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Submitted on 22 May 2018
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Rôle de la SIRT3 et de la déacétylation des protéines mitochondriales dans la cardioprotection : effet du
vieillissement
Camille Villedieu
To cite this version:
Camille Villedieu. Rôle de la SIRT3 et de la déacétylation des protéines mitochondriales dans la cardioprotection : effet du vieillissement. Physiologie [q-bio.TO]. Université de Lyon, 2018. Français.
�NNT : 2018LYSE1017�. �tel-01797374�
N°d’ordre NNT : 2018LYSE1017
THESE de DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE LYON
opérée au sein de
l’Université Claude Bernard Lyon 1 Ecole Doctorale
ED 205Ecole Doctorale interdisciplinaire Sciences-Santé (EDISS) Spécialité de doctorat
: BiologieDiscipline
:Soutenue publiquement le 09/02/2018, par :
Camille Villedieu
Rôle de la SIRT3 et de la déacétylation des protéines mitochondriales dans la
cardioprotection : effet du vieillissement
Devant le jury composé de :
Van Coppenolle Fabien Pr. Université Claude Bernard, Lyon Président Angoulvant Denis PUPH. Université François Rabelais, Tours Rapporteur Garnier Anne PhD. Université Paris Sud, Paris Rapporteure Vergely Catherine Pr. Université de Bourgogne, Dijon Rapporteure Ovize Michel PUPH Université Claude Bernard Directeur de thèse Baetz Delphine PhD, Université Claude Bernard Co-directrice de thèse Gharib Abdallah PhD Université Claude Bernard Invité
UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1
Président de l’Université
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Vice-président du Conseil Formation et Vie Universitaire Vice-président de la Commission Recherche
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Directeur : M. le Professeur C. VITON
Directeur : M. le Professeur A. MOUGNIOTTE Directeur : M. N. LEBOISNE
R
Remerciements
Michel Ovize, merci tout d’abord de m’avoir accepté dans votre équipe. Merci pour votre implication et vos conseils pendant la thèse et votre disponibilité quand j’en ai eu besoin. Cela aura été un honneur de travailler dans votre équipe et sous votre direction, et de profiter de votre expertise dans notre domaine de recherche, qui aura permis de mener notre projet à terme.
Abdallah, tu m’as supervisée depuis le M2 et même après ta retraite. Tu m’as parlé la première fois de « tarte aux pommes » et de « tuer un lapin », mais après quelques jours de travail j’ai réussi à trouver un décodeur. Tu m’as formée, m’as transmis ta passion et ta rigueur scientifique, et tu t’es occupé de moi comme un papa poule. Entre engueulades et fous rires, tu as su me mettre des coups de pieds (littéralement) quand j’en ai eu besoin et me motiver avec des phrases mythiques (A. Gharib et al « Abdallahdes » 2016). Merci pour tous ces bons moments que nous avons partagés au labo, autours d’un verre, à Barcelone, et que nous continuerons de partager. Je te dois énormément et tout ce travail n’aurait pas été possible sans toi et j’espère avoir été un bon grain (j’ai pas tué le gardien !).
Delphine, merci d’avoir accepté de me prendre en stage lors de mon M2 et de m’avoir permis de continuer en thèse. Merci pour ta disponibilité, pour la formation que tu m’as prodiguée et pour ta gentillesse. Je te dois en partie ce travail et je t’en remercie sincèrement.
A mon jury de thèse, M. Denis Angoulvant, Mme. Anne Garnier et Mme Catherine Vergely, je vous remercie d’avoir accepté d’évaluer mon travail. Je vous remercie chaleureusement pour vos commentaires, vos corrections et conseils avisés et bienveillants que je m’emploierai à suivre.
Fabien, merci d’avoir accepté d’être président de mon jury, merci d’avoir participé au développement de ma passion pour la biologie en TP de L3 et d’avoir pu boucler la boucle en me permettant de moi-même y participer. Merci pour tous les cafés que tu m’as offerts, pour ces discussions et moments de partages que nous avons eus et qui m’ont touché.
Hubert Vidal, merci de m’avoir acceptée au laboratoire, de m’avoir permis de réaliser une thèse chez vous, merci de votre écoute et votre aide.
Noëlle, je te le dis depuis le début, tu es ma maman du labo. Tu m’as mise en confiance dès que j’ai mis le pied dans la pièce mito, et tu as toujours été là pour me consoler après les savons d’Abdallah (FCCP je ne t’oublierai plus jamais !). Je te remercie de tout mon cœur pour ta gentillesse,
ta patience, ton aide, ta formation aux mitos, et tous ces bons moments que nous avons passés ensemble dans le labo et à l’extérieur, et que nous continuerons évidemment à passer. Je t’embrasse fort ma petite Noëlle, et prends soins de tes nouveaux enfants du labo ;)
Mumu, tu as été ma psy attitrée et je t’en remercie du fond du cœur. Tu as été là aux moments où j’en avais besoin (« on est large !!! ») et tu m’as tellement fait rire (« Doux Jésus ! ») que tu m’as vraiment aidée à décompresser. Merci pour ta gentillesse, ton humour et ta patience. Je sais que même si je pars du labo nous resterons toujours en contact et continuerons cette belle amitié.
Claire, tu es pour moi un modèle et une véritable amie, et je te remercie pour tous les jolis moments que nous avons partagés. Tu m’as initiée au monde de l’inflammation et aux longues soirées du jeudi en salle de culture avec les macrophages! Ta gentillesse et ta bonne humeur ont été une réelle motivation pour moi et m’ont bien souvent permis de me changer les idées. Je te remercie du fond du cœur pour ton amitié et je sais qu’elle perdurera.
Bruno, merci pour toutes ces souris que tu m’as préparées, merci de ta disponibilité et ta gentillesse même quand tu es over-booké. Merci de ta bonne humeur continuelle, de tes chansons qui restent dans la tête ensuite (« j’ai touché le fond de la piscine… »), merci de m’avoir montré ton vrai visage en voiture, merci pour tes délicieuses tartes au citron meringuées, merci d’être à l’écoute… Merci de (“ Bonsoir !”) ton amitié tout simplement.
Nolwenn, tu es ma petite souris du labo, mon sergent Kinder, miss Haribo et autres sucreries ! J’ai passé de très jolis moments avec toi, tu as toujours été à l’écoute quand j’en avais besoin et nous avons beaucoup rigolé ! Je sais que nous partagerons pendant longtemps encore de jolies choses. Je te souhaite tout le meilleur pour la fin de ta thèse, et tu sais que tu pourras toujours compter sur moi. Merci d’avoir été une si géniale caméléon-sitter et comme promis, je n’ai pas pu le mettre dans ma présentation…
Sally, Zeina, Maya, je ne peux pas écrire ici tout le bien que je pense de vous, vous le savez déjà.
Merci pour votre profonde gentillesse, et merci de m’apprendre à parler Arabe, merci pour les recettes de cuisine et merci surtout pour votre amitié. B7ebkoun ktir w bchoufkoun be Lebnen Nsha’Allah ٚ
Christelle, merci d’être si mignonne et si gentille, merci pour ton aide avec le caméléon et tout simplement merci de ton amitié.
Alex, merci pour ta bonne humeur et ton franc parlé qui m’ont bien fait rire. Merci d’avoir fait l’effort de châtier ton langage en ma présence ٚ. Garde cette motivation, ça fait plaisir à voir.
Andréa, merci d’avoir été à l’écoute et de m’avoir appris de nouvelles expressions farfelues (« Vin diouss, c’est le pompon sur la pomponette de la Garonne… »). Merci pour ta gentillesse en toute circonstance.
Lionel, mon binôme de choc de processus qualité, je te remercie pour ta gentillesse et ton humour. Je n’ai pas énormément travaillé avec toi, mais ça a toujours été un plaisir ٝ
Christophe, nous n’avons pas eu l’occasion de travailler ensemble, mais je tiens à te remercier car tu as été un excellent enseignant pendant la licence et tu as vraiment su me transmettre ta passion ce qui a été un vrai moteur pour la suite. Tu as été pour moi un vrai exemple quand j’ai dû passer de l’autre côté pour enseigner. Merci pour ta bonne humeur, ton humour, tes conseils et ta franchise.
