B.Western blot anti-CIRP et anti-actine, 15µg de protéines par piste. Les différents signaux ont été

(1)

Figure 1. Expression et localisation de CIRP en réponse à l’arsénite

A. Les cellules ont été traitées à l’arsénite (500µM) durant les temps indiqués avant que ne soient extraits les ARN. L’accumulation du messager CIRP est analysée par Northern Blot sur15µg d’ARN total en utilisant une sonde antisens CIRP ou antisens GAPDH.

B. Western blot anti-CIRP et anti-actine, 15µg de protéines par piste. Les différents signaux ont été quantifiés et le rapport CIRP/Actine indiqué sous les pistes correspondantes.

C. La distribution nucléocytoplasmique de CIRP est analysée par Western blot. Les fractions nucléaires et cytoplasmiques (15µg de protéines) sont contrôlées au moyen d’un anticorps anti- MYC.

D. Immunofluorescence anti-CIRP ( rouge) et anti-eIF3b (vert) sur cellules COS traitées ou non à l’arsénite (1mM, 30min). La barre représente 20µm.

E. idem sauf immunofluorescence anti-CIRP (rouge) et anti-TIAR (vert).

A D

B

E

C

(2)

A

B

C

Figure 2. Localisation de CIRP dans les SG.

Des cellules COS ont été transféctées par une construction codant pourcl’YFP-CIRP (vert). La barre blanche représente 20µm.

A. Les cellules sont traitées ou non à l’arsénite après incubation en présence ou non d’émétine. La localisation de TIAR est déterminée par immunoflurescence avec l’anticorps anti-TIAR (rouge)

B. Les cellules sont traitées à l’arsénite, puis soumises à une hybridation in situ avec une sonde oligodT (rouge).

C. Les cellules ont été cotransfectées par des constructions codant pour l’YFP-CIRP et la RCP-DCP1 (rouge), et traitées à l’arsénite.

Remarque: les cellules ont été choisies sur base d’une expression modérée d’YFP-CIRP

puisqu’une expression élevée de CIRP entraîne la formation d’agrégats. (voir plus loin)

(3)

A

B

C

Figure 3. Localisation de CIRP suite à différents type de stress La barre représente 20µm

A. Des cellules COS exprimant l’YFP-CIRP ont subi des traitements au sorbitol, d’hyperthermie, au DTT et au FCCP (voir matériel et méthodes), puis fixée. Les cellules MEF ont été traitées à la thapsigargine, la protéine flag-CIRP a été détectée par immunofluorescence avec un anticorps anti-Flag

B. Les cellules COS ont été transfectées par une construction codant pour la G3BP-GFP. La protéine CIRP a été détectée par immunofluorescence anti-CIRP

C. Les cellules COS exprimant l’YFP-CIRP ont été incubées à 32°C durant 18h ou non, et la

protéine TIAR a été détectée par immunofluorescence anti-TIAR

(4)

Figure 4. Localisation de la protéine CIRP dans les SG en absence des protéines TIA-1 ou TIAR Les cellules MEF tiar-/- et MEF tia -/-exprimant de manière stable la protéine de fusion flagCIRP ont été traitées ou non à l’arsénite et marquées doublement par les anticorps anti-flag (rouge) et anti-eIF3b (vert). Les barres représentent 20µm.

Figure 5. La surexpression de la protéine CIRP induit la formation des SG.

Les cellules COS ont été transfectées par des constructions codant pour les protéines flagTIA-1,

flagTIAR, flagCIRP ou HA-hnRNP M. Elles ont ensuite été traitées à l’arsénite et marquées

doublement par les anticorps anti-eIF3b (vert) et anti-flag ou anti-HA (rouge). Les barres

représentent 20µm.

(5)

Figure 6. Localisation de mutants YFP-CIRP dans des cellules traitées ou non à l’arsénite.

A. Représentation schématique des mutants CIRP exprimés dans les cellules HeLa. Le domaine RRM rouge en italique indique qu’il comporte les mutations ponctuelles suivantes: F9D, G11P,L13D.

B. Analyse par Western Blot de l’expression des mutants CIRP fusionnés à l’YFP avec un anticorps anti- GFP de l’expression des mutants CIRP (15µg de protéines par pistes).

