Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
IV.2.3. Génération et analyse physiologique d’une banque de mutants cop Description de la banque de mutants.
La construction de mutants est une approche classique pour étudier le rôle d’une protéine.
Compte tenu du grand nombre de gènes cop, une méthode de mutagenèse aléatoire a été utilisée. Nous avons utilisé un transposon de type miniTn5, ou « single hopper ». Ce minitransposon n'a plus le gène tnpA et ne peut se transposer que si la transposase TnpA est exprimée en trans dans la souche porteuse du miniTn5.
Le plasmide pMOL1024 est construit au départ du vecteur pLAFR3 (Staskawicz et al., 1987) dans lequel la région comprise entre les gènes caiA et resU de pMOL30 a été clonée. Cette région correspond à l’îlot cop niché dans l’îlot génomique CMGI30b. Comme décrit plus haut, ces îlots de C. metallidurans CH34 sont délimités par des intégrases partiellement délétées. Ces délétions assurent la stabilité génétique de ces blocs au sein de ces îlots génomiques (Mergeay et al., en préparation).
Après transposition in vitro du miniTn5 dans pMOL1024, les plasmides mutés sont introduits dans E. coli afin de faciliter leur multiplication et extraction.
Les plasmides pMOL1024::miniTn5 obtenus peuvent alors être transférés vers AE104 (les mutants correspondent alors à des dérivés de la souche AE1744) ou vers CH34 (les mutants correspondent à des dérivés de la souche sauvage CH34).
Pour introduire une mutation dans le contexte génétique du pMOL30, un plasmide pMOL1024::miniTn5 est introduit dans la souches sauvage CH34. Les transconjugants dans lesquels s’est produit une double-recombinaison : qui ont intégrés le mini::Tn5 dans pMOL30 et perdu le pMOL1024, sont sélectionnés pour le marqueur du transposon et criblés pour la perte du marqueur de pMOL1024.
Des insertions ont été obtenues dans les gènes copV, copT, copM, copK, copS, copR, copA, copB, copD, copJ, copG, copF, copL, copQ et copE, soit 15 des 19 gènes cop.
Dans le cas des transferts vers pMOL30, nous n’avons pas obtenu les mutants des gènes copJ et copL.
Il n'y a donc pas de mutants pour les gènes copI et copH pour lesquels des données structurelles existent, ni pour copC qui est le gène le plus exprimé en présence de cuivre (Monchy et al., 2006a), ni copN pour lequel nous n’avons que des indications bioinformatiques.
Phénotype des mutants : courbes de viabilité.
Le but de cette étude est de déterminer les phénotypes de ces mutants quant à la réponse au cuivre à diverses concentrations. Cependant, l’écart de CMI entre les souches de référence n’est que d’un facteur deux environ, si bien que les écarts entre une souche parentale et ses mutants sont forts petits.
Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
Nous disposons de l’ensemble des mutants dans deux contextes génétiques différents : dans AE1744, où seuls les gènes cop sont présents, et dans la souche CH34, où tout le plasmide pMOL30 (et pMOL28°) est présent. La différence génotypique entre ces deux souches se traduit par une sensibilité accrue au Cu(II) pour la souche AE1744 et un profil biphasique particulier en fonction de la concentration appliquée (voir section IV.I.1). Les courbes de viabilité sont réalisées au départ de précultures induites (figure IV.15) ou non induites (figure IV.14). La concentration d’induction choisie est deux fois plus faible que la concentration toxique pour la souche la plus sensible : AE104 (figure IV.4).
Figure IV.14 : Représentation des zones de viabilité pour les souches AE104, AE1744 et CH34 dont les précultures ne sont pas induite.
Légende : La zone 1 correspond à la zone de viabilité d’AE104, tout phénotype correspondant à celui d’AE104 est dit « sensible » (un cas d'hypersensibilité par rapport à AE104 sera décrit ci-dessous) ; la zone 2 correspond à la zone de viabilité d’AE1744, tout phénotype se situant dans la zone 2 est dit « sensible intermédiaire », tout phénotype situé dans la zone 3 est dit « identique à CH34 » (ou sauvage), la zone 5 correspond aux viabilités supérieures à
la viabilité de CH34, tout phénotype dans cette zone est dit « hyperrésistant ».