Gabriel, tu as toujours été disponible pour répondre à mes questions, avec en bonus ta bonne humeur et ta franchise. Merci pour tes formations éclaires dans le bureau, pour ta rigueur et pour ton écoute.
Lucille, tu as été là pendant une bonne partie de ma thèse, à l’écoute et toujours prête à en discuter en terrasse ! ٝ Je suis heureuse d’avoir pu partager ces moments avec toi, merci.
Yves, merci pour ton aide quand je suis arrivée, merci de m’avoir fait rire en pause-café et de m’avoir présenté Simon ! Tâche de faire du sport sans te blesser à l’avenir ٚ
Rania, tu sais très bien ce que je pense donc je ne vais pas m’étaler ici. Tu as été ma (2eme :P) plus belle rencontre dans ce laboratoire. Dès le premier jour on a accroché, et on ne s’est pas lâchées ٚ Merci pour tout sincèrement.
Olivier, merci d’avoir écouté nos jérémiades de chercheur, avec beaucoup de patience. Merci d’avoir été de bons conseils, et de tous les bons moments que nous avons passés et allons passer ensemble. Merci de ton amitié.
Jo, Sylvie, Mallory, Xavier, Margaux, Ludo, Mélanie, Thomas, Pascal, Sandrine, Hélène, René, Emmanuelle, Marlène, Violaine, Elisa, Justine, je n’ai pas eu l’occasion de travailler avec vous, mais
je vous remercie pour cette bonne ambiance au labo, qui ne serait pas la même sans vous aux pauses café. Merci d’avoir rendu la vie au laboratoire plus joyeuse.
Ribal, je te remercie de m’avoir soutenue chaque jour mais encore plus de m’avoir supporté, ce qui n’est pas toujours facile ٚ. Merci d’avoir su trouver les mots pour me calmer et me motiver quand j’en ai eu besoin, et de m’avoir accompagné dans les bons et les mauvais moments. Je t’aime.
A ma famille, merci de votre soutien, et de m’avoir épaulée quand j’en ai eu besoin, d’avoir écouté même quand vous ne compreniez rien et d’avoir été présents. Je vous aime.
RESUME
L’infarctus du myocarde est une des première cause de mortalité mondiale et l’amélioration de la prise en charge et des techniques de reperfusion ont permis une amélioration de la survie des patients. Les méthodes de cardioprotection se sont développées afin de limiter la taille d’infarctus après l’épisode d’ischémie reperfusion dans le but de limiter les effets délétères de l’infarctus du myocarde, tels que le remodelage ventriculaire et l’insuffisance cardiaque.
Dans notre étude, nous nous sommes particulièrement focalisés sur le rôle majeur de la mitochondrie dans les phénomènes de mort cellulaire associés à l’ischémie reperfusion. Au sein de la mitochondrie, notre cible principale était la sirtuine 3 (SIRT3), dont les modifications post- traductionnelles associées ont été montrées comme ayant un rôle potentiel dans la modulation de la mort cellulaire liée à l’ischémie reperfusion. Ainsi, dans la première partie de notre travail, nous avons pu mettre en évidence (1) la nécessité de la SIRT3 dans les mécanismes de cardioprotection chez les souris jeunes et (2) l’importance de la déacétylation par la SIRT3 de la cyclophiline D (CypD) dans la réussite de la cardioprotection.
Récemment, de nombreuses études précliniques ont mis en avant de nouvelles techniques de cardioprotection efficace chez différents modèles animaux, qui n’ont pourtant pas fait leur preuve lors de la transposition en étude clinique. Dans une seconde partie de notre travail, nous nous sommes attachés à comprendre une des raisons de ces différents échec cliniques, en nous appuyant sur le simple constat que les études précliniques sont réalisées sur des animaux jeunes, alors que l’infarctus du myocarde est une pathologie des personnes sénescentes. Nous avons ainsi étudié l’impact du vieillissement sur différentes méthodes de cardioprotection utilisées au laboratoire, et avons mis en évidence (3) des modifications mitochondriales impactant la déacétylation de la CypD en réponse aux techniques de cardioprotection chez les souris âgées. Cette étude nous a permis de
soulever un problème majeur des études précliniques, à savoir l’âge des modèles animaux utilisés par rapport à la pathologie étudiée.
Ce travail a donc permis de déterminer le rôle crucial de la déacétylation de la CypD et de la SIRT3 dans la cardioprotection, mais aussi de soulever la question de l’âge des modèles animaux avant de possibles transferts des avancées thérapeutiques en clinique humaine.
SOMMAIRE
LISTES DES FIGURES ... i
LISTE DE PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS ... iii
Publications ... iii
Communications ... iii
ABBREVIATIONS ... iv
INTRODUCTION ... 1
Chapitre 1 : Infarctus du myocarde et cardioprotection ... 3
I- Infarctus du myocarde... 4
A- Lésions d’ischémie ... 5
B- Lésions de reperfusion ... 8
C- La mort cellulaire au cours de l’ischémie reperfusion ... 12
II- Cardioprotection ... 16
A- Pré-conditionnement (PréC) ... 17
B- Post-conditionnement (PostC) ... 18
C- Voies de signalisation de la cardioprotection ... 20
1- La voie RISK (Reperfusion Injury Salvage Kinase) ... 21
2- La voie SAFE (Survivor Activating Factor Enhancement) ... 23
3- La voie du NO/cGMP/PKG ... 24
Chapitre 2 : Le rôle de la mitochondrie et du mPTP dans la cardioprotection ... 26
I- La mitochondrie ... 26
A- Structure ... 26
B- Fonctions ... 27
1- La phosphorylation oxydative (OxPhos) ... 27
2- La production de ROS ... 28
3- Le potentiel de membrane ... 29
4- L’homéostasie calcique ... 30
II- Le pore de transition de perméabilité mitochondrial (mPTP) ... 31
A- Structure ... 31
1- La cyclophiline D (CypD) ... 32
2- VDAC ... 32
3- ANT ... 33
4- Transporteur de phosphate inorganique ou Phosphate Carrier (PiC) ... 33
5- F1F0ATP synthase ... 34
6- Bax et Bak ... 35
B- Le mPTP et la physiologie cellulaire ... 35
C- Le mPTP et la mort cellulaire liée à l’ischémie reperfusion ... 37
D- Le mPTP dans la cardioprotection ... 39
Chapitre 3 : La Sirtuine 3 ... 41
I- Les sirtuines ... 41
A- Les sirtuines chez les mammifères ... 41
1- Localisation subcellulaire... 42
2- Dépendance au NAD+ ... 42
B- Activité enzymatique des sirtuines... 43
1- Déacétylation ... 43
2- ADP-ribosyltransférase ... 44
C- Fonctions générales des sirtuines ... 44
1- La régulation du cycle circadien et du cycle cellulaire ... 44
2- Le métabolisme mitochondrial ... 44
3- Le vieillissement ... 47
1- Restriction calorique et activité physique ... 48
2- Régulateurs pharmacologiques ... 49
II- La Sirtuine 3 ... 49
A- Localisation et expression ... 49
