Liste des abréviations
Actine –F actine filamenteuse
AH acide hyaluronique
αMEM α minimum essential medium
APC allophycocyanine
β2-/- β2m knock-out
β2m β2-microglobuline
BFU burst-forming unit
BMP bone morphogenic protein
BSA bovine serum albumin
CBD cell binding domain
Cdk cyclin dependant kinase
CFSE carboxy fluorescéine diacétate succinimidyl ester
CFU colony forming unit
CLT culture à long terme
CMN cellule mononucléée
CMSP cellule mobilisée dans le sang périphérique
CMV cytomégalovirus
CPH cellule progénitrice hématopoïétique
CS cellule souche
CS calf serum
CS-1 connecting segment-1
CSH cellule souche hématopoïétique CSM cellule souche mésenchymateuse
CSPH cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques CSSP cellule souche du sang périphérique
Cy cyclophosphamide
DMSO diméthylsulfoxyde
EBV Epstein-Barr virus
E-cadhérine epithelilal-cadherin
EDTA ethylene diamine tetraacetic acid
EPO érythropoïétine
FAK focal adhesion kinase
FBS fetal bovine serum
FITC fluorescéine isothiocyanate FL fleet ligand, Flt-3 ligand Flt-3 fetal liver tyrosine kinase - 3
Fn fibronectine
G-CSF granulocyte - colony stimulating factor
GEMM granulocyte erythroïd megakaryocyte macrophage
GM granulocyte macrophage
GM-CSF granulocyte macrophage - colony stimulating factor GPCR G protein coupled receptor
GVHD graft-versus-host disease
GVL graft versus leukemia
HBD heparin binding domain
HBSS Hanks’s balanced salt solution
HLA human leucocyte antigen
HUVEC human umbilical vein endothelial cells ICAM-1 intercellular adhesion molecule – 1
Ig immunoglobuline
IFM intensité de fluorescence moyenne
Il interleukine
IMDM Iscove’s modified Dulbecco’s medium LFA-1 leucocyte function antigen - 1
LTC-IC long term culture – initiating cell
MadCAM-1 mucosal addressin cell adhesion molecule - 1 MCF(R) mean channel fluorescence (ratio)
MEC matrice extracellulaire
MIP 1α macrophage-inflammatory protein 1α
MK mégakaryocyte
MMP matrix metalloproteinase
MO moelle osseuse
NK natural killer
NOD/SCID non obese diabetic severe combined immune deficient
PBS phosphate-buffered saline
PE phycoérythrine
PI3-K phosphatidyl inositol-3 kinase
PKC protéine kinase C
PLC phospholipase C
PSGL-1 P-selectin glycoprotein ligand
PTH parathormone
ROS Reactive oxygen species
SC sang de cordon
SCF stem cell factor
SDF-1 stromal cell derived factor-1
SP sang périphérique
SRC SCID repopulating cell
TBI total body irradiation
TGFβ transforming growth factor β TNFα tumor necrosis factor α
TPO thrombopoïétine
VCAM-1 vascular cell adhesion molecule - 1 VE-cadhérine vascular endothelial-specific cadherin
VLA very late antigen
Table des matières
1 INTRODUCTION GENERALE ... 9
1.1 L’HEMATOPOÏESE ... 9
1.1.1 Les cellules hématopoïétiques et leur organisation hiérarchique ... 9
1.1.2 Origine des cellules souches hématopoïétiques ... 12
1.1.3 Identification des cellules souches hématopoïétiques ... 14
1.1.4 Régulation de l’hématopoïèse ... 18
1.2 MOTILITE DES CSH ... 25
1.2.1 Mobilisation des cellules souches de la moelle vers le sang périphérique... 25
1.2.2 Modèle de l’implantation médullaire des CSH ... 27
1.2.3 Les récepteurs d’adhérence des cellules souches et progéniteurs ... 31
1.2.4 Motilité et chimiotaxie des CSH : le couple SDF-1 /CXCR-4 ... 41
1.2.5 Les enzymes de dégradation ... 45
1.2.6 Le détachement cellulaire (la dé-adhérence cellulaire) ... 46
1.2.7 Conditionnement de l’hôte et implantation médullaire des CSH ... 48
1.3 EXPANSION EX VIVO DES CSH ... 49
1.3.1 Perspectives cliniques de l’expansion ex vivo ... 49
1.3.2 Essais (pré)cliniques ... 50
1.3.3 Mise en cycle et modifications fonctionnelles des cellules souches ... 51
2 MATERIELS ET METHODES ... 55
2.1 GENERALITES ... 55
2.1.1 Sources cellulaires ... 55
2.1.2 Culture d’expansion à court terme des CSH ... 56
2.1.3 Culture à long terme (LTC-IC) ... 57
2.1.4 Mesure de l’expression des intégrines, du CD44 et du récepteur CXCR-4 par cytométrie en flux ... 58
2.2 ALTERATIONS DE LA FONCTION DES INTEGRINES A LA SURFACE DES LTC-IC DE SANG MOBILISE AMPLIFIEES EX VIVO ... 59
2.2.1 Visualisation du nombre de divisions cellulaires : « cell tracking » ... 59
2.2.2 Fonction des intégrines après amplification ex vivo des LTC-IC : schéma général ... 60
2.2.3 Capacité d’adhérence des LTC-IC ... 61
2.2.4 Capacité migratoire des LTC-IC ... 63
2.2.5 Contrôle de la prolifération des LTC-IC par les récepteurs d’adhérence ... 65
2.3 LA PERTE DE FONCTION DU VLA-4 SUR LES CELLULES SOUCHES HEMATOPOÏETIQUES APRES EXPANSION EX VIVO RESULTE D’UNE AFFINITE EXCESSIVE POUR VCAM-1 ET D’UNE SENSIBILITE REDUITE AUX STIMULI ACTIVATEURS ... 66
2.3.1 Protocole de transplantation in vivo ... 66
2.3.2 Activité de VLA-4 avant et après expansion : capacité d’adhérence à la forme soluble de VCAM-1 ... 69
2.3.3 Activité des intégrines β1 avant et après expansion : expression de la forme active du CD29 .... 71
2.3.4 Etat fonctionnel du CXCR-4 et réactivité des cellules au SDF-1 avant et après expansion ... 72
2.3.5 Adhérence des cellules CD34+ au VCAM-1 ... 73
2.3.6 Migration des cellules CD34+ au travers de VCAM-1 ... 73
3 ALTERATION DE LA FONCTION DES INTEGRINES A LA SURFACE DES LTC-IC DE SANG MOBILISE AMPLIFIEES EX VIVO ... 75
3.1 INTRODUCTION ... 75
3.2 OBJECTIFS DE TRAVAIL ... 77
3.3 RESULTATS ... 77
3.3.1 « Cell tracking » : mise au point. ... 77
3.3.2 Activité des intégrines au cours de cycles cellulaires successifs ... 80
3.3.3 Expression des intégrines VLA-4, VLA-5 et LFA-1 au cours des divisions cellulaires successives ... 87
3.4 DISCUSSION ... 90
4 LA PERTE DE FONCTION DU VLA-4 SUR LES CELLULES SOUCHES HEMATOPOÏETIQUES APRES EXPANSION EX VIVO RESULTE D’UNE AFFINITE EXCESSIVE POUR VCAM-1 ET
D’UNE SENSIBILITE REDUITE AUX STIMULI ACTIVATEURS... 93
4.1 INTRODUCTION ... 93
4.2 OBJECTIFS DE TRAVAIL ... 94
4.3 RESULTATS ... 95
4.3.1 Mécanismes d’implantation médullaire des SRC amplifiées ex vivo : transplantation à la souris NOD/SCID β2-/-... 95
4.3.2 Mécanismes d’implantation médullaire des SRC amplifiées ex vivo : transplantation à la souris NOD/SCID ... 102
4.3.3 Contrôle des effets indirects des anticorps neutralisants sur les cellules CD34+ ... 106
4.3.4 Activité des intégrines et du récepteur CXCR4 après expansion ... 111
4.4 DISCUSSION ... 119
5 CONCLUSIONS ... 125
6 REFERENCES ... 127
1 Introduction générale
1.1 L’hématopoïèse
L'hématopoïèse peut être définie comme l'ensemble des mécanismes qui concourent à la fabrication et au remplacement continu et régulé des cellules sanguines.