C. Localisation des mutants YFP-CIRP dans les cellules HeLa en condition normale fixées. Les barres représentent 20µm.

D. Localisation des mutants YFP-CIRP dans les cellules HeLa après traitement à l’arsenite puis fixées. La protéine TIAR est détectée par immunofluorescence un anticorps anti-TIAR. Le chiffre indique le rapport du nombre de granules contenant de l’YFP / nombre de granules contenant TIAR. Les barres représentent 20µm.

A. D.

B.

C.

(6)

Fig7. Rôle des arginines des motifs RGG dans la localisation nucléocytoplasmique de CIRP.

A. Représentation schématique de l’YFP-CIRP. Les arginines des motifs RGG remplacées par des lysines sont soulignées (R94,105,116,K)

B. Localisation de l’YFP-CIRP et du mutant YFP-CIRP (R94,105,116,K) dans des cellules HeLa.

Fig 8. Rôle de la méthylation dans la localisation de CIRP dans les SG.

A. Les cellules COS ont été transfectées par la construction flagCIRP, et traitées à l’AdOx ou non. La protéine flag CIRP a été ensuite immunoprécipitée par des billes d’agarose couplées à l’anticorps anti-flag. La méthylation de CIRP a ensuite été analysée par un anticorps anti-arginine méthylée (Rmethyl). Les flèches indiquent la protéine flagCIRP.

B. Localisation de l’YFP-CIRP ou du mutant YFP-CIRPΔRGG (figure 6A, construction F) après traitement des cellules COS à l’AdOx et à l’arsénite.

C. Les protéines flagCIRP et flag-CIRPΔRGG ont été

immunprécipitées comme en A. et on été révélées par Western Blot anti-flag ou anti-arginine méthylée. Les flèches indiquent leur position.

A. B.

C.

(7)

R.Luc/F.Luc(%

d u c o n trô le)

R.Luc/F.Luc(% du contrôle)

Figure 9. Etude du rôle de la protéine CIRP dans le métabolisme des ARN.

A. Représentation schématique des gène rapporteurs contenant ou non (-) les séquences cibles RPA2 , TRX , ou potentiellement cibles ((AUUU)

₈

) de CIRP

B. Les activités luciférases mesurées dans les extraits cellulaires sont exprimées en rapport R.Luc/F.Luc. Les valeurs sont la moyenne de trois expériences indépendante (les barres d’erreurs :

± écart-type). Gris foncé: valeurs obtenues en surexprimant la protéine flagCAT. Gris clair: valeurs obtenues en surexprimant la protéine flagCIRP

C. Analyse de la surexpression de CIRP par Western Blot anti-CIRP

D. Les activités luciférases mesurées dans les extraits cellulaires sont exprimées en rapport R.Luc/F.Luc. Les valeurs sont la moyenne de trois expériences indépendante (les barres d’erreurs :

± écart-type). Gris foncé: valeurs obtenues avec le petit ARN contrôle, en gris clair: valeurs obtenues avec les petits ARN qui ciblent CIRP.

E. Analyse de l’inhibition de l’expression de CIRP par Western Blot avec l’anticorps anti-CIRP. Le blot a été normalisé à l’aide d’un anticorps anti-actine.

A. B. D.

C. E.

(8)

R.Luc/F.Luc(% du contrôle) R.Luc/F.Luc(% du contrôle)

Figure 10. Répression de la traduction par la protéine CIRP.

A. Représentation schématique de la protéine CIRP. Les motif RGG sont soulignés et les arginines qui sont remplacées par des lysines sont en gras italique.

B. Les activités luciférases mesurées dans les extraits cellulaires sont exprimées en rapport R.Luc/F.Luc.

Les valeurs sont la moyenne de trois expériences indépendante (les barres d’erreurs : ± écart-type).

Les barres en gris foncé: 0MS2, les barres en gris clair: 8MS2. Les astérisques indiquent une différence statistiquement significative des valeurs (p<0.05).

