteur dérivé du parvovirus MVM, ou par présentation des antigènes tumoraux par la machinerie des cellules dendritiques (DC), via la génération d’hybrides entre DC et cellules tumorales (TC).

L’intérêt majeur du parvovirus autonome MVM en tant que vecteur pour la thérapie génique du cancer vient de son expression préférentielle dans les cellules transformées (oncotropisme) et de son aptitude à lyser celles-ci (oncolyse). Les vecteurs générés au laboratoire conservent l’unité de transcription NS et expriment l’IL2 humaine sous contrôle du promoteur P38, à la place des protéines de capside. Malgré les améliorations apportées à la production de vecteurs recombinants, la faible concentration des stocks reste un problème. Il a été montré que, de nombreux virus sont mieux produits en conditions de faible tension en oxygène (hypoxie). Nous avons tenté d’améliorer les titres des vecteurs en les produisant sous faible tension d’oxygène mais sans y parvenir (annexe 1). Dans un modèle in vivo utilisant la lignée de mélanome K-1735 dans des souris immunocompétentes, des cellules tumorales infectées in vitro avant leur implantation en sous-cutané ont montré un effet anti- tumoral du vecteur MVM/IL2 (annexe 2). Afin de mettre en évidence l’apport de l’oncolyse parvovirale dans l’activité anti-tumorale, nous avons mis au point des expériences, dans le même modèle de tumeur, visant à comparer l’efficacité du vecteur MVM/IL2 à celle d’autres vecteurs, Ad/IL2 et Rétrovirus/IL2, ne possédant pas d’activité oncolytique. Dans le but de mettre en évidence une éventuelle réponse immune in vivo, nous avons utilisé le modèle de tumeur TC-1 mais ce modèle s’est montré moins sensible à l’effet du vecteur MVM/IL2 et nous n’avons pas pu démontrer d’activation de cellules cytotoxiques spécifiques de la tumeur.

Il a été proposé d’utiliser des hybrides entre DC/TC pour la vaccination anti-tumorale pour optimaliser la présentation des antigènes tumoraux. Une lignée cellulaire exprimant la protéine fusogène du virus de la leucémie du Gibbon (GaLV-FMG, Gibbon ape leukemia virus) a été dérivée de la lignée cellulaire CHO (cellules ovariennes de hamster chinois) au laboratoire. Cette lignée CHO- FMG, utilisée comme partenaire intermédiaire, a permis la fusion entre cellules tumorales et dendritiques (annexe 3). Nous avons montré que l’expression transitoire après infection par un vecteur AAV-FMG ou après transfection transitoire ne génère pas un pourcentage significatif d’hybrides. En effet, le niveau d’expression ainsi que le pourcentage de cellules transduites exprimant FMG s’est révélé trop faible. Ceci a mis en valeur l’efficacité de la lignée stable CHO-FMG comme intermédiaire de la fusion. De plus, nous avons intégré dans la lignée fusogène, le gène de l’interleukine-2, qui devrait permettre d’augmenter l’efficacité de l’induction de la réponse immune.

L’activation des cellules effectrices de l’immunité anti-tumorale via la présentation antigénique et/ou par des cytokines est au centre de ce travail. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents devrait permettre d’améliorer ces systèmes de vaccination non- conventionnels.

Tout d’abord, je tiens à apporter ma reconnaissance aux professeurs Gilbert Vassart et Jacques Dumont de m’avoir accueillie à l’IRIBHM et plus spécialement au Professeur Thierry Velu pour m’avoir hébergée dans son laboratoire.

Je tiens à remercier plus particulièrement Annick qui m’a épaulée toutes ces années pour mener à bien mon travail. Tu es toujours restée disponible pour répondre à mes questions techniques et théoriques tout en me laissant mon indépendance. Malgré les petites tensions, je garderai un bon souvenir de mon séjour dans ton labo et je te remercie d’avoir été si patiente et d’avoir en plus pris soin de mon avenir…

Merci à Perrine, Marylou et tout le labo du professeur Yvan de Launoit pour leur accueil et leurs enseignements à Erasme.

Je n’oublie pas non plus Bénédicte, Chiat et Isabelle avec qui j’ai passé tout mon temps pendant les manipulations et qui m’ont soutenue pendant ces longs mois de rédaction.

A Béné, Chiat et Isa, s’ajoutent les autres membres du « café du commerce » : Marianne, Céline, Eileen, Monique, Selena, Virginie et Dr Yoann ! Merci d’avoir mis du « piment » dans la vie trépidante du labo : ragots, gâteaux, jeux de cartes… tout était là pour égayer les pauses-incubations!

Catherine, Damia et Mohamed, vous n’êtes pas restés longtemps mais nous avons eu de chouettes discussions. Merci pour votre aide dans les deux projets.

Odile, Dominique, Isabelle, le groupe des « mamans » merci pour vos lumières en immunohistochimie.

Je n’oublie pas Hakim, Virginie, Sarah, Dorothée, Fred, Valérie, Sophie, Christophe, Serge, Bruno, Reginald, Gilles (merci pour ton bureau près de la fenêtre !), Bernard, Stéphane, Daniel, Christiane, et Marie-jeanne.

Mes remerciements vont aussi à Jean-Denis, Maryse, Sandrine, Laurence, Renato, Jose et Jacques, membres d’Euroscreen qui m’ont apporté tantôt des encouragements et leur bonne humeur, tantôt des conseils pratiques ou techniques.

Je remercie également mes parents qui m’ont soutenue et « motorisée » toutes ces années.

Merci à ma Ninie d’exister !

Mes pensées vont enfin à Bonga qui m’a soutenue et qui a supporté mes tensions, énervements, découragements… Merci d’avoir réalisé avec moi (et si bien réussi !!!) notre plus belle manip : Nathanael, notre bébé d’amour.

Charlotte

ABREVIATIONS

AAV : Adeno Associated Virus Ad : adénovirus

ADN : acide désoxyribonucléique APC : antigen presenting cell ARN : acide ribonucléique

ATCC : American type culture collection ATF-1: adjacent transcription factor ATP : adénosine triphosphate BSA : bovine serum albumine cap : capside

CBP/p300 : CREB binding protein CDK : cyclin dependant kinase

CFSE : 5-(and 6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester

CHO : chinese hamster ovary CMV : cytomegalovirus

CRE : cAMP responsive element

CREB-1 : cAMP responsive element binding protein

CTL : cytotoxic T lymphocyte DC : dendritic cell

DMEM : dubelco’s modified Eagles medium DO : densité optique

EBS : Ets binding site

EDTA : ethylenediaminetetraacetic acid EGFR : epidermal growth factor receptor eGFP : enhanced GFP

ELISA : enzyme linked immunosorbent assay ELISPOT : enzyme linked immunospot assay Env : enveloppe

FACS : fluorescence activated cell sorting FITC : fluorescein-5-isothiocyanate FMG : fusogenic membrane glycoprotein FCS : fetal calf serum

FSC : forward scatter GAG : glycosaminoglycan

GaLV : Gibbon ape leukaemia virus GFP : green fluorescent protein

GM-CSF : granulocyte macrophage colony stimulating factor

HBS : HIF binding site = HRE HBS : Hepes buffer saline HBV : hepatitis B virus HIF : hypoxia inducible factor HLA : human leukocyte antigen HMG : high mobility group HPV : human papilloma virus

