Les vecteurs basés sur des parvovirus autonomes sont capables de transduire des cellules transformées et permettent de cibler l’expression des transgènes dans les cellules tumorales grâce à leur oncotropisme (Russel et al, 1992). Cependant, ces vecteurs sont difficiles à produire, les titres obtenus après cotransfection avec un plasmide auxiliaire sont faibles et les stocks contiennent du virus réplicatif de type sauvage issu de la recombinaison homologue entre ces plasmides. Différentes approches ont permis d’améliorer leur production (Brandenburger et Velu, 2004).
Parmi ces approches, l’utilisation d’une lignée d’encapsidation permet de minimiser le risque de voir apparaître du virus réplicatif (Brandenburger et Russell, 1996 ; El Bakkouri et al, 2000 ; Brandenburger et Velu, 2004). L’intégration du plasmide auxiliaire dans le génome de la lignée permet de diminuer la fréquence de recombinaison entre les séquences vecteur et auxiliaire (Subramani et Rubnitz, 1985). De plus, l’utilisation de telles lignées cellulaires permet d’effectuer des cycles d’infections successives pour amplifier le virus recombinant. Cependant, il est préférable de limiter les amplifications à un cycle, afin de garder des stocks dépourvus ou ayant peu de virus de type sauvage. En effet, le virus de type sauvage a un avantage sélectif sur les vecteurs défectifs et il est rapidement amplifié dès son apparition (Brandenburger et Russel, 1996 ; El Bakkouri et al, 2000).
Nous avons sous-cloné la lignée d’encapsidation construite au laboratoire, NB-VP38, afin d’isoler un clone produisant des stocks plus concentrés après infection ou transfection. L’auxiliaire intégré, pP38-VP, et le vecteur pMVM/IL22, tous deux de deuxième génération ,
ne partagent aucune homologie à droite du transgène (Clément et al, 2002). Ceci diminue encore les risques de recombinaison entre l’auxiliaire et le vecteur comparé à la lignée de 1ère génération (Brandenburger et Velu, 2004). Cependant, comparée à cette dernière, la lignée NB-VP38 produit moins de vecteur après transfection et ne permet pas son amplification après infection. Nous avons donc sélectionné deux sous-clones, NBVP38.2 et NBVP38.49, pour produire des stocks par transfection et par infection, respectivement.
D’autre part, nous avons généré une lignée d’encapsidation à partir de la lignée cellulaire 293T, celle-ci étant connue pour sa haute transfectabilité (DuBridge et al, 1997). Les stocks de MVM/IL22 obtenus par transfection dans cette lignée étaient 5-10 fois plus concentrés que dans la lignée NB-VP38.2 ayant intégré le même auxiliaire,. Les cellules 293T n’étant pas sensibles à l’infection par MVM, la lignée d’encapsidation dérivée de celle-ci ne peut être utilisée que pour produire des stocks par transfection.
Enfin, nous avons optimalisé les conditions d’amplification des stocks de vecteur ainsi que la récupération de celui-ci par lyse des cellules dans des plus petits volumes. Ceci permet au final d’obtenir des stocks à des titres de 106-107 particules infectieuses (p.i.) par ml, contenant peu ou pas de virus de type sauvage (<0.5% après un cycle d’amplification). Les titres des stocks de vecteur obtenus classiquement étaient de ~104 p.i./ml. Ces expériences ont été réalisées avec le vecteur pMVM/IL2² et l’auxiliaire de deuxième génération pP38VP, n’ayant pas d’homologie à droite du transgène et une homologie réduite au niveau du promoteur P38. D’autre part, nous avons pu concentrer ces stocks par co-précipitation au Phosphate de calcium, selon la méthode de concentration mise au point pour les vecteurs rétroviraux (Morling et al, 1995 ; Pham et al, 2001), mais cette concentration s’accompagnait d’une perte de 50% du vecteur.
Dans le but de pouvoir injecter le vecteur directement dans des tumeurs pré-établies, nous avons purifié les stocks par centrifugation à travers un gradient d’iodixanol, tel que décrit pour les vecteurs dérivés d’AAV et du parvovirus H-1 (Zolotukhin et al, 1999 ; Wrzesinski et al, 2003).
Une autre approche que nous avons tentée pour obtenir des stocks plus concentrés consistait à produire le MVM recombinant dans des conditions de faible tension en oxygène (hypoxie). En effet, plusieurs virus, dont le parvovirus B19, voient leur expression et production augmenter en hypoxie (Caillet-Fauquet et al, 2004 ; Pillet et al, 2004 ; Polonis et al, 1991 ; Ebbesen et al, 1991 et 1998 ; Davis et al, 2001). L’hypoxie stabilise un facteur de transcription appelé HIF (hypoxia inducible factor), qui active la transcription de gènes
possédant dans leur promoteur des éléments HRE (Hypoxia Responsive Element) (Semenza et al, 1996).