C. Analyse par Northen Blot des messagers luciférases à partir d’extraits totaux (panneau de gauche) et à partir de fraction cytoplasmique (panneau de droite). Les signaux ont été quantifiés au Phosphorimager et les rapports R.Luc/F.Luc sont indiqués en dessous de chaque piste.

D. Analyse par RT-PCR de la présence de l’ARN U1 dans les extraits totaux ou cytoplasmique.

E. L’effet de l’adressage de la protéine du CIRP et du mutant CIRPΔRRM sur l’expression protéique du messager est calculé en faisant la rapport entre les valeurs normalisées de l’activité R.Luc et les valeurs normalisée des l’ARN cytoplasmique de R.Luc.

F. Analyse par immunofluorescence anti-flag de la localisation la protéine MS2-CP seule ou en fusion avec la protéine CIRP, dans des cellules traitées ou non à l’arsénite (T: fraction totale. C: fraction cytoplasmique).

B.Western blot anti-CIRP et anti-actine, 15µg de protéines par piste. Les différents signaux ont été

Figure 1. Expression et localisation de CIRP en réponse à l’arsénite

A. Les cellules ont été traitées à l’arsénite (500µM) durant les temps indiqués avant que ne soient extraits les ARN. L’accumulation du messager CIRP est analysée par Northern Blot sur15µg d’ARN total en utilisant une sonde antisens CIRP ou antisens GAPDH.

B. Western blot anti-CIRP et anti-actine, 15µg de protéines par piste. Les différents signaux ont été quantifiés et le rapport CIRP/Actine indiqué sous les pistes correspondantes.

C. La distribution nucléocytoplasmique de CIRP est analysée par Western blot. Les fractions nucléaires et cytoplasmiques (15µg de protéines) sont contrôlées au moyen d’un anticorps anti- MYC.

D. Immunofluorescence anti-CIRP ( rouge) et anti-eIF3b (vert) sur cellules COS traitées ou non à l’arsénite (1mM, 30min). La barre représente 20µm.

E. idem sauf immunofluorescence anti-CIRP (rouge) et anti-TIAR (vert).

A D

B

E

C

A

B

C

Figure 2. Localisation de CIRP dans les SG.

Des cellules COS ont été transféctées par une construction codant pourcl’YFP-CIRP (vert). La barre blanche représente 20µm.

A. Les cellules sont traitées ou non à l’arsénite après incubation en présence ou non d’émétine. La localisation de TIAR est déterminée par immunoflurescence avec l’anticorps anti-TIAR (rouge)

B. Les cellules sont traitées à l’arsénite, puis soumises à une hybridation in situ avec une sonde oligodT (rouge).

C. Les cellules ont été cotransfectées par des constructions codant pour l’YFP-CIRP et la RCP-DCP1 (rouge), et traitées à l’arsénite.

Remarque: les cellules ont été choisies sur base d’une expression modérée d’YFP-CIRP

puisqu’une expression élevée de CIRP entraîne la formation d’agrégats. (voir plus loin)

A

B

C

Figure 3. Localisation de CIRP suite à différents type de stress La barre représente 20µm

B. Les cellules COS ont été transfectées par une construction codant pour la G3BP-GFP. La protéine CIRP a été détectée par immunofluorescence anti-CIRP

C. Les cellules COS exprimant l’YFP-CIRP ont été incubées à 32°C durant 18h ou non, et la

protéine TIAR a été détectée par immunofluorescence anti-TIAR

Figure 5. La surexpression de la protéine CIRP induit la formation des SG.

Les cellules COS ont été transfectées par des constructions codant pour les protéines flagTIA-1,

flagTIAR, flagCIRP ou HA-hnRNP M. Elles ont ensuite été traitées à l’arsénite et marquées

doublement par les anticorps anti-eIF3b (vert) et anti-flag ou anti-HA (rouge). Les barres

représentent 20µm.

Figure 6. Localisation de mutants YFP-CIRP dans des cellules traitées ou non à l’arsénite.

A. Représentation schématique des mutants CIRP exprimés dans les cellules HeLa. Le domaine RRM rouge en italique indique qu’il comporte les mutations ponctuelles suivantes: F9D, G11P,L13D.