B- Mécanisme de déacétylation dans les mitochondries ... 50
C- Les principales cibles de la SIRT3 ... 51
D- Rôle de SIRT3 ... 56
1- SIRT3 dans le métabolisme énergétique et la production d’ATP ... 56
2- SIRT3 dans la modulation des ROS et du stress oxydant ... 57
3- SIRT3 dans l’apoptose ... 59
4- SIRT3 dans la biogénèse mitochondriale ... 60
E- Polymorphisme génétique de SIRT3 ... 60
III- SIRT3 et physiopathologie ... 61
A- SIRT3 dans les pathologies métaboliques ... 61
B- SIRT3 dans le cancer : rôle anti-tumoral ... 62
C- Pathologies neuro-dégénératives ... 63
1- Maladie de Huntington ... 63
2- Maladie de Parkinson ... 64
3- Maladie d’Alzeihmer... 64
D- SIRT3 dans les pathologies cardiovasculaires ... 64
1- SIRT3 et lésions d’ischémie reperfusion ... 64
2- SIRT3, hypertrophie et insuffisance cardiaque... 65
Chapitre 4 : Effets du vieillissement sur la fonction cardiaque ... 68
I- Effet du vieillissement sur le cœur ... 68
II- Effets du vieillissement sur la mitochondrie ... 69
B- Modifications fonctionnelles ... 70
Instabilité du génome mitochondrial ... 70
Production de ROS ... 71
OxPhos et métabolisme ... 71
Homéostasie redox ... 72
III- Vieillissement et cardioprotection ... 72
A- La cardioprotection au cours du vieillissement en pré-clinique ... 73
B- La cardioprotection en clinique ... 74
BUT DU TRAVAIL ... 77
MATERIELS ET METHODES ... 78
Animaux ... 78
Ischémie reperfusion in vivo ... 78
1- Protocole d’ischémie reperfusion ... 78
2- Protocole de postconditionnement ischémique ... 79
3- Protocole de postconditionnement CsA ... 79
4- Quantification de la zone de nécrose ... 79
Extraction des mitochondries cardiaques ... 80
Etude des fonctions mitochondriales ... 81
1- Capacité de rétention calcique (CRC) ... 81
2- Phosphorylation oxydative ... 82
Analyses biochimiques ... 83
1- Western Blot ... 83
2- Immunoprécipitation... 83
3- Dosage du NAD+ ... 84
RESULTATS ... 85
Discussion Article 1 : ... 95
Article 2 ... 100
Discussion Article 2 ... 122
RESULTATS SUPPLEMENTAIRES ... 125
I- Etude du postC et impact du vieillissement chez les souris 129Sv : rôle de la SIRT3 ... 125
A- Taille d’infarctus chez les souris WT et SIRT3 KO âgées ... 125
B- Activité déacétylase post-IR chez les souris WT et SIRT3 KO âgées ... 126
C- Activité déacétylase mitochondriale basale chez les souris WT et SIRT3 KO jeunes et âgées……….. ... 127
II- Impact du vieillissement sur les fonctions mitochondriales ... 130
III- Evaluation de l’impact d’un âge intermédiaire (6 mois) sur les fonctions mitochondriales basales………… ... 137
IV- Rétablir une activité déacétylase chez les souris âgées pour permettre la cardioprotection ? ... 139
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES ... 142
BIBLIOGRAPHIE ... 150
LISTES DES FIGURES
Figure 1: Schéma représentant les principales modifications au sein du cardiomyocytes au cours de l'ischémie. ... 8 Figure 2 : Graphique de la mortalité cellulaire a cours du temps lors d’une ischémie reperfusion..
... 9 Figure 3: Schéma résumant les principales modifications au sein du cardiomyocyte au cours de la reperfusion. ... 12 Figure 4 : Schéma non exhaustif représentant les différentes voies de mort cellulaire et leurs inter-connexions, au cours de l’ischémie reperfusion.. ... 16
Figure 5 : Schéma non exhaustif représentant les différentes voies de signalisation de la cardioprotection. ... 21
... 28 Figure 7 : Schéma représentant l’implication du mPTP dans les voies de mort cellulaire lors de l’ischémie reperfusion. ... 38
Figure 8 : Schéma résumant la synthèse du NAD+. ... 43 Figure 9 : Schéma représentant les principales cibles de la SIRT3 ainsi que les voies métaboliques associées. ... 59 Figure 10 : Schéma représentant le rôle de SIRT3 dans la physiopathologie de quelques organes.
... 62 Figure 11: Taille d'infarctus. ... 125 Figure 12: Evaluation de la fonction déacétylase post-IR chez les souris Wt et SIRT3 KO âgées. 126 Figure 13: Evaluation de l'activité déacétylase mitochondriale basale chez les souris WT et SIRT3 KO jeunes et âgées ... 127 Figure 14: Evaluation des fonctions mitochondriales basale au cours du vieillissement chez les souris WT et SIRT3 KO. ... 129
Figure 15: Evaluation de la CRC selon le fond génétique et l'âge des souris.. ... 132 Figure 16: Evaluation de la phosphorylation oxydative en fonction du fond génétique et de l’âge des souris.. ... 135 Figure 17: Quantification de l'expression de NDUFA9... 136 Figure 18: Evaluation des fonctions mitochondriales basale chez des souris d'âge intermédiaire (6 mois). ... 137
Figure 19: Tableau récapitulatif de la quantification de l'expression des différentes protéines d'intérêt dans nos groupes expérimentaux en fonction de l'âge. ... 138
Figure 20: Etude de la supplémentation en NAD+.. ... 141
LISTE DE PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS
Publications
No de-acetylation of Cyclophilin D in response to postcondtionning in mice ageing heart. Villedieu C, Pillot B, Harisseh R, Augeul L, Harhous Z, Bochaton T, Gallo-Bona N, Al-Mawla R, Gharib A, Ovize M
& Baetz D. (Submitted)
Acute induction of translocon-mediated calcium leak from longitudinal sarcoplasmic reticulum protects cardiomyocytes against ischemia/reperfusion injuries. Al-Mawla R, Bidaux G, Païta L, Pillot B, Villedieu C, Bonvallet R, Ovize M, Ducreux S, Van Coppenolle F. (Under revision)
Inhibition of PIKfyve prevents myocardial apoptosis and hypertrophy through activation of SIRT3 in obese mice. Tronchere H, Cinato M, Timotin A, Guitou L, Villedieu C, Thibault H, Baetz D, Payrastre B, Valet P, Parini A, Kunduzova O, Boal F. EMBO Mol Med. 2017 Jun;9(6):770-785.
Cyclophilin D Modulates the Cardiac Mitochondrial Target of Isoflurane, Sevoflurane, and Desflurane. Harisseh R, Chiari P, Villedieu C, Sueur P, Abrial M, Fellahi JL, Ovize M, Gharib A. J Cardiovasc Pharmacol. 2017 May;69(5):326-334.
Inhibition of myocardial reperfusion injury by ischemic postconditioning requires sirtuin 3- mediated deacetylation of cyclophilin D. Bochaton T, Crola-Da-Silva C, Pillot B, Villedieu C, Ferreras L, Alam MR, Thibault H, Strina M, Gharib A, Ovize M, Baetz D. J Moll Cell Cardiol. 2015 Jul;84:61-9.
Communications
2017 EDISS oral, prix meilleure communication (Lyon): Echec du postconditionnement chez les souris âgées : rôle de l’acétylation des protéines et des sirtuines mitochondriales.