HRE : hypoxia responsive element = HBS HRP : horse radish peroxydase

HSV-TK : herpes simplex virus-thymidin kinase i.v. : intra-veineuse

IFN : interféron Ig : immunoglobuline IL2 : interleukine

IRES : internal ribosome entry site ITR : inverted terminal repeat kb : kilobase

kDa : kiloDalton

LTR : long terminal repeat

MACS: magnetic activated cell sorting MAGE : melanoma associated antigen

M-CSF : macrophage colony stimulating factor MHC : major histocompatibility complex µM : micro molaire

MLV : murine leukaemia virus MOI : multiplicity of infection MVM : minute virus of mice NBE : newborn embryonic Neo^R : resistant à la néomycine NK : natural killer cell

NS : non structural protein ODD : oxygen dependent domain PBS : phosphate buffered saline PCR : polymerase chain reaction PE : phycoérythrine

PEG : polyethyleneglycol Pfu : plaque forming unit PIF : parvovirus initiator protein POL : polymerase

rad : radiation absorbed dose RCV : replication competent virus Rep : replication

SDS-PAGE : sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis

SRC-1 : steroid receptor coactivator SSC : sideward scatter

SV40 : simian virus 40

TAA : tumor associated antigen TAR : transcription activation region TBP : TATA box binding proteins TC : tumor cell

TCR : T-cell receptor

TGF : transforming growth factor Th1 ou Th2 : T helper

TNF : tumor necrosis factor Treg : T regulator

u.i. : unités infectieuse U.I. : unité internationale u.t. : unite de transduction UV : ultra-violet

VEGF : vascular endothelial growth factor VHL : von hippel lindau

VIH : virus de l’immunodéficience humaine VP : viral protein

VSV-G : vesicular stomatitis virus

wt : wild type

TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION ... 9

IMMUNITÉ ANTI TUMORALE... 11

I. Immunosurveillance : De la présentation antigénique à l’oncolyse ... 11

II. Antigènes tumoraux... 13

III. Mécanismes d’échappement à la réponse immune anti tumorale ... 14

IMMUNOTHÉRAPIE ANTI TUMORALE... 15

I. Immunothérapie cellulaire via la fusion de cellules dendritiques et tumorales... 15

II. Immunothérapie humorale via l’interleukine-2... 17

THÉRAPIE GÉNIQUE DU CANCER... 19

I. Vecteurs non viraux ... 20

I. 1. ADN nu ... 20

I. 2. Vecteurs synthétiques ... 21

II. Vecteurs viraux ... 21

II. 1. Vecteurs adénoviraux ... 22

II. 2. Vecteurs rétroviraux ... 23

II. 3. Vecteurs parvoviraux... 24

MVM(P) ET VECTEURS DÉRIVÉS DE MVM ... 25

I. Structure et classification... 25

II. Cycle viral ... 25

III. Biologie moléculaire de MVM(p)... 26

III. 1. Organisation du génome et expression des différents gènes de MVM(p) ... 26

III. 2. Promoteurs P4 et P38 ... 27

III. 3. Les protéines non structurales... 29

III. 4. Protéines de la capside ... 30

III. 5. Réplication de l’ADN... 30

IV. Oncotropisme et oncolyse... 31

V. Vecteurs dérivés de MVM(p)... 32

HYPOXIE... 35

I. Dégradation de HIF par le protéasome en normoxie ... 35

II. Stabilisation de HIF en hypoxie ... 36

III. Stabilisation de HIF par le Cobalt... 36

IV. Transactivation du gène cible ... 37

OBJECTIFS... 39

RESULTATS ... 43

1^ÈRE PARTIE.GÉNÉRATION DE VECTEURS DÉRIVÉS DU PARVOVIRUS MVM(P) ET CARACTÉRISATION DE LEUR EFFET ANTITUMORAL IN VIVO... 45

I. Optimalisation de la production de vecteurs... 45

I. 1. Production de vecteurs en hypoxie (annexe 1) ... 45

I. 1. a) Survie des cellules productrices de vecteur en hypoxie... 46

I. 1. b) Stabilisation de HIF1α dans les cellules productrices... 46

I. 1. c) Expression de NS1 en hypoxie ... 47

I. 1. d) Vecteurs inductibles par l’hypoxie ... 48

I. 1. e) Plasmides auxiliaires, expression de protéines de capside en hypoxie ... 50

I. 1. f) Cinétique de la production de vecteur en hypoxie ... 51

I. 1. g) Production de vecteur en hypoxie par infection d’une lignée d’encapsidation... 51

I. 2. Optimalisation de la production de vecteurs dans une lignée d’encapsidation... 52

I. 2. a) Sous-clonage de la lignée d’encapsidation NB-VP38 ... 52

I. 2. b) Optimalisation des conditions d’amplification des stocks de vecteur... 54

I. 2. c) Elaboration d’une lignée d’encapsidation à partir des cellules 293T... 56

I. 3. Concentration et purification des stocks... 57

I. 3. a) Lyse des cellules dans un petit volume (lysat cellulaire) ... 57

I. 3. b) Concentration par co-précipitation au Phosphate de Calcium... 58

I. 3. c) Purification par centrifugation à travers un gradient d’iodixanol ... 59

II. Effet antitumoral des vecteurs MVM/IL2 in vivo... 60

II. 1. Modèle du mélanome K1735 ... 60

II. 1. a) Effet antitumoral du vecteur MVM/IL2 dans le modèle du mélanome K1735 (annexe1) ... 60

II. 1. b) Comparaison de l’effet anti-tumoral de vecteurs transduisant le gène de l’interleukine-2 humaine... 61

II. 2. Extension de l’étude à un autre modèle, la lignée épithéliale de poumon TC-1... 64

II. 2. a) Susceptibilité de la lignée TC-1 à l’infection par MVM. ... 64

II. 2. b)Tumorigénicité des cellules TC-1 infectées par le vecteur MVM/IL2 ... 65

II. 2. c) Infiltrations immunes dans les tumeurs TC-1 infectées par MVM... 66

II. 2. d) Recherche d’activité CTL in vivo ... 68

2^ÈME PARTIE. GÉNÉRATION D’HYBRIDES PAR L’INTERMÉDIAIRE D’UNE CELLULE FUSOGÈNE POUR LA VACCINATION ANITUMORALE. ... 73

I. Efficacité de la fusion induite par des cellules exprimant FMG après infection ou transfection comparé à la lignée stable CHO-FMG. ... 74

II. Mise au point d’un modèle in vivo ... 78

II. 1. Coloration intracytoplasmique au CFSE... 78

II. 2. Coloration intracytoplasmique au SNARF-1... 80

II. 3. Détection par coloration intracytoplasmique de l’expression d’un transgène apporté par la lignée fusogène.. 81

III. Fusion en culot ... 81

IV. Validation de l’approche pour une autre lignée cellulaire ... 82

DISCUSSION... 85

1^ÈRE PARTIE.GÉNÉRATION DE VECTEURS DÉRIVÉS DU PARVOVIRUS MVM(P) ET CARACTÉRISATION DE LEUR EFFET ANTITUMORAL IN VIVO... 87

I. Amélioration de la production de vecteur... 87

II. Caractérisation de l’activité antitumorale in vivo... 90

2^ÈME PARTIE. GÉNÉRATION D’HYBRIDES PAR L’INTERMÉDIAIRE D’UNE CELLULE FUSOGÈNE POUR LA VACCINATION ANITUMORALE... 95

CONCLUSIONS GÉNÉRALES ET PERSPECTIVES... 99

MATERIEL ET METHODES ... 103

A.LIGNÉES CELLULAIRES... 105

B.BACTÉRIES ET PLASMIDES... 107

1^ÈRE PARTIE.GÉNÉRATION DE VECTEURS DÉRIVÉS DU PARVOVIRUS MVM(P) ET CARACTÉRISATION DE LEUR EFFET ANTITUMORAL IN VIVO... 115

