Expériences in vivo

1. Perte de tumorigénicité des cellules K1735 infectées par MVM/IL2

Les expériences de perte de tumorigénicité des cellules K1735 ont été réalisées sur des

souris femelles C3H/HeN de 5-6 semaines (Charles River Laboratories). Ces expériences ont

été décrites dans El Bakkouri et al, 2005.

Les cellules tumorales K1735 ont été ensemencées la veille à une densité de 5.10

⁵

cellules par boite de pétri de 10 cm. Le jour de l’infection, les cellules de deux boites témoins

ont été comptées et les autres cellules ont été infectées à une MOI de 1 par du virus MVMwt

ou MVM/IL2

¹

ou MVM/IL2fs

¹

dans un volume final de 2ml de PBS

⁺⁺

par boite. Les cellules

ont été incubées pendant une heure à 37°C, puis 4ml de milieu ont été ajoutés et l’infection

s’est poursuivie pendant 5 heures à 37°C. Les cellules ont été ensuite trypsinisées, rincées 2

fois au PBS, comptées et le volume a été ajusté avec du milieu sans additif à une

concentration de 10

⁶

/cellules/200µ l. Une partie des cellules a été mise en culture pour évaluer

d’une part la production d’IL2 après 1, 2, 3 jours. 200µl ont été injectés en sous-cutané aux

souris, ces dernières se trouvant confinées dans une animalerie A3. Les tumeurs ont été

mesurées deux fois par semaine et les souris ayant des tumeurs dont le diamètre dépassait

1.5cm ont été sacrifiées.

2. Comparaison de l’effet anti-tumoral de vecteurs transduisant le gène de l’IL-2 humaine

a. Virus recombinant dérivé de l’Adénovirus

Un stock d’Adénovirus/IL2 contenant 2.7.10

¹¹

particules totales/ml nous a été fourni

par la firme Transgène SA. Nous avons déterminé le titre en « unités de transduction » (u.t.)

par la méthode ELISPOT en infectant la lignée de référence pour l’adénovirus : les cellules

293T. Les MOI sont calculées sur base des unités de transduction (4.10

⁹

u.t./ml). Dans le

vecteur Ad/IL2, le gène de l’IL2 est sous contrôle du promoteur CMV.

b. Virus recombinant dérivé du rétrovirus MuLV

Afin de faciliter la comparaison avec les vecteurs Adénovirus/IL2 et MVM/IL2, qui

transduisent l’IL2 humaine, nous avons remplacé le gène murin (mIL2) par le gène humain

(hIL2), dans le vecteur pBabe-Neo-mIL2.

L’efficacité de transduction du rétrovirus étant très faible, nous avons établi une lignée

stable à partir des cellules K1735 : K1735/hIL2.

3. Perte de tumorigénicité des cellules TC-1 infectées par MVM/IL2

Les expériences de perte de tumorigénicité dans le modèle TC-1 ont été réalisées sur

des souris femelles C57BL/6 de 5-6 semaines (Harlan).

Les cellules tumorales TC-1 ont été infectées à une MOI de 3 par du virus MVMwt ou

MVM/IL2

¹

comme décrit en D.1. Les cellules infectées ont été resuspendues à 10

⁶

ou

10

⁵

cellules/100µ l. Une partie des cellules a été mise en culture pour évaluer d’une part la

production d’IL2 après 1, 2, 3 jours et d’autre part l’efficacité de transduction par ELISPOT.

100µ l ont été injectés en sous-cutané aux souris.

4. Recherche d’activité CTL spécifique de l’antigène E7 dans des souris vaccinées

4.1. Vaccination des souris

Pour chaque groupe, 3 souris adultes C57BL/6 (8 semaines) ont été vaccinées au jour

0 et au jour 3 avec 10

⁶

cellules TC-1 irradiées, non infectées ou infectées à une MOI de 10 par

MVM/IL2

¹

ou MVMwt (comme décrit en D.3). L’irradiation aux rayons γ a été réalisée sur

glace dans une bombe à Cobalt (1013 RAD) avant l’injection en sous-cutané aux souris.

