Chapitre IV : Résultats.

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Chapitre IV : Résultats, 1. Physiologie de la réponse au cuivre.

Chapitre IV : Résultats.

IV.1. Physiologie de la réponse au cuivre.

IV.1.1. Phénotype de la réponse au cuivre.

Souches mises en œuvre : pMOL1024 porte l’îlot cop.

Cinq souches de référence (Mergeay et al., 1985, Borremans et al., 2001, Monchy et al., 2006) sont utilisées pour étudier la physiologie de C. metallidurans vis-à-vis du cuivre (figure IV.1).

Figure IV.1 : Génotypes des souches de référence de C. metallidurans.

CH34 AE128

AE126 AE104

AE1744 Gènes cop

de pMOL30

CH34 AE128

AE126 AE104

AE1744 Gènes cop

de pMOL30

Légende : toutes les souches de C. metallidurans portent le chromosome et le mégaplasmide.

CH34 est la souche sauvage qui porte les deux plasmides pMOL28 (en bleu) et pMOL30 (en rouge) ; AE128 ne porte que le plasmide pMOL30 ; AE126 ne porte que le plasmide pMOL28, AE104 ne porte aucun des deux plasmides ; AE1744 est un dérivé de AE104 dans

laquelle le cosmide pMOL1024 (en vert) a été introduit. Le cosmide pMOL1024 est un plasmide à large spectre d'hôtes et vecteur de clonage qui ne contient que les gènes cop de

pMOL30 (n° accession AJ278983).

La région cop de pMOL30 fait partie de l’îlot génomique CMGI30b de pMOL30 (figure I.9).

Elle comprend 21 orfs ou gènes appelées cop sur base d'observations diverses (Monchy et al., 2006^a et Monchy et al., 2007, et travail présent) et deux orfs fragmentaires (une étant appelée

∆caiA). Cette région d’environ 18 kb est flanquée par deux orfs correspondant à des

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Le plasmide pMOL1024 est un vecteur de clonage dans lequel l’îlot niché cop est présent seul. Ce plasmide est introduit dans une souche AE104, donnant ainsi une souche de C.

metallidurans dans laquelle l’îlot cop seul est présent (AE1744), en plus du chromosome et du mégaplasmide.

La présence dans une souche du pMOL1024 ou du pMOL30 augmente d’un facteur deux à trois la CMI vis-à-vis du Cu(II). La CMI est alors du même ordre que celle de CH34 (environ 1.2 mM) (Mergeay et al., 2003). La différence de résistance entre une souche portant ou non les gènes cop est donc faible mais mesurable et reproductible. Dans ce contexte, des courbes de viabilité, plus précises que des stries, permettent d’affiner l’observation du phénotype.

Nous avons mesuré la résistance au cuivre des cinq souches mentionnées vis-à-vis des deux formes ioniques du cuivre. Le Cu(I) est obtenu au départ de Cu(II) mis en solution en présence d’ascorbate de sodium (« vitamine-C »), un agent réducteur qui stabilise les ions Cu(I) de sorte qu’ils ne dismutent pas (Grass, communication personnelle).

Courbes de viabilité en présence de Cu(I) :

Les plasmides ne sont pas responsables d’une résistance au Cu(I) exogène.

Des précultures sont inoculées dans du milieu minimum sans cuivre. Les comptes viables obtenus à chaque concentration sont comparés au contrôle sans cuivre : les rapports ainsi obtenus permettent d'établir une courbe de viabilité en fonction de la concentration.

La concentration minimale inhibitrice (ou CMI) se définit comme la plus faible concentration en métaux pour laquelle il n'y a plus de croissance visible de la souche bactérienne étudiée, les conditions de culture étant standardisées. Dans ces courbes de viabilité, nous considérons que la CMI correspond à l’intersection de la courbe avec l’axe des abscisses, soit le moment où la population comptée correspond à moins de 99,9

% de la population initiale (qui peut aussi être notée CMI 99,9).

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Figure IV.2 : Courbes de viabilité des cinq souches de référence sur Cu(I).

