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THESE
PRESENTEE
A L'UNIVERSITE DE BORDEAUX H pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE 3e CYCLE
Spécialité : îiologie et Physiologie Végétales.
Option : Pathologie Microbienne et Virale.
par
Sylvie ESTERLIN
Influence des rayonnements gamma sur la fixation des anticorps sur le polystyrène.
Application au test immunoenzymatique ELISA.
Soutenue le 26 février 1986, -^- \
\ . s devant la Commission d'Examen : •'.'< \1 ' t. • i
Mme C. BEBEAR Président '., ~~ ^ M. J.-M. BOVE ' M. A. DELPUECH Examinateurs
M. J. DUNEZ
1986
A mes Parents, Avec toute mon affection.
Professeur J.M. BOTE- Je tiens à le remercier de m'avoir accordé sa confiance, de m'avoir prodigué conseils et encouragements et d'avoir critiqué cette étude. Je le remercie également de faire partie de ce Jury.
Que Monsieur A. DELPUECH, Docteur ès-Sciences, qui a bien voulu m'accueillir au sein de son Unité et m'a permis de pouvoir réaliser ce travail, soit assuré de ma sincère et profonde recon- naissance.
Je prie Madame le Professeur BEBEAR de l'Université de Bordeaux II, qui me fait l'honneur de présider cette thèse, d'agréer l'expression de ma sincère gratitude.
Monsieur J. DUNEZ, Directeur de Recherche à I1INRA, a accepté de faire partie de ce Jury. Qu'il soit assuré de mes res- pectueux remerciements.
Que Madame M.H. TAILLEUR, qui a pris part à ma formation, qui n'a cessé de me conseiller avec bienveillance et qui m'a égale- ment guidée dans l'élaboration de cette thèse, accepte l'expression de ma sincère gratitude.
Je remercie sincèrement toute l'équipe de l'Antenne MX du Commissariat à l'Energie Atomique pour l'accueil chaleureux qu'elle m'a réservé et pour le souvenir reconnaissant que j'en garderai, et plus particulièrement Messieurs CARRERA et DOGNON, pour leur contri-bution a ce travail, ainsi que Mademoiselle F. NOËL pour les heures partagées sur cette étude.
Je tiens à remercier Madame C. BOVE pour la gentillesse avec laquelle elle n'a cessé de me prodiguer ses conseils.
Que Madame P. CARLE, pour ses enseignements et son encou- ragement ainsi qu 'au nom de l'amitié qui nous lie désormais, soit assurée de toute ma sympathie.
Je remercie également Mademoiselle C. SAILLARD.
Que Mesdames E. ABELA, C- LIPART et M. VALENTIN, pour le temps qu'elles ont consacré à la réalisation finale de ce travail et pour la bonne humeur qu'elles ont toujours manifestée, reçoivent 1'expression de mes sincères remerciements.
S O M M A I R E
INTRODUCTION 1 Première Partie : 4 ETUDE DES PLAQUES DE MICROTITRATION POUR LE TEST ELISA APPLIQUE A
LA DETECTION DE SPIBOPLASMA CITBI ; EXTENSION AU VIRUS DE LA TRISTEZA ET AU VIRUS DE LA MOSAÏQUE JAUNE DU NAVET
INTRODUCTION 4 I - TEST IMMUNOENZYMATIQUE ELISA 4 A - PRINCIPE 4 B - MATERIEL ET METHODE 5 1) Spiroplasme et virus 5 a) Souche de spiroplasme 5 b) Virus de la mosaïque jaune du navet 6 c) Virus de la Tristeza 7 2) Préparation des immunoglobulines 9 a) Immunisation des lapins 9 - contre Spiroplasma c-itri R8A2 9 - contre le virus de la mosaïque jaune du navet 10 - contre le virus de la Tristeza 10 b) Purification des immunoglobulines 11 3) Préparation du conjugué IgG-phosphatase a l c a l i n e ... 12 4) Préparation des antigènes 12 5) Réalisation du test 12 a) Fixation des IgG sur le support plastique 13 b) Dépôt d'antigène 13 c) Addition du conjugué 13 d) Addition du substrat 13 e) Lecture de la densité optique 14 II - ETUDE DES PLAQUES DE MICROTITRATION 15
A - CLASSEMENT DES PLAQUES DE MICROTITRATION POUR LA DETECTION
DE SPIROPLASMA CITRI 15
B - ETUDE PHYSICOCHIMIQUE DES PLAQUES DE MICROTITRATION 17 1 ) Spectrométrie de masse 17 2) Speccromëtrie infra-rouge 20 3 ) Mïcrosonde Raman 21 4) Microscopic électronique à balayage 22
III - INFLUENCE DES RAYONNEMENTS GAMMA IONISANTS SUR LES PLAQUES DE MICROTITRATION DANS L'UTILISATION DU TEST IMMUNOENZYMATIQUE ELISA 23 A - RAPPEL DE L'ACTION DES RAYONNEMENTS IONISANTS SUR LES
POLYMERES : APPLICATION AU POLYSTYRENE 23 1) Action des rayonnements sur la matière 23 2} Action des rayonnements sur les polymères 25 a) Changements chimiques 26 b) Changements des propriétés physiques 27 c) Effet des rayonnements gamma ionisants sur le
polystyrène 2ù B - MATERIEL ET METHODE 29 1) Source utilisée 29 2) Traitement des plaques de microtitration 29 C - ACTION DES RAYONNEMENTS IONISANTS GAMMA SUR LA SENSIBILITE
DU TEST ELISA DANS LA DETECTION DE SPIROPLASMA CITRI 30 1) Définition du facteur k 30.