Au cours de l’ontogenèse, l'hématopoïèse embryonnaire est initialement extramédullaire de la 3ème à la 20ème semaine de développement. Localisée dans la région aorto-gonado- mésonéphrique, elle gagnera progressivement le foie fétal. L’hématopoïèse hépatique débute aux alentours de la 6ème semaine de développement. A partir de la 15ème semaine, la moelle osseuse (MO) devient hématopoïétique et prend le relais du foie fétal (Morrison et al, 1995). L'hématopoïèse chez l'homme adulte a lieu exclusivement dans la MO au niveau des cavités osseuses, plus précisément au niveau d’un tissu de soutien médullaire encore mal défini à ce jour.
1.1.1 Les cellules hématopoïétiques et leur organisation hiérarchique
Le compartiment hématopoïétique contient les cellules assurant le remplacement permanent et strictement contrôlé des différentes cellules rencontrées dans le sang périphérique telles que les globules rouges, les plaquettes, les monocytes-macrophages, les polynucléaires basophiles, éosinophiles et neutrophiles ainsi que les lymphocytes. On notera que les cellules souches hématopoïétiques sont également capables de donner naissance aux cellules dendritiques.
Schématiquement, trois compartiments cellulaires peuvent être définis : les cellules souches pluripotentes, les progéniteurs et les précurseurs.
Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont des cellules rares, multipotentes et douées d’auto-renouvellement. Le caractère multipotent se définit par la capacité de donner naissance à des cellules pouvant se différencier en chacune des lignées hématologiques.
L’auto-renouvellement se définit par la capacité de générer des cellules filles ayant conservé leur immaturité ce qui assure une réserve constante de cellules souches durant toute la vie de l’individu. Ces cellules ne sont pas identifiables morphologiquement.
La majorité des CSH sont « dormantes » et demeurent en phase G0 du cycle cellulaire (Hao et al, 1995;Jordan et al, 1996). Seul un petit nombre de cellules souches activées contribue à la production de l’ensemble des lignées sanguines (Prchal et al, 1996). Ce phénomène appelé « succession clonale » aboutit à la génération oligoclonale de cellules progénitrices primitives de durée de vie définie. Malgré le temps de réplication très long des cellules souches (Mahmud et al, 2001) la majorité d’entre elles participent, de façon séquentielle, à la succession clonale ; elles se divisent périodiquement puis retournent dans leur état de quiescence (Abkowitz et al, 1995).
Figure 1.1. Schéma général de l’hématopoïèse (Reya et al, 2001;Iwasaki & Akashi, 2007).
CSH : cellules souches hématopoïétiques PM : progéniteur multipotent
PLGM : progéniteur lympho-granulo-monocytaire PLC : progéniteur lymphoïde commun
PMC : progéniteur myéloïde commun PGM : progéniteur granulo-monocytaire PEM : progéniteur érythro-mégakaryocytaire PMk : progéniteur mégakaryocytaire
PEr : progéniteur érythrocytaire.
Les progéniteurs sont des cellules engagées, de manière irréversible, dans un processus de différenciation graduelle aboutissant à la génération des précurseurs des différentes lignées sanguines. Les progéniteurs se distinguent fondamentalement des cellules souches par leur incapacité à réaliser des divisions d’auto-renouvellement.
Doués d’un haut pouvoir de prolifération, les progéniteurs, originaires des rares cellules souches multipotentes, sont capables de donner naissance à un grand nombre de précurseurs. Le rythme de prolifération des progéniteurs s’accroît progressivement au fur et
Les progéniteurs hématopoïétiques sont mis en évidence en utilisant une méthodologie de clonage en milieu semi-solide (figure 1.2.). Ce milieu est composé de méthylcellulose et de différents facteurs de croissance. Celui-ci est conçu pour stimuler la prolifération et la différenciation des cellules progénitrices hématopoïétiques (CPH) dénommées colony- forming unit (CFU). Son état semi-solide limite la diffusion des cellules produites, ce qui permet la formation de colonies distinctes reconnaissables morphologiquement.
Figure 1.2. Prolifération clonogène des progéniteurs hématopoïétiques en culture semi- solide.
Les progéniteurs s’organisent selon une hiérarchie fonctionnelle, identifiable selon leur potentiel prolifératif et différentiatif et du délai de maturation des colonies produites.
Après 2 semaines en culture, les progéniteurs pouvant être reconnus sont (figure 1.3.) : - Les CFU-GEMM (ou CFU-Mix) : colonies provenant de progéniteurs multipotents. Du fait
de leur grande immaturité et de leur potentiel prolifératif et différenciatif, elles sont capables de générer de très grandes colonies composées de cellules granuleuses et macrophagiques ainsi que de cellules érythroïdes et mégakaryocytaires.
- Les CFU-GM : capables de donner des colonies granuleuses et macrophagiques.
- Les BFU-E : à l’origine de foyers de colonies érythroïdes.
- Les CFU-E : progéniteurs plus matures que les BFU-E, capables de générer des petites colonies érythroïdes.
BFU-E CFU-GM CFU-GEMM
Figure 1.3. Photographies de colonies BFU-E, CFU-GM, et CFU-GEMM.
Les précurseurs sont des cellules déjà reconnaissables morphologiquement, correspondant à des cellules en cours de maturation avant leur passage dans la circulation sanguine, lequel intervient après différenciation terminale. L’acquisition de fonctions cellulaires spécialisées aboutit à l’arrêt progressif des divisions cellulaires.
1.1.2 Origine des cellules souches hématopoïétiques
1.1.2.1 La moelle osseuse
Source traditionnelle de CSH, la MO présente dans les crêtes iliaques est prélevée par ponction médullaire sous anesthésie générale. Elle sera ensuite infusée dans la circulation générale à un individu receveur compatible.
cellules mobilisées dans le sang périphérique conservent la capacité de migrer dans la MO et de reconstituer un système hématopoïétique complet.
Cette méthode offre deux avantages par rapport à la récolte de CS de MO(Eaves, 1993).
D’une part, le donneur ne doit subir ni anesthésie générale ni ponction traumatique de MO.
D’autre part, la reprise hématologique est plus rapide par rapport à la greffe de moelle en raison du plus grand nombre de CS que l’on peut récolter par ce moyen.
Néanmoins, le potentiel prolifératif et différenciatif des cellules CD34+ mobilisées est inférieur à celui des CS de MO. La fréquence des cellules souches véritables parmi les CSPH qui composent ce type de greffon est également moindre en comparaison des autres sources cellulaires. Un nombre plus important de cellules mobilisées est nécessaire pour obtenir un repeuplement hématopoïétique chez la souris NOD/SCID (Wang et al, 1997).
Les limitations principales de la transplantation allogénique de CSH sont, d’une part, le manque de donneurs compatibles et d’autre part les complications résultant des réactions GVHD d’autant plus sévères que l’incompatibilité au niveau du système d’histocompatibilité HLA est importante. La présence de lymphocytes T activés responsable de l’effet GVHD dans les greffons de CSH adultes impose des critères de sélection de donneurs HLA compatibles très stricts.
1.1.2.3 Le sang de cordon ombilical
Le sang refluant du placenta est riche en cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques (CSPH). Celui-ci peut être recueilli sans risque pour la mère ou l’enfant et stocké pour une utilisation future.
Du fait de leur immaturité, l’utilisation des CSH de sang de cordon (SC) offre plusieurs avantages cliniques.