4.2. Préparation des cibles CFSE

Isolement des cellules des ganglions lymphatiques

Les ganglions lymphatiques de souris naïves sont disséqués (ganglions inguinaux,

axillaires, intestinaux, aortique et cervicaux) en prenant soin de ne pas laisser de tissus

adipeux. Les ganglions sont écrasés au moyen du piston d’une seringue puis les cellules sont

récupérées dans du milieu sans sérum à 4°C et tamisées dans une passoire qui s'adapte sur un

tube Falcon de 50 ml (tamis de 100µ m). Le tamis est rincé plusieurs fois par addition de

milieu sans sérum. Tout le procédé se fait sur glace. Les cellules sont centrifugées pendant 10

minutes à 800 g à 4°C et transférées dans un nouveau tube. Cette étape élimine les acides gras

des bords du tube, ceux-ci pouvant être toxiques pour les cellules. Les cellules sont à nouveau

centrifugées, resuspendues à 10

⁷

/ml dans du milieu complet et gardées à 4°C jusqu'à leur

utilisation.

Isolement des cellules nucléées de la rate

Après avoir prélevé les ganglions, la rate est disséquée et un maximum de tissu

adipeux est enlevé. La rate est écrasée dans une boite de pétri en utilisant l'extrémité

supérieure d'un piston de seringue. Les cellules sont mises en suspension, tamisées et

centrifugées comme décrit ci-dessus. Elles sont resuspendues à 2.10

⁷

cellules/ml dans du

milieu sans sérum. Les globules rouges et les débris sont éliminés par séparation de densité à

température ambiante sur Lympholyte-M (Polysucrose 400 et sodium Diatrizoate, densité :

1.0875g/cm3 à 22°C (Cedarlane). Le gradient est formé en plaçant une pipette Pasteur stérile

au fond d'un tube 50ml contenant les cellules. 10 ml de Lympholyte-M sont alors versés dans

la pipette de Pasteur à l'aide d'une pipette en plastique. Le gradient est centrifugé à 1500g

pendant 20 minutes à température ambiante. La couche de cellules à l'interface est récupérée

au moyen d’une pipette Pasteur et les cellules sont centrifugées à 800g pendant 13 minutes à

température ambiante. Les cellules sont lavées deux à trois fois dans du milieu puis

resuspendues à 10

⁷

/ml dans du milieu complet. Les cellules sont gardées sur glace jusqu'à

utilisation.

Chargement des cibles avec le peptide E7

La séquence (H2N- RAH YNI VTF –COOH) du peptide E7 a été synthétisée par

Eurogentec. Les cellules de rate et des ganglions sont mélangées à une concentration finale de

10

⁷

/ml dans du milieu complet. La moitié des cellules est chargée avec le peptide antigénique

E7 par incubation avec 1 µM (1.1µg/ml) de peptide pendant 90 minutes à 37°C 5% CO

2

. Les

cellules sont ensuite culottées par centrifugation à 800g.

Coloration des cellules au CFSE

Les cellules (chargées ou non en peptide) sont resuspendues dans du milieu sans

sérum. Le CFSE est ajouté à une concentration finale de 20µM (cellules chargées de peptide)

et 2 µM (cellules contrôles). Les cellules sont incubées à 37°C et agitées deux fois pendant 10

minutes. Ceci assure un chargement homogène en CFSE. La réaction est arrêtée en ajoutant 7

volumes de milieu complet et froid. Cette étape est censée bloquer les estérases

intracellulaires qui sont inhibées à 4°C. Elle fournit également un excès de protéines

extracellulaires qui agissent en tant que piège pour la Carboxy-fluorescéine non liée. Les

cellules sont centrifugées 5 minutes à 800g et 4°C et lavées deux fois avec du PBS. À ce

stade, les cellules peuvent être gardées sur glace et dans l'obscurité jusqu'à leur injection.