0,1 1,0 10,0 100,0

0 5 10 15 20 25 30 35

[Cu(I)] (µM)

Viabilité (%)

CH34 AE128 AE1744 AE126 AE104

Légende : les courbes de viabilité correspondent aux souches notées dans l’encart. Le Cu(I) est préparé au départ du Cu(II) réduit et stabilisé par de l’ascorbate de sodium. Les CMI des cinq souches correspondent à l’intersection de la courbe de viabilité avec l’axe des abscisses.

La viabilité exprimée en pourcent correspond au nombre d’UFC compté sur le milieu minimum avec agent toxique à une concentration donnée au nombre d’UFC compté sur le

milieu minimum sans cuivre ajouté.

Les CMI des cinq souches sont comprises entre 25 et 35 µM en Cu(I) (figure IV.2). Il y a une réduction régulière de la viabilité avec la concentration en Cu(I). Les courbes de viabilité sont très proches pour les cinq souches, les déterminants plasmidiens ne semblent donc jouer aucun rôle dans la réponse au Cu(I) exogène. Ce résultat, a priori surprenant, sera discuté au point V.7.

Courbes de viabilité en présence de Cu(II) :

Le groupe de gènes cop ne restaure pas totalement le phénotype de la souche sauvage.

En absence des gènes cop, soit pour AE104 et AE126, la CMI est de l’ordre de 0,6 mM en Cu(II) pour le double environ en présence de ces gènes (CH34, AE128, AE1744) (figure IV.3).

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Figure IV.3 : Courbes de viabilité des souches de référence sur Cu(II).

0,1 1,0 10,0 100,0

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3

[Cu(II)] (mM)

V ia b il it é ( % )

CH34 AE128 AE1744 AE104 AE126

Légende : les courbes de viabilité correspondent aux souches notées dans l’encart. Les CMI des cinq souches correspondent à l’intersection de la courbe de viabilité avec l’axe des abscisses, l’ordonnée étant en échelle logarithmique. La viabilité exprimée en pourcent correspond au nombre d’UFC compté sur le milieu minimum avec agent toxique à une concentration donnée au nombre d’UFC compté sur le milieu minimum sans cuivre ajouté.

L’allure des courbes de viabilité permet de distinguer trois phénotypes : celui des souches qui ne portent pas les gènes cop et dont la viabilité diminue rapidement dès 0,2 mM en Cu(II) ; celui de la souche AE1744 dont la viabilité diminue de façon biphasique avec un pallier autour de 10%, avant de diminuer régulièrement jusqu’à la CMI ; et celui des souches CH34 et AE128 dont la viabilité reste élevée jusqu’à 0,6 mM en Cu(II) avant de diminuer régulièrement jusqu’à la CMI.

Ces résultats montrent que :

1. L’îlot cop n’intervient pas dans la résistance au Cu(I) exogène. En effet, aucune différence physiologique majeure n’apparaît pour les cinq souches de référence.

2. La résistance de CH34 vis-à-vis du Cu(II) ne dépend pas de la présence du plasmide pMOL28.

3. La présence de l’îlot cop de pMOL30 (cosmide pMOL1024) augmente la CMI d’un facteur deux environ par rapport à la souche sans plasmide, mais le phénotype sauvage n'est pas entièrement restauré ce qui suggère que d'autres gènes de pMOL30 sont requis.

4. Le Cu(I), chimiquement plus réactif que le Cu(II), est de 30 à 40 fois plus toxique que le Cu(II), les CMI étant respectivement de l’ordre de 30 µM et d’environ 1,2 mM.

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Courbes de croissance en présence de Cu(II) (précultures non induites) : Le groupe de gènes cop ne restaure pas totalement le phénotype de la souche sauvage.

La croissance a été mesurée durant 12 jours de façon à couvrir aussi la phase stationnaire qui apparaît d'ailleurs dès le 3^ème jour dans certaines conditions (figure IV.4). Des cultures à 0, 0,3, 0,6, 0,9, 1,2, 1,6 et 2 mM en Cu(II) ont été réalisées. On ne voit guère de différence entre le contrôle et les cultures incubées en présence de 0,3mM et de 0,6mM. Aucune croissance n’a été observée après 12 jours d’incubation à 2 mM en Cu(II). Le phénotype de la souche AE128 est identique à celui de la souche CH34 (résultat non-présenté).