En effet, l’immaturité des CS repeuplantes réduit les allo-réactions potentielles des lymphocytes du receveur vis-à-vis du greffon, ce qui diminue l’incidence et la sévérité de la réaction du greffon contre l’hôte (GVHD) lors d’une transplantation de compatibilité partielle du système d’histocompatibilité (human leucocyte antigen, HLA). De ce fait, une ou deux incompatibilités HLA sont tolérées entre le greffon et le patient receveur ce qui permet d’étendre le pool de donneurs compatibles.
Les unités de SC sont également composées d’un répertoire complet de lymphocytes T, de cellules natural killer (NK) et de lymphocytes T cytotoxiques immatures pouvant générer un effet graft-vs-leukemia (GVL) après transplantation (Gluckman, 2000).
Le risque de transmission d’une infection par un virus latent tel que le cytomégalovirus (CMV) et Epstein-Barr (EBV) est réduit.
La fréquence des SC ayant un haplotype HLA rare est plus haute par rapport aux autres sources cellulaires.
De par le faible nombre de progéniteurs hématopoïétiques contenus dans les SC, le risque d’obtenir un repeuplement médullaire insuffisant ou un ralentissement de la reprise hématologique après greffe est relativement élevé. Contrairement aux transplantations de MO où la compatibilité HLA d’un donneur non apparenté est primordiale, le facteur de prédiction le plus important, dans le cas des transplantations de SC, est le nombre de cellules nucléées infusées (Gluckman et al, 2005;Wagner et al, 2002). Pour cette raison,
cette source cellulaire est principalement utilisée chez l’enfant. La transplantation de SC chez l’adulte doit être considérée comme une option acceptable lorsqu’un donneur non apparenté HLA compatible n’est pas disponible(Burgio & Locatelli, 1997).
Afin d’augmenter la dose infusée, la transplantation combinée de 2 SC partiellement compatibles a été évaluée en clinique. Cent jours après greffe, un seul donneur était détectable chez tous les patients. Cette prédominance d’une unité de SC sur l’autre a été attribuée, non pas à la dose de cellules mononuclées ou CD34+ infusées ni aux incompatibilités HLA, mais à la présence des cellules CD3+ présentes dans les greffons des deux donneurs (Barker et al, 2005).
La transplantation de 2 unités de sang de cordon compatibles reste envisageable et permettrait de franchir l’obstacle de la dose infusée, facteur limitant principal chez l’adolescent et l’adulte.
1.1.3 Identification des cellules souches hématopoïétiques
1.1.3.1 Caractérisation antigénique
Les CS et les progéniteurs primitifs ne sont pas reconnaissables morphologiquement du fait de leur nature indifférenciée. Ces deux populations cellulaires peuvent être isolées sur base d’un profil antigénique propre.
L’antigène CD34
L’antigène de surface CD34, ou sialomucine, est considéré comme l’un des principaux marqueurs des cellules souches hématopoïétiques. Néanmoins, la population CD34+ s’est avérée être une population hétérogène, associant des progéniteurs tardifs, au potentiel de différenciation limité, et de véritables cellules souches, qui ne sont que très minoritaires (Krause et al, 1996). Cet antigène, exprimé par approximativement 1.5% des cellules médullaires humaines (Hao et al, 1995), est régulé négativement au cours de la différenciation cellulaire. En fin de différenciation, les cellules hématopoïétiques matures n’expriment plus l’antigène CD34. Cet antigène est présent sur tous les progéniteurs primitifs hématopoïétiques quelle que soit la source cellulaire dont ils proviennent (SC, SP, MO). Des techniques d’isolement et de purification sont réalisées sur base de la présence ou de l’absence de cet antigène de surface.
Il faut toutefois préciser que l’antigène CD34 n’est pas exprimé exclusivement par les CSPH.
On le retrouve également à la surface des cellules endothéliales.
La transplantation de ces cellules aux souris immunodéfiencentes NOD/SCID s’accompagne d’une régénération hématopoïétique qui se caractérise par une descendance myéloïde et lymphoïde B et T.
Les données recueillies tant in vitro qu’in vivo suggèrent que les cellules CD34- précèderaient leurs homologues CD34+ dans la hiérarchie de l’hématopoïèse chez l'homme. Cette découverte remet donc en cause le dogme selon lequel l’antigène CD34 serait présent à la surface de toutes les CSH.
L’antigène AC133
L’antigène AC133 est une glycoprotéine de 120 kD présente sélectivement à la surface des CSH CD34+ primitives ainsi que sur la majorité des progéniteurs engagés dans la voie granulo/monocytaire. Cet antigène n’est pas détectable à la surface des cellules hématopoïétiques CD34- en cours de différenciation et en fin de maturation ni à la surface des cellules endothéliales de veines ombilicales humaines cultivées (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC).
Les cellules co-exprimant les antigènes AC133 et CD34, lorsqu’elles sont transplantées à un fœtus de mouton, ont la capacité de repeupler la moelle de l’hôte. Les cellules humaines, isolées des MO chimériques de ce modèle animal, sont capables de repeupler un hôte secondaire. Ceci nous montre le potentiel de repeuplement médullaire à long terme de ces cellules (Yin et al, 1997).
Approximativement 75% des cellules mononuclées de SC sélectionnées sur base du CD34 expriment conjointement l’AC133, tandis que pratiquement toutes les cellules purifiées selon l’expression de l’AC133 sont CD34+. De plus, les cellules AC133+ contiennent environ 4 fois plus de cellules aptes à repeupler l’environnement médullaire de souris SCID (SCID repopulating cells, SRC) en nombre absolu comparativement aux cellules CD34+ (Suzuki et al, 2006).
Les cellules de SC AC133+ CD34- sont capables de générer des cellules CD34+ en culture. Ces observations suggèrent qu’au moins une fraction de la population cellulaire AC133+ est ancestrale aux cellules CD34+ (Summers et al, 2004).
L’antigène AC133 est une alternative au CD34 dans les protocoles de sélection de CSH. Etant donné qu’AC133 n’est pas exprimé par les blastes leucémiques, la sélection des CSH AC133+
permet une déplétion des cellules tumorales contaminant les autogreffes.
Complexe phénotypique
Malgré l’absence d’antigène spécifique des CSH primitives, un consensus phénotypique a été établi. Contrairement aux progéniteurs différenciés, les CSH expriment CD34, AC133 ainsi que CD90 (Baum et al, 1992;Craig et al, 1993) (ou Thy-1) et CD117 (Ashman et al, 1991). Par contre, elles n’expriment pas CD38 (Terstappen et al, 1991) et HLA-DR (Andreoni et al, 1990).
1.1.3.2 Epreuves fonctionnelles
Détermination des progéniteurs primitifs (LTC-IC)
Les CSH, contrairement aux cellules progénitrices hématopoïétiques, sont douées d’une capacité d’autorenouvellement. Cette propriété exclusive des CSH est mise à profit dans certains modèles de culture cellulaire afin d’identifier précisément les CS primitives.
Les CSH sorties de leur environnement tissulaire in vivo entrent difficilement en réplication et perdent leur potentiel multipotent. Ceci reflète la difficulté à reconstituer in vitro la complexité de la « niche » médullaire, refuge des CSH. C’est Mike Dexter qui, en 1977, développa une culture constituée d’une couche de cellules stromales adhérentes dans laquelle s’insinuent les CSH. Cette couche stromale, issue de la moelle osseuse, est composée d’une population cellulaire hétérogène comprenant des fibroblastes, des cellules endothéliales, des adipocytes, des macrophages ainsi que leur matrice extracellulaire composée de protéoglycanes et des glycosaminoglycanes sur lesquels viennent s’adsorber diverses molécules régulatrices dont les cytokines.
La culture de Dexter permet, pendant plusieurs semaines, la survie et la prolifération des progéniteurs les plus primitifs ayant conservé leur potentiel d’autorenouvellement (Dexter et al, 1977). On les appelle de ce fait les long term culture-initiating cells (LTC-IC). Après cinq semaines en culture à long terme, l’identification des LTC-IC se fait indirectement en plaçant les cellules résiduelles en milieu semi-solide; ceci stimule la prolifération clonogène des cellules progénitrices dérivant des cellules ancestrales. L’énumération des colonies permet de quantifier l’activité LTC-IC (figure 1.4.).