2017 GRRC poster (Nantes): SIRT3-dependent ischemic postconditioning fails at reducing infarct size in old mice.
2016 ARC oral (Lyon): Rôle de l’ischémie reperfusion cardiaque au cours du vieillissement 2015 ISHR poster (Bordeaux): Role of SIRT3 in cardioprotection and evolution with aging
2015 GRRC poster et oral (Toulouse): Role of SIRT3 in cardioprotection and evolution with aging 2015 IANA oral (Barcelone): Aging effect on mitochondrial functions in the cardiac protection: role of SIRT3
2015 Exposition Universelle (Milan): Rédaction de la charte de la jeunesse scientifique de Rhône- Alpes Auvergne
2015 ARC poster (Lyon) : Effet du vieillissement sur les fonctions mitochondriales dans la cardioprotection : rôle de SIRT3
ABBREVIATIONS
'<m : Potentiel de membrane mitochondrial Δp : Gradient électrochimique
ΔpH : Gradient de protons
AceCS2 : Acétyl CoA synthétase 2 AD : Alcool déshydrogénase ADNmt : AND mitochondrial ADP : Adénosine Di Phosphate AMPK : AMP Kinase
ANT : Adenine nucleotide translocator
APAF-1 : Apoptotic Protease Activating Factor 1 ATP : Adénosine Tri Phosphate
BMAL1 : Brain and muscle Arnt-like protein-1 BSA : Bovine serum albumine
CRC : Capacité de rétention calcique
CREB : Cyclic AMP response element binding protein CsA : Cyclosporine A
CypD : Cyclophiline D Cyt.c : Cytochrome c
DISC : Death inducing signaling complex eNOS : NO synthase
ERK : Extracellular signal-regulated kinase ETC : Chaîne de transport d’électrons
FADH2 : Flavine Adénine Dinucléotide
FCCP : Carbonyl cyanide-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone FOX : Forkhead Box
GDH : Glutamate déshydrogénase GLUT4 : Glucose transporter GMP : Glutamate malate pyruvate GPx : Glutathion peroxydase GSH : Glutathione réduit
GSK3β : Glycogen synthase kinase GSSG : Glutathione oxydé
HADH : Hydroxyl-CoA déshydrogénase HIF1α : Hypoxia inducible factor α HK2 : Hexokinase 2
HMGCS2 : HydroxylméthylglutarylCoA synthase 2
HMGCS2 : Mitochondrial 3-hydroxy3-methylglutaryl CoA synthase 2 HSP70 : Heat shock protein 70
ICDH2 : Isocitrate déshydrogénase 2 IV : Intraveineuse
IVA : Artère inter-ventriculaire antérieure JAK : Janus Kinase
LCAD : Long-chain acyl-CoA deshydrogénase Letm1 : échangeurs Ca2+/H+
LKB1 : Liver Kinase B1 MAO : Mono amine oxydase
MAP : Mitogen-activated protein MCoAD : Malonyl CoA decarboxylase MCU : Mitochondrial Calcium Uniporter MEF : Mouse embryonic fibroblast
MnSOD ou SOD2 : Mitochondrial manganese superoxyde dismutase mPTP : pore de transition de perméabilité mitochondrial
MRPL10 : Mitochondrial ribosomal protéine L10 NAAD : Acide nicotinique adénine dinucléotide NADH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide
NADP : Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate NAMN : Acide nicotinique mononucléotide
Nampt : Nicotinamide phosphorybaosyltransférase NCLX : échangeur Ca2+/Na+
NMN : Nicotinamide mononucléotide
Nmnat : Nicotinamide mononucléotide adénylyltransférase NO : Oxyde nitrique
Npt : Acide nicotinique phosphorybosyltransférase OPA1 : Mitochondrial Dynamin Like GTPase OSCP : Oligomycin sensitivty conferring protein OTC : Ornithine transcarbamoylase
OxPhos : Phosphorylation oxidative PARP : Poly ADP-Ribose Polymérase PDH : Pyruvate déshydrogénase PDH : Pyruvate déshydrogénase
PDK : Kinase phospholipide dépendante
PGC1α : Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha Pi : Phosphate inorganique
PI3K : Phosphoinositide 3 kinase
PiC : Phosphate carrier ou Transporteur de Pi PKC : Protéine kinase C
PKG : Protéine kinase G PostC : Post-conditionnement
PostC-D : Post-conditionnement à distance PostC-I : Post-conditionnement ischémique PostC-P : Post-conditionnement pharmacologique PPIase : Peptitdyl-prolyl cis-trans isomérase PréC : Pré-conditionnement
PréC-I : Pré-conditionnement ischémique RC : Restriction calorique
RCI : Indice de couplage respiratoire RCPG : Récepteur couplé aux protéines G RISK : Reperfusion injury salvage kinase ROS : Espèces réactives de l’oxygène Rot : Roténone
SAFE : Survivor activating factor enhancement SDH : Succinate déshydrogénase
sGC : Guanylate cyclase
Sir2 : Silent information regulator
SIRT : Sirtuine
SNP : Single nucleotide polymorphism
STAT3 : Signal transducer and activator of transcription TAC : Trans-aortic constriction
TGFβ1 : Transforming Growth Factor β1 TMPD : Tétraméthyle phénylène diamine TNFα : Tumor Necrosis Factor alpha
TRADD : TNF-receptor-associated death domain TRAF : TNF-receptor-associated factor
TTC : Chlorure de triphényltétrazolium VDAC : Voltage-dependent anion channel VG : Ventricule gauche
VTNR : Variant Number Tandem Repeat
INTRODUCTION
L’infarctus du myocarde est une des premières causes de mortalité mondiale, et bien que la prise en charge des patients ait été améliorée, l’incidence de la pathologie augmente dans les pays industrialisés, qui présente une population vieillissante, des habitudes alimentaires néfastes et une augmentation de la sédentarité. Des méthodes ont été mises au point afin de limiter les effets délétères de l’infarctus du myocarde, qu’on regroupe sous le terme « cardioprotection ». Le principal but de la cardioprotection est de réduire la taille d’infarctus suite à une ischémie reperfusion. En effet, il a été démontré que le taux de survie et de récupération des patients était inversement proportionnel à la taille de l’infarctus. Les travaux de notre laboratoire s’appliquent donc à déterminer des cibles thérapeutiques afin de limiter la taille d’infarctus dans le but d’améliorer le taux de survie des patients après un infarctus du myocarde ainsi qu’à limiter les effets délétères à long terme. Depuis plusieurs décennies, le domaine de la cardioprotection s’intéresse aux voies de signalisation impliquées dans la protection du myocarde suite à l’ischémie et au rôle central de la mitochondrie dans les mécanismes de mort et de survie cellulaire.
Dans ce travail, nous nous sommes penchés sur le rôle prépondérant de la mitochondrie lors d’un infarctus du myocarde, ainsi que comme effecteur final des voies impliquées dans la cardioprotection. La cyclophiline D (CypD) est une enzyme de la matrice mitochondriale, régulant l’activité d’un méga canal de la membrane interne de la mitochondrie, le pore de transition de perméabilité mitochondrial (mPTP). L’ouverture du mPTP est impliquée dans le déclenchement de voies de mort cellulaires lors d’une ischémie reperfusion et est une cible majeure des stratégies de cardioprotection, notamment via l’inhibition de la CypD. Il a été montré que la sirtuine 3 (SIRT3), déacétylase mitochondriale, était responsable entre autres, de la déacétylation de la CypD. La CypD sous forme déacétylée est limitée dans sa faculté à fixer le mPTP et donc à favoriser son ouverture et la mort cellulaire. De plus, le rôle de la SIRT3 a été mis en évidence dans différentes pathologies liées au vieillissement, notamment les pathologies cardiovasculaires. Nous avons utilisé des souris SIRT3
KO ainsi que leurs contrôles WT de fond génétique 129Sv, afin d’étudier dans un premier temps le rôle de la SIRT3 dans les fonctions mitochondriales basales et son rôle dans la réussite du post- conditionnement ischémique. Nous avons également testé dans ce modèle les effets protecteurs de la cyclosporine A (CsA) en post-conditionnement, molécule de référence dans l’inhibition de l’ouverture du mPTP. Afin d’élucider l’effet potentiel du vieillissement sur ces méthodes de cardioprotection, nous avons utilisé des souris jeunes de 2 mois et des souris âgées de plus de 12 mois. Sachant également que le fond génétique des souris n’est absolument pas représentatif de la diversité génétique humaine, nous avons comparé deux souches de souris différentes, C57Bl/6 et 129Sv/Ej.
Chapitre 1 : Infarctus du myocarde et cardioprotection
Les pathologies ischémiques myocardiques sont une des principales causes de mortalités dans les pays industrialisés. Le principal objectif des axes de recherche au sein de notre laboratoire est de trouver des cibles thérapeutiques afin de limiter les lésions provoquées par cette pathologie, dans le but d’augmenter le taux de survie des patients ainsi qu’améliorer la récupération de la fonction cardiaque à long terme.
Afin de comprendre la physiopathologie de l’ischémie reperfusion, il est nécessaire de revenir en substance sur la physiologie des cardiomyocytes, cellules musculaires cardiaques, en condition saine.
La fonction des cardiomyocytes dépend de leur organisation en réseau de cellules connectées physiquement et électriquement, permettant la propagation de potentiels d’action et de la force contractile développée. L’organisation et la structure du myocarde permettent une transmission efficace des potentiels d’action et de la force contractile, à l’origine de l’efficacité de la fonction cardiaque (Buckberg et al., 2001).