Figure IV.15 : Représentation des zones de viabilité pour les souches AE104, AE1744 et CH34 dont les précultures sont induites à 0,3 mM en Cu(II).
Légende : La zone 1 correspond à la zone de viabilité d’AE104, tout phénotype correspondant à celui d’AE104 est dit « sensible » ; les zones 2, 3 et 4 correspondent à la zone de viabilité
de CH34, tout phénotype se situant dans la zone 2 est dit « sensible intermédiaire », tout phénotype situé dans la zone 3 est dit « identique à CH34 », la zone 4 correspond à une viabilité résiduelle (observée chez le sauvage), tout phénotype de ce type est dit « persistant »,
la zone 5 correspond aux viabilités supérieures à la viabilité de CH34, tout phénotype dans cette zone est dit « hyperrésistant ».
Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
Les phénotypes des mutants sont observables à toutes les concentrations en Cu(II) avec une grande fiabilité : tous les milieux sont identiques dans leur composition, préparés et inoculés au même moment et utilisés dans les mêmes conditions d’incubation. Le phénotype observé vaut pour le domaine de concentration considéré, soit de 0 à 1,2 mM en Cu(II) en conditions non-induites et de 0 à 3 mM en condition induites.
Les déterminations phénotypiques ont dépendu de choix précoces qui auraient pu être révisés a posteriori : pour la souche AE1744, les concentrations de 1,5 mM et au-delà auraient pu être testées. De plus, comme AE1744 a le même profil de survie quelles que soient les conditions (induite ou non induite), le phénotype des mutants après induction n'a pas été testé. Pour finir, les comptages de la survie sur boîte n'ont pas été testés en dessous de la dilution 10-3 ce qui peut poser un problème pour l’observation du phénotype persistant.
Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
Figure IV.16 : courbes de viabilité du mutant copV::miniTn5 vis-à-vis du Cu(II)
pMOL 1024
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
AE1744 AE104 pMOL1024copV- CH34
La mutation copV::miniTn5 se traduit par un phénotype pratiquement identique à CH34 mais la CMI est plus faible.
pMOL30
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)](mM)
Viabilité (%)
CH34 AE104 pMOL30copV-
La mutation copV::miniTn5 se traduit par un phénotype pratiquement identique à CH34 mais la CMI est plus faible.
pMOL30
Induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
CH34 0.3mM AE1744 0.3mM
AE104 0.3mM pMOL30copV- 0.3 mM
La mutation copV::miniTn5 se traduit par un phénotype pratiquement parental.
Discussion
Le phénotype de copV::miniTn5 dans pMOL1024 est de type sauvage dans la zone 0,8 à 1,1 mM car plus résistant et au niveau de celui de CH34. Dans le contexte pMOL30, la mutation n’affecte pas le phénotype de la souche CH34, excepté à la CMI. Son phénotype est parental, sauf aux très hautes [Cu(II)] où le phénotype persistant disparaît partiellement. Le gène copV n’a pas d’homologue de fonction connue dans les bases de données.
Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
Figure IV.17 : courbes de viabilité du mutant copT::miniTn5 vis-à-vis du Cu(II).
pMOL 1024
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
AE1744 AE104 pMOL1024copT- CH34
La mutation copT::miniTn5 se traduit par un phénotype pratiquement identique à CH34 (voire un peu plus résistant) mais la CMI est légèrement plus faible.
pMOL30
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)](mM)
Viabilité (%)
CH34 AE104 pMOL30copT-
La mutation copT::miniTn5 se traduit par un phénotype quasi parental mais la CMI est légèrement inférieure.
pMOL30
Induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
CH34 0.3mM AE1744 0.3mM
AE104 0.3mM pMOL30copT- 0.3 mM
La mutation copT::miniTn5 se traduit par un phénotype quasi parental
mais le
phénotype persistant est absent.
Discussion
Le phénotype de copT::miniTn5 dans pMOL1024 est de type de type sauvage dans la zone 0,8 à 1,1 mM car le phénotype est le même que celui de CH34. Dans le contexte pMOL30, la mutation n’affecte pas le phénotype de la souche CH34, excepté à la CMILe phénotype persistant disparaît totalement. Le gène copT coderait pour une cytochrome-c. La localisation de CopT serait périplasmique.
Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
Figure IV.18 : courbes de viabilité du mutant copM::miniTn5 vis-à-vis du Cu(II)
pMOL 1024
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
AE1744 AE104 pMOL1024copM- CH34
La mutation copM::miniTn5 se traduit par un phénotype
identique à CH34 mais avec une CMI légèrement inférieure.
pMOL30
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)](mM)
Viabilité (%)
CH34 AE104 pMOL30copM-
La mutation copM::miniTn5 se traduit par un phénotype
entièrement parental.
pMOL30
Induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
CH34 0.3mM AE1744 0.3mM
AE104 0.3mM pMOL30copM- 0.3 mM
La mutation copM::miniTn5 se traduit par un phénotype quasi parental.
Discussion
Le phénotype de copM::miniTn5 dans pMOL1024 est de type sauvage dans la zone 0,8 à 1,2 mM. Dans le contexte pMOL30, le phénotype de la mutation est parental.
Le gène copM n’a pas d’homologue de fonction connue dans les bases de données.
Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
Figure IV.19 : courbes de viabilité du mutant copK::miniTn5 vis-à-vis du Cu(II)
pMOL 1024
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
AE1744 AE104 pMOL1024copK- CH34
La mutation copK::miniTn5 se traduit par un phénotype plus résistant de 0,8 à 1,2 mM. La
CMI est
parentale
(inférieure à celle de CH34).
pMOL30
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)](mM)
Viabilité (%)
CH34 AE104 pMOL30copK-
La mutation copK::miniTn5 se traduit par un phénotype plus résistant
pMOL30
Induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
CH34 0.3mM AE1744 0.3mM
AE104 0.3mM pMOL30copK- 0.3 mM
La mutation copK::miniTn5 se traduit par un phénotype parental, ou légèrement plus sensible.
Discussion
La mutation copK::miniTn5dans dans pMOL1024 est de type de type sauvage dans la zone 0,8 à 1,2 mM car le phénotype est le même que celui de CH34. La CMI est cependant inférieure à celle de CH34 et au niveau de la souche parente. Dans le contexte pMOL30, la mutation entraîne une résistance plus élevée. Par contre, après induction, son phénotype est parental. Le gène copK n’a pas d’homologue de fonction connue dans les bases de données. La localisation de CopK est périplasmique.
Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
Figure IV.20 : courbes de viabilité du mutant copS::miniTn5 vis-à-vis du Cu(II)
pMOL 1024
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
AE1744 AE104 pMOL1024copS- CH34
La mutation copS::miniTn5 se traduit par un phénotype
sensible intermédiaire.
pMOL30
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)](mM)
Viabilité (%)
CH34 AE104 pMOL30copS-
La mutation copS::miniTn5 se traduit par un phénotype quasi parental mais avec une CMI légèrement
inférieure.
pMOL30
Induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
CH34 0.3mM AE1744 0.3mM
AE104 0.3mM pMOL30copS- 0.3 mM
La mutation copS::miniTn5 se traduit par un phénotype
sensible
intermédiaire, le phénotype
persistant n’est pas affecté par la mutation.
Discussion
La mutation copS::miniTn5 dans pMOL1024 entraîne une diminution de la résistance au Cu(II). Il n’y a donc pas de substitution par le CopS du mégaplasmide ou cette substitution n’est que partielle. Dans le contexte pMOL30, la mutation copS::miniTn5 diminue légèrement la CMI. Le phénotype persistant n'est pas affecté. Le gène copS code pour une kinase senseur de la présence du cuivre dans le périplasme. Elle phosphoryle alors CopR qui activerait la transcription des gènes copABCD.
Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
Figure IV.21 : courbes de viabilité du mutant copR::miniTn5 vis-à-vis du Cu(II)
pMOL 1024
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
AE1744 AE104 pMOL1024copR- CH34
La mutation copR::miniTn5 se traduit par un phénotype sensible à basse [Cu(II)] et sensible
intermédiaire aux hautes [Cu(II)].
pMOL30
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)](mM)
Viabilité (%)
CH34 AE104 pMOL30copR-
La mutation copR::miniTn5 se traduit par un phénotype sensible intermédiaire.
pMOL30
Induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
CH34 0.3mM AE1744 0.3mM
AE104 0.3mM pMOL30copR- 0.3 mM
La mutation copR::miniTn5 se traduit par un phénotype sensible
intermédiaire et l’absence de phénotype persistant.