2) Influence de la dose d'irradiation sur la valeur du facteur k 31 3) Influence de la concentration d'antigène sur la va-
leur du coefficient k 31 4) Seuil de sensibilité 32 5) Conclusions 32 D - EXTENSION DES RESULTATS A LA DETECTION DE SPIROPLASMA
CITRI EN MILIEU HETEROGENE 33 1) Cas du mélange sérum albumine bovine - Spiroplasma .
citTi. 34 2) Cas de broyats de plantes infectées par Spiroplasma.
aitri R8A2 35 E - EXTENSION DES RESULTATS A LA DETECTION DU VIRUS DE LA
MOSAÏQUE JAUNE DU NAVET ET A LA DETECTION DU VIRUS DE
LA TRISTEZA 35 1 ) Mode opératoi re 36 2) Influence de l'irradiation du support sur la sensibi-
lité du test ELISA dans la détection du VMJN purifié 36 3) Influence de l'irradiation du support sur la sensibi-
lité du test ELISA dans la détection du virus purifié de la Tristeza 37 4) Comparaison de l'évolution du facteur k pour Spiro-
plasma. aitri, VMJN et virus de la Tristeza 37 F - INTERPRETATION DE L'AMELIORATION APPORTEE AU TEST ELISA
PAR IRRADIATION DES PLAQUES DE MICROTITRATION 37 G - ETUDE COMPARATIVE DES DIFFERENTES PLAQUES DE MICROTITRA-
TION UTILISEES POUR LE TEST ELISA APRES TRAIThMENT AUX
RAYONNEMENTS GAMMA 42 CONCLUSIONS 43
- Ill -
Deuxième Partie : 46
INFLUENCE DES RAYONNEMENTS GAMMA SUR L'ACTIVITE BIOLOGIQUE DES IMMUNOGLOBULINES : APPLICATION AU TEST ELISA
I - EFFETS DES RAYONNEMENTS IONISANTS SUR LES BIOMOLECULES 46
1) Notions de radiobiologie fondamentale 46 2) Effets des rayonnements ionisants sur les molécules biolo-
giques (ADN>t protéines) 48 a) Modifications structurales et biologiques des pro-
téines et des acides nucléiques sous l'influence des rayonnements ionisants 48 b) Facteurs influençant la radiosensibilité des protéines 50
b.l) Influence du milieu environnant la molécule
biologique 50
b.2) Effets des conditions du traitement 52 b.2.1) Dose d'irradiation 53 b.2.2} Température d'irradiation 53 b.2.3) Atmosphère 53 3) Conclusions sur la radiosensibilité des protéines 54
II - INFLUENCE DES RAYONNEMENTS GAMMA SUR L'ACTIVITE BIOLOGIQUE
DES IMMUNOGLOBULINES POUR LE TEST ELISA 55 1) Effets des rayonnements ionisants sur les immunoglobulines
à Tétât sec 56
2) Action des rayonnements gamma sur les immunoglobulines en solution aqueuse 57
a) Importance du milieu environnant 58 a.l) Influence du tampon de dilution 58 a.2) Influence de la dilution des immunoglobulines 60 b) Effet de la température d1irradiation 61 III - INTERACTION IMMUNOGLOBULINE - SUPPORT PLASTIQUE SOUS
IRRADIATION 62
1) Evolution du test ELISA après irradiation du système irnrnu- noglobuline-support plastique avec immunoglobulines préala- blement fixées 63 2) Evolution du test ELISA après irradiation du complexe immu-
noglofauline-support plastique avec IgG diluées en solution aqueuse 64
CONCLUSION 67 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 71
ABREVIATIONS
BSA : Sérum Albumine Bovine
0C : Degré Celsius
Ci : Curie
cm, mm, nm : Centimètre, Millimètre, Nanometre
60CO : Cobalt 60
DO : Densité Optique
Ey : Energie moyenne des rayonnements EDTA : Ethylène Diamine Tetra-acétate 9, rog. ug : Gramme, Milligramme, Microgramme h, mn : Heure, Minute
KCaI : Kilocalorie kSy : Kilogray
1, ml, ul : Litre, Millilitre, Microlitre M, mM : Molaire, Millimolaire
MeV, eV : Mega-electronvolt, Electronvolt
PEG : Polyethylene Glycol
rpm : Révolution par Minute
Tg : Transition vitreuse
Tris : Tris(hydroxymëthyl) Aminométhane
•uO : Fréquence du rayonnement incident va : Fréquence du rayonnement diffusé
I N T R O D U C T I O N
substances difficilement décelables.
