Dans le but d’identifier les différents types cellulaires impliqués dans la formation des hybrides, les partenaires de la fusion étaient identifiés soit par leur expression intracellulaire d’une protéine fluorescente (GFP, green fluorescent protein), soit par marquage avec des anticorps spécifiques. Bien que ces deux méthodes permettent une identification claire des deux partenaires, elles sont cependant limitantes car il faut connaître un marqueur spécifique pour chaque type de cellule participant à la fusion ou en dériver un clone exprimant la GFP. Pour les cellules dérivées de biopsies, on ne connaît en général pas de marqueur spécifique de la tumeur et il est difficile de dériver un clone exprimant la GFP pour chaque patient (coût, temps, inconvénients liés à la culture de ces cellules, etc…). Le marquage intracellulaire est applicable à n’importe quelle lignée, rapide et relativement simple. Les conditions de coloration par le CFSE (5-(and 6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) (en vert, émission à 525 nm) et le SNARF-1 (SNARF-1 carboxylic acid, acetate, succinimidyl ester) (en rouge, émission à 620 nm) avant la fusion ont donc été mises au point. Ces deux colorants diffusent librement à travers les membranes cellulaires et se fixent de manière irréversible aux protéines de la cellule. Nous avons vérifié si la présence simultanée des deux colorants dans les hybrides générait une interférence lors de l’analyse par cytométrie de flux, et si il y avait diffusion des colorants d’une cellule à l’autre.
II. 1. Coloration intracytoplasmique au CFSE
Différentes concentrations de CFSE ont été testées et les cellules ont été analysées par FACS au cours du temps : la fluorescence verte du CFSE est très intense et diminue fortement dans les premières heures qui suivent la coloration. Ceci est dû au fait que le CFSE diffuse librement à travers la membrane plasmique de la cellule jusqu’à ce qu’il y ait un couplage irréversible avec les protéines cytoplasmiques. A partir de ce moment, l’intensité de la fluorescence est stable, uniquement diluée par répartition entre les cellules-filles au cours de la division cellulaire. Ceci est illustré dans la figure 48a) pour le marquage des cellules dendritiques : la fluorescence des DC diminue fortement entre 1 et 6 heures puis très peu entre 6 et 24 heures. De plus, le pic de fluorescence est très étroit, toutes les cellules sont colorées de façon homogène. Le CFSE relargué par les cellules dans les premières heures après la
coloration peut se retrouver dans des cellules non colorées si elles sont mélangées pendant cette période. En effet, des cellules de glioblastome de rat Fischer (9L) non colorées, mélangées avec des cellules colorées au CFSE tout de suite après coloration deviennent légèrement fluorescentes (fig. 48b). Si le mélange est réalisé 16 heures après la coloration, aucun transfert de CFSE n’est observé (figure 48c).
Figure 48. Coloration CFSE. Superposition d’histogrammes de fréquences (abscisses : intensité de fluorescence verte ; ordonnées : nombre d’évènements). Les cellules non colorées sont représentées en blanc. a) cellules dendritiques 1h, 6h et 24h après coloration par 5 µM de CFSE. Cellules 9L mélangées b) tout de suite ou c)16h après coloration (5µM CFSE) et cultivées pendant 6h avec des cellules 9L non colorées.
Des fusions ont été réalisées entre des cellules CHO-FMG (lignée fusogène) et des cellules 9L. La coloration des cellules 9L au CFSE a été réalisée 16 heures avant la fusion. Ces marquages permettent d’identifier clairement une population de cellules doublement colorées (figure 49 : cadrant supérieur droit).
Figure 49. Coculture (a) et Fusion (b) analysées par FACS après coloration en rouge des cellules CHO (ou CHO-FMG) par un anticorps primaire de souris antiCHO puis un anticorps secondaire anti Ig de souris couplé à la phycoérythrine (PE). Les cellules 9L sont colorées avant la fusion par le CFSE (5µM).
Fusion 9L-CHO-FMG Coculture 9L-CHO
a) b) c)
24h 6h 1h a) b)II. 2. Coloration intracytoplasmique au SNARF-1
Le SNARF-1 est un autre succinimidyl ester émettant dans le rouge. Il est utilisé selon le même protocole que le CFSE mais à une concentration 10 fois supérieure (50µM). Même dans ces conditions, l’intensité du marquage détecté par FACS (excitation à 488 nm et émission à 620 nm à pH7) est plus faible que celle du CFSE et elle décroît après 24 heures (figure 50a). Le transfert de coloration étant négligeable (Figure 50b), il est préférable de réaliser la coloration juste avant le mélange des cellules à fusionner.
Figure 50. Coloration au SNARF-1. Superposition d’histogrammes de fréquences (abscisses : intensité de fluorescence rouge ; ordonnées : nombre d’évènement). Les cellules non colorées sont représentées en blanc. a) cellules 9L colorées avec 50µM de SNARF : analyse après 6h et 24h. b) cellules 9L colorées avec 50µM de SNARF et mélangées tout de suite pendant 6h avec des cellules 9L non colorées.
Des cocultures (figure 51a) et fusions (figure 51b) ont été réalisées entre des cellules CHO(-FMG) et des cellules 9L. Les cellules 9L ont été colorées au CFSE 16h avant le mélange des deux populations et les CHO ou CHO-FMG ont été marquées par le SNARF-1 juste avant le mélange. Les résultats sont équivalents à ceux obtenus avec des cellules CHO colorées avec un anticorps (figure 51).
Figure 51. Coculture (a) et Fusion (b) après coloration des CHO (ou CHO-FMG) en rouge par le SNARF-1 (50µM) et des cellules 9L en vert par le CFSE (5µM). Analyse par FACS.
6h 24h
a) b)
II. 3. Détection par coloration intracytoplasmique de l’expression d’un transgène apporté par la lignée fusogène
Afin d’augmenter l’efficacité du vaccin basé sur les cellules tumorales fusionnées via la lignée fusogène aux cellules dendritiques, le partenaire CHO pourrait fournir une cytokine immunostimulatrice, telle que l’IL2, qui permettrait d’augmenter l’activation de la réponse immune par l’hybride. C’est pourquoi, une lignée stable produisant l’IL2 a été dérivée des cellules CHO-FMG. Pour cela, le gène de l’IL2 humaine a été cloné dans un plasmide bicistronique conférant la résistance à la zéocine. Cette construction a ensuite été transfectée dans les cellules CHO et CHO-FMG. Les clones stables CHO-IL2 et CHO-FMG-IL2 produisant le plus d’IL2 dans le surnageant ont été sélectionnés. Des fusions ont été réalisées entre les cellules 9L-GFP et CHO-FMG-IL2 et suivies au cytomètre de flux après coloration intracytoplasmique avec un anticorps anti-IL2 (figure 52). L’expression de l’IL2 n’est pas diminuée dans les hybrides, du moins après 24 heures de fusion.
Figure 52. Mise en évidence de l’expression d’IL2 dans les hybrides par marquage intracytoplasmique. Les cellules CHO-FMG-IL2 (a) et 9L-GFP (b) ainsi que la coculture et la fusion ont été colorées par un anticorps anti-IL2 couplé à la PE. Les cellules ont été fusionnées pendant la nuit puis l’excrétion de l’IL2 a été bloquée (brefeldin et monensine) 5 heures avant le début de la coloration intracytoplasmique.