Le cœur est un organe particulièrement demandeur en énergie, ce qui explique que les cardiomyocytes soient si riches en mitochondries (30% du volume des cardiomyocytes (Murphy and Steenbergen, 2007)). Comme toutes les cellules, l’énergie utilisée est nécessaire pour le maintien de l’homéostasie cellulaire. Les cardiomyocytes utilisent une quantité d’ATP très importante afin de maintenir l’activité contractile du cœur et ceci en continu (Davies, 1977). De plus cette production d’énergie doit être très facilement modulable en fonction des besoins de l’organe, qui doit s’adapter aux besoins de l’organisme. Dans les cardiomyocytes normoxiques (à l’état physiologique non hypoxique), la production d’ATP dépend de la disponibilité en ADP et de la régulation de l’ATP synthase. Cette régulation de la production d’ATP assure une fourniture d’énergie adéquate, permettant de maintenir la fonction contractile du cœur en adéquation avec les besoins de l’organisme (Carmeliet, 1999; Das, 1998).
Le métabolisme énergétique du myocarde est majoritairement basé sur le métabolisme des acides gras (Opie, 1991). Le mécanisme de la β-oxydation des acides gras au niveau de la mitochondrie permet la production d’environ 60% de l’ATP produit en 24h (Lacolley, 2007). D’autre part, le glucose est responsable de 30% de cette production et les substrats mineurs, tels que le lactate, les corps cétoniques et les acides aminés sont responsables de moins de 10% de cette production. Toutefois, ces valeurs ne sont que des estimations moyennes, puisque le métabolisme varie en fonction de l’état nutritionnel et neuro-humoral.
La fonction cardiaque nécessite donc un apport en oxygène et en nutriments ininterrompu, assuré par la circulation coronaire, car seul le métabolisme aérobie permet la production d’ATP nécessaire au bon fonctionnement du myocarde. Le myocarde est perfusé par trois artères coronaires principales, antérieure gauche descendante, droite et circonflexe, qui perfusent chacune un territoire distinct du myocarde, et par un réseau capillaire extrêmement dense.
I- Infarctus du myocarde
L’infarctus du myocarde est dû à une limitation voire à une interruption du flux sanguin au niveau de la circulation coronaire, conduisant à une inadéquation entre les besoins en énergie et en O2 de l’organe et la fourniture de ceux-ci. Cela induit ainsi une phase ischémique privant la zone irriguée par cette artère de l’oxygène et des nutriments nécessaires à la survie et au fonctionnement cellulaire. Cette ischémie va être à l’origine de dégâts cellulaires, eux-mêmes responsables d’une dysfonction contractile dont l’importance et la réversibilité dépend du temps et de la sévérité de l’ischémie. Il a été montré qu’une ischémie de plus de 30 minutes chez le porc et l’homme provoque des dommages irréversibles (Spinale et al., 1989) qui s’accompagnent d’une dysfonction contractile majeure. La restauration du flux sanguin s’avère cruciale afin de sauver le myocarde. Plusieurs méthodes ont été développées afin de restaurer le flux sanguin, comme l’angioplastie coronaire, le
bypass coronaire ou les traitements thrombolytiques qui consistent globalement à éliminer de façon mécanique ou pharmacologique le thrombus, ou à contourner la sténose artérielle. Ces techniques permettent de stopper les dommages qui apparaissent au cours de la phase ischémique en permettant la reperfusion. Toutefois, paradoxalement, cette phase de reperfusion, bien que nécessaire, entraine la survenue d’autres lésions qui aggravent celles développées lors de la phase ischémique. Ces lésions spécifiques à la phase de reperfusion sont appelées lésions de reperfusion, et constituent une fenêtre d’action thérapeutique non négligeable dans la diminution de la taille d’infarctus. En effet, l’ensemble des lésions ischémiques et des lésions de reperfusion forment les lésions d’ischémie-reperfusion et donc déterminent la taille d’infarctus finale, dont il a été montré qu’elle est directement corrélée à la survie du patient (Bolli et al., 2004; Yellon and Hausenloy, 2007).
A- Lésions d’ischémie
L’occlusion d’une artère coronaire provoque l’ischémie d’un territoire du myocarde et la zone normalement irriguée par cette artère délimite ce qu’on appelle la zone à risque. Le myocarde nécessite un flux énergétique très élevé pour maintenir sa fonction, or au moment de l’ischémie, la demande en oxygène et en nutriments excède rapidement les apports. En effet, il a été montré que la quasi-totalité de l’ATP du myocarde était consommé dans les 40-60min après le début de l’ischémie (Marban et al., 1994). Dans ce contexte, l’ischémie affecte de façon dramatique la physiologie des cardiomyocytes et donc la fonction cardiaque (Reimer et al., 1977).
L’ischémie modifie brutalement la physiologie cellulaire et entraine une séquence d’évènements qui finalement conduira à la mort des cardiomyocytes. Au sein de cette zone à risque le myocarde et les cellules qui le composent subissent des processus de mort cellulaire, qui croissent avec la durée de l’ischémie et qui délimite une région appelée zone nécrosée. La zone nécrosée commence à se développer à partir d’une vingtaine de minutes d’ischémie chez l’homme. Cette durée est variable selon l’espèce, la région du myocarde touchée, et la sévérité de l’ischémie. Pendant ce temps, les
cellules cardiaques meurent en vague, commençant dans le sous-endocarde puis se propageant à- travers l’épicarde (Reimer et al., 1977). L’ischémie cardiaque a des conséquences irréversibles sur la fonction cardiaque car les cardiomyocytes sont des cellules qui ont un potentiel de régénération quasiment nul. De ce fait, chaque cardiomyocyte perdu, sera remplacé par du tissu fibreux qui ne participera plus à la fonction contractile du cœur.
L’ischémie entraine une modification du métabolisme énergétique des cardiomyocytes. Les effets de l’ischémie du myocarde sur l’environnement intracellulaire des cardiomyocytes ont été largement décrits. Seront détaillés dans cette partie les évènements clés résultant de l’ischémie myocardique au niveau des cardiomyocytes (pour résumé, voir figure 1) :
- Accumulation d’ADP et de Phosphate inorganique (Pi) : Ne pouvant plus synthétiser l’ATP à partir du métabolisme aérobie, les cardiomyocytes passent à un métabolisme anaérobie de type glycolytique dans les 30 secondes suivant l’occlusion de l’artère coronaire (Davies, 1977;
Jennings and Reimer, 1981). Toutefois, le rendement de production d’ATP n’est pas aussi efficace qu’en condition aérobie, ce qui implique que les cellules ne peuvent plus produire la quantité d’ATP nécessaire afin de maintenir l’homéostasie cellulaire et la fonction cardiaque normale. A terme, cela provoque une série de modifications cytosoliques et mitochondriales, incluant l’accumulation d’ADP et de Pi.
- Acidification intracellulaire : L’acidification intracellulaire (pHi ≤7.2) se produit principalement par l’accumulation de lactate et l’hydrolyse de l’ATP (5.8 ≤ pHi ≤ 6.0). Lors de la glycolyse anaérobie, le pyruvate est réduit en lactate par la lactate déshydrogénase, dans un processus qui produit des protons (ions H+). Les ions H+ en excès sont excrétés par l’échangeur Na+/H+, provoquant ainsi une accumulation de Na+ (Pike et al., 1993).
L’accumulation des protons est ensuite exacerbée par l’hydrolyse de l’ATP qui libère le Pi et des H+. L’effet cumulatif du lactate et des protons entraine une acidification progressive du
cytosol et de la matrice mitochondriale. Ce phénomène conduit également à l’inhibition des enzymes de la glycolyse, diminuant encore plus le rendement de production d’ATP (Jennings and Reimer, 1981). L’accumulation des protons ajoutée à la réduction de l’apport en ATP peuvent altérer de nombreuses voies de signalisation notamment, l’inhibition des canaux voltage et ATP dépendant responsables de l’homéostasie calcique dans les cardiomyocytes, (Carmeliet, 1999; Manning and Hearse, 1984).