Figure IV.4 : Courbes de croissance des souches de référence en présence de Cu(II).

Jusqu’à 0,6 mM en Cu(II), il n’y a pas de

différence de croissance entre les

souches CH34, AE104 et AE1744.

A 0,9 mM en Cu(II), la souche CH34 pousse un peu plus lentement qu’à 0,6

mM en Cu(II), AE1744 présente une

latence de 1 jour et pousse plus lentement,

AE104 a une latence de 4 jours et pousse

plus lentement.

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A 1,2 mM en Cu(II), la souche CH34 présente une latence de 1 jour et pousse un

peu plus lentement qu’à 0,6 ou 0,9 mM en Cu(II), AE1744 a une latence de 4 jours.

AE104 ne pousse pas.

A 1,6 mM en Cu(II), la souche CH34 présente une latence de 1 jour et pousse un

peu plus lentement qu’à 1,2 mM en Cu(II), AE1744 et AE104 ne poussent

pas.

Légende : les courbes de croissance sont suivies par la mesure de la densité optique mesurée chaque jour, pour des cultures incubées en présence de Cu(II) dès l’inoculation par une

préculture qui ne contenait pas de Cu(II).

La souche AE104 est la plus sensible au Cu(II), AE1744 a un niveau de résistance intermédiaire et CH34 est la souche la plus résistante au Cu(II) :

1. Le pMOL1024 ne restaure pas complètement le phénotype sauvage.

2. La gamme de concentrations à laquelle des différences phénotypiques apparaissent entre les différentes souches est identique à celle observée sur boîtes.

3. La présence des gènes cop dans le contexte du plasmide pMOL30 augmente de moins d’un facteur deux la résistance au Cu(II).

4. La latence peut augmenter de plusieurs jours en fonction de la concentration en Cu(II) pour une souche considérée mais la phase de croissance exponentielle est toujours la même.

Courbes de viabilité avec addition de Cu(II) à la préculture :

L’îlot cop seul ne permet pas d’induire fortement la résistance au Cu(II).

Les concentrations d’induction sont choisies de sorte que le Cu(II) présent dans la préculture ne soit pas trop toxique. Les concentrations d’induction varient donc d’une souche à l’autre.

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Figure IV.5 : Courbes de croissance des souches de référence vis-à-vis du Cu(II) pour des précultures induites au Cu(II).

0,1 0,1 0,1

Pour CH34, la viabilité et la CMI augmentent proportionnelle-

ment à la concentration en Cu(II) dans la préculture.

Cette augmentation est visible dès 0,3 mM ajouté à

la préculture.

0,1 0,1

Pour AE1744, la viabilité n’augmente que

très légèrement lorsque la préculture contient du cuivre. La CMI ne varie pas.

0,1 0,1

Pour AE104, la viabilité augmente

légèrement avec la concentration en Cu(II) dans

la préculture. La CMI ne varie pas.

Légende : la courbes de viabilité est mesurée sur milieu solide. Les précultures en milieu liquide contiennent du Cu(II) ou pas. Les concentrations en Cu(II) dans la préculture sont

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Les courbes de viabilité en conditions induites diffèrent des conditions non-induites (figure IV.5) :

1. Lorsque du Cu(II) est ajouté à la préculture, la viabilité augmente. Ceci correspond bien à un effet d’induction de la résistance au Cu(II).

2. Seule la souche sauvage C. metallidurans CH34 voit sa CMI augmenter de façon significative. Cette augmentation est très clairement proportionnelle à la concentration en Cu(II) ajoutée à la préculture.

3. Les courbes induites de la souche sauvage mettent en évidence des populations faibles qui se maintiennent même à très hautes concentrations ou qui ne diminuent que très progressivement, contrairement à ce qu'on observe pour les autres métaux. Nous reviendrons ultérieurement sur cette observation (voir point V.4).

IV.1.2. Effet du Cu(II) observé par cytométrie de flux.

Intérêt de la cytométrie de flux :

Visualiser des changements physiologiques à des concentrations sublétales.

Les premières applications de la cytométrie de flux sur des bactéries ont été faites en microbiologie environnementale (Porter et al., 1996). Elles ont permis de visualiser l’hétérogénéité d’une culture bactérienne (Davey et Kell, 1996) ou de mesurer les effets physiologiques de différents stress (Nebe-von-Caron et al., 2000).