A. Expériences en hypoxie (ou en présence de Cobalt)... 115

1. Dosage de l’activité luciférase... 115

a. Activité de différents promoteurs en hypoxie ... 115

b. Mesure de la transactivation de P38... 116

2. Détection de la protéine NS1 : Western blot... 116

3. Détection de la protéine HIF1α... 117

B. Production de stocks de virus recombinant... 118

1. Production de stocks de virus recombinant par cotransfection... 118

2. Production de stocks de virus recombinant par transfection d’une lignée d’encapsidation. ... 118

3. Par amplification dans la lignée d’encapsidation ... 119

4. Purification des vecteurs par centrifugation à travers un gradient d’iodixanol... 119

C. Titration des stocks de virus... 120

1. Estimation de la production de virus recombinant par dosage de l’IL2 produite après infection... 120

2. Détermination du titre en particules virales recombinantes par ELISPOT (Cheong et al, 2003)... 120

3. Détermination du titre en particules virales sauvages par plages de lyse ou par hybridation in situ ... 121

D. Expériences in vivo ... 122

1. Perte de tumorigénicité des cellules K1735 infectées par MVM/IL2 ... 122

2. Comparaison de l’effet anti-tumoral de vecteurs transduisant le gène de l’IL-2 humaine ... 123

3. Perte de tumorigénicité des cellules TC-1 infectées par MVM/IL2 ... 123

4. Recherche d’activité CTL spécifique de l’antigène E7 dans des souris vaccinées ... 124

4.1. Vaccination des souris... 124

4.2. Préparation des cibles CFSE... 124

4.3. Injection des cibles aux souris ... 125

4.4. Récupération et analyse des cibles ... 125

5. Immunohistochimie ... 126

5.1. Préparation des coupes de tumeurs ... 126

5.2. Coloration immunohistochimique... 126

2^ÈME PARTIE. GÉNÉRATION D’HYBRIDES PAR L’INTERMÉDIAIRE D’UNE CELLULE FUSOGÈNE POUR LA VACCINATION ANITUMORALE... 127

A. Microscopie, coloration DiffQuik... 127

B. Cytométrie de flux ... 127

1. Fusions... 127

2. Expression de GaLV-FMG et fusions ... 128

BIBLIOGRAPHIE... 131

ANNEXES... 143

INTRODUCTION

I

Les cellules tumorales sont des cellules qui ont perdu leur mécanisme de contrôle de croissance. Elles prolifèrent d’une manière non contrôlée, anarchique. De ces cellules dérivent des clones de cellules qui peuvent générer une masse considérable appelée tumeur et n’ayant aucune utilité pour l’individu. Une tumeur qui n’envahit pas le tissu avoisinant est dite

« bénigne », tandis qu’une tumeur envahissante est une tumeur « maligne », cancéreuse.

.

I. I

: D

’

La théorie de l’immunosurveillance a été émise vers 1970 par Burnet (Burnet, 1967).

Il a suggéré que très fréquemment dans l’organisme, il y a apparition de cellules cancéreuses, lesquelles sont reconnues comme étrangères par le système immunitaire et sont ainsi aussitôt éliminées. Suivant ce concept, une tumeur ne se développe que si elle parvient à échapper à la surveillance immunitaire de l’individu. En accord avec cette théorie, les observations chez les patients immunodéprimés (sidéens, greffés) ont mis en évidence une augmentation de l’incidence de cancers comparé aux sujets sains (Goedert et al, 1998).

Le système immunitaire est constitué d’un ensemble de cellules et d’organes, éléments nécessaires pour protéger un individu des agressions externes et de l’altération de ses propres cellules. Il y a deux types de systèmes de défense immunitaire : le système inné et le système adaptatif, qui est spécifique de l’antigène.

L'induction de l'immunité anti-tumorale « adaptative » est un processus en trois étapes: 1) présentation des antigènes associés à la tumeur (TAAs) ; 2) sélection et activation des cellules T spécifiques ainsi que des effecteurs non spécifiques ; 3) migration des cellules T spécifiques à l'emplacement de la tumeur. Les cellules dendritiques sont importantes pour induire la réponse immune cellulaire et humorale et peuvent aussi activer les cellules natural killer (NK) (revu dans Igney et Krammer, 2002).

Les antigènes sont présentés via le complexe majeur d’histocompatibilité de type II

(MHC-II) des cellules dendritiques aux lymphocytes T CD4, et via le MHC-I aux

lymphocytes T CD8. Les cellules dendritiques sont les seules à pouvoir initier la réponse

immune en activant les lymphocytes T naïfs spécifiques grâce aux signaux de costimulation

(B7) (figures 1-2). Un troisième signal peut aussi être important pour activer les cellules T :

l’IL2 ou la liaison CD40-CD40ligand (revu dans K. Sun et al, 2006 ; Schott, 2006).

Une fois activés, les lymphocytes T CD8 sont appelés lymphocytes T cytotoxiques

« CTL » : ils s’attachent à leur cible via leur récepteur T et le contenu de leurs granules est alors libéré par exocytose. Les molécules de perforine s’insèrent dans la membrane de la cellule cible et forment des pores permettant aux molécules de granzymes d’entrer dans la cellule. La cascade des caspases est alors activée et aboutit à l’autodestruction de la cellule par apoptose (revu dans Igney et Krammer, 2002).

La cascade des caspases peut aussi être activée par la liaison de Fas-ligand, exprimé à la surface des CTL, avec son récepteur Fas, présent sur les cibles des CTL (revu dans K. Sun et al, 2006 et Schott, 2006).

Les cellules “natural killer” (NK) jouent un rôle important dans l’immunité anti- tumorale « innée » ou non spécifique. Il existe à la surface des cellules NK, des récepteurs au MHC-I, qui inhibent leur activité lorsqu’ils reconnaissent leur ligand. Les cellules NK s’activent et tuent les cellules présentant peu ou pas de molécules du MHC-I via la libération de granules de «perforine et granzyme ».

Les macrophages et les neutrophiles sont aussi des cellules faisant partie du système immunitaire inné. Ils participent au rejet de la tumeur par élimination directe des cellules tumorales, par destruction de la matrice ou des vaisseaux nourriciers de la tumeur et par inhibition de l’angiogenèse. Ils servent aussi de cellules présentatrices d’antigènes (APC) et peuvent stimuler d’autres cellules immunes telles que les CTL, cellules NK ou APC (revu dans Igney et Krammer, 2002).

Figure 1. La génération d'une réaction immunitaire adaptative exige deux signaux indépendants. La reconnaissance du récepteur T (TCR) par le complexe antigène-MHC sur la cellule dendritique fournit un signal (signal 1) ce qui peut induire l'activation et l'expansion des cellules T si le signal de costimulation (signal 2) est présent (reconnaissance des molécules CD28-B7). D’après K. Sun et al, 2006.

Figure 2. Les cellules dendritiques matures induisent l’immunité anti-tumorale. La stimulation des DCs naïves induit un procédé de maturation et de migration des DCs vers les ganglions lymphatiques drainants. Les DC expriment alors une grande quantité de molécules du MHC I et II ainsi que des molécules costimulatrices. Les antigènes tumoraux sont présentés sur les MHC II et I aux lymphocytes CD4 (helper) et CD8 (cytotoxiques). L’interaction entre les DCs et les T helper active ces deux types de cellules et augmente leur capacité à stimuler les CTLs, qui peuvent alors lyser les cellules tumorales. En outre, les DCs peuvent stimuler et recruter les cellules NK. D’après M. Schott, 2006.