- Surcharge calcique : L’accumulation des protons peut aussi être à l’origine d’une surcharge calcique dans les cardiomyocytes. Le mécanisme à l’origine de cette accumulation de calcium se ferait via les échangeurs d’ions (essentiellement l’échangeur Na+/H+ et le cotransporteur Na+-HCO3-) qui s’activent afin de rétablir le pHi. La forte concentration en protons entraine donc une accumulation de sodium intracellulaire (Kloner and Jennings, 2001; Manning and Hearse, 1984). A cet égard, les modifications concernant la régulation des ions H+ et Na+ sont particulièrement importantes puisqu’elles peuvent influencer l’homéostasie calcique intracellulaire et par conséquent l’activité contractile des cellules cardiaques. L’activation des systèmes membranaires dépendant du sodium, en absence de fonctionnement normal de la Na+/K+ ATPase, entraîne une diminution du gradient sodique transmembranaire ; la concentration de sodium intracellulaire ([Na+]i) sous-membranaire augmente. La force motrice (= le gradient sodique transmembranaire) de l’échange Na+/Ca2+ est diminuée. Ceci a pour conséquence la baisse d’activité de l’échangeur Na+/Ca2+, voire son fonctionnement en mode inverse, c’est à dire une entrée de Ca2+ dans la cellule et une augmentation excessive du calcium diastolique (Tani and Neely, 1989). Il y a aussi d’autres acteurs des perturbations de la concentration calcique pendant l’ischémie. La surcharge calcique intracellulaire accélère les interactions entre les protéines contractiles, ce qui augmente encore la demande en énergie et aggrave la déplétion énergétique des cardiomyocytes. De plus, la modification de l’homéostasie calcique provoque des modifications des voies de signalisations impliquant
le calcium, délétère pour la cellule. La mitochondrie capte le calcium du cytoplasme via le MCU (mitochondrial calcium uniporter ) et se retrouve elle aussi surchargée de calcium (Kristián and Siesjö, 1998).
Switch métabolique
Oxydatif Glycolytique
Diminution production ATP Accumulation ADP et Pi
Accumulation lactate et H+
Accumulation Na+ Perte potentiel de
membrane
Inversion échangeur Na+/Ca2+
Acidification intracellulaire Canaux voltage et ATP dép.
Altération homéostasie calcique Accumulation Ca2+
cytosolique Accumulation Ca2+
mitochondriale Modification voies
signalisation
méta
pro
hom
ulati
ATP
Accumulation la
at n éc mbr
hondria
Acid Can Ca2+ Al
ale alisation
ale
Na+/H+ tion ADP et Pi
Accumula n intracellulaire
tion
n int ula
sie
+
Figure 1: Schéma représentant les principales modifications au sein du cardiomyocytes au cours de l'ischémie.
B- Lésions de reperfusion
La désocclusion coronaire permet de rétablir rapidement le flux sanguin dans la zone ischémiée, c’est ce qu’on appelle la reperfusion. Bien que nécessaire afin de sauver le tissu ischémié, la reperfusion du myocarde entraine paradoxalement un aggravement des désordres cellulaires provoqués lors de l’ischémie. Le temps d’ischémie détermine l’étendue des principales modifications intracellulaires et ainsi les lésions de reperfusion a posteriori (Davies, 1977). Les lésions de reperfusion sont des lésions de gravité variable des cardiomyocytes qui avaient souffert auparavant, au moment de l’ischémie (Braunwald and Kloner, 1985; Kloner, 1993). Dans certaines circonstances, il a été suggéré que les lésions de reperfusion pouvaient être à l’origine de 30 à 50% de la taille d’infarctus finale. La délimitation précise entre lésion ischémique et de reperfusion reste toutefois
difficile, puisque la gravité des lésions de reperfusion est dépendante de la phase ischémique (figure 2). La reconnaissance de l’importance de ces lésions de reperfusion dans la taille de l’infarctus a permis des études poussées sur le sujet, afin de déterminer les voies de signalisations mises en jeu au cours de la reperfusion, dans le but de découvrir des cibles thérapeutiques contre l’apparition de ces lésions (Garcia-Dorado et al., 2009).
Figure 2 : Graphique de la mortalité cellulaire a cours du temps lors d’une ischémie reperfusion. Lors de la phase ischémique se développent les lésions ischémiques entrainant la mort des cellules (zone bleue). Si cette ischémie n’est pas stoppée, la mort cellulaire va atteindre jusqu’à 100% des cellules de la zone concernée (courbe pointillée). Dans le cas d’une reperfusion, la mortalité cellulaire augmente, du fait des lésions de reperfusion, puis se stabilise (zone rouge). L’ensemble de la mortalité cellulaire provoquée par les lésions ischémiques et les lésions de reperfusion déterminent la taille d’infarctus finale (zones rouge et bleue). Adapté de (Hausenloy and Yellon, 2013).
Seront décrites ici les altérations cellulaires provoquées par la reperfusion (pour résumé voir figure 3) :
- Production rapide d’ATP : La restauration rapide du flux sanguin et le retour de l’oxygène permettent le retour au métabolisme aérobie. La production d’ATP peut ainsi augmenter et
répondre à la demande énergétique du cœur, permettant ainsi le fonctionnement des enzymes ATP-dépendantes. Ceci entraine une élimination du lactate et un retour au pHi physiologique. Toutefois, ce retour rapide à la normale pourrait être la cause d’hyper- contractures (Piper and García-Dorado, 1999).
- Gonflement osmotique et œdème : Lors de l’ischémie, l’accumulation des produits du métabolisme anaérobie entraine une augmentation de la pression osmotique, accentuée par la perte du potentiel transmembranaire (Garcia-Dorado et al., 2012). Ceci entraine un gonflement des cardiomyocytes, dû à l’arrivée massive du sang dans le myocarde (Braunwald and Kloner, 1985). La régulation homéostasique du gonflement cellulaire provoque un efflux de sodium ainsi qu’un influx de calcium, aggravant le phénomène de surcharge calcique (Hoffman et al., 2004). De plus, il a été montré qu’un gonflement cellulaire excessif peut aussi être à l’origine de la mort cellulaire (Kloner, 1993).
- Surcharge calcique : La concentration calcique intracellulaire est à la fois importante dans la survie du cardiomyocyte et dans sa fonction durant la reperfusion. Après une ischémie modérée, l’homéostasie cellulaire dépendant de l’ATP qui se remet en place au moment de la reperfusion et permet de rétablir la concentration calcique à son niveau pré-ischémique et ainsi de préserver la survie et la fonction contractile cellulaire (Braunwald and Kloner, 1985).
Après une ischémie plus sévère, les lésions de la membrane cellulaire combinées avec la régulation homéostasique en réponse au gonflement cellulaire entrainent une surcharge calcique intracellulaire et intra-mitochondriale via le MCU, provoquant la mort cellulaire (Crompton and Costi, 1988; Vermeiren et al., 2000). Le phénomène de mort cellulaire causé par la surcharge calcique mitochondriale sera développé plus en détail.
La surcharge calcique associée à la restauration rapide du pHi peut provoquer une contraction excessive des cardiomyocytes, ce qu’on appelle hyper-contracture, qui, si elle se
prolonge, peut provoquer la mort cellulaire par une fragilisation de la membrane plasmique.
Ce phénomène provoque également la mort des cellules adjacentes par des altérations mécaniques et la mise en contact de fortes concentrations calciques (Hoffman et al., 2004;
Piper and García-Dorado, 1999).
- Accumulation de ROS : Le taux de ROS (espèces réactives de l’oxygène), particulièrement l’anion supeorxide (mais aussi des ions hydroxyls, et le peroxynitrite), est augmenté lors de la phase de reperfusion, de par la présence d’oxygène, associée à une dysfonction de la chaine respiratoire et une défaillance des défenses anti-oxydantes. Cette production de ROS serait également due à l’accumulation de succinate lors de la phase ischémique, du fait de l’inversion de l’activité de la succinate déshydrogénase. En effet, lors de la reperfusion, le succinate est rapidement oxydé par la succinate déshydrogénase de la chaine respiratoire et entraine la production excessive de ROS par le rétro-transport d’électrons du complexe II au complexe I (Chouchani et al., 2014). L’accumulation des ROS est exacerbée par l’élimination des défenses anti-oxydantes par le retour du flux sanguin lors de la reperfusion, ainsi que par la production des ROS des cellules inflammatoires s’infiltrant dans le myocarde (Braunwald and Kloner, 1985). Les dommages oxydatifs (peroxydation lipidique, dénaturation protéique, altération de l’ADN…) provoquées par les ROS peuvent engendrer la mort cellulaire, en plus des effets spécifiques au niveau mitochondrial qui seront discutés plus tard.