Le fait que ces techniques de détection soient utilisées aussi bien dans le monde médical que dans le monde pharmaceutique, vétérinaire et agronomique explique en partie le vif intérêt que de nombreux chercheurs y ont porté. Les premières techniques ayant permis la mesure de molécules de faible poids moléculaire et l'identification de certaines maladies infectieuses sont l e test radïoimmunologique RIA (Radio Imrnuno Assay) et le test fluo-immuno- logique FIA (fluorescent Imtnuno Assay), mais ces deux systèmes immu- nochimiques présentent un certain nombre de désaventages.
En effet, outre la difficulté de marquage des anticorps par des isotopes, ces tests nécessitent un personnel très q u a l i f i é , des réactifs ayant une durée de vie brève et un appareillage très perfectionné, ce qui les rend coûteux et donc peu rentables pour une utilisation de routine.
C'est la raison pour laquelle des recherches ont été menées pour obtenir des techniques de substitution : c'est ainsi que la technique immunoenzymatique EIA (Enzyme Immuno Assay), appa- rue grâce à l'obtention d ' u n couplage enzyme-anticorps par AVRAMEAS en 1969, a permis à ENGVALL et PERLMANN de décrire pour la première fois en 1971 la technique ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent As- say). Celle-ci a alors supplanté la RIA et la FIA dans les analyses courantes.
La technique ELISA met en jeu des anticorps ou des anti- gènes fixés à un support solide et des anticorps liés à un enzyme (conjugué).
- 2 -
Son succès s'explique par ses qualités de reproductibi- lité, spécificité, rapidité, facilité de mise en oeuvre et par son prix de revient bon marché.
Bien que cette technique soit très sensible, il serait intéressant d'abaisser son seuil de sensibilité pour permettre des détections plus fines et donc plus précoces.
Cette amélioration dépend en partie de la qualité du support choisi qui conditionne la fixation des anticorps.
C'est pourquoi, nous avons orienté notre travail sur l'étude des supports d'une part et sur celle des systèmes support- anticorps d'autre part.
Notre travail se divise en deux parties :
- La première partie se décompose en trois chapitres : une présen- tation du test ELISA, une analyse comparative des supports les plus utilisés pour cette technique et une étude sur les effets des rayonnements gamma sur la qualité des supports.
Cette étude a été réalisée avec les antigènes suivants : Spiro- plasjna aitri R8A2, le virus de la mosaïque jaune du navet et le virus de la Tristeza.
- La deuxième partie est consacrée à l'action des rayonnements gamma sur les anticorps et le système support-anticorps.
ETUDE DES PLAQUES DE MICROTITRATION POUR LE TEST ELISA APPLIQUE A LA DETECTION DE SPI3OPLASMA CITBI ;
EXTENSION AU VIRUS DE LA TRISTEZA ET AU VIRUS DE LA MOSAÏQUE JAUNE DU NAVET
INTRODUCTION
Comme la sensibilité et la reprodûctibilité du test iiranu- noenzymatique ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) dépendent largement de7Ià qualité du support, nous nous sommes attachés dans cette première partie à 1'étude du matériel utilisé dans les labo- ratoires.