Modèle de transplantation xénogénique
Les tests in vitro ne peuvent mimer les conditions de fonctionnement d’un organisme entier, ce qui les rendent peu appropriés à l’identification des CS responsables de la reconstitution hématopoïétique in vivo. Ceci explique les efforts entrepris pour créer un modèle expérimental in vivo où les cellules souches humaines pourraient s’implanter et se développer dans la MO d’un receveur xénogénique, produisant une descendance lympho- myéloïde active pendant plusieurs mois.
Le modèle murin non-obese diabetic/severe combined immune deficiency (NOD/SCID), créé par Shultz et al., est habituellement utilisé. Ces souris ont été générées par croisement entre les souris atteintes d’un diabète congénital (non obese diabetic, NOD) et les souris présentant le syndrome d’immunodéficience combinée sévère (severe combined immune deficiency, SCID). Les souris NOD sont caractérisées par un déficit en cellules NK, l’absence de complément circulant, ainsi qu’une déficience dans la fonction et la différenciation des cellules présentatrices d’antigène. Les souris SCID présentent un déficit sévère en lymphocytes B et T fonctionnels. La combinaison de leurs déficits immunitaires respectifs en fait un modèle immuno-tolérant bien adapté à l’étude du repeuplement médullaire par les CSH humaines.
Néanmoins, l’immunotolérance de ces souris reste partielle. L’immunité résiduelle reste donc un des facteurs limitant l’implantation et le repeuplement médullaire par les cellules humaines (Glimm et al, 2001;Kerre et al, 2002). De plus, l’homologie entre les facteurs de croissance murins et humains n’est que partielle, ce qui limite la prolifération et la différenciation des CSH implantées (Lapidot et al, 1992).
Des travaux tentent continuellement d’améliorer l’immunotolérance de ce modèle. La souche β2mnull NOD/SCID est une variante présentant un déficit supplémentaire de l’immunité cellulaire. L’activité NK des souris NOD/SCID a été éliminée par excision du gène codant pour la β2-microglobuline (β2m). Cet hôte améliore considérablement la détection des CSH humaines.
D’autres modèles murins ont été également développés. Nous citerons les souris NOD/SCID γc null capables de donner naissance à des lymphocytes T à partir de cellules CD34+ (Yahata et al, 2004).
La détection des cellules hématopoïétiques primitives sur base de leur capacité à coloniser l’environnement médullaire murin et à reconstituer une population lympho/myéloïde est un outil puissant qui a permis de caractériser les cellules souches humaines. C’est ainsi qu’ont été identifiées 2 populations de cellules primitives repeuplantes humaines, la population CD34+ CD38- SRC et CD34- CD38- SRC (Bhatia et al, 1998;Larochelle et al, 1996).
De plus, ce modèle a permis d’évaluer les cinétiques de colonisation médullaire et d’expansion de différentes populations de cellules hématopoïétiques. Il a été montré que les cellules CD34+ CD38- migrent dans la moelle et restent quiescentes durant la première semaine et se multiplient ensuite de manière intensive dès la troisième semaine. Par contre, les cellules CD34+ 38+, 3 jours après l’implantation médullaire, commencent à se multiplier de manière intensive et disparaissent complètement de l’environnement médullaire dès la quatrième semaine (Kerre et al, 2001).
A l’heure actuelle, il n’a pas pu être démontré que les LTC-IC observées in vitro et les SRC mises en évidence in vivo provenaient d’une même population de cellules hématopoïétiques primitives.
Tout d’abord, des analyses quantitatives ont montré que la fréquence des SRC de SC est bien moindre comparée aux LTC-IC. L’équipe de Wang et al a mesuré une fréquence moyenne de 1 SRC pour 9.3.105 cellules de SC (Wang et al, 1997). La fréquence des LTC-IC dans le SC a été estimée à 2.6 ±1.2 LTC-IC pour 105 cellules de SC (Wyrsch et al, 1999). D’autre part, lors de cultures d’expansion de LTC-IC, l’amplification concomitante des SRC n’a pu être obtenue (Gan et al, 1997).
Habituellement, les CSH sont administrées par voie intra-veineuse aux souris NOD/SCID préalablement conditionnées par irradiation. Ces cellules voyageant dans la circulation générale de la souris, ont de nombreux obstacles à franchir avant d’atteindre l’environnement médullaire. Finalement, seule une petite fraction de cellules infusées s’implantent dans la moelle osseuse, ce qui pourrait expliquer l’implantation faible généralement observée dans ce système. La fréquence des cellules CD34+ de SC douées de capacité implantatoire a été estimée entre 3 et 6% par Hennik (van Hennik et al, 1999). Ces obstacles pourraient être responsables d’une sous-estimation de la fréquence réelle des SRC.
Afin d’éliminer les éventuelles interférences rencontrées lors du processus implantatoire, l’injection directe des CSH dans la cavité de l’os a été mise au point. Cette méthode permet d’augmenter de 15 fois le nombre de SRC détectées par rapport aux résultats obtenus par injection intra-veineuse (Yahata et al, 2003).
1.1.4 Régulation de l’hématopoïèse
L’hématopoïèse est un processus parfaitement contrôlé où chaque élément figuré du sang est produit en quantité et en temps voulus.
Schématiquement, on peut diviser les éléments régulateurs de l'hématopoïèse en 2 grandes catégories : les facteurs de croissance et le microenvironnement (composante cellulaire et matrice extracellulaire (MEC)).
1.1.4.1 Le tissu de soutien médullaire siège de l’hématopoïèse
Chez l’adulte, l’hématopoïèse a lieu exclusivement dans la MO au sein du tissu de soutien
vitronectine, de thrombospondine, d’hémonectine ainsi qu’une grande variété de protéoglycanes (Nilsson et al, 1998). Sur ces protéines enchevêtrées viennent s’adsorber un grand nombre de cytokines et de chimiokines. L’adhérence des cellules hématopoïétiques à cette matrice est capitale dans la mesure où la matrice constitue un réservoir considérable de facteurs de croissance.
Une organisation histologique précise de la moelle osseuse est bien établie(Weiss, 1976;Weiss & Sakai, 1984). L’hématopoïèse a lieu dans les espaces extravasculaires, en périphérie des sinus veineux médullaires. Les CSH sont concentrées principalement à la surface endostéale. Les progéniteurs hématopoïétiques, en cours de maturation, quittent la région endostéale et se redistribuent principalement dans la région médullaire centrale où ils établissent des associations spécifiques avec les cellules de soutien (Nilsson et al, 2001).
Les précurseurs plus matures migrent vers les vaisseaux de la cavité médullaire centrale dans lesquels ils sont relargués en fin de maturation.
Selon la voie de spécialisation choisie, certains précurseurs hématopoiétiques s’associent spécifiquement à des cellules de soutien particulières. Ainsi, les mégakaryocytes se développent à la surface adventitielle des sinusoïdes vasculaires, les granulocytes sont associés à des fibroblastes réticulaires alkaline phosphatase positifs et les érythroblastes entreprennent une maturation synchronisée autour d’un macrophage central formant ainsi un îlot érythroblastique.
La réorganisation permanente du tissu hématopoïétique résulte d’une modulation des propriétés d’adhérence des cellules hématopoïétiques en cours de maturation.
Le comportement des cellules hématopoïétiques est régi par le tissu de soutien bien organisé qui les entoure. Ce dernier est décrit comme étant constitué d’une multitude de
« niches » stromales(Schofield, 1978) fonctionnellement hétérogènes et spécialisées dans le contrôle prolifératif et différenciatif des CSH et de leur descendance. A la surface endostéale de l’os, elles conféreraient aux CSH la capacité de conserver leur quiescence mitotique, d’induire les divisions d’autorenouvellement et d’inhiber leur différenciation.