Switch métabolique
Oxydatif Glycolytique
méta
Production ATP Fonction canaux ATP dép.
Elimination lactate Retour pH physiologique
Accumulation Ca2+
cytoplasmique Gonflement osmotique
Efflux Na+ Influx Ca2+
Hyper-contracture Fragilisation membranes
Mort cellulaire Accumulation Ca2+
mitochondriale Production ROS
Peroxydation lipides Dénaturation protéines
Altération ADN
Inflammation
ctio anau tion phy ulati
cont F
Mort cell A
Inflamm olytique
on ROS Glyco
TP Productio
olyt ctio
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Mort cell nt osmotique
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Fon
Re
Figure 3: Schéma résumant les principales modifications au sein du cardiomyocyte au cours de la reperfusion.
C- La mort cellulaire au cours de l’ischémie reperfusion
Les principales voies de mort cellulaire connues sont la nécrose et l’apoptose (Kroemer et al., 2009). Historiquement, l’apoptose était considérée comme la forme de mort cellulaire régulée, alors que la nécrose était décrite comme un mécanisme passif et non régulé. L’autophagie d’autre part, est considérée comme un mécanisme de survie cellulaire, permettant un recyclage des protéines et des organites en conditions délétères (Levine and Kroemer, 2008) qui, lorsqu’il est dépassé, conduit lui aussi à la mort cellulaire. L’ensemble des mécanismes décrits est brièvement résumé dans la figure 4.
La nécrose
La nécrose se caractérise par un gonflement cellulaire et des organites, la rupture de la
et non régulé. Bien que la nécrose joue un rôle important dans l’infarctus du myocarde, la plupart des études sur la mort cellulaire se sont penchées sur l’apoptose. Une des voies mise en jeu dans le phénomène de nécrose impliquerait l’ouverture du mPTP situé dans la membrane interne de la mitochondrie. Il a également été montré que la stimulation des récepteurs de mort en présence d’inhibiteurs de caspase pouvait provoquer une mort cellulaire par nécrose (Holler et al., 2000;
Kitanaka and Kuchino, 1999; Matsumura et al., 2000). Bien que les connaissances à ce sujet méritent d’être développées, deux types d’évènements majeurs peuvent provoquer la nécrose : la stimulation des récepteurs de mort lors de la nécroptose, et l’ouverture du mPTP. La rupture de la membrane plasmique est un évènement important de la mort cellulaire par nécrose. Cette rupture pourrait être facilitée par les calpaïnes (protéases dépendantes du Ca2+) ou d’autres protéases du cytosquelette.
De plus, la déplétion de l’ATP inhiberait les pompes ioniques de la membrane plasmique, provoquant le gonflement cellulaire et conduisant à terme à la rupture de la membrane plasmique (Murphy and Steenbergen, 2008). En amont de ces phénomènes, une augmentation de la concentration calcique plasmatique a été observée lors de l’ischémie et des premières minutes de la reperfusion. Cette augmentation calcique serait à l’origine de l’activation des calpaïnes, pouvant être impliquées dans le clivage de protéines conduisant à la rupture membranaire. L’augmentation de la concentration calcique cystosolique provoquerait également une augmentation de la concentration calcique mitochondriale, responsable en grande partie de l’ouverture du mPTP (Murphy and Steenbergen, 2008).
Le mécanisme de mort cellulaire associé à l’ouverture du mPTP sera détaillé dans le chapitre Mitochondries.
L’apoptose
L’apoptose est un mécanisme clairement défini dans lequel l’activation finale des protéases de la famille des caspases provoque la mort cellulaire (Earnshaw et al., 1999). De la même manière que
cardiomyocytes. Les caspases sont synthétisées sous forme inactive de pro-caspase dans le cytosol.
Une fois la voie des caspases activée, les caspases initiatrices (caspases 2, 8, 9 et 10) clivent les caspases effectrices (caspases 3 et 7). Cela entraine l’inactivation de l’enzyme poly ADP-ribose polymérase (PARP), provoquant la fragmentation de l’ADN par les endonucléases activées par les caspases (van Gurp et al., 2003). On décrit généralement deux voies de mort par apoptose :
- La voie extrinsèque de l’apoptose est stimulée par la liaison du Tumor necrosis factor α (TNFα) et de Fas à leurs récepteurs spécifiques, exprimés à la surface des cellules. Ce phénomène provoque ensuite la liaison de différents adaptateurs à la face cytosolique des récepteurs, comme TNF-receptor-associated death domain (TRADD) et TNF-receptor- associated factor (TRAF) (Hsu et al., 1996). Ce complexe multi-protéique, death inducing signaling complex (DISC) lie ensuite la pro-caspase 8. Celle-ci serait ensuit clivée et activée en caspase 8, entrainant ainsi l’activation de caspases effectrices comme la caspase 3.
- La voie intrinsèque mitochondriale serait activée par une grande variété de stimuli extracellulaires, comme les altérations de l’ADN, le stress oxydant ou les altérations mécaniques. L’équilibre entre les facteurs pro-apoptotiques (Bid, Bax, Bak) et anti- apoptotiques (Bcl-2 et Bcl-xL), membres de la famille des protéines Bcl-2, joue un rôle crucial dans l’amorçage de cette voie de mort cellulaire (Youle and Strasser, 2008). Il a été décrit qu’une fois stimulé, Bax se transloque vers la mitochondrie et forme un complexe avec Bak à la membrane interne de la mitochondrie et entraine la libération du cytochrome c (Cyt. c) et d’autres protéines pro-apoptotiques dans le cytosol (Zou et al., 1999). Dans le cytosol, le Cyt.
c interagit avec Apoptotic Protease Activating Factor 1 (APAF-1), formant un complexe appelé apoptosome. Ce complexe active ensuite la caspase 9, entrainant l’activation conséquente des caspases 3 et 7 et ainsi la fragmentation de l’ADN et la mort cellulaire (Boatright and Salvesen, 2003).
L’autophagie
L’autophagie est un mécanisme physiologique mis en jeu afin d’éliminer les organites endommagés, tels que les mitochondries ou le réticulum endoplasmique. Une autophagie trop importante serait à l’origine de phénomènes de mort cellulaire. Toutefois, le rôle de l’autophagie lors de l’ischémie reperfusion reste encore débattu. Certaines études démontrent que l’inhibition de l’autophagie durant l’ischémie est délétère, suggérant donc un rôle bénéfique de la stimulation de l’autophagie lors de l’ischémie reperfusion (Dosenko et al., 2006; Yan et al., 2005). D’autres études montrent au contraire, qu’une diminution de la protéine beclin1 qui stimule l’autophagie, limite le phénomène d’autophagie et ainsi la mort cellulaire dans un modèle de souris beclin 1 +/- (Takagi et al., 2007).
Le rôle bénéfique ou néfaste de l’autophagie lors de l’ischémie reperfusion reste donc à éclaircir.
Il est important de noter que les mécanismes impliqués dans l’autophagie seraient également impliqués dans d’autres formes de mort cellulaire. En effet, l’augmentation du taux de calcium serait un activateur de l’autophagie (Høyer-Hansen et al., 2007). Il a également été montré que le clivage de Atg5 par les calpaïnes est un phénomène impliqué dans l’autophagie, ainsi que dans l’apoptose.
En effet, Atg5 clivé serait transporté vers la mitochondrie afin de lier Bcl-2 et provoquerait l’apoptose (Hamacher-Brady et al., 2006; Takagi et al., 2007).
Ø ATP
Inhibition pompes ioniques
Gonflement cellulaire
Rupture membranaire
Accumulation Ca2+ cyto.