Discussion
Du fait que copRS sont en opéron, la mutation dans copR peut avoir un effet polaire sur copS. La mutation copR::miniTn5 dans pMOL1024 provoque une sensibilité accrue au Cu(II), aussi à basse concentration en Cu(II). CopR pourrait donc réprimer certains gènes codant pour des protéines responsables de l’entrée du Cu(II). La mutation dans le contexte pMOL30 est préjudiciable à la résistance au cuivre. Si on compare le mutant copR au mutant copS, on peut penser que le gène copR est impliqué dans le phénotype persistant. CopR activerait la transcription des gènes copABCD.
Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
Figure IV.22 : courbes de viabilité du mutant copA::miniTn5 vis-à-vis du Cu(II).
pMOL 1024
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
AE1744 AE104 pMOL1024copA- CH34
La mutation copA::miniTn5 se traduit par un phénotype
sensible.
pMOL30
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)](mM)
Viabilité (%)
CH34 AE104 pMOL30copA-
La mutation copA::miniTn5 se traduit par un phénotype
intermédiaire.
pMOL30
Induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
CH34 0.3mM AE1744 0.3mM
AE104 0.3mM pMOL30copA- 0.3 mM
La mutation copA::miniTn5 se traduit par un phénotype
intermédiaire et peut-être par l’absence de phénotype
persistant.
Discussion
La mutation copA::miniTn5 dans pMOL1024 inactive totalement la résistance au Cu(II). Dans le contexte pMOL30, le phénotype est moins net : le plasmide pMOL30 compense peut-être la mutation de copA. Le phénotype persistant n’est pas observé. Le gène copA code pour une oxydase multicuivre (qui réalise la conversion du Cu(I) en Cu(II)). CopA serait chargé en cuivre dans le cytoplasme par CopD, pour ensuite passer dans le périplasme.
Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
Figure IV.23 : courbes de viabilité du mutant copB::miniTn5 vis-à-vis du Cu(II)
pMOL 1024
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
AE1744 AE104 pMOL1024copB- CH34
La mutation copB::miniTn5 se traduit par un phénotype
hypersensible.
pMOL30
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)](mM)
Viabilité (%)
CH34 AE104 pMOL30copB-
La mutation copB::miniTn5 se traduit par un phénotype
sensible intermédiaire.
pMOL30
Induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
CH34 0.3mM AE1744 0.3mM
AE104 0.3mM pMOL30copB- 0.3 mM
La mutation copB::miniTn5 se traduit par un phénotype
hyperrésistant et la perte du phénotype
persistant.
Discussion
La mutation copB::miniTn5 dans pMOL1024 a un phénotype hypersensible que l'on ne trouve que pour ce mutant et uniquement dans le contexte du cosmide. Dans le contexte pMOL30, la situation est très différente : l'allèle sauvage interfère avec la résistance maximum mais semble nécessaire au phénotype persistant. La fonction de CopB n’est pas connue avec précision, sa localisation est dans le périplasme mais ancrée dans la membrane externe. Son domaine soluble (du côté N-terminal) présente un motif de liaison au Cu(I) de type Met/His répété onze fois.
Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
Figure IV.24 : courbes de viabilité du mutant copD::miniTn5 vis-à-vis du Cu(II).
pMOL 1024.
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
AE1744 AE104 pMOL1024copD- CH34
La mutation copD::miniTn5 se traduit par un phénotype
identique à CH34 jusque 0,9 mM puis il devient
intermédiaire avec une CMI parentale.
pMOL30.
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)](mM)
Viabilité (%)
CH34 AE104 pMOL30copD-
La mutation copD::miniTn5 se traduit par un phénotype quasi parental
(sauvage) avec
une CMI
légèrement réduite.
pMOL30.
Induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
CH34 0.3mM AE1744 0.3mM
AE104 0.3mM pMOL30copD- 0.3 mM La mutation
copD::miniTn5 se traduit par un phénotype
sensible à 0,3 et 0,6 mM, puis sensible
intermédiaire. Le phénotype
persistant n’est pas ou peu affecté.
Discussion
La mutation copD::miniTn5 dans pMOL1024 a un léger effet sur le phénotype qui est un peu plus résistant qu’AE1744 dans une gamme de concentration très limitée.