II. A

Plusieurs antigènes tumoraux pouvant être reconnus par les cellules T ont été identifiés par l’équipe de T.Boon (revu dans Boon et van der Bruggen, 1996). Certains d’entre eux sont exprimés exclusivement dans les tumeurs et sont appelés « antigènes spécifiques de tumeur ». Ces antigènes sont dérivés de mutations ou de translocation de gènes normaux. Ces mutations peuvent être l’origine même de la carcinogenèse. Un autre groupe d’antigènes sont les « antigènes associés aux tumeurs » (TAA). Ils ne sont pas exprimés seulement par les tumeurs mais aussi par d’autres tissus de l’organisme tels les tissus placentaires, ou testiculaires (ex : MAGE, BAGE, GAGE). Des protéines non mutées mais surexprimées peuvent aussi servir d’antigène tumoral (ex : p53, Her2/neu). En plus, des lymphocytes réactifs contre des antigènes de différenciation présents sur des mélanocytes normaux aussi bien que dans des mélanomes ont été identifiés (ex : MART-1/Melan-A, tyrosinase, gp100).

Enfin, des antigènes de virus oncogènes sont présents sur les cellules tumorales. L’expression

des antigènes tumoraux peut être hétérogène à l’intérieur même d’une tumeur et un patient

peut développer des réactions immunes contre plusieurs antigènes (revu dans Igney et Krammer, 2002).

III. M

’

Malgré tout l’arsenal que possède le système immunitaire, des tumeurs développent des mécanismes d’échappement à la surveillance immune. La tumeur se divisant rapidement, de nombreuses mutations apparaissent et les nouveaux variants pouvant échapper à la réponse immune auront un avantage sélectif par rapport aux autres cellules.

Une stratégie d’échappement à la réponse immune adaptative est la modification de la présentation antigénique. Ceci peut être dû à la mutation ou la sous-expression d’antigènes tumoraux, ou à la perte d’expression ou la mutation du MHC-I. Les cellules tumorales peuvent subir des changements dans l’expression des molécules impliquées dans la signalisation de l’apoptose, aboutissant à la résistance de la tumeur aux mécanismes d’élimination par le système immunitaire (ex : système Fas-FasL et cascade des caspases).

Les cellules tumorales peuvent exprimer des facteurs immunosuppressifs tels que le TGF-

(transforming growth factor), le VEGF (vascular endothelial growth factor), les prostaglandines, l’IL-10, le M-CSF… ou adopter les mécanismes de « killing » du système immunitaire pour éliminer les lymphocytes réactifs, un concept appelé « contre-attaque tumorale ». Le manque de réponse cellulaire T contre les antigènes tumoraux peut aussi s’expliquer par l’induction par la tumeur d’une tolérance envers la tumeur. Un mécanisme est l’induction d’anergie due à un manque de molécules de costimulation (ex : B7) comme signal secondaire (voir plus haut) ou à un dérèglement métabolique par des enzymes tels que Indoleamine 2,3-Dioxygenase (IDO). L’expression d’IDO par les cellules tumorales permet de bloquer les réponses T et induit l’anergie ou l’apoptose des lymphocytes T (Gajewski et al, 2006). Un autre mécanisme exploité par la tumeur est la déviation de la réponse Th1, requise pour un rejet efficace par les CTL, en réponse Th2 (réponse humorale) ou l’activation de cellules T régulatrices (Treg).

Enfin, la sous-expression de molécules d’adhésion dans les tissus tumoraux ou dans le conjonctif entourant la tumeur pourrait inhiber l’infiltration des cellules immunitaires de

« surveillance ». Aussi, malgré la présentation d’antigènes par les cellules tumorales et la présence de cellules immunes qui peuvent potentiellement réagir contre ces cellules, dans certains cas, l’emplacement de la tumeur dans des sites privilégiés (œil, cerveau) la rendrait

« invisible » pour le système immunitaire (revu par Igney et Krammer, 2002).

I

Le principe de l’immunothérapie du cancer est de tenter d’augmenter ou d’initier la réponse immune d’un patient envers sa tumeur. Différents outils faisant partie du système immunitaire sont utilisés dans ce but : les cytokines (immunothérapie non spécifique), les anticorps (immunisation passive), les antigènes tumoraux et leur présentation par les cellules appropriées (immunothérapie active ou vaccins) ou cellules T spécifiques, sélectionnées et amplifiées in vitro (immunothérapie adoptive) (Old, 1996).

Les deux approches décrites ci-dessous sont (I) la création de novo d’une réponse immune en utilisant les cellules dendritiques pour la présentation des antigènes tumoraux dans le contexte approprié et (II) la stimulation d’une réponse immune existante par administration de cytokines ou leur gène.

I. I

Les cellules dendritiques sont des cellules présentatrices d’antigènes qui ont l’unique capacité d’induire les réponses immunes primaires. Plusieurs stratégies ont été développées afin d’associer les antigènes tumoraux aux cellules dendritiques. Dans un premier temps, les antigènes tumoraux ont été chargés sur les DCs (protéine entière, peptide, gène sous forme d’ARN, d’ADN, via la transduction par des vecteurs viraux…). Cette approche suppose que les antigènes tumoraux sont connus. D’autre part, il existe un risque de développer une résistance si la tumeur perd l’expression de cet antigène. Pour contourner cette limitation, les DCs ont été chargées avec des lysats tumoraux entiers ou avec de l’ARN total (pour revue, Faith et Hawrylowicz, 2005 ; Avigan, 2004).

Une autre stratégie a été développée aboutissant à la formation d’hybrides issus de la

fusion entre cellules dendritiques et tumorales. Dans cette approche, une cellule immunogène

est créée qui exprime à la fois les antigènes tumoraux et les molécules de costimulation

apportées par les DCs. Un grand nombre d’antigènes, y compris des antigènes non identifiés,

peuvent alors être présentés dans le contexte HLA approprié. Cette stratégie devrait induire

une réponse CTL poly-clonale, optimalisant la possibilité d’induire le rejet de la tumeur

(Gong et al, 1997).

Ces hybrides sont classiquement générés par électrofusion ou fusion via le polyéthylène glycol (PEG) (Zhang et al, 2006 ; Guo et al, 2005). Ces méthodes sont cependant cytotoxiques et génèrent des débris cellulaires pouvant être phagocytés par les DCs, rendant l’identification des hybrides difficile.

Une autre approche de fusion cellulaire a été décrite récemment, qui fait usage de l’expression de glycoprotéines membranaires fusogènes (FMG) virales comme la FMG du VSV (Vesicular Stomatitis Virus) (Phan et al, 2003) ou de GaLV (Gibbon ape Leukemia Virus) (figure 3) (Bateman et al, 2000).

La fusion via FMG implique le démasquage des épitopes fusogéniques de la protéine.

Suite à des réarrangements conformationnels engendrés par (a) une diminution de pH pour la protéine fusogène de VSV-G ou (b) la fixation de la protéine à son récepteur (le récepteur Pit- 1 pour GaLV-FMG). La mécanique moléculaire qui sous-tend ces phénomènes reste largement méconnue, de même que les facteurs cellulaires impliqués. Leur décryptage passe aujourd’hui non seulement par l’étude des enveloppes, mais aussi par celle des récepteurs (revu par Heard et al, 1999). Le récepteur de GaLV, Pit-1, appartient à la famille des transporteurs de phosphate. Il joue le rôle de récepteur pour différents rétrovirus et il est exprimé par la plupart des cellules de mammifère (Kavanaugh et al, 1994). Pit-1 n’est fonctionnel comme récepteur viral que chez certaines espèces, notamment l’homme. Les cellules murines et certaines cellules de hamster, comme les CHO, sont résistantes à l’infection par GaLV (Chaudry et al, 1999).