Une étude sur Acinetobacter johnsonii soumis à un stress cuivrique a montré que cet ion induisait des modifications dans l’intégrité et la polarité de la membrane cellulaire à une concentration en Cu(II) supérieure à la CMI (Boswell et al., 1998).

Plusieurs études par cytométrie de flux ont été réalisées sur C. metallidurans soumis à un stress thermique (Baatout et al., 2005), à un stress oxydatif (Baatout et al., 2006) ou à un stress acido-basique (Baatout et al., 2007). Toutefois, les mesures ont été faites dans des conditions où il est évident que la cellule est très affectée (comme à -170° ou +70 °C dans le cas d’un stress thermique). Dans ces travaux, la cytométrie a donc été utilisée comme un substitut de méthodes microbiologiques classiques, les mesures de viabilité ayant été faites uniquement par cytométrie de flux.

Ces travaux ont permis de mettre au point les conditions expérimentales adéquates comme le nombre minimum de cellules à observer, le tampon optimal et la vitesse de visualisation des cellules.

Les objectifs poursuivis ici sont :

• Déterminer s’il apparaît une hétérogénéité dans une population de C. metallidurans soumise à un stress cuivrique.

• Déterminer quels paramètres cellulaires sont influencés par le génotype des cellules et quantifier les modifications physiologiques observées.

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Au total, six paramètres physiologiques ont été mesurés : la taille, la granularité, l’intégrité membranaire, le potentiel membranaire, le taux d’oxygène radicalaire et l’activité réductase.

Le choix de ces paramètres n’est pas aléatoire : le premier chapitre montre que la présence de métaux lourds dans l’environnement cellulaire implique de nombreux processus, contrôlés ou pas par la cellule.

Nous savons que la taille et la granularité sont influencées par les stress les plus rigoureux (Baatout et al., 2005, Baatout et al., 2006, Baatout et al., 2007).

C’est aussi le cas de l’intégrité et du potentiel membranaire pour la bactérie Acinetobacter sp.

soumise à un stress cuivrique (Boswell et al., 1998).

Le taux d’oxygène radicalaire varie dans la cellule du fait des réactions aspécifiques des ions métalliques lourds avec les molécules du contenu cellulaire (Hobman et al., 2007).

L’activité réductase mesure le taux de transfert électronique dans la chaîne respiratoire qui (Smith et McFeters, 1997). Ce paramètre a été mesuré car il nous est apparu évident que la valence du cuivre est fondamentale dans les processus de détoxication du cuivre et qu’il est vraisemblable que les électrons transférés transitent par la chaîne respiratoire avant d’aboutir à l’accepteur final d’électron.

Il s’agit pour la première fois de visualiser par cytométrie de flux des effets physiologiques du cuivre à des concentrations sublétales.

L'étude par cytométrie de flux se concentrera sur la souche sauvage CH34, la souche sans plasmides AE104 et la souche porteuse du cosmide pMOL1024, AE1744.

Chaque mesure, pour une souche et une concentration donnée, est rapportée à la mesure réalisée sur des cellules non exposées au Cu(II) (dont la valeur est fixée à 100%). L’approche est donc différentielle comme en protéomique ou transcriptomique, ce qui permet d’éliminer beaucoup d’interférences.

Deux conditions ont été choisies : (i) un temps de contact long (culture en présence de Cu(II)), c’est-à-dire une population adaptée ou (ii) un choc bref en présence de Cu(II), c’est-à-dire un stress aigu. Ces conditions ont montré leur intérêt dans le cadre d’une étude transcriptomique de Pseudomonas aeruginosa vis-à-vis du Cu(II) (Teitzel et al., 2006).

Observation d’une population adaptée au Cu(II).

Variation de la taille avec la concentration en Cu(II).

La taille des cellules de C. metallidurans ne varie pas aux concentrations sublétales en Cu(II).

La taille augmente légèrement lorsque la concentration en Cu(II) s’approche de la CMI : à 0,75 et 0,9 mM en Cu(II) pour AE104 et à 1,2 mM en Cu(II) pour AE1744, mais plus nettement avec CH34: de 20 à 50 % de 0,9 à 1,2 mM en Cu(II) (voir annexe 2).