Selon Zhang et al., les ostéoblastes immatures en bordure de l’endosteum sont des constituants clés des niches qui contrôlent le développement des CSH (Zhang et al, 2003).
Par l’intermédiaire de l’inactivation conditionnelle du gène codant le récepteur de la protéine bone morphogenic protein (BMP) (BMPR1A) chez la souris, une corrélation entre l’augmentation du nombre d’ostéoblastes et le nombre de CSH a été observée. Les CSH primitives ne se répartissent pas au hasard dans les os long, elles sont localisées exclusivement au contact des ostéoblastes immatures exprimant la N-cadhérine. Cette protéine d’adhérence également exprimée par une sous-population de CSH semble participer au logement des CSH au contact des ostéoblastes. Ces données suggèrent que la signalisation médiée par BMP contrôle le nombre de CSH en régulant la taille des niches médullaires.
De même, Clavi et al. ont montré un accroissement de la population d’ostéoblastes en surexprimant le récepteur à la parathormone (PTHR) et du peptide associé (PTH related peptide) (Calvi et al, 2003). Leurs données confirment la relation entre l’augmentation du nombre d’ostéoblastes et le nombre de CSH ; les précurseurs hématopoïétiques plus matures n’étant pas modifiés. De plus, la stimulation du récepteur PTHR provoque une augmentation de l’expression de jagged-1 par les ostéoblastes. Or, l’activation par ce ligand
du récepteur Notch (Notch1 ou 2) exprimé par les CSH, est considérée comme critique pour l’autorenouvellement des CSH. Il apparaît donc que les ostéoblastes sont des constituants importants des niches des CSH in vivo capables de réguler la fonction des CS par l’intermédiaire d’une activation de Notch.
Outre Notch déjà cité, Wnt est impliqué dans l’autorenouvellement et le maintien de la quiescence mitotique des CSH au sein des niches endostéales.
De manière générale, Notch est impliqué dans la régulation du développement. La protéine Notch est un récepteur membranaire exprimé par les CSH et les cellules stromales. Il est activé par les ligands Delta et Jagged présentés à la surface des ostéoblastes et cellules stromales médullaires. L’interaction entre le ligand et son récepteur conduit au clivage et à la libération d’un fragment intracellulaire de Notch qui s’associe au coactivateur transcriptionnel Mastermind-like-1 (MAML1). Dans le noyau, ce complexe se lie alors au répresseur transcriptionnel CBF-1, autorisant l’expression de gènes impliqués dans l’autorenouvellement des CSH (figure 1.5.).
Figure 1.5. La signalisation Notch à l’interface entre ostéoblaste et CSH.
De nombreuses expérimentations ont montré que la perte de la signalisation Notch conduit à une différenciation accélérée des CSH in vitro et à la déplétion des CSH in vivo.
Inversement, des CSH humaines cultivées en présence de Jagged 1, ligand de Notch1, permettent d’améliorer la reconstitution hématopoïétique après greffe in vivo (Karanu et al, 2000). Des expériences de gain de fonction de Notch chez la souris révèlent un
indifférencié et peut de ce fait être considérée comme un élément déterminant dans le choix de la cellule entre auto-renouvellement et différenciation (Duncan et al, 2005).
Wnt est une famille complexe de glycoprotéines également sécrétées dans la moelle osseuse. A ce jour, 19 ligands Wnt, 8 récepteurs Frizzled (Fzd), 2 corecepteurs LDL-receptor related Protein (LRP) et une variété de médiateurs Wnt sont connus. L’association de Wnt à son récepteur, inhibe la phosphorylation des β-caténines par la glycogène synthase kinase 3β (GSK3β). Ceci conduit à la stabilisation des β-caténines et à leur accumulation dans le cytosol. Celles-ci sont alors transloquées dans le noyau où elles se lient aux facteurs de transcription de la famille LEF-TCF ce qui induit la transcription de gènes impliqués dans la maintenance et le développement des cellules hématopoiétiques, et dans la réponse immunitaire (Reya et al, 2003) (figure 1.6.).
Figure 1.6. Autorenouvellement des CSH et la signalisation Wnt.
Une activation persistante de Wnt chez la souris conduit à des défauts de l’hématopoïèse dont un trouble de différenciation des CSH (Kirstetter et al, 2006;Scheller et al, 2006).
La signalisation Wnt est réduite chez les CPH, ce qui facilite leur mise en cycle. Ceci se traduit également par un déclin progressif de leur capacité de régénération après transplantation.
Cet effet est déterminé par le microenvironnement et est irréversible (Fleming et al, 2008).
L’infusion d’un milieu conditionné en protéine Wnt5a aux souris NOD/SCID permet d’améliorer la régénération hématopoiétique par les CSH humaines (Murdoch et al, 2003).
La signalisation Wnt dans les niches stromales semble donc essentielle pour limiter la prolifération des CSH et préserver la fonction de reconstitution des CSH endogènes.
Les signalisations Notch et Wnt sont conjointement actives dans la majorité des CSH localisées dans les niches hématopoïétiques.
Une interconnexion entre la voie Notch et Wnt est suspectée. En effet, la stimulation des CSH par Wnt3A augmente l’expression des gènes Hes1 et Dtx1, tous deux étant des gènes cibles de la voie Notch. Wnt pourrait donc moduler l’expression de cibles Notch chez la CSH.
De plus, GSK3β peut promouvoir la dégradation du fragment intracellulaire de Notch. Dès
lors, la signalisation Wnt, en réprimant GSK3β, peut faciliter la signalisation Notch. Cette dernière semble toutefois dominante par rapport à Wnt. Seul, Wnt ne peut maintenir les CSH indifférenciées lorsque la voie Notch est inhibée. Notch semble donc un signal clé requis pour l’inhibition de la différenciation cellulaire, Wnt collaborant à améliorer l’auto- renouvellement des CSH.
1.1.4.2 Les facteurs de croissance contrôlant l’hématopoïèse Les cellules stromales produisent la plupart des facteurs de croissances nécessaires au développement des cellules hématopoïétiques, à l’exception de l’érythropoïétine (EPO), produite par le rein, et de la thrombopoïétine (TPO), d’origine hépatique et rénale. Certains sont activateurs, d’autres inhibiteurs de la prolifération des cellules hématopoïétiques. Ce sont des glycoprotéines actives à de très faibles concentrations, de l'ordre de la nM ou de la pM. On distingue les cytokines agissant préférentiellement sur les cellules les plus précoces, favorables aux divisions d’auto-renouvellement, et les cytokines stimulatrices des progéniteurs en voie de différenciation et des précurseurs. Un même facteur peut néanmoins agir à la fois sur les cellules les plus primitives et sur des progéniteurs différenciés (figure 1.7.).
Figure 1.7. Contrôle de l’hématopoïèse.
LTC-IC : long term culture-initiating cell Il : interleukine
SCF : stem cell factor Fl : flt3 ligand TPO : thrombopoïétine
GM-CSF : granulocyte macrophage colony stimulating factor G-CSF : granulocyte colony stimulating factor
EPO : érythropoïétine
En rouge, cytokines utilisées dans ce travail, agissant au stade précoce de l’hématopoïèse.
Les cytokines utilisées dans ce travail étaient à action activatrice sur l’hématopoïèse précoce.
Le stem cell factor (SCF), ligand du récepteur c-kit exprimé par la plupart des cellules hématopoïétiques, a une action centrale sur l’hématopoïèse précoce.
Le flt-3 ligand (FL) améliore la survie et la prolifération des progéniteurs myéloïdes primitifs in vitro et stimule les divisions d’auto-renouvellement des cellules souches immatures. Le récepteur Flt-3 est détectable à la surface des cellules CD34+ primitives de la MO par opposition aux cellules CD34- qui ne l’expriment pas (Xiao et al, 1999).
La thrombopoïétine (TPO) agit à la fois sur l’hématopoïèse précoce et tardive. Elle a une action centrale dans la mégakaryocytopoïèse en stimulant et en activant les progéniteurs mégakaryocytaires. Elle stimule également l’amplification des cellules souches immatures tout en conservant leur potentiel multipotent.