B. Analyse par Western Blot de l’expression des mutants CIRP fusionnés à l’YFP avec un anticorps anti- GFP de l’expression des mutants CIRP (15µg de protéines par pistes).

C. Localisation des mutants YFP-CIRP dans les cellules HeLa en condition normale fixées. Les barres représentent 20µm.

A. D.

B.

C.

Fig7. Rôle des arginines des motifs RGG dans la localisation nucléocytoplasmique de CIRP.

A. Représentation schématique de l’YFP-CIRP. Les arginines des motifs RGG remplacées par des lysines sont soulignées (R94,105,116,K)

B. Localisation de l’YFP-CIRP et du mutant YFP-CIRP (R94,105,116,K) dans des cellules HeLa.

Fig 8. Rôle de la méthylation dans la localisation de CIRP dans les SG.

B. Localisation de l’YFP-CIRP ou du mutant YFP-CIRPΔRGG (figure 6A, construction F) après traitement des cellules COS à l’AdOx et à l’arsénite.

C. Les protéines flagCIRP et flag-CIRPΔRGG ont été

immunprécipitées comme en A. et on été révélées par Western Blot anti-flag ou anti-arginine méthylée. Les flèches indiquent leur position.

A. B.

A. B.

C.

d u c o n trô le)

Figure 9. Etude du rôle de la protéine CIRP dans le métabolisme des ARN.

A. Représentation schématique des gène rapporteurs contenant ou non (-) les séquences cibles RPA2 , TRX , ou potentiellement cibles ((AUUU)

) de CIRP

B. Les activités luciférases mesurées dans les extraits cellulaires sont exprimées en rapport R.Luc/F.Luc. Les valeurs sont la moyenne de trois expériences indépendante (les barres d’erreurs :

± écart-type). Gris foncé: valeurs obtenues en surexprimant la protéine flagCAT. Gris clair: valeurs obtenues en surexprimant la protéine flagCIRP

C. Analyse de la surexpression de CIRP par Western Blot anti-CIRP

D. Les activités luciférases mesurées dans les extraits cellulaires sont exprimées en rapport R.Luc/F.Luc. Les valeurs sont la moyenne de trois expériences indépendante (les barres d’erreurs :

± écart-type). Gris foncé: valeurs obtenues avec le petit ARN contrôle, en gris clair: valeurs obtenues avec les petits ARN qui ciblent CIRP.

E. Analyse de l’inhibition de l’expression de CIRP par Western Blot avec l’anticorps anti-CIRP. Le blot a été normalisé à l’aide d’un anticorps anti-actine.

A.

B. D.

C. E.

Figure 10. Répression de la traduction par la protéine CIRP.

A. Représentation schématique de la protéine CIRP. Les motif RGG sont soulignés et les arginines qui sont remplacées par des lysines sont en gras italique.

B. Les activités luciférases mesurées dans les extraits cellulaires sont exprimées en rapport R.Luc/F.Luc.

Les valeurs sont la moyenne de trois expériences indépendante (les barres d’erreurs : ± écart-type).

Les barres en gris foncé: 0MS2, les barres en gris clair: 8MS2. Les astérisques indiquent une différence statistiquement significative des valeurs (p<0.05).

C. Analyse par Northen Blot des messagers luciférases à partir d’extraits totaux (panneau de gauche) et à partir de fraction cytoplasmique (panneau de droite). Les signaux ont été quantifiés au Phosphorimager et les rapports R.Luc/F.Luc sont indiqués en dessous de chaque piste.

D. Analyse par RT-PCR de la présence de l’ARN U1 dans les extraits totaux ou cytoplasmique.

E. L’effet de l’adressage de la protéine du CIRP et du mutant CIRPΔRRM sur l’expression protéique du messager est calculé en faisant la rapport entre les valeurs normalisées de l’activité R.Luc et les valeurs normalisée des l’ARN cytoplasmique de R.Luc.

F. Analyse par immunofluorescence anti-flag de la localisation la protéine MS2-CP seule ou en fusion avec la protéine CIRP, dans des cellules traitées ou non à l’arsénite (T: fraction totale. C: fraction cytoplasmique).

Protéine ARN

Protéine/ARN cytoplasmique

A. D.

B. C.

E.

F.