Cette étude a été menée dans deux directions : d'une part, la comparaison et l'analyse des plaques de microtitration servant actuellement de support, d'autre part, l'amélioration de ces sup- ports notamment par irradiation aux rayonnements ionisants gamma.
Ces deux orientations ont été suivies dans le but d'élu- cider certains mécanismes de fixation des immunoglobulines sur les supports, mécanismes encore mal connus à ce jour.
Il est présenté de façon détaillée par VOLLER et al. (1976).
A - PRINCIPE
II est relativement simple. Il s'agit de détecter et de mesurer la quantité d'antigène présente dans une solution.
r
TEST IMMUNOENZYMATIQUE " E L ( S A "(ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)
T)Fixation de l'anticorps.
I
(g) Addition de Ia solution a tester contenant l'antigène.T
(3) Addition du complexe (enzyme-anticorps) spécifique de l'antigène.(4;Addition du substrat de l'enzyme.
©Lecture calorimétrique de la réaction enzymatique .
E
a
Anticorps.
Antigène.
Complexe enzyme-anticorps.
Substrat de l'enzyme.
Produit de l'hydrolyse du substrat.
Figure 1
- 5 -
On procède de la manière suivante ( f i g u r e 1) :
1) On fixe sur une phase solide des anticorps spécifiques d ' u n antigène donné. Cette phase de fixation est .suivie, d ' u n ..rinçage permettant l'élimination des anticorps qui ne sont pas absorbés sur le support.
2) La solution à tester est ajoutée. On la laisse incuber afin de permettre aux antigènes présents dans la solution de se fixer sur les anticorps correspondants. On rince ensuite le support.
3) On additionne le conjugué, c'est-à-dire l'anticorps l i é à un enzyme. Cet anticorps spécifique de l'antigène sera retenu par les antigènes restés accrochés à l'étape précédente. Un rinçage permet d'éliminer le conjugué resté libre.
4) Pour terminer, on ajoute enfin le substrat de l'enzyme. Le chan- gement de couleur est proportionnel à la quantité d'antigène pré- sente dans la solution à tester de la deuxième étape.
B - MATERIEL & METHODE
1) SPIROPLASME ET VIRUS
Notre étude a été réalisée avec la souche de spiroplasme Spiroplasma. aitri R8A2 et les virus de la Mosaïque Jaune du Navet et le viras de la Tristeza.
a) Souche de Spiroplasme
La souche de Spiroplasme, Spi.ropla.sma citri R8A2 (ATCC 27556), a été isolée à partir d'orangers malades provenant du Maroc, présentant des symptômes de jaunissement, de raccourcisse- ment des entre-noeuds, de nanisme et produisant des fruits déformés en forme de glands. La culture de l'organisme (SAGLIO et al., 1971, a et b), ainsi que sa caractérisât!on (BOVE et al., 1973 ; SAGLIO et al., 1973) ont apporté la preuve que Spiroplasma sitri R8A2 était bien l'agent causal de la maladie du "Stubborn" des agrumes.
COMPOSITION DU M I L I E U DE CULTURE BSR
Infusion de coeur de boeuf 22,5 g Sérum de poulain 100 ml Sorbitol 70 g Sucrose 10 g Glucose 1 g Fructose 1 g Rouge de phénol 30 mg Eau ramenée à 1 1
- 6 -
Ce spiroplasme se multiplie facilement dans un m i l i e u de culture appelé BSR (tableau I ) , contenant du sérum de p o u l a i n .
Or, toutes les protéines présentes dans ce sérum de pou- l a i n s'adsorbent sur le spiroplasme au cours de sa croissance.
C'est pourquoi, on utilise pour la fabrication d'anticorps anti- Spiroplasrna citri R8A2, une souche de spiroplasme cultivée dans un milieu différent du milieu BSR pour éviter que la fabrica- tion d'anticorps dirigés contre les protéines du m i l i e u de culture se surajoutent aux anticorps fabriqués contre le spiroplasme. Le milieu BSR sert dans notre cas uniquement à la croissance des spi- roplasmes utilisés comme antigène.
La température de croissance est de 320C. A la fin de la phase exponentielle de croissance, les cultures sont centrifugées.