L’interleukine(Il)-6, seule, n’a pas d’activité biologique sur l’expansion des CSH. Néanmoins, elle agit comme un puissant cofacteur dans l’expansion des cellules CD34+ en présence de SCF, FL et TPO. L’Il-6 interagit avec son récepteur, l’Il-6R, induisant l’homodimérization de la sous-unité gp130 médiateur de la signalisation intracellulaire.
Les CSH pluripotentes n’expriment pas le récepteur Il-6R. Néanmoins, la signalisation médiée par gp130 peut être obtenue en utilisant un complexe d’Il-6 et Il-6R soluble (Il-6/sIl-6R).
Il-6/sIl-6R en présence de SCF induit une prolifération importante des progéniteurs hématopoïétiques humains in vitro (Ueda et al, 2000). Une protéine de fusion, réunissant l’Il-6 et Il-6R (Hyper-Il-6), a été développée et peut être utilisée à des concentrations 100 à 1000 fois plus faibles que la forme non liée Il-6 et sIl-6R. L’hyper-Il-6, utilisé conjointement avec FL, a une action efficace sur l’expansion des cellules CD34+ de sang périphérique (PB).
Le granulocyte - colony stimulating factor (G-CSF) est un facteur essentiellement actif sur la lignée granulocytaire et les cellules souches multipotentes. Tout comme l’Il-6, le G-CSF utilisé seul, a peu d’effet. Il a également une action potentialisatrice en présence de SCF, TPO et FL.
Le G-CSF est capable de stimuler le passage de progéniteurs et de cellules souches médullaires dans la circulation périphérique. Cette particularité, qu’il partage avec d’autres cytokines telles que SCF, l’Il-8, FL, le GM-CSF et autres, est utilisée couramment en clinique dans les protocoles de mobilisation et de récolte de cellules souches de sang périphérique (CSSP).
D’autres cytokines activatrices agissent à des stades plus tardifs de l’hématopoïèse et / ou sur des lignées spécifiques. Ces facteurs comprennent notamment l’EPO, le TPO qui agissent respectivement sur l’érythropoïèse et la mégakaryopoïèse, le granulocyte macrophage (GM) – CSF et le G-CSF qui agissent plus spécifiquement sur les lignées granulo-monocytaires, et l’Il-3 stimulant la prolifération non spécifique des progéniteurs hématopoïétiques.
Parmi les cytokines inhibitrices, on peut citer le transforming growth factor β (TGFβ), le tumor necrosis factor α (TNFα), et le macrophage-inflammatory protein 1α (MIP 1α).
Les cytokines produites par les cellules stromales médullaires existent sous une forme soluble, agissant sur les cellules hématopoïétiques voisines par la voie paracrine, et sous une forme membranaire intervenant dans la communication intercellulaire juxtacrine. Les cytokines membranaires sont généralement des précurseurs incomplets de la forme biologiquement active normalement sécrétée. Ils peuvent également être produits par l'épissage alternatif de l’ARNm correspondant.
La communication juxtacrine est importante dans les processus de développement nécessitant une restriction spatiale ; elle est particulièrement importante dans l’hématopoïèse. L’action paracrine et juxtacrine d’une même cytokine peut parfois être différente. Le SCF, sous la forme soluble, stimule la prolifération et la différenciation des CSH et des progéniteurs myéloïdes précoces. Sa forme membranaire serait impliquée dans le mécanisme d’adhérence des progéniteurs hématopoïétiques aux cellules stromales de la MO (Broxmeyer et al, 1991). En général, les formes membranaires sont plus actives que les formes solubles. C’est le cas du SCF présent à la surface des cellules stromales qui stimule plus efficacement la prolifération des progéniteurs érythopoïétiques en comparaison de la forme soluble.
De même, in vivo, ce mode de communication intercellulaire semble jouer un rôle central. A titre d’exemple, les souris mutantes « steel-dickie » ne produisent plus la forme membranaire du SCF suite à une délétion intragénique de la région codant la séquence intramembranaire et cytoplasmique du SCF. Cela se traduit par diverses anomalies incluant un déficit de l’hématopoièse, principalement de la lignée érythroïde. L’expression d’un transgène du SCF membranaire chez ces souris conduit à une amélioration de l’érythopoïèse et à une réduction de l’hypoplasie médullaire. Par contre l’expression d’un transgène de la forme soluble du SCF n’a pas d’effet sur la lignée rouge mais corrige néanmoins le déficit de la lignée myéloïde (Kapur et al, 1998).
1.2 Motilité des CSH
1.2.1 Mobilisation des cellules souches de la moelle vers le sang périphérique.
La mobilisation et l’implantation médullaire des CSH sont des processus physiologiques étroitement associés intervenant séquentiellement. Durant l’hématopoïèse, le passage en circulation des cellules sanguines n’est pas restreint aux cellules des voies lympho/myéloïdes matures. Un petit nombre de progéniteurs quiescents, incluant des CS primitives, sont continuellement relargués en circulation. Leur fonction, leur renouvellement, leur destination et leur destinée sont inconnus. Néanmoins, leur rôle physiologique probable serait d’approvisionner en CSH les régions médullaires endommagées et de participer au repeuplement continu du thymus (Wright et al, 2001b).
La mobilisation est naturellement augmentée dans certaines pathologies hématologiques.
Elle peut également être induite par divers traitements pharmacologiques. C'est le cas lors de la phase de récupération observée après une aplasie médullaire induite par des agents chimiothérapeutiques tels que la cyclophosphamide et le paclitaxel. De même un traitement par des cytokines telles que G-CSF, GM-CSF, IL-7, Il-3, Il-12, SCF et Flt-3 ou par certaines
chimiokines comme Il-8, MIP-1α et SDF-1 stimule également la mobilisation. L’efficacité de la mobilisation, le délai de mise en circulation des cellules et le type de cellules mobilisées dépendent de l’agent mobilisant utilisé.
Le G-CSF, combiné ou non à la cyclophosphamide, est le plus couramment utilisé en clinique.
Il induit une prolifération intense des CSPH dans la moelle, première étape de la mobilisation (Morrison et al, 1997). Leur passage en circulation est dépendant d’un mécanisme contrôlé par le cycle cellulaire ; il se produit spécifiquement après la phase M du cycle (Wright et al, 2001a). Ainsi, seules des cellules souches en phase G0/G1 sont retrouvées dans le sang périphérique. Un phénomène analogue est observé lors de l’infusion de CS dans le sang périphérique ; l’implantation médullaire des cellules est alors maximale durant le phase G0/G1 et réduite durant la phase G2/M (Gothot et al, 1998;Glimm et al, 2000).
De nombreuses recherches ont tenté d’élucider les mécanismes qui contrôlent la rétention et la mobilisation des CSH. Une intégrine β1 exprimée par les CSH, very late antigen-4 (VLA-4), est décrite comme essentielle dans ces processus. Chez la souris et le primate, l’inactivation de VLA-4 par un anticorps neutralisant induit la mobilisation des CSPH(Papayannopoulou & Nakamoto, 1993). De plus, l’expression de VLA-4 est réduite à la surface des progéniteurs mobilisés (Mohle et al, 1993).
Une participation active de l’agent chimioattractant stromal cell derived factor-1 (SDF-1), puissant activateur des CSH synthétisé par les cellules stromales, a été établie sur base d’expériences menées in vivo. Il a été montré qu’une augmentation rapide de la concentration en SDF-1 circulant s’accompagne d’une mobilisation des CSPH dépendante du SDF-1 chez la souris et le primate (Sweeney et al, 2002).
Un modèle décrivant la mobilisation des CSH après stimulation par G-CSF a été proposé (Figure 1.8.). En l’absence de stimulations exogènes par ce facteur de croissance, les CS sont étroitement associées aux cellules stromales de la MO. Cette localisation stricte est dépendante de la production locale de SDF-1. Celui-ci active les CSH, ce qui maintient VLA-4 dans un état de haute affinité pour son ligand vascular cell adhesion molecule – 1 (VCAM-1) exprimé par les cellules stromales.