Nous avons montré que le promoteur P4 de MVM est induit en hypoxie. Cette induction pourrait être liée à la présence dans P4 d’éléments HRE potentiels. Nous n’avons cependant pas confirmé (par exemple par gel retard), que ces éléments sont bien la cible du facteur HIF.
La présence d’éléments HRE potentiels dans le promoteur P4 de MVM et l’inductibilité de ce promoteur faisaient supposer que, à l’instar du parvovirus B19, la production du vecteur MVM/IL2 serait améliorée en hypoxie (Pillet et al, 2004). Malheureusement, les titres des stocks de vecteur, produits dans ces conditions de faible tension en oxygène étaient fortement diminués. L’ajout d’éléments HRE dans le promoteur P4 du vecteur n’a pas permis de lever le blocage. Au contraire, cette insertion diminuait la production de vecteur, même en normoxie. L’ajout d’éléments HRE aurait pu rendre le vecteur encore plus spécifique aux tumeurs, étant donné les conditions hypoxiques, présentes à l’intérieur des tumeurs (Wang et al, 2005).
Le blocage dans la production de vecteur se produit après 1 jour d’incubation en hypoxie et ne semble pas être lié à la production de protéines de capside. En effet, deux plasmides auxiliaires différents ont été utilisés pour fournir les protéines de capside en
trans
sous contrôle des promoteurs P38, induit en hypoxie ou PSV40, insensible à l’hypoxie (Riedinger et al, 1999 et Pillet et al, 2004). Dans ces deux cas, les titres des stocks de vecteur produits en hypoxie étaient plus faibles que ceux produits en normoxie. Dans un vecteur dérivé du parvovirus AAV, l’insertion de 6 HRE dans un promoteur SV40, couplé au gène rapporteur lacZ a augmenté la production de
β
-gal de 10 fois en hypoxie (Ruan et al, 2001). L’ajout d’éléments HRE dans les promoteurs P38 ou PSV40 de l’auxiliaire n’a pas permis d’augmenter la production de vecteur, suggérant à nouveau que la quantité des protéines de capside n’est pas limitante en hypoxie.Certains virus, notamment le SV40 et l’Adénovirus voient leur production diminuée en hypoxie. Dans ce cas, la diminution serait due à une inhibition de la réplication du génome (Riedinger et al, 1999 ; Shen et al, 2005). Nous avions recherché par extraction de l’ADN de faible poids moléculaire (extraits de Hirt) si le blocage de la production des vecteurs dérivés de MVM était dû à une mauvaise amplification en hypoxie. La méthode n’est pas très quantitative mais l’amplification du vecteur MVM/IL2 ne semblait pas être affectée en hypoxie (Servais, mémoire 2002).
L’hypoxie est connue pour affecter la physiologie cellulaire non seulement au niveau de l’expression mais aussi au niveau des modifications post-traductionnelles de protéines. En effet, plusieurs kinases sont activées en hypoxie (MAPkinases, protéine kinase-C…) (Corbucci et al, 2005 ; Haddad, 2004). L’hypoxie pourrait donc agir au niveau de la phosphorylation des protéines virales ou cellulaires. En condition de « simulation de l’hypoxie » par incubation des cellules infectées avec du Cobalt, les différentes formes phosphorylées de la protéine non structurale de MVM, NS1, semblaient être affectées. Il est connu que les différentes fonctions de NS1 sont régulées par des modifications post-traductionnelles, telle que la phosphorylation (Nuesch et al, 1998). Ceci pourrait provoquer une inhibition ou activation d’une des différentes fonctions de NS1 telles que la transactivation de promoteurs, la cytotoxicité, l’amplification de l’ADN viral,... Il a également été montré que les modifications post-traductionnelles des protéines VP sont importantes pour la production du virus MVM(p) (Maroto et al, 2000). Si l’activité des protéines responsables de la phosphorylation de VP est modifiée en hypoxie, la phosphorylation des protéines de capside et par conséquent, l’assemblage des particules ou l’encapsidation du génome pourraient aussi être affectés.
Il existe un réseau d’interactions, non encore élucidé, entre le virus et la cellule hôte, nécessaire à l’aboutissement du cycle viral. En effet, l’infection par le parvovirus H-1 modifie l’expression de gènes impliqués dans la transcription, l’apoptose, la réponse au stress et la réponse immune (Li et al, 2005)… Il est difficile de prévoir quelle interaction nécessaire à la production du vecteur serait compromise en hypoxie.