Transactivation du gène cible

Dans des conditions hypoxiques, HIF1α est stable, se détache de la protéine

chaperonne hsp90 (heat shock protein 90) et est transloquée vers le noyau. La transactivation

implique que les deux sous unités de HIF (α et β) se dimérisent et se lient à un élément

enhancer appelé HRE « hypoxia responsive element » qui se trouve dans les promoteurs des

gènes cibles (Semenza, 2001). Les motifs bHLH et PAS sont nécessaires à la dimérisation et

une région basique permet une liaison spécifique à la séquence consensus HRE

(5’-(A/G)CGTG- 3’) (Semenza et al, 1996). Le domaine de transactivation C-terminal, non

hydroxylé par FIH en hypoxie, interagit avec les coactivateurs CBP/p300 (CREB binding

protein) et ATF-1/CREB-1 (adjacent transcription factor/cAMP responsive element binding

protéine) ou SRC-1 (steroid receptor coactivator) pour activer la transcription (figure 13)

(Ebert et al, 1998 ; Lando et al, 2002).

Figure 13. Régulation de HIF1α en normoxie et en hypoxie. En conditions normales d’oxygène, la sous unité α de HIF est hydroxylée en présence de fer par la proline-hydroxylase (PHD) au niveau de prolines présentes dans le domaine de dégradation dépendante de l’oxygène. Cela permet au facteur von Hippel-Lindau (VHL) de se lier à HIF. Son activité ubiquitine-ligase lie des ubiquitines sur le substrat HIF1α. Toute protéine polyubiquitinylée est destinée à être dégradée par le protéasome. En hypoxie, la proline hydroxylase est inactive, la protéine HIF1α est très rapidement stabilisée et migre dans le noyau où elle s’associe à son partenaire HIF1β. Le complexe ainsi formé recrute d’autres partenaires, en particulier CBP/p300, et se fixe sur la séquence nucléotidique spécifique de reconnaissance du facteur HIF (motif HBS : HIF-binding site ou HRE : Hypoxia responsive element) située dans les régions régulatrices des gènes cibles. L’activation de la protéine HIF par l’hypoxie entraîne la synthèse de facteurs protéiques impliqués notamment dans l’érythropoïèse, l’angiogenèse et la glycolyse anaérobie (d’après Pillet et Le Guyader, 2005).

Les stratégies immunothérapeutiques abordées dans ce travail, incluent l’activation (ou la réactivation) du système immunitaire par l’expression de facteurs immunomodulateurs (ex : l’interleukine-2) via l’utilisation de vecteurs viraux (parvovirus MVM), ou par présentation d’antigènes tumoraux par la machinerie des cellules dendritiques (DC), via la génération d’hybrides entre DC et cellules tumorales (TC).

Par ses propriétés oncotropiques et oncolytiques, un vecteur destiné à la thérapie génique du cancer a été dérivé du parvovirus MVM. La production de titres élevés de ce vecteur est importante et reste une étape limitante à son utilisation. Il a été décrit dans la littérature que différents virus, dont le parvovirus B19, étaient produits en plus grande quantité sous des conditions hypoxiques. Le promoteur de B19 comporte un site de fixation HRE (hypoxia responsive element) pour un facteur de transcription stabilisé en hypoxie : HIF (hypoxia responsible factor). Or, le promoteur P4 du MVM comporte aussi des séquences HRE, sites potentiels de réponse à l’hypoxie. Un premier objectif de ce travail a été de tester si la transcription des protéines virales et les titres de vecteur étaient augmentés en réponse à l’hypoxie.

L’activité antitumorale du vecteur MVM/IL2 a été évaluée in vivo, dans des souris immunocompétentes, dans un modèle de mélanome. Un autre objectif de nos travaux a été d’évaluer l’apport de l’oncolyse parvovirale dans l’activité anti-tumorale, en comparant l’efficacité du vecteur MVM/IL2 à celle d’autres vecteurs, Ad/IL2 et Rétrovirus/IL2, ne possédant pas d’activité oncolytique, dans le même modèle de tumeur. Enfin, dans le but de mettre en évidence in vivo une éventuelle réponse CTL spécifique de la tumeur, nous avons utilisé le modèle de tumeur TC-1, exprimant les antigènes E6 et E7 du virus HPV-16.

L’autre stratégie immunothérapeutique abordée dans ce travail est l’activation du système immunitaire via la présentation d’antigènes tumoraux par des hybrides de cellules tumorales et dendritiques. Les hybrides sont obtenus par l’intermédiaire d’une lignée fusogène générée au laboratoire à partir des cellules CHO et qui exprime de manière stable la protéine virale fusogène du GaLV (FMG). Les cellules CHO ne sont pas susceptibles elles-mêmes à la fusion par la GaLV-FMG. Dans le but de déterminer pourquoi des cellules tumorales humaines transduites avec ces vecteurs n’avaient pas permis de générer des hybrides avec des DC, les cellules CHO ont été utilisées pour caractériser l’expression de la protéine fusogène ainsi que la capacité des cellules à fusionner, après transduction du gène GaLV-FMG par un vecteur viral (AAV-GaLV) ou plasmidique. Ces expériences ont montré que le taux d’expression de GaLV-FMG après transduction est beaucoup plus faible que dans la lignée stable CHO-FMG. De plus la proportion de cellules qui expriment la protéine fusogène pourrait ne pas être suffisante.

Afin d’augmenter l’efficacité des hybrides TC-DC, des gènes codant pour des protéines immunostimulatrices pourraient être apportés par la lignée fusogène. Nous avons introduit le gène de l’IL2 dans la lignée CHO-FMG et vérifié l’expression de cette cytokine dans les hybrides TC-CHO, obtenus via la nouvelle lignée fusogène.

1

P

.G

MVM(

)

CARACTÉRISATION DE LEUR EFFET ANTITUMORAL IN VIVO

Différents vecteurs dérivés de MVM(p) ont été générés dans notre laboratoire. Ils

portent le gène de l’Interleukine-2 humaine (hIL-2) à la place d’une partie des gènes de

capside, sous contrôle du promoteur viral P38. Ils conservent les promoteurs P4 et P38, et les

gènes codant pour les protéines NS, afin de maintenir les propriétés d’oncotropisme et

d’oncolyse de MVM(p). Les vecteurs de 1

et 2

génération seront appelés MVM/IL2

et

MVM/IL2² (voir matériel et méthodes).