L’avantage principal de la fusion via une protéine fusogène est que, contrairement au PEG et à l’électrofusion, elle n’engendre pas de cytotoxicité directe (en dehors de la fusion) liée à l’expression de FMG. Une des limites de cette méthode est l’efficacité de transfert du gène fusogène dans un des partenaires de la fusion.

C’est pourquoi, une nouvelle stratégie a été développée dans le laboratoire pour

générer des hybrides entre DC et TC qui fait intervenir une lignée fusogène non humaine

exprimant constitutivement la GaLV-FMG, les cellules CHO-FMG. Cette approche permet de

contourner l’étape du transfert du gène FMG, souvent inefficace ainsi que d’éviter la

formation de syncytia non viables par les cellules humaines transfectées avec FMG. Les

cellules CHO-FMG ne fusionnent pas, leur récepteur Pit-1 étant exprimé à un trop faible niveau

(Tailor et al, 2000). Cette méthode a permis de générer des hybrides tri-parentaux avec un

rendement reproductible (Cheong, thèse de doctorat février 2005). La génération d’hybrides

par l’intermédiaire d’une lignée fusogène est une alternative intéressante aux méthodes

existantes de par sa simplicité et sa flexibilité dans le choix des partenaires de la fusion ; des DC et TC autologues ou allogéniques. De plus, ce système de fusion offre la possibilité d’intégrer dans la lignée fusogène des transgènes codant des facteurs immunomodulateurs, permettant d’augmenter l’efficacité de l’induction de la réponse immune.

Figure 3. La fusion entre cellules tumorales et dendritiques via une protéine fusogène virale. La fixation de GaLV-FMG à son récepteur, Pit-1 induit des réarrangements conformationnels dont la conséquence est le démasquage d’épitopes fusogéniques et l’induction de la fusion entre les deux cellules. Ceci devrait réunir les éléments nécessaires à l’induction d’une réponse immune anti-tumorale spécifique. Les antigènes tumoraux se retrouvant dans l’hybride, devraient pouvoir ainsi être apprêtés et présentés aux cellules T dans un contexte favorable (MHC de classe I et II plus le signal de costimulation).

II. I

’

-2

Une autre stratégie pour tenter d’augmenter la réponse immunitaire envers la tumeur est l’immunothérapie non spécifique par traitement par des cytokines telles que l’IL2, l’IFN-

, le GM-CSF… De cette façon, l’immunité existante dirigée contre les antigènes tumoraux pourrait être amplifiée et aboutir au rejet de la tumeur.

En 1976, l’IL-2 a été décrite pour la première fois en tant que facteur de croissance et activateur des lymphocytes-T et des cellules NK. En 1985, Rosenberg a décrit les premières

Cellule

dendritique Cellule

tumorale

Hybride MHC I

MHC II costimulation

(MHC I) Antigènes tumoraux GaLV-FMG Pit-1

Activation du système immunitaire

réponses encourageantes dans le traitement du cancer du rein et du mélanome métastatiques.

Le traitement consistait en des injections systémiques d’IL2 recombinante à haute dose (revu par Rosenberg, 2001).

Il a été suggéré que l’IL2 pourrait induire la prolifération ou activer les fonctions effectrices des lymphocytes T CD8. L’IL2 augmenterait la perméabilité des vaisseaux sanguins ce qui pourrait faciliter la migration des cellules T spécifiques des antigènes tumoraux de la circulation vers le site tumoral. Enfin, l’IL2 stimulerait les cellules mononuclées, entraînant alors la production d’autres cytokines pro inflammatoires. Ceci, transformant une réponse inflammatoire chronique en réponse inflammatoire aigüe, aboutirait à trois effets prédominants : activation des cellules présentatrices d’antigènes, production massive de molécules chimioattractives recrutant d’autres cellules immunitaires et enfin, activation des mécanismes cytotoxiques des monocytes et des Natural Killer. Ensuite, par effet « boule de neige », la mort des cellules tumorales aboutirait à l’initiation de l’immunité adaptative via récupération et présentation des antigènes tumoraux (revu dans Wang et al, 2004).

L’IL2 est essentiellement indiquée dans deux cancers chimiorésistants : le cancer du

rein métastatique et le mélanome métastatique. Les effets secondaires, souvent sévères :

fièvre, rash cutanés, troubles digestifs et surtout syndrome d'hyperperméabilité capillaire,

avec fuite du liquide en dehors des vaisseaux et capillaires, d'où œdèmes, épanchement

pleuraux ou péritonéaux, hypotension artérielle… sont liés à la nécessité d’injecter de fortes

doses de façon systémique. D’où l’idée de développer des systèmes de transfert ciblés au

niveau des tumeurs, qui permettraient de diminuer fortement les doses.

T

D

La thérapie génique a été développée au départ pour soigner des maladies génétiques.

A présent, plus de 1200 essais cliniques de thérapie génique ont été réalisés dans le monde, dont plus de 2/3 en rapport avec la thérapie du cancer (figure 4).

Figure 4. Maladies abordées dans des essais cliniques de thérapie génique.

Le principe de la thérapie génique du cancer est "d'injecter" dans une cellule un gène, soit pour suppléer à un gène déficient (ex, p53), soit pour faire exprimer une substance dans le but de détruire les cellules tumorales (ex, gène suicide : HSV-TK couplé au Ganciclovir ou gènes antiangiogéniques), ou d’activer le système immunitaire (ex : interleukine-2) (Figure 5). L’apport de cytokines ou d’antigènes tumoraux par le transfert de gènes dans les tumeurs revient à pratiquer une immunothérapie plus ciblée. D’autre part, il existe plusieurs alternatives consistant à injecter de l’ADN ou de l’ARN non codant pour inactiver un gène spécifique au niveau de la traduction : technique de l’interférence à l’ARN (RNAi), ribozymes…

Aujourd'hui, l'évolution de la thérapie génique repose essentiellement sur le

développement de systèmes de transfert de gènes : ils doivent être sûrs, efficaces, spécifiques

à un type cellulaire. De plus, leur production industrielle doit être fiable et rentable. Pour la

thérapie génique du cancer, il n’est pas nécessaire qu’ils puissent s’exprimer dans des cellules

quiescentes ni qu’ils assurent la stabilité de l'expression du gène d'intérêt thérapeutique.

Les vecteurs sont répartis en 2 catégories : les vecteurs non viraux et les vecteurs viraux. Chacun de ces vecteurs a des avantages et des inconvénients ; le choix du vecteur dépendra des cellules à cibler et du type d’expression requis (stable ou transitoire).

Figure 5. Types de gènes thérapeutiques transférés dans les essais cliniques de thérapie génique.

I. V

Il existe deux classes principales de vecteurs non viraux: l’ADN plasmidique et les vecteurs synthétiques. Leurs avantages majeurs sont la facilité et les faibles coûts de production et de stockage ainsi que leur faible immunogénicité, ce qui autorise les administrations répétées. De plus, ils sont plus sûrs, et n’ont pas de limite théorique quant à la taille de la cassette d’expression. Ils peuvent être produits à partir de composants définis.

Mais la transduction est peu efficace, l’expression des gènes est de courte durée dans la plupart des tissus et le ciblage reste encore trop peu spécifique.

I. 1. ADN nu

L'ADN nu est injecté sous forme de plasmide (molécule circulaire) ou sous forme de

produit PCR dans le tissu cible. Il est ensuite intégré dans les cellules par des mécanismes

encore inconnus (revu dans Gardlìk et al, 2005).