Activation calpaïnes et
protéases
Accumulation Ca2+ mito
Ouverture mPTP
NECROSE AUTOPHAGIE
Stress ox, altération ADN…
Bax/Bak à la mitochondrie Perméabilisation
membranaire Libération cyt. C
Formation apoptosome Cascade caspases
APOPTOSE
Fixation TNFαet Fas aux récepteurs
Formation complexe DISC Ø ATP
ibit
flem
Ru
mul
ivat
upture uptu
Accum
ture
AUTO CROSE
branaire
CRO OPHAGIE
p p Cascade c
O mulation
S altér Ba mit mul
Stress S
/Bak
abil
tion
APOPTO Fixation TNF
mat mation
ptosome caspases p
mat
ca e c e
O
Figure 4 : Schéma non exhaustif représentant les différentes voies de mort cellulaire et leurs inter-connexions, au cours de l’ischémie reperfusion. En vert la voie de la nécrose, en jaune la voie de l’autophagie et e bleu les voies de l’apoptose.
L’ensemble de ces données montrent que la mort cellulaire suite à l’ischémie reperfusion résulte d’un ensemble de mécanismes impliquant la nécrose, l’apoptose et l’autophagie. De plus, la distinction entre ces différents mode de mort cellulaire pourrait ne pas être relevant étant donné que chacune de ces voies semblent être interconnectées (Golstein and Kroemer, 2007; Zong and Thompson, 2006). De plus, le nombre considérable d’acteurs mis en jeu dans ces différents mécanismes ne nous permettent pas d’en faire une description exhaustive dans ce manuscrit.
II- Cardioprotection
Le développement des connaissances sur la physiopathologie de l’ischémie reperfusion cardiaque a permis de développer des techniques de protection du cœur face à ces différentes
d’agir lors du déclenchement de la phase ischémique, en revanche il est possible d’agir lors de la phase de reperfusion, et plus les connaissances avancent, plus il est possible de développer des méthodes différentes. L’ensemble de ces méthodes visant à réduire la taille de l’infarctus sont appelées méthodes de cardioprotection. En 2005 a été publié une des premières études cliniques démontrant un effet positif du post-conditionnement, réalisé par des épisodes d’une minute de gonflement et dégonflement du ballon d’angioplastie, résultant en une réduction de ±36% de la taille d’infarctus (Staat et al., 2005).
A- Pré-conditionnement (PréC)
L’ère de la cardioprotection a commencé avec Murry et al., qui ont démontré pour la première fois en 1986 que 4 cycles de 5min d’ischémie/5min de reperfusion en amont d’une ischémie prolongée, permettait de réduire significativement la taille d’infarctus chez le chien (Murry et al., 1986). Toutefois, cette taille d’infarctus n’était pas modifiée si l’ischémie était prolongée au-delà de 3h, soulignant l’importance du moment de la reperfusion. Cette technique, le pré-conditionnement ischémique (PréC-I), a été rapidement transposée en clinique humaine, mais ne peut être utilisée que dans les cas de coronarographie et bypass coronaire. Après la reperfusion, le PréC est l’intervention la plus efficace afin de réduire la taille d’infarctus et efficace sur différents modèles animaux (pour revue, (Przyklenk and Kloner, 1998)).
Il a été montré que le stimulus du PréC induisait deux fenêtres de cardioprotection. Une première immédiatement après l’application du PréC qui dure 2 à 3h (PréC classique). La seconde fenêtre s’ouvre 12 à 24h plus tard et dure 48 à 72h (PréC retardé) (Kuzuya et al., 1993; Marber et al., 1993). Malgré de très nombreuses études sur le sujet, les mécanismes cardioprotecteurs du PréC restent encore un vaste champ d’investigation afin de décrypter au mieux les phénomènes impliqués. Néanmoins il a été décrit que le stimulus mécanique du PréC entraine la production d’acétylcholine, adénosine, bradykinine, endothélines et autres opioïdes par les cardiomyocytes. Ces
molécules, quand elles se lient leur récepteur spécifique à la membrane plasmique des cardiomyocytes, stimulent des voies de signalisation cardioprotectrices qui convergent vers la mitochondrie. Ces voies seront détaillées ci-après.
B- Post-conditionnement (PostC)
Les interventions appliquées au début de la reperfusion afin d’améliorer la récupération du tissu, sont regroupées sous le terme de Post-Conditionnement (PostC). Les recherches sur les mécanismes impliqués dans le PostC ont permis de confirmer que le PostC et le PréC entrainent l’activation de voies de signalisation communes (Kin et al., 2004).
- Le Post-Conditionnement Ischémique (PostC-I) fut le premier décrit. En 2003, Zhao et al.
démontrait dans un modèle canin que l’application de brèves occlusions / reperfusions de 30s au moment de la reperfusion réduisait significativement la taille d’infarctus (Zhao et al., 2003). Cette méthode a par la suite démontré son efficacité dans différentes espèces animales : in vivo chez la souris, le lapin et le cochon (Gomez et al., 2008; Schwartz and Lagranha, 2006; Tang et al., 2006; Yang et al., 2004), sur des cellules cardiaques murines (Heusch et al., 2006; Tsang et al., 2004), et chez l’homme (Sivaraman et al., 2007). Le principe de cette intervention repose sur des cycles d’occlusion / reperfusion de l’artère coronaire impliquée dans l’infarctus du myocarde, sur des périodes très brèves de 10 à 30 sec. La plupart des études suggèrent que le moment de l’application du PostC est critique dans la réussite de cette technique. En effet, un retard d’une minute dans la mise en place de la première réocclusion peut entrainer la perte de l’effet cardioprotecteur chez le rat et le lapin. Chez la souris, le chien et l’homme, la perte d’effet du PostC n’intervient qu’avec une retard de 180 sec (Skyschally et al., 2009). Ceci serait en lien avec l’hypothèse que les lésions de reperfusion seraient associées majoritairement à l’ouverture du mPTP dans les premières minutes de la reperfusion et que le PostC aurait un effet inhibiteur sur l’ouverture du mPTP
(Di Lisa et al., 2001; Griffiths and Halestrap, 1995). Toutefois, d’autres études ont démontré que le PostC-I pouvait avoir un effet cardioprotecteur même appliqué 30 min après le début de la reperfusion dans un modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris (Roubille et al., 2011). Cette technique fut donc nommée PostC-I retardé.
Bien que les effets du PostC-I aient été décrits chez de nombreuses espèces, l’efficacité quant à la diminution de la taille d’infarctus est extrêmement variable d’une espèce à l’autre, mais également d’un laboratoire à l’autre. Globalement, on rapporte une diminution de 30% de la taille d’infarctus dans les modèles murins, et de 50% dans les modèles de plus gros animaux comme le lapin et le chien (Vinten-Johansen et al., 2011). La variabilité des protocoles utilisés entre ces différentes études pourrait expliquer en partie ces résultats disparates.
En plus de ces effets sur la taille d’infarctus, il a été montré que le PostC-I pouvait limiter le développement d’arrythmies dans le cœur de rat (Dow et al., 2008), diminuait l’apoptose des cardiomyocytes et les lésions vasculaires (Schwartz and Kloner, 2012).
- Le Post-Conditionnement à distance : De nombreuses études expérimentales et cliniques suggèrent que l’ischémie intermittente au moment de la reperfusion, appliquée à des organes à distance du cœur, permettrait de limiter la taille d’infarctus. Ce phénomène est appelé PostC à distance (PostC-D). La méthode la plus étudiée du PostC-D est l’ischémie intermittente appliquée au niveau de la jambe au moment de la reperfusion du myocarde.
Cette méthode a montré des résultats positifs aussi bien chez l’animal que chez l’homme (Kharbanda et al., 2001; Loukogeorgakis et al., 2006). La simplicité de cette intervention s’avère particulièrement intéressante, d’autant plus que son application retardée de 30 minutes par rapport au début de la reperfusion augmenterait son efficacité. Les mécanismes impliqués dans le PostC-D restent encore peu clairs, mais pourraient mettre en jeu des facteurs humoraux et nerveux, ainsi que la transmission de facteurs inconnus par des microvésicules (Giricz et al., 2014).