4.3. Injection des cibles aux souris

Les cellules sont resuspendues dans du HBSS à 10

⁸

/ml. Les cellules chargées avec le

peptide sont mélangées aux cellules contrôle juste avant l’injection. 200µ l sont injectés

immédiatement dans le sinus rétro orbital de l'animal.

4.4. Récupération et analyse des cibles

Les cellules injectées sont récupérées le lendemain dans la rate et les ganglions

lymphatiques (voir D.4.2). Le rapport entre les cellules chargées avec le peptide (CFSE

^high

) et

les cellules contrôles (CFSE

^low

) est déterminé par cytométrie de flux pour chaque souris et

comparé à celui des souris contrôles, non vaccinées.

5. Immunohistochimie

5.1. Préparation des coupes de tumeurs

Les tumeurs ont été disséquées au jour 20 après l’injection des cellules tumorales

TC-1. Les tumeurs sont fixées dans un fixateur au zinc (ImmunoHistofix, ImmunoHistoWax

^R

,

A-Phase) pendant 3 jours à 4°C. Elles sont ensuite déshydratées par passage dans des bains

successifs d’éthanol (30%, 50%, 70%, 90% et 100%) de 20 minutes chacun à température

ambiante. L’infiltration de résine (Immunohistowax) est réalisée par trois bains successifs de

30 minutes chacun à 37°C. Les pièces sont ensuite enrobées et montées sur support pour

permettre la réalisation des coupes (6µ m d’épaisseur) au moyen d’un microtome. Les coupes

sont déposées sur une goutte d’eau sur des lames silanisées (3-aminopropyltriethoxysilane) et

dégraissées à l’acétone. Les lames sont séchées à l’air à température ambiante.

5.2. Coloration immunohistochimique

La résine est éliminée des coupes par trempage pendant 5 minutes dans un bain

d’acétone suivi d’un rinçage au PBS. Les sites de réaction non spécifiques sont bloqués

pendant 30 minutes à température ambiante avec du PBS-BR (Blocking Reagent, Boehringer,

1% dans du PBS) et les coupes sont rincées dans trois bains successifs de PBS. Les

peroxydases endogènes sont inhibées en incubant les coupes dans de l’H

₂

O

₂

3% dans du PBS

pendant 30 minutes à température ambiante. Après trois rinçages dans du PBS, les coupes

sont incubées pour la nuit à 4°C avec l’anticorps primaire. Le lendemain, après trois bains de

PBS, les coupes sont incubées pendant la nuit à 4°C avec l’anticorps secondaire (voir couples

dans le tableau ci-après). Après trois lavages au PBS, la phosphatase alcaline (AP) puis la

peroxydase (HRP) sont révélées selon les instructions des fabricants. Les coupes sont rincées

trois fois au PBS et les lames sont montées en collant (liquide de montage Aquatex) une lame

couvre objet. Les coupes sont examinées au microscope 3 jours après et photographiées

(grossissement 200x).

Anticorps primaire Anticorps secondaire Révélation

neutrophiles 1A8-FITC (1/20) Anti-FITC-AP (1/250) Bleu (kit ABC VECTOR) macrophages F4-80-biotinylé (1/100) Streptavidine-HRP

(1/500)

Rouge (kit AEC Sigma) lymphocytes T AntiCD3-2c11-FITC

(1/50)

2

^ÈME PARTIE

.G

ÉNÉRATION D

’

HYBRIDES PAR L

’

INTERMÉDIAIRE D

’

UNE CELLULE FUSOGÈNE POUR LA VACCINATION ANITUMORALE

Les expériences de fusion ont été réalisées dans des plaques multi puits de 24 puits.

Les fusions entre deux partenaires cellulaires ont été réalisées avec 2.10

⁵

cellules par puits et

dans un rapport 1 :1. Le temps de fusion classique est de 16h et toute autre durée sera

spécifiée pour chaque expérience.

Dans le document MISE AU POINT DE THERAPIES ANTI-TUMORALES IMPLIQUANT DES VECTEURS PARVOVIRAUX ET LA FUSION DE CELLULES TUMORALES ET DENDRITIQUES (Page 122-127)