Variation de la granularité avec la concentration en Cu(II).

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Les variations observées pour la granularité sont probablement dues à la concentration élevée en Cu(II) : la cellule se déstructure et perd sa forme de bâtonnet droit. La souche AE104 meurt à ces concentrations. L’augmentation de la granularité pourrait correspondre à la formation d'inclusions sous l’action d’un stress, un phénomène déjà observé pour d’autres stress rigoureux (Baatout et al., 2005).

Variation de l’intégrité membranaire avec la concentration en Cu(II) :

L’intégrité membranaire de la souche sauvage est mieux préservée que celle de ses dérivés AE104 et AE1744.

Les dommages membranaires sont mesurés par l’entrée de l’iodure de propidium. Lorsqu’il pénètre dans la cellule, il s’intercale dans l’ADN et émet une fluorescence mesurée par cytométrie. La fluorescence est d’autant plus élevée que les membranes externe et interne sont endommagées.

Figure IV.6 : Evolution de la perméabilité membranaire moyenne à différentes concentrations en Cu(II) pour des cellules prélevées dans le tapis bactérien.

* ****** ***** **

***

**

****

*

**

****

* ****** ***** **

***

**

****

*

**

****

Légende : L’intégrité membranaire est mesurée grâce à l’iodure de propidium : la fluorescence est d’autant plus élevée que le membrane est altérée. Les trois souches de C.

metallidurans pour lesquelles les mesures ont été réalisées sont notées dans l’encart. « * » indique une différence par rapport à la référence (à 100 %) avec une certitude de 95%, « ** »

indique une différence par rapport à la référence (à 100 %) avec une certitude de 99,9 %.

La perméabilité membranaire des souches augmente significativement avec la concentration en Cu(II) (figure IV.6).

L’augmentation est la plus marquée chez AE1744 où elle atteint un maximum de 300 % à 0,9 mM en Cu(II).

L’augmentation atteint 200% pour CH34 et AE104 lorsque les concentrations en Cu(II) sont proches de leurs CMI respectives (soit 1,2 et 0,75 mM).

A toutes les concentrations en Cu(II) testées, la souche sauvage CH34 montre une augmentation de perméabilité moins marquée que AE1744 et AE104.

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Variation du potentiel membranaire avec la concentration en Cu(II).

Le potentiel membranaire, généré par l'hydrolyse de l'ATP et les transferts électroniques à la surface membranaire, est mesuré par un marqueur cationique, le DiOC2(3). Ce marqueur lipophile s'accumule à l'intérieur des bactéries (dont le potentiel de membrane est négatif à l'intérieur et positif à l'extérieur) en émettant des fluorescences différenciées suivant qu’il s’accumule à l’intérieur ou à l’extérieur de la cellule. Le rapport de ces fluorescences reflète la différence de potentiel membranaire.

Les différences de potentiels membranaires des trois souches semblent diminuer légèrement jusqu’à 0,6 mM. Cependant, la variabilité entre les échantillons utilisés ne permet pas d’observer de variations significatives. (voir annexe 2). Au-delà de 0,6 mM, on note un accroissement du potentiel membranaire chez AE1744.

Variation du taux d’oxygène radicalaire avec la concentration en Cu(II) : La présence des gènes cop limite la formation de radicaux oxygénés.

Le taux d’oxygène radicalaire regroupe un ensemble d’ions hautement réactifs (OH°, OH^-°, H₂O₂, RO°, O₂^-°…) qui sont générés par des réactions entre un ion ou une molécule très réactive (dans notre cas, les ions Cu(I) et Cu(II)) avec différents groupes hydroxylés présents dans les molécules organiques. L'hydroéthidine est le marqueur fluorescent utilisé pour la mesure de la production d'oxygène radicalaire.

Figure IV.7 : Evolution du taux d’oxygène radicalaire moyen à différentes concentrations en Cu(II) pour des cellules prélevées dans le tapis bactérien.

* * * *

*

* * * *

*

Légende : L’hydroéthidine réagit avec les radicaux libres oxygénés intracellulaires et émet alors une fluorescence d’autant plus élevée que le taux de radicaux libres oxygénés est élevé.