L'ADN plasmidique peut être injecté dans le tissu cible et son entrée dans les cellules peut être facilitée par électroporation. On envoie des impulsions électriques répétées, à des fréquences et intensités définies pour optimaliser le transfert. En effet, cette méthode permet une transduction 100 fois plus efficace qu'une simple injection car elle rend la paroi momentanément poreuse et semble "attirer" l'ADN vers l'intérieur de la cellule.

L’ADN peut aussi être injecté sans aiguille par la méthode « Gene gun »: un courant d'hélium à haute pression fait pénétrer l'ADN fixé sur des particules d'or directement dans le cytoplasme de la cellule (revu dans Gardlìk et al, 2005).

I. 2. Vecteurs synthétiques

L'ADN est une molécule chargée négativement, d'où l'idée de la complexer avec des molécules chargées positivement (lipides ou autres polymères) par des interactions électrostatiques.

L’ADN est protégé des éventuelles dégradations intra- et extracellulaires par compaction et association avec le polymère (liposome ou polysome). L’entrée de l’ADN est facilitée car les complexes chargés positivement rapprochent l’ADN de la membrane cellulaire par liaison aux protéines membranaires de charge négative. L'ADN, intégré par endocytose, échappe ensuite aux lysosomes en sortant de l’endosome pour atteindre le noyau.

Ces vecteurs peuvent être rendus plus spécifiques par la fixation de ligands reconnaissant les protéines de surface de la cellule (Faivre et Fessi, 2000).

II. V

Les virus sont particulièrement efficaces pour délivrer leur information génétique

(ADN ou ARN) dans des cellules spécifiques. Malgré des limitations liées à la sécurité, les

vecteurs viraux sont les plus utilisés comme véhicules de transfert de gènes. Aujourd’hui, plus

de 2/3 des protocoles cliniques de thérapie génique utilisent un vecteur d’origine virale (figure

6).

Figure 6. Types de vecteurs utilisés dans les essais cliniques de thérapie génique.

II. 1. Vecteurs adénoviraux

Le matériel génétique des adénovirus est un ADN circulaire double brin. Les vecteurs dérivés de l’adénovirus sont les véhicules de transfert les plus étudiés et les plus utilisés dans des protocoles cliniques. Ils amènent le gène thérapeutique dans le noyau de la cellule cible, qu'elle soit en mitose ou non. Trois générations de vecteurs ont été développées, selon le nombre de gènes viraux qui ont été enlevés. Les vecteurs dits « gutless » ont été délétés de tout gène viral à l’exception des ITR (inverted terminal repeat), ce qui leur confère la possibilité de transférer de larges séquences d'ADN (jusqu'à 30 kb). Les avantages majeurs de ce virus sont le taux de transduction très élevé et la facilité de production à des titres élevés.

Par contre, ils ne s'intègrent pas dans le chromosome mais restent sous forme d’épisome.

L’expression du gène a donc tendance à disparaître au fil des divisions cellulaires (maximum

15 jours d’expression). Ces vecteurs entraînent une forte réaction immunitaire ce qui rend

impossible des administrations répétées, mais qui pourraient aussi être un avantage car ils

pourraient stimuler le système immunitaire du patient, en agissant comme adjuvant (revu dans

Bangari et al, 2006 ; Gardlìk et al, 2005).

II. 2. Vecteurs rétroviraux

Les rétrovirus sont des virus à ARN qui est transcrit en ADN par la transcriptase inverse virale. Les vecteurs dérivés des rétrovirus amènent le gène thérapeutique à l'intérieur du noyau de la cellule cible lors de la mitose et l'intègrent aux chromosomes.

La plupart de ces vecteurs sont dérivés de la sous-famille des onco-rétrovirus tels que MLV (virus de la leucémie murine). L’obtention d’un vecteur rétroviral recombinant à partir du virus parental requiert l’utilisation de deux types de constructions plasmidiques : un/des plasmide(s) dit « auxiliaire(s) » qui code(nt) pour les gènes des protéines requises en trans pour la réplication des particules (gag, pol et env), et un plasmide codant pour le vecteur rétroviral. Ce dernier code pour la cassette d’expression du gène thérapeutique et ne contient que les séquences virales requises en cis pour la réplication de l’ARN recombinant, son encapsidation et son intégration dans le génome de la cellule cible. Le gène thérapeutique est exprimé sous contrôle du LTR ou d’un promoteur interne. La taille du gène inséré est de 8 kb maximum. Les gènes auxiliaires et l’ADN du vecteur peuvent être intégrés dans une lignée d’encapsidation, ce qui diminue le risque de voir apparaître du virus réplicatif. Les vecteurs peuvent être pseudotypés (c'est-à-dire enveloppés avec des glycoprotéines d’un autre virus) pour augmenter leur stabilité ou changer leur spécificité cellulaire.

L’avantage principal des vecteurs rétroviraux est l’expression prolongée du gène inséré. Les inconvénients de ce virus sont une faible efficacité de transduction, restreinte aux cellules en division, une production difficile et le risque de mutagenèse par insertion (revu dans Kurian et al, 2000 ; Robbins et al, 1998 ; Baum et al, 2006).

Les recherches actuelles se tournent vers une autre famille de rétrovirus, les lentivirus

(tels que le VIH) qui sont capables d'infecter des cellules ne se divisant pas. Leur génome est

plus complexe que celui des oncorétrovirus. Le vecteur est en fait un système combinant une

partie du génome VIH dans un vecteur avec une protéine d'enveloppe non-VIH telle que la

protéine d’enveloppe de VSV-G ou du virus de la leucémie murine. Le gène thérapeutique est

exprimé sous contrôle du LTR ou d’un promoteur interne (revu dans Buchschacher et al,

2000).

II. 3. Vecteurs parvoviraux

Les Parvovirinae font partie de la sous famille des Parvoviridae infectant les vertébrés.

Cette sous famille se subdivise en trois genres : les erythrovirus (exemple le B19), les parvovirus autonomes (tels que MVM(p), décrit plus en détail dans la partie suivante) et les dependovirus, dont font partie les AAV (Adeno Associated Virus).

Les parvovirus AAV sont des virus non enveloppés à ADN linéaire simple brin, non pathogènes, très répandus chez l'homme. Ils sont appelés « dependovirus » car ils dépendent de l’infection d’un virus auxiliaire (adénovirus, herpès, CMV, papillomavirus ou virus de la vaccine) pour se répliquer. C'est le seul virus de mammifère connu qui s'intègre spécifiquement dans une région du génome (bras court du chromosome 19 humain) (revu par Li et al, 2005 ).

Les vecteurs dérivés de AAV sont les vecteurs parvoviraux les plus étudiés. Le gène thérapeutique est inséré entre les deux ITR (inverted terminal repeats) et les protéines de réplication (rep) et de capside (cap) sont fournies en trans lors de la production de vecteur.

Les vecteurs dérivés de AAV donnent une transduction efficace pour une grande variété de

cellules. Ces virus étant petits, la taille du gène inséré reste limitée (5 kb) (revu par Li et al,

2005 ; Robbins et al, 1998). Les administrations répétées semblent difficiles, vu l’existence

d’une réaction immune humorale dirigée contre les capsides (Halbert et al, 2000) et

l’induction chez l’homme de cellules T CD8 spécifiques des capsides AAV (Mingozzi et al,

2007).