Dans pMOL30, la mutation influence peu le phénotype. Après induction, la viabilité du mutant diminue de façon régulière dès les plus basses concentrations en Cu(II).
CopD est un canal de la membrane interne qui réalise l’entrée du cuivre qui lui est présenté du côté du périplasme par CopC. L’entrée du cuivre réalisée par CopD favoriserait donc la résistance aux basses concentrations en cuivre.
Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
Figure IV.25 : courbes de viabilité du mutant copJ::miniTn5 vis-à-vis du Cu(II)
pMOL 1024
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
AE1744 AE104 pMOL1024copJ- CH34
La mutation copJ::miniTn5 se traduit par un phénotype sensible intermédiaire.
Discussion
La mutation copJ::miniTn5 dans pMOL1024 affecte le phénotype aux plus hautes concentrations en Cu(II) puisque la CMI rejoint celle d’AE104 à 0,9 mM alors que sa viabilité est identique à celle de AE1744 en dessous de cette concentration. Le gène copJ coderait pour une protéine de type cytochrome-c. La localisation de CopJ serait périplasmique.
Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
Figure IV.26 : courbes de viabilité du mutant copG::miniTn5 vis-à-vis du Cu(II).
pMOL 1024
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
AE1744 AE104 pMOL1024copG- CH34
La mutation copG::miniTn5 a le phénotype parental.
pMOL30
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)](mM)
Viabilité (%)
CH34 AE104 pMOL30copG-
La mutation copG::miniTn5 a le phénotype parental avec une CMI légèrement réduite.
pMOL30
Induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
CH34 0.3mM AE1744 0.3mM
AE104 0.3mM pMOL30copG- 0.3 mM
La mutation copG::miniTn5 a un phénotype quasi parental à l'exception du
domaine de
concentration ou s'exprime le phénotype
persistant
Discussion
La mutation dans pMOL1024 n’affecte pas le phénotype. Dans pMOL30, la mutation affecte peut-être légèrement la CMI. Le phénotype persistant est affecté par la mutation. Le gène copG coderait pour une protéine chaperonne du cuivre périplasmique.
Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
Figure IV.27 : courbes de viabilité du mutant copF::miniTn5 vis-à-vis du Cu(II)
pMOL 1024
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
AE1744 AE104 pMOL1024copF- CH34
La mutation copF::miniTn5 se traduit par un phénotype
sensible.
pMOL30
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)](mM)
Viabilité (%)
CH34 AE104 pMOL30copF-
La mutation copF::miniTn5 se traduit par un phénotype
sensible intermédiaire.
pMOL30
Induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
CH34 0.3mM AE1744 0.3mM
AE104 0.3mM pMOL30copF- 0.3 mM
La mutation copF::miniTn5 se traduit par un phénotype
sensible intermédiaire jusqu’à 1.5 mM, puis
résistant au-delà.
Discussion
La mutation copF::miniTn5 dans pMOL1024 confirme que CopF est une des protéines principale responsable de la résistance au Cu(II). Après induction du mutant copF::miniTn5 la viabilité diminue très fortement jusque 1,5 mM, au-delà le phénotype s’inverse. copF est donc indispensable à la survie élevée aux basses [Cu(II)] mais, curieusement, la mutation favorise aussi la survie bactérienne aux plus hautes [Cu(II)]. CopF est une ATPase de type P de la membrane interne qui réalise l’efflux du Cu(I) cytoplasmique vers le périplasme.
Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
Figure IV.28 : courbes de viabilité du mutant copL::miniTn5 vis-à-vis du Cu(II)
pMOL 1024
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
AE1744 AE104 pMOL1024copL- CH34
La mutation copL::miniTn5 se traduit par un phénotype quasi identique à CH34, mais la CMI est parentale (celle d'AE1744).
Discussion
La mutation copL::miniTn5 dans pMOL1024 a un phénotype identique à CH34 dans la zone 0,8 à 1,1 mM mais parental au niveau de la CMI. Ce phénotype est identique à celui des mutants des gènes copVTMK. Le gène copL n’a pas d’homologue de fonction connue.
Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
Figure IV.29 : courbes de viabilité du mutant copQ::miniTn5 vis-à-vis du Cu(II)
pMOL 1024
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
AE1744 AE104 pMOL1024copQ- CH34
La mutation copQ::miniTn5 se traduit par un phénotype plus résistant jusque 0,9 mM puis il rejoint celui de la souche AE1744.
pMOL30
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)](mM)
Viabilité (%)
CH34 AE104 pMOL30copQ-
La mutation copQ::miniTn5 se traduit par un phénotype
largement parental mais avec une CMI inférieure.
pMOL30
Induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
CH34 0.3mM AE1744 0.3mM
AE104 0.3mM pMOL30copQ- 0.3 mM
La mutation copQ::miniTn5 se traduit par un phénotype
intermédiaire. Le phénotype
persistant n’est pas affecté.
Discussion
La mutation copQ::miniTn5 dans pMOL1024 montre un phénotype plus résistant qu’AE1744 dans une gamme réduite de concentration en Cu(II). Dans le contexte pMOL30, la mutation n’a d’influence qu’à la CMI. Après induction, la viabilité du mutant diminue de façon régulière mais le phénotype persistant n’est pas affecté.
Ce phénotype rappelle celui du mutant copD. Le gène copQ a deux homologues sur pMOL30 : mmrQ et czcJ qui sont induits par les métaux lourds avec des niveaux d’induction remarquablement élevés (Monchy et al., 2007).
Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
Figure IV.30 : courbes de viabilité du mutant copE::miniTn5 vis-à-vis du Cu(II)
pMOL 1024
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
AE1744 AE104 pMOL1024copE- CH34
La mutation copE::miniTn5 se traduit par un phénotype
sensible jusqu’à 0,7 mM, puis identique à AE1744.
pMOL30
Non- induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)](mM)
Viabilité (%)
CH34 AE104 pMOL30copE-
La mutation copE::miniTn5 se traduit par un phénotype sensible intermédiaire.
pMOL30
Induite.
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3
[Cu(II)] (mM)
Viabilité (%)
CH34 0.3mM AE1744 0.3mM
AE104 0.3mM pMOL30copE- 0.3 mM
La mutation copE::miniTn5 se traduit par un phénotype résistant.
Discussion
La mutation copE::miniTn5 dans pMOL1024 montre un phénotype particulier : il y a une diminution régulière de la viabilité dès les plus basses [Cu(II)] mais aussi une CMI supérieure à celle de la souche parentale. Dans le contexte pMOL30, la mutation affecte la résistance. En conditions induites, la mutation devient favorable à la survie bactérienne. Le phénotype rappelle celui de la mutation copF dans les concentrations les plus élevées en Cu(II). Le gène copE n’a pas d’homologue de fonction connue dans les bases de données. Il pourrait coder pour une lipoprotéine.
Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
L’ensemble des observations physiologiques des mutants est résumé dans la table IV.3 :
Table IV.3 : Phénotypes des mutants dans les différents contextes génétiques et de préculture.
Mutant pMOL1024, non induit.
pMOL30, non induit.
pMOL30, induit. Phénotype persistant.*
copV Pratiquement identique à CH34
mais CMI plus faible
Parental Parental. Partiel.
copT Identique à CH34 mais CMI légèrement plus
faible
Parental mais à CMI légèrement
inférieure
Parental. sauf vers la CMI
Absent.
copM Identique à CH34 mais CMI légèrement
inférieure.
Parental. Parental. Présent.
copK résistant de 0,8 à 1,2 mM mais la CMI
est parentale (légèrement inférieure à celle de
CH34).
Résistant. Parental. Présent.
copS Sensible
intermédiaire.
Quasi parental. Sensible intermédiaire.
Présent.
copR Sensible en deçà de 0,6 mM, sensible
intermédiaire au delà.
Sensible intermédiaire.
Sensible intermédiaire.
Absent.
copA Sensible. Sensible
intermédiaire.
Sensible intermédiaire.
Absent.
copB hypersensible. Sensible intermédiaire.
Hyperrésistant sauf juste avant la
CMI (hypersensible).
Absent.
copD Identique à CH34 jusque 0,9 mM,
sensible intermédiaire
au delà.
Parental Sensible en deçà de 0,6 mM,
sensible intermédiaire
au delà.
Présent.
copG Parental Parental à CMI
légèrement réduite.
parental Absent.
copJ Sensible
intermédiaire.
NR NR NR
copF Sensible. Sensible
intermédiaire.
D'intermédiaire à résistant.
Résistant.
Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
copL Identique à CH34 mais la CMI est parentale, inférieure
à celle de CH34.
NR NR NR
copQ Identique à CH34 jusque 0,9 mM,
parental au-delà (CMI inférieure à celle de
CH34).
Parental Sensible
intermédiaire.
Présent.
copE Sensible en deçà de 0,7 mM, intermédiaire
au delà.
Sensible intermédiaire.
Parental. Résistant.
Légende : pour les mutants du cosmide pMOL1024, la souche de référence est AE1744, pour les mutants de pMOL30, la souche de référence est CH34 (souche sauvage) ; * : la
persistance ne concerne que les courbes de viabilité induites. NR : non réalisé.
L’observation majeure est la nette différence des phénotypes selon : (i) le contexte génétique (îlot cop seul ou l’entièreté des gènes de pMOL30) et (ii) les conditions de préculture (avec ou sans cuivre) :
• Les phénotypes observés dans le contexte pMOL1024 sont beaucoup plus marqués que dans le contexte de pMOL30 : cela tient essentiellement à la « compensation » d’une mutation d’un des gènes cop par les autres gènes de pMOL30. Ainsi, aucun mutant cop dans pMOL30 n’a le phénotype de la souche sans plasmide, AE104.
• Les gènes copSRABCD du MPL ne semblent pas ou assez peu complémenter les mutations de leurs orthologues de pMOL30.
• Comme pour la souche de référence CH34, l’induction modifie le phénotype des mutants de pMOL30
Ces observations suggèrent que certains gènes cop auraient des fonctions non directement liées à l'efflux du cuivre. Voici quelques exemples de ces fonctions :
• Le cuivre se substitue aux métaux non-redox dans les enzymes du métabolisme cellulaire, comme le Zn(II) ou le Fe(II). Certaines protéines Cop pourraient séquestrer les ions cuivre pour éviter qu’ils ne chassent les ions métalliques essentiels à la fonction de nombreuses enzymes. Par ailleurs, le potentiel du cuivre est telle qu’il peut réagir avec les ions essentiels au métabolisme cellulaire : la séquestration du cuivre est donc très importante pour empêcher ces réactions.
• Les systèmes d’efflux mis en place par la cellule pourraient être tellement efficaces qu'il faudrait veiller à préserver le Cu nécessaire au métabolisme (« Cu essentiel »).
Certaines protéines Cop pourraient donc agir pour préserver le réservoir de cuivre intracellulaire.
• Un système d’influx rapide pour assurer l’induction de la résistance au cuivre (voir à d’autres métaux) avant que sa concentration ne devienne toxique ou n’atteigne la concentration nécessaire à l’action de CopS sur CopR (ou d’autres régulateurs). Ce système d’influx rapide serait similaire à celui observé dans le cas du plomb (Borremans et al., 2001).
Chapitre IV : Résultats, 2. Recherche de la fonction des protéines Cop.
• Un système dit « persistant » qui permettrait la mise en dormance des cellules qui survivent alors à des concentrations létales en Cu(II).
• Une modulation de la valence du cuivre suivant les besoins mais surtout les capacités cellulaires. On peut suggérer qu’une ou des protéines Cop réduisent le Cu(II) en Cu(I) plus toxique, mais pompé sur les sites riches en Met/His de liaison au Cu(I). Le cas de CopB de pMOL30 qui porte onze fois ce motif est à ce titre remarquable.
• Plusieurs mutants semblent plus résistants que leur parent et aussi résistants que la souche sauvage (CH34) (cosmide : copVTKM, copL, copQ ou pMOL30 : copB, copT et copG), excepté autour de la CMI où la résistance reste toujours inférieure à celle de CH34. Il semble que l'allèle sauvage de ces gènes affecte la viabilité ou gêne l'expression optimale de l’îlot cop dans le contexte du cosmide, mais qu'il soit impérativement requis autour de la CMI. Ce point crucial sera évoqué dans la discussion.
Il faudrait étendre l'analyse phénotypique à l'effet sur la réponse aux autres métaux lourds (en particulier, ceux qui induisent les gènes cop) voire sur des mélanges de métaux.
Les phénotypes observés pour les mutants cop seront corrélés avec les prédictions bioinformatiques et les données biochimiques sur CopK et CopI dans le dernier chapitre de cette thèse.