On centrifuge 50 ml de culture à 20.000 g pendant 20 minutes (BECKMAN J2.21). Le culot est lavé avec 20 ml de tampon phosphate NaCl à température ambiante. Cette opération est s u i v i e d'une nouvelle centrifugation. Le culot final est remis en suspen- sion dans 3 ml de tampon phosphate NaCl. L'échantillon est ajusté à une concentration finale en protéines de 100 ug par m l .
b) Le virus de la Mosaïque Jaune du Navet (VMJJI)
Le virus de la mosaïque jaune du navet (VMJN) est le virus type des Tymovirus. Il s'agit d ' u n virus à RNA "plus". Ses plantes-hôtes sont du genre Crucifères et son hôte de prédilection est l e chou de C h i n e (Brassiaa sinensis L . ) . Le symptôme classique est l'apparition sur le limbe de la f e u i l l e d ' u n e mosaï- que jaune vif ou jaune vert.
On cultive les choux de Chine (Bnzssiaa sinensis L.
variété Cantonner) à une température variant entre 20 et 260C. Les plants sont inoculés, mécaniquement en présence de carborundum (400 mesh), avec une "suspension de virus" de la mosaïque jaune du navet (VMJN) purifiée à la concentration de 0,5 mg/ml de tampon phos- phate 10 mM pH 7,0.
Les symptômes d'infection systémique apparaissent sur les feuilles une dizaine de jours après inoculation.
La purification du virus est réalisée selon la méthode de STEERE (1956). Les feuilles qui présentent des symptômes d'infec- tion systémique à la surface du limbe vont être dénervurées et lavées avant d'être broyées dans du tampon phosphate pH 7,0. Cette opération a lieu pendant deux minutes à 40C à l ' a i d e d ' u n Turnrix.
Le broyât est filtré sur gaze. Le filtrat ainsi obtenu est mélangé à une solution chloroforme-butanol (v/v). L'agitation dure environ 30 minutes au bout desquelles 1 "emulsion est centrifu- gée (MSE-18) 15 minutes à 9.000 rpm.
On récupère la phase aqueuse qui est centrifugée à nou- veau à la même vitesse. Le surnageant obtenu lors de cette dernière étape subit une centrifugation pendant 90 minutes à 30.000 rpm
(rotor Ti 60, centrifugeuse Spinco Beckman L5-50).
Le culot obtenu, contenant les virions, est remis en suspension dans du tampon phosphate. La suspension ainsi réalisée est soumise à une centrifugation différentielle à 9.000 rpm durant 15 minutes, puis à 42.000 rpm pendant 120 minutes, afin d'obtenir un culot de virions purifiés. Le culot est repris par du tampon phosphate 0,01 M.
La concentration en virions est enfin déterminée par lecture de la densité optique à 260 nm. Ces virions peuvent servir soit à l'inoculation de jeunes plants de chou de Chine, soit à la fabrication d'anticorps anti-VMJN par injection à des lapins.
s) Le vims de la T-r*isteza
II s'agit d'un virus à RNA "plus" du groupe des Clostero- virus. C'est l'agent causal de la maladie de la Tristeza, maladie affectant les agrumes.
- 8 -
Les arbres atteints de la "Tristeza" présentent des si- gnes plus ou moins sévères de défoliation, de rabougrissement ou de dépérissement. Les fruits mûrissent souvent dès l'apparition de la maladie et sont réduits en taille.
Les plants de lime mexicaine (cït-ms aurantifolia) sont inoculés par greffage avec différentes souches de Tristeza.
Les plants virosés sont maintenus en serre à 240C.
La purification du virus de la Tristesa est ;-é*1T'ée selon la méthode de BAR-JOSEPH, LOEBENSTEIN et COHEN U97Z\ C-:
broie 10 g (écorce saine ou virosée) avec de l'azote liquide au broyeur DANGOUMEAU pendant 4 Minutes. On obtient une poudre très fine, qui, remise en suspension dans 120 ml de Tris-HCl pH 7,4 0,05 M, est agitée durant 10 minutes à température ambiante. On filtre sur quatre épaisseurs de gaze. La poudre est remise en sus- pension dans 50 ml de Tris. On agite 5 Minutes. On filtre sur la même gaze. On centrifuge 5 minutes à 7.000 rpm (MSE 18) ; le surna- geant auquel on ajoute 6,1 g (4 ») de polyéthylène-glycol (P.W. = 6.000) (PEG) et 6,1 ml de NaCl 20 % (4 ml pour 100 ml), est agité durant 20 minutes à la chambre froide. Cette emulsion est ensuite centrifugée pendant 15 minutes à 20.000 g (12.600 rpm - MSE 18). Le culot obtenu est remis en suspension dans 40 ml de tampon phosphate Na pH 8,2 - 0,04 M (minimum 30 minutes).