MVM(

)

MVM

I. S

Le MVM (Minute Virus of Mice) appartient à la famille des Parvoviridae. Ceux-ci sont des petits virus non enveloppés à ADN linéaire simple brin de ~ 5kb se terminant par deux extrémités palindromiques. Ils sont encapsidés dans une coque protéique icosaédrique de 20 à 25 nm de diamètre. L’ADN code pour deux types de protéines : les protéines NS (non structurales), impliquées dans la réplication de l’ADN, dans le cycle viral et dans la transcription du deuxième type de protéine (VP), constituant la capside (pour revue, Cornelis et al, 2004). La famille des Parvoviridae est subdivisée en deux sous-familles : les Densovirinae, infectant les arthropodes, et les Parvovirinae, infectant les vertébrés. Les Parvovirinae se subdivisent en trois genres selon ce que requiert le virus pour accomplir son cycle : le genre des dependovirus comprend des virus qui dépendent de l’infection d’un virus auxiliaire pour achever leur cycle (exemple : AAV). Les erythrovirus se répliquent uniquement dans les érythrocytes (exemple : B19). Enfin, les parvovirus autonomes requièrent des fonctions cellulaires spécifiques pour accomplir leur cycle. Ils se répliquent de préférence dans des cellules en prolifération rapide, à un stade de différenciation précis (pour revue, Deleu et al, 2002). Deux sérotypes dérivés de MVM existent : le MVM(p) (prototype) et le MVMi (immunosuppressif).

II. C

Le cycle viral débute par l’adsorption du virus à la membrane cellulaire au moyen de

récepteurs non encore identifiés, mais présents de manière ubiquitaire. Ce sont des

glycoprotéines contenant des acides N-acétylneuraminiques. Il s’ensuit l’entrée du virus dans

la cellule par pinocytose (vésicules recouvertes de clathrine). Le virus est ensuite transporté

vers le noyau où il va pouvoir être décapsidé. Ces premières étapes se déroulent sans

spécificité cellulaire connue. Le génome simple brin est transformé en double brin et ensuite

en formes multimériques. L’activation du promoteur précoce (P4) va permettre l’expression

de NS1, nécessaire pour la réplication du génome ainsi que pour la transactivation du

promoteur tardif (P38) qui contrôle l’expression des protéines de capside (VP). L’assemblage

des virions se fait au fur et à mesure de la disponibilité des éléments. Le cycle se termine avec

la lyse de la cellule, due à la cytotoxicité de la protéine NS1 qui s’est accumulée dans le cytoplasme. Les virions sont alors libérés (figure 7) (pour revue : Cornelis et al, 2004).

Figure 7. Cycle lytique de MVM(p). Les étapes initiales sont l’adsorption et l’internalisation du virus dans la cellule.

Lorsque la cellule entre en phase S, le génome simple brin est converti en double brin. La réplication peut alors commencer, elle requiert la protéine NS1, produite après activation du promoteur P4. NS1 transactive P38 ce qui va permettre la synthèse des protéines de la capside. Les génomes sont encapsidés et les virions ne pourront sortir que lorsque NS1 aura provoqué la lyse de la cellule (d’après Deleu et al, 2002).

III. B

MVM(

)

III. 1. Organisation du génome et expression des différents gènes de MVM(p)

Le génome de MVM a été cloné et entièrement séquencé (Merchlinsky et al, 1983 ; Astell et al, 1986). Il est composé d’ADN simple brin et est long de 5149 nucléotides. Les deux extrémités sont formées de séquences palindromiques qui sont repliées en épingles à cheveux. Le brin d’ADN encapsidé est dit négatif car il est de polarité inverse à l’ARN messager. Le génome possède deux unités de transcription se chevauchant partiellement. Le

Lyse par NS1

Entrée et décapsidation

Conversion en double brin

Réplication et expression de l’ADN génomique Encapsidation

promoteur précoce est appelé P4 par référence à sa localisation génomique. Il permet la transcription de deux ARN messagers R1 (4,8 kb) et R2 (3,3 kb), codant respectivement pour NS1 et NS2. Le promoteur P38 initie la transcription du messager R3 (3,0 kb), codant, selon l’AUG utilisé par le ribosome, pour VP1 et VP2 ; VP3 étant le produit d’un clivage protéolytique de VP2. Toute cette variété de protéines pour un si petit génome résulte de l’utilisation d’AUG différents (VP1 et VP2) et d’épissages alternatifs (NS1 et NS2) des ARNm. Il n’existe qu’un seul site de polyadénylation pour tous les messagers (figure 8) (pour revue, Deleu et al, 2002).

0 25 50 75 100 Unités cartographiques

R1 AAAA NS1

R2 AAAA NS2

R3 mineur AAAA VP1

R3 majeur AAAA VP2 VP3

Figure 8. Organisation du génome de MVM(p). Le génome viral est divisé en deux unités transcriptionnelles dirigées par les promoteurs P4 et P38. Sous le génome sont représentés les ARNm. Les boîtes représentent les phases ouvertes de lecture (points pour la phase de lecture 1, lignes verticales pour la phase de lecture 2 et lignes horizontales pour la phase de lecture 3). Les introns sont représentés par des côtes (^) et la queue de polyadénylation par des AAA. VP3 est issu du clivage protéolytique de VP2.

III. 2. Promoteurs P4 et P38

Le taux de transcription du gène de NS1 varie en fonction du cycle cellulaire. MVM est grandement dépendant des facteurs de transcription cellulaires, surtout ceux exprimés en phase S du cycle. L’activité basale du promoteur P4 dépend de la boite TATA , liant les TBP

3

NS1

(TATA box binding proteins) et de la boite GC, liant Sp1. Cette activité basale peut être modulée en cis via des motifs connus pour lier une variété de facteurs de transcription cellulaires, dont deux éléments CRE (cAMP responsive element) liant la famille des facteurs de transcription ATF/CREB, EBS (E2F binding site), deux boites Y (liant le facteur nucléaire Y) et une boite E (liant USF) (figure 9A). E2F est le facteur majeur de l’activation de P4 en phase S ; il participe à 80% de l’activité du promoteur. Notons que NS1 n’est pas nécessaire à l’activation de son promoteur mais participe à augmenter le nombre de copies du génome et donc de matrices de transcription.

P38 se caractérise par une boite CCAAT impliquée dans l’efficacité de transcription (Lorson et al, 1998). Il existe également une région TAR (transcription activation region) ; NS1 se fixe sur ce site et transactive fortement P38. Un site GC pour Sp1 se trouve entre la boite TATA et la boite CCAAT (figure 9B).

A. P4

B. P38

TAR

1858 1889 1950 1959 1976 1982 2005

Figure 9. Organisation des promoteurs P4 et P38. Les différents facteurs de transcription se liant à l’ADN sont représentés par des boites. A. Le promoteur P4 est représenté avec son palindrome replié (d’après Deleu et al, 1998 et Paglino et al, 2006) B. Le promoteur P38. TAR, transcriptionnal activation region (D’après Lorson et al, 1998)

TATA Sp1

RNA start

VP

III. 3. Les protéines non structurales

NS1 est une phosphoprotéine multifonctionnelle de 83 kDa. Grâce à un signal de localisation nucléaire (NLS), cette protéine se retrouve dans le noyau où elle exerce ses différentes fonctions : endonucléase, ATPase et hélicase (Nuesch et Tattersall, 1993) (figure 10). Elle peut se fixer à l’ADN sur des séquences consensus (ACCA)

et peut introduire des coupures dans le génome à des sites spécifiques. Elle régule P38 ainsi que d’autres promoteurs. NS1 peut former des oligomères ou s’associer à d’autres protéines pour exercer ses fonctions de transactivation et d’amplification du génome (Pujol et al, 1997). Les fonctions de NS1 sont régulées par diverses phosphorylations par les protéines kinases C, entre autres, contribuant au tropisme de MVM pour les cellules transformées (revu dans Nuesch et al, 2005).