Les trois souches de C. metallidurans pour lesquelles les mesures ont été réalisées sont notées dans l’encart. « * » indique une différence par rapport à la référence (à 100 %) avec une

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La production d'oxygène radicalaire augmente significativement avec la concentration en Cu(II) chez AE104 : l’augmentation est de 50% à 0.3 mM seulement et atteint un maximum à de 400% à 0,9 mM en Cu(II) (figure IV.7).

Le taux d'oxygène radicalaire est stable pour la souche CH34 quelle que soit la concentration en Cu(II). Ce résultat suggère que le groupe de gènes cop de pMOL30 empêche l’interaction aspécifique des ions Cu(II) avec les molécules organiques intracellulaires.

Le taux d’oxygène radicalaire d’AE1744 augmente uniquement lorsque la concentration en Cu(II) est proche de la CMI.

Variation de l’activité réductase avec la concentration en Cu(II).

Le marqueur RedoxSensor Green pénètre à travers la membrane bactérienne et il émet un signal fluorescent stable proportionnel au niveau de l'activité réductase.

Aucune information n'a pu être tirée des résultats obtenus car la variabilité entre échantillons était trop grande (résultats non présentés).

Les mesures par cytométrie après un contact long entre cellules et cuivre montrent :

1. Pour tous les paramètres physiologiques observés, les variations dans la population bactérienne semblent homogènes : on ne voit pas de sous-populations.

2. Sur les six paramètres mesurés, deux (activité réductase, potentiel de membrane) ont une variabilité trop élevée et les résultats ne peuvent être interprétés, deux diffèrent à des concentrations sublétales et peu toxiques (taux d’oxygène radicalaire, perméabilité membranaire) et deux diffèrent de la condition contrôle seulement lorsque la concentration en Cu(II) est proche de la CMI (taille, granularité).

3. Pour AE104, dépourvue des gènes cop, on observe une augmentation du taux d’oxygène radicalaire et de la perméabilité membranaire, caractéristiques d’une cellule en souffrance : sa membrane est dégradée et son taux de radicaux libres est élevé.

4. Pour CH34, la perméabilité membranaire augmente mais le taux d’oxygène radicalaire reste stable quelle que soit la concentration en Cu(II). L’augmentation de perméabilité ne semble cependant pas préjudiciable aux cellules vivantes puisque le taux d’oxygène radicalaire est bien contrôlé.

5. Pour AE1744, les observations sont identiques à celles faites pour sur la souche CH34, excepté que la perméabilité membranaire augmente plus rapidement avec la concentration en Cu(II). Donc, l’îlot cop n’est pas responsable du maintien de l’intégrité membranaire. Par contre, ses gènes sont responsables du maintien d’un taux d’oxygène radicalaire bas, et ce, malgré une perméabilité deux fois plus élevée que dans la souche sauvage.

6. Les mesures par cytométrie montrent que la présence des plasmides pMOL30 et pMOL28 a un effet sur le maintien de l’intégrité membranaire. Il est possible que les gènes gtr de pMOL30 participent au maintien de l’intégrité membranaire. Ces gènes sont induits par le Cu(II) (voir point I.4.3) (Monchy, 2007).

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Observation d’une population soumise à un choc de Cu(II) Variation de la taille avec la concentration en Cu(II).

La taille cellulaire des trois souches diminue très légèrement (de moins de 5 %) et ce, de manière significative (voir annexe 2).

Variation de la granularité avec la concentration en Cu(II).

Pour les trois souches la granularité augmente significativement en fonction de la concentration en Cu(II). L'augmentation est la plus marquée chez AE1744 et AE104 (de l’ordre de 50%) et plus faible chez CH34 (de l’ordre de 25 %) (voir annexe 2).

Variation de l’intégrité membranaire avec la concentration en Cu(II) : Les variations observées ne sont pas significatives (résultat non présenté).

Variation du potentiel membranaire avec la concentration en Cu(II) : La présence de l’îlot cop réduit le potentiel membranaire.

Le potentiel membranaire (figure IV.8) diminue fortement pour AE1744 (jusqu'à 50 %), tandis que pour les deux autres souches, la diminution est moins marquée et n’est pas significative pour CH34.