Au cours de la mobilisation, le G-CSF infusé induit une prolifération intense des CSPH et stimule la sécrétion par les neutrophiles médullaires d’enzymes protéolytiques (élastase, cathepsin G et métalloprotéinases (MMP)).
Celles-ci dégradent la MEC facilitant le passage des CSPH de la moelle vers le sang. Elles clivent également VCAM-1 (Levesque et al, 2001) et le SDF-1 (Petit et al, 2002), principaux responsables de la rétention médullaire des CSPH. L’expression de CXCR-4 (Petit et al, 2002) et la sécrétion de MMP-2 et -9 (Pruijt et al, 1999;Janowska-Wieczorek et al, 1999) par les CSPH sont également augmentées ce qui facilite leur migration au travers du stroma et de l’endothélium vasculaire.
Figure 1.8. Modèle de la mobilisation des cellules souches par G-CSF.
Au repos (A), les cellules souches sont au contact des cellules stromales grâce aux interactions entre VLA-4/VCAM-1 et SDF-1/CXCR4. Lors de la mobilisation (B), les polynucléaires neutrophiles stimulés par G-CSF libèrent dans l’environnement médullaire diverses protéases dégradant la MEC et le SDF-1, ce qui permet la migration des CSPH dans la circulation périphérique.
1.2.2 Modèle de l’implantation médullaire des CSH
L’implantation médullaire des CSH constitue l’aboutissement d’une série d’évènements complexes où les CSH circulant par voie sanguine sont converties en un tissu cellulaire résidant dans la MO hôte.
Ces évènements sont communément scindés en 2 séries d’actions : tout d’abord, les CSPH circulants sont recrutés par les cellules endothéliales des sinusoïdes médullaires, siège de la migration transendothéliale. Ensuite, les CSH migrent au travers de la MO vers des sites anatomiques spécifiques connus sous la dénomination de « niches stromales ».
A.
B.
Ce processus mimant la migration des leucocytes vers un site inflammatoire, est dépendant de l’action combinée de molécules d’adhérence cellulaire, de cytokines et de chimiokines.
L’implantation médullaire est un processus rapide. Les cellules CD34+ humaines, transplantées par voie intraveineuse quittent, endéans quelques minutes (Hidalgo et al, 2002), le sang périphérique de l’hôte pour gagner les niches stromales médullaires. Les cellules colonisent également différents organes dont la rate, le foie et les poumons (Brenner et al, 2004;Noort et al, 1998).
Un modèle décrivant les mouvements et la distribution médullaire des CSH infusées a été suggéré par l’équipe de Nilsson et al (Nilsson et al, 2001). Depuis les sinusoïdes médullaires traversant la zone corticale de l’os, la majorité des CSPH réalisent une migration transendothéliale pour gagner la région médullaire centrale. Une migration transendothéliale faible est également observée dans la région endostéale. Les progéniteurs engagés persisteront principalement dans la région médullaire centrale contrairement aux progéniteurs plus primitifs qui gagneront les niches stromales localisées dans la région endostéale (figure 1.9.).
Figure 1.9. Modèle suggérant les flux de CSH transplantées migrant dans la MO hôte.
Les CSPH de MO circulant dans les sinus médullaires migrent au travers de l’endothélium vasculaire pour gagner la région médullaire centrale. Les cellules primitives gagnent ensuite la région endostéale de l’os contrairement aux cellules engagées qui persisteront dans la région centrale.
(Modifié d’après Nilsson et al.)
de l’endothélium vasculaire où, par l’intermédiaire des sélectines endothéliales E et P, les CSH adhèrent de manière labile afin de ralentir leur déplacement dans le torrent circulatoire.
Cette étape est appelée la margination des CSH sur l’endothélium vasculaire (Frenette et al, 1998a;Schweitzer et al, 1996). A l’approche du site d’implantation, la densité croissante de SDF-1, produit localement et immobilisé à la surface de l’endothélium vasculaire, module l’affinité de VLA-4 présent à la surface des CSH pour son ligand vasculaire VCAM-1 (Peled et al, 1999b;Grabovsky et al, 2000). L’activation de VLA-4 combinée aux interactions entre leucocyte function antigen-1 (LFA-1) et intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) se traduit par l’arrêt ferme des CS sur l’endothélium vasculaire (Peled et al, 1999a). Les cellules migrent ensuite au travers de l’endothélium et du stroma médullaire jusqu’aux niches médullaires supportives de l’hématopoïèse primitive (figure 1.10.).
Cette migration dirigée selon un gradient de concentration de SDF-1 préétabli par les cellules stromales (Peled et al, 1999b;Imai et al, 1999), résulte d’une collaboration entre VLA-4 et VLA-5 s’associant à la fibronectine (Fn) (Peled et al, 2000) et de CD44 interagissant avec l’acide hyaluronique (AH).
Rappelons que le SDF-1 est un puissant chimioattractant des CSPH humains produit par les cellules endothéliales et stromales (Aiuti et al, 1997;Mohle et al, 1998;Kim & Broxmeyer, 1998a) ; il active les CSPH par l’intermédiaire de son unique récepteur CXCR-4.
D’autres éléments contribuent également à la rétention des CSH dans les niches stromales.
Driessen et al ont montré l’importance de la forme transmembranaire du SCF (tmSCF) dans le logement et la rétention des CSH aux niches stromales. En effet, l’implantation des CSH dans la région médullaire endostéale chez un modèle murin dépourvu de cette isoforme immobilisée était compromise (Driessen et al, 2003).
L’ostéopontine semble également être un composant essentiel des niches stromales, indispensable à la rétention médullaire des CSH (Nilsson et al, 2005).
Figure 1.10. Modèle de l’implantation médullaire des CSH.
A l’initiation du processus d’implantation médullaire, VLA-4 présent à la surface des CSH est sous une forme inactive. Les interactions labiles entre les sélectines E et P endothéliales et leurs ligands ESL et PSGL-1, combinées à l’interaction faible entre VLA-4/VCAM-1, permettent la margination des CSH à la surface de l’endothélium des sinus médullaires.
A l’approche du site d’implantation, l’augmentation de la densité de SDF-1 lié à l’endothélium, active les CSH par l’intermédiaire du récepteur CXCR-4. L’activation des intégrines se caractérise par un changement de conformation de VLA-4 lui conférant une affinité accrue pour son ligand VCAM-1. Les interactions fortes entre VLA-4/VCAM-1 et LFA- 1/ICAM-1 provoquent l’arrêt ferme des cellules sur l’endothélium. Les CSH vont ensuite migrer au travers de l’endothélium et de la membrane basale jusqu’aux niches stromales.
Cette migration est cette fois médiée par VLA-4 et VLA-5 interagissant avec la Fn et CD44 se liant à l’acide haluronique.
L’intégrine VLA-4 pourrait participer à la margination des CSH à l’endothélium. Lorsque les densités en SDF-1 sont faibles, VLA-4 est présent dans un état non actif à la surface des CSH.
Dans ces conditions, VLA-4 permet l’attachement labile des CSH à VCAM-1 présent sur
L’expression partielle d’une forme non fonctionnelle de la sialomucine P-selectin glycoprotein ligand (PSGL-1) à la surface de progéniteurs CD34+ de SC pourrait être à l’origine de cette implantation moins efficace (Hidalgo et al, 2002).