Domaine de fixation à l’ADN Hélicase TAD

1 100 200 300 400 500 600 672

Figure 10. Domaines de la protéine NS1. NS1 possède une région commune à NS2 (points), une région homologue à l’antigène grand T de SV40 (vagues) contenant le site de fixation à l’ATP (noir), un domaine de liaison à l’ADN, un signal de localisation nucléaire (NLS, nuclear localisation signal), le domaine à fonction hélicase et le domaine de transactivation (TAD, transactivation domain) (d’après Pujol et al, 1997).

NS2 est une phosphoprotéine de 25kDa provenant de la transcription du messager R2.

NS2 reste localisée dans le cytoplasme car elle ne possède pas de signal de localisation nucléaire. Sa présence n’est pas nécessaire pour la réplication dans certaines cellules humaines. Aucune activité enzymatique ne lui a été attribuée mais certaines protéines peuvent interagir avec elle. Son rôle dans le cycle viral et dans la cytotoxicité induite par NS reste non élucidé (revu dans Nuesch et al, 2005).

NLS

III. 4. Protéines de la capside

La capside icosaédrique est composée de 60 sous unités. VP1 est une protéine de 85 kDa nécessaire pour le caractère infectieux du virus et est présente en 10 copies par particule.

VP2 (66 kDa) est la protéine majeure de la capside. Elle s’associe à VP1 dans le cytoplasme formant un polymère qui se retrouvera dans le noyau pour empaqueter les génomes. Elle est nécessaire à l’encapsidation des génomes simple brin ainsi qu’au transport des virions vers le cytoplasme. VP3 (63 kDa) est issue du clivage de VP2 ; elle pourrait intervenir dans le transport du virus de la membrane au noyau lors de l’infection. Les extrémités amino- terminales de ces protéines sont exposées à l’extérieur du virus de façon séquentielle selon l’étape du cycle où le virus se trouve (Farr et al, 2006).

III. 5. Réplication de l’ADN

Pour sa réplication, MVM est entièrement dépendant de la machinerie cellulaire, mais aussi de NS1.

a. Conversion en double brin. Cette étape dépend de la cycline A exprimée en phase S (Bashir et al. 2000). Le palindrome 3’ sert d’amorce à la machinerie cellulaire ; la polymérisation s’arrête lorsque les polymérases rencontrent le palindrome 5’. On obtient alors une forme réplicative monomérique double brin (dsmRF) (Baldauf et al, 1997).

b. Résolution terminale du palindrome de droite. NS1 réalise une coupure au niveau de l’extrémité de droite libérant ainsi une extrémité 3’OH servant d’amorce pour répliquer le palindrome de droite (Nuesch et al, 1995 ; Baldauf et al, 1997 ; Cotmore et al, 2000).

c. Multimérisation du génome. Les 2 palindromes 5’ se reploient, créant ainsi une nouvelle extrémité 3’OH pour la polymérase. Le double brin est ouvert en simple brin pour permettre la formation d’une forme réplicative dimérique (dRF)

d. Résolution des formes multimériques et génération de génomes simple brin. Celle-ci

requiert deux étapes de clivage par NS1 (nick) au niveau des palindromes donnant in fine

deux molécules de génome : l’une servant à continuer le cycle de polymérisation (retour à

l’étape b), l’autre étant encapsidée sous forme de génome simple brin négatif. Le choix du

sens du brin encapsidé est contrôlé par l’efficacité supérieure du site de coupure du palindrome de droite (figure 11) (Cotmore et Tattersall, 2005).

Figure 11. Réplication du génome de MVM. D’après Astell et al, 1985. Les différentes étapes sont décrites dans le texte. v = brin viral c= brin complémentaire

IV. O

La préférence de MVM(p) pour les cellules transformées s’explique à plusieurs étapes.

En effet, la conversion d’ADN simple brin en double brin n’est induite qu’en phase S du cycle cellulaire. Elle requiert la présence de cycline A, qui, associée à une activité CDK (cyclin dependant kinase), est requise pour franchir la barrière G1/S (Bashir et al, 2001). La protéine NS1 est requise pour la réplication mais également certains facteurs cellulaires particuliers comme HMG, eux-mêmes régulés en fonction de l’état de transformation cellulaire (Kuntz-Simon et al, 1999).

Par ailleurs, l’activation de P4 implique la synthèse de NS1, nécessaire aux différentes étapes de la réplication. Le facteur E2F peut activer jusqu’à 60 fois la transcription de NS1 qui à son tour peut stimuler l’amplification du génome. Or, la forme active de E2F n’apparaît qu’à partir de la transition G1/S. D’autre part, P4 est activé dans des cellules transformées par ras via les motifs EBS et boîte-GC, cibles de Ets et Sp1 (Fuks et al, 1996). Ras active aussi les

a.

b.

c.

d.

dsmRF

dRF

protéines CREB (Perros et al, 1995, Perros et al 1999). Les motifs CRE et EBS contribuent de manière équivalente à l’oncosélectivité de P4 dans les cellules transformées par ras (Paglino et al, 2006).

L’accumulation de NS1 dans la cellule permissive en phase S aboutit à la lyse de la cellule. Ses multiples fonctions peuvent prendre les composants de la cellule pour cible, ce qui pourrait expliquer la contribution de NS1 dans la cytotoxicité. Elle provoque des cassures irréversibles dans l’ADN, inhibant sa synthèse et aboutissant à la mort cellulaire. Elle interagit avec des composants cellulaires, tels que la caséine-kinase (CKII

), directement impliquée dans l’induction d’altérations morphologiques de la cellule permissive infectée par MVM (Nuesch et Rommelaere, 2006 et Nuesch et Rommelaere, 2007).

Le mécanisme exact de mort cellulaire induite par ces virus oncolytiques est encore inconnu. Les parvovirus de rongeurs peuvent induire soit la nécrose, soit l’apoptose, selon le modèle tumoral considéré. Par exemple, après une infection par H1, des cellules leucémiques monoblastiques humaines (U937) et quelques lignées d’hépatocarcinome meurent par apoptose (Moehler et al, 2001 et Rayet et al, 1998) alors que des fibroblastes transformés et des kératinocytes humains montrent des signes de nécrose (Ran et al, 1999). Il a été décrit que des DCs pulsées avec des cellules tumorales en apoptose sont plus efficaces pour induire des réponses antitumorales protectrices que les DC chargées avec des cellules tumorales en nécrose (Inzkirweli et al, 2007 ; Yasuda et al, 2006). C'est pourquoi il serait intéressant d'approfondir quel est le mécanisme de mort cellulaire induit par MVM sur différentes lignées tumorales.

V. V

MVM(

)

L’oncotropisme et l’oncolyse de MVM(p) font de ce virus un vecteur de choix pour la thérapie génique du cancer : en remplaçant le gène des protéines de capside par un gène stimulant l’immunité (ici, l’interleukine 2), on pourrait pratiquer une immunothérapie ciblée vers les cellules cancéreuses (Russell, 1990). Le virus garde ainsi ses propriétés oncotropiques et oncolytiques. P4, activé dans ces cellules prolifératives, va permettre la transcription des protéines NS. NS1 transactive P38 et permet donc l’expression préférentielle par les cellules tumorales du transgène, amplifiée par la réplication du génome viral, avec l’aide de NS1.

Enfin, la mort des cellules causée par NS1 pourrait faciliter la fonction de présentation

d’antigènes par les cellules spécialisées et l’activation du système immunitaire (figure 12).