Figure IV.8 : Evolution du potentiel membranaire moyen à différentes concentrations en Cu(II) pour des cellules soumises à un choc de Cu.

** * *

* **

** * *

* **

Légende : Le potentiel membranaire est mesuré grâce à un marqueur fluorescent cationique qui émet une fluorescence différenciée suivant son accumulation d’un côté ou l’autre de la membrane. Plus la différence de fluorescence est élevée, plus le potentiel de membrane est élevé. Les trois souches de C. metallidurans pour lesquelles les mesures ont été réalisées sont

notées dans l’encart. « * » indique une différence par rapport à la référence (à 100 %) avec une certitude de 95%, « ** » indique une différence par rapport à la référence (à 100 %) avec

une certitude de 99,9 %.

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Variation du taux d’oxygène radicalaire avec la concentration en Cu(II).

Figure IV.9 : Evolution du taux d’oxygène radicalaire moyen à différentes concentrations en Cu(II) pour des cellules soumises à un choc de Cu.

** * ** * ** *

Légende : L’hydroéthidine réagit avec les radicaux libres oxygénés intracellulaires et émet alors une fluorescence d’autant plus élevée que le taux de radicaux libres oxygénés est élevé.

Les trois souches de C. metallidurans pour lesquelles les mesures ont été réalisées sont notées dans l’encart. « * » indique une différence par rapport à la référence (à 100 %) avec une certitude de 95%, « ** » indique une différence par rapport à la référence (à 100 %) avec une

certitude de 99,9 %.

La production d'oxygène radicalaire augmente significativement dès 0.3 mM pour AE1744 et AE104. Pour CH34, la production d'oxygène radicalaire reste inchangée (figure IV.9).

Variation de l’activité réductase avec la concentration en Cu(II) : L’îlot cop augmente l’activité réductase.

Figure IV.10 : Evolution de l’activité réductase moyenne à différentes concentrations en Cu(II) pour des cellules soumises à un choc de Cu.

**

*

* *

**

*

* *

**

Légende : L’activité réductase est mesurée grâce au Redox Green Sensor qui émet une fluorescence d’autant plus intense que le taux de transfert électronique est élevé dans la chaîne respiratoire. Les trois souches de C. metallidurans pour lesquelles les mesures ont été

réalisées sont notées dans l’encart.« * » indique une différence par rapport à la référence (à 100 %) avec une certitude de 95%, « ** » indique une différence par rapport à la référence (à

100 %) avec une certitude de 99,9 %.

L'activité réductase augmente significativement jusqu'à 800 % pour AE1744, jusqu'à 200 % pour AE104 et diminue pour CH34. (figure IV.10).

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Après un choc de Cu(II), l’activité réductase de la souche AE1744 atteint le double de la souche sauvage CH34, tandis que l’activité de la souche sans plasmide n’augmente que d’un facteur deux au maximum et reste bien en deçà des niveaux atteints par la souche sauvage.

Les mesures cytométriques après un choc de Cu(II) montrent que :

1. Quel que soit le paramètre physiologique observé, les variations dans la population bactérienne semblent homogènes : on ne voit pas de sous-populations.

2. Cinq des six paramètres observés varient lors d’un choc au Cu (tous sauf la perméabilité membranaire), ces variations n’évoluent pas de la même façon selon le génotype de la souche.

3. Les réponses observées pour une population soumise à un stress aigu diffèrent fortement des observations faites pour une population soumise à un stress chronique.

4. Les paramètres activité réductase et potentiel membranaire évoluent de façon inversée pour AE104 et AE1744 : quand l’activité réductase augmente, le potentiel de membrane diminue. Autrement dit, l’activité réductase intense utiliserait la différence de potentiel membranaire. Cette activité semble liée à l’îlot cop car les écarts sont beaucoup plus faibles chez AE104. Cette hypothèse suggère que la réponse à un choc de Cu(II) est modéré dans la souches sauvage CH34, présumant donc de la présence de régulateurs d’expression du système Cop.

5. La membrane interne n’est que peu affectée. Il semble que la mortalité au moment d’un stress aigu résulte plutôt des réactions radicalaires due aux ions Cu(II) que de la désintégration membranaire.