Rôle des cellules accessoires
Une étude comparant l’activité hématopoïétique de cellules mononucléées aux cellules CD34+ isolées à partir de SC, a mis en évidence une nette amélioration des chimérismes lorsque la population cellulaire CD34- était co-transplantée (Kim et al, 1999). L’équipe de Byk et al. a montré que cette coopération n’est pas limitée à la population CD34- . Les cellules progénitrices CD34+/38+ en phase G1 du cycle cellulaire améliorent également la migration dirigée vers SDF-1 in vitro et l’implantation in vivo des cellules primitives quiescentes CD34+/38- de SC en G0 (Byk et al, 2005). Ces auteurs suggèrent un rôle coopératif des cellules matures et des progéniteurs différenciés sur l’implantation des CSH. Les mécanismes de cette coopération sont encore mal connus ; ils semblent toutefois dépendre de la sécrétion, par les progéniteurs, des enzymes protéolytiques MMP-9 et de diverses cytokines favorisant l’expression de CXCR-4 à la surface des CSH, ce qui facilite leur migration.
La déplétion des lymphocytes T CD8+ du greffon est également associée à une diminution du repeuplement médullaire chez la souris NOD/SCID. L’explication de ce phénomène réside, non pas dans un effet immunologique contre les cellules hôtes résiduelles ou la production de cytokines, mais également dans un effet de coopération à la motilité cellulaire. La population lymphocytaire T affecterait la signalisation médiée par SDF-1 (Adams et al, 2003).
La co-transplantation de cellules souches mésenchymateuses (CSM) améliore également le repeuplement de la MO et de la rate par les cellules CD34+ de SC par un mécanisme qui n’améliore pas l’implantation à court terme (Noort et al, 2002).
1.2.3 Les récepteurs d’adhérence des cellules souches et progéniteurs
Les cellules du système hématopoïétique, contrairement à la majorité des cellules qui composent notre organisme, sont naturellement non-adhérentes. Néanmoins des modulations dynamiques de leur adhérence aux cellules endothéliales, stromales et à la MEC régulent leur motilité et déterminent leur localisation anatomique stricte.
1.2.3.1 Les sélectines
L’initiation de l’implantation médullaire des CSH, est caractérisée par une interaction labile entre la cellule souche et la cellule endothéliale qui exprime les sélectines E et P.
Cette première étape d’adhérence est déterminante car elle ralentit la CSH dans le courant circulatoire en la faisant rouler à la surface de l’endothélium.
Les sélectines (CD62) sont une famille de trois récepteurs d'adhérence dépendant du calcium et qui regroupe la sélectine -L, -P et -E. La partie extracellulaire de chaque sélectine est constituée d’un domaine lectine se liant fortement à des résidus glycosylés.
Contrairement aux endothéliums vasculaires présents à d’autres endroits de l’organisme, les sélectines E sont exprimées de façon constitutive sur les cellules endothéliales de la MO (Schweitzer et al, 1995;Frenette & Wagner, 1996). Ailleurs, les sélectines E (CD62E) apparaissent sur les cellules endothéliales quelques heures après leur activation par un stimulus inflammatoire (LPS, IL-1, TNF, INFγ) (Bevilacqua et al, 1989). Le ligand des sélectines E n’a, à ce jour, pas été clairement identifié.
La sélectine P intervient également dans la margination des CSPH par liaison à une glycoprotéine appelée PSGL-1 (CD162) (Sako et al, 1993). Cette dernière est une glycoprotéine transmembranaire présente sur les cellules hématopoïétiques primitives, lymphoïdes, myéloïdes et sur certaines cellules non-hématopoïétiques(Vestweber, 1993).
PSGL-1 pourrait être un ligand partagé par les sélectines -P et –E (Norman et al, 2000;Katayama et al, 2003). Un autre ligand pour les sélectines –E semble néanmoins exister puisque des CSH isolées à partir de souris knock-out pour la protéine PSGL-1 adhèrent à la sélectine-E (Winkler et al, 2004).
Une sous-population de MadCAM-1 (Mucosal addressin cell adhesion molecule-1), présente à la surface des cellules endothéliales des veinules mésentériques, est un ligand de la L-sélectine. MadCAM-1 avait été initialement décrit comme ligand de l’intégrine α4β7.
Rôle physiologique des sélectines
Le rôle physiologique des sélectines a été identifié par mutation dirigée chez la souris. La neutralisation des gènes codant les sélectines endothéliales E et P (E/P-/-) s’exprime chez la souris par un déficit sévère de la margination et de la diapédèse des leukocytes aux sites d’inflammation ou d’infection (Frenette et al, 1996;Bullard et al, 1996). De plus, ces souris E/P-/- ont montré des anomalies de l’hématopoïèse caractérisées par une leukocytose sévère, une hématopoïèse splénique étendue ainsi qu’un taux anormalement élevé de cytokines hématopoïétiques.
Au cours de transplantation de CSH chez ces souris irradiées, la mortalité accrue des souris E/P-/- a été corrélée à un déficit de l’implantation médullaire par les CS infusées (Frenette et al, 1998b).
1.2.3.2 Les sialomucines
Les sialomucines constituent une famille de glycoprotéines qui se caractérise par une glycosylation de groupements hydroxyles de résidus sérine et thréonine. Cinq membres de cette famille sont exprimés intensément par les CSPH : CD34, PSGL-1, CD43, CD45RA et CD164.
CD34
Selon une publication récente, CD34 aurait un rôle probable dans les phénomènes d’adhérence cellulaire. Les mastocytes, issus de souris dont les gènes codant pour les sialomucines CD34 et CD43 ont été neutralisés, présentent une adhérence augmentée in vitro associée à un déficit de migration. Ces cellules s’avèrent également incapables de reconstituer le compartiment mastocytaire de souris W/Wv porteuses de mutations du récepteur c-kit et donc elles-mêmes déficientes en mastocytes. Cette étude suggère une fonction hématopoïétique à cette sialomucine ; celle-ci agissant comme un régulateur négatif de l’adhérence cellulaire (Drew et al, 2005).
Son implication dans l’adhérence des CSPH aux cellules stromales par induction de l’activation des intégrines β1 et β2 n’est pas exclue (Majdic et al, 1994).
CD43 (Leukosialin)
CD43 est exprimé à la surface de la plupart des CSPH et des leukocytes matures, à l’exception des lymphocytes B.
Sa fonction dans l’implantation médullaire est encore inconnue. Il semblerait que l’ICAM-1, ayant pour récepteur LFA-1, soit également un ligand du CD43 (Rosenstein et al, 1991). Les CPH pourraient donc interagir avec ICAM-1 exprimé par les cellules stromales grâce à LFA-1 et CD43. Ceci expliquerait l’absence d’effet de la neutralisation de CD43 sur les CPH, LFA-1 compensant la perte de CD43.
Le CD43 pourrait être un régulateur négatif des stades précoces de l’hématopoïèse en délivrant un signal pro-apoptotique. En effet l’activation de CD43 par un anticorps monoclonal induit l’apoptose des CSPH primitifs, les CPH plus différenciées étant insensibles à cette activation (Bazil et al, 1995a).
CD164 (MGC-24v)
CD164 est une sialomucine exprimée par les CSH primitives et par les cellules stromales médullaires.
La neutralisation de CD164 par un anticorps monoclonal empêche l’adhérence des CSPH aux cellules stromales in vitro (Zannettino et al, 1998a), ce qui suggère un rôle de CD164 dans l’adhérence cellulaire. La nature de son ligand est inconnue.
CD164 aurait également une fonction régulatrice sur la prolifération des CSH. L’engagement de CD164 sur les CSH CD34+ inhibe l’entrée en cycle des cellules quiescentes.
1.2.3.3 La superfamille des immunoglobulines, le PECAM-1 De manière générale, les protéines de cette famille possèdent une ou plusieurs copies de domaines constants ou variables d’immunoglobuline (Ig).
Un représentant de cette famille, CD31 aussi appelé platelet endothelial cell adhesion molecule (PECAM-1), est présent au niveau des plaquettes, des cellules endothéliales, des monocytes, des polynucléaires neutrophiles, de certaines sous-populations de lymphocytes T et des progéniteurs hématopoïétiques CD34+ (Watt et al, 1993;Chan & Watt, 2001).
Les souris déficientes en PECAM-1 sont viables et fertiles, sans anomalie de l’hématopoïèse (Duncan et al, 1999). PECAM-1 est requis dans la migration transendothéliale des cellules