Une nouvelle centrifugation est alors réalisée pendant 10 minutes à 5.000 rpm. On ajoute au surnageant 2 g de PEG et 2,4 ml de NaCl 20 % puis on agite ce mélange 20 minutes dans la chambre froide. Après cette agitation, une nouvelle centrifugation est menée 15 minutes à 20.000 g à la suite de laquelle le culot obtenu est resuspendu dans 4 ml de tampon phosphate de Na pH 8,2 - 0,025 M. La centrifugation qui suit, 15 minutes à 5.000 rpm, permet d'obtenir un surnageant qui est une solution de virus partiellement purifiée.
A partir de cette solution partiellement purifiée, on effectue tout d'abord une observation au microscope électronique (acide phosphotungstique 1 %), puis une centrifugation en chlorure ae césium.
Pour chaque gradient, on mélange dans un tube du rotor SW 50, 1,1 ml de chlorure de césium de densité 1,79, 0,2 ml de formal- dehyde 40 % et 2,4 ml de solution de virus ou de témoin. On intro- duit au fond 1 ml de chlorure de césium 1,79. On centrifuge durant 5 heures à 35.000 rpm. L'observation du gradient est faite en den- sité optique à 260 nm.
2) PREPARATION DES IfWUNOGLOBULINES
Elle est importante ouisque de la qualité des immunoglo- bulines dépendra la qualité du :est.
a) Immunisation des lapins
- Contre Spiroplasma ci tri R8A2
La souche Spiroplasma aitri R8A2 qui a été cultivée dans du milieu BSRH en vue de l'immunisation des lapins est centri- fugée en fin de phase exponentielle de croissance pendant 20 minu- tes à 20.000 g à 150C dans une centrifugeuse Beckman (J2-21).
On reprend à température ambiante le culot obtenu dans 20 ml d'une solution tampon phosphate - NaCl pH 7,4 (tampon phos- phate 0,1 M pH 7,4 NaCl 0,33 M ) , afin de débarasser les spiroplas- mes d'une partie des protéines provenant du milieu de culture.
Cette opération est suivie d'une nouvelle centrifugation et d ' u n nouveau lavage du culot obtenu dans les mêmes conditions que précé- demment.
Après ces deux lavages successifs, le culot final est remis en suspension dans 6 ml de tampon phosphate NaCl pour un dosage de protéines, selon la méthode de LOWRY (1951).
- 10 -
On ajoute ensuite, goutte à goutte, 1 ml d'adjuvant de FREUND complet ( B . D . Mérieux) ) 1 ml de la suspension de protéines de spiroplasmes (4 mg de protéines). Les 2 ml ainsi obtenus sont mélangés pendant 10 minutes sur un Vortex puis injectés dans le muscle de chaque patte arrière d ' u n lapin.
L'immunisation est réalisée pendant un mois à raison d'une injection par semaine. Un rappel aura lieu deux semaines après la dernière injection si le titre de 1'immunsérum n'est pas suffisant.
- Contre "Le virus de la mosaïque Jaune du navet On injecte à des lapins le mélange virus p u r i f i é - adjuvant de Freund ( v / v ) à la concentration finale de 1 mg par ml de virus. On répète l'injection tous les quinze jours pendant deux mois au bout desquels le sang du lapin est récupéré et centrifugé à 15.000 rpm pendant 15 minutes pour éliminer les éléments figurés du sang.
- Contre le virus de la Tristeza
On peut obtenir des anticorps dirigés contre le virus de la Tristeza en injectant une solution de virus p u r i f i é soit à des lapins, soit à des chèvres.
Nous avons réalisé l'immunisation par injection du virus purifié en intramusculaire à des lapins. Une première injection de 0,245 mg de virus purifié a été suivie trois semaines après par une nouvelle injection de 0,345 mg. Un mois après l a deuxième injec- tion, le sang de l'animal a été prélevé pour être centrifugé à 15.000 rpm pendant 10 minutes : le sérum obtenu contient les immu- noglobulines anti-Tristeza.
b) Purification des irrmunoglobulines
Le sang prélevé sur le lapin immunisé est gardé 1 heure à 370C puis 24 heures à 4°C afin de séparer le caillot du sérum. Ce dernier, qui est la partie contenant les immunoglobulines, est ensuite centrifugé pendant 10 minutes à 10.000 g (centrifugeuse MSE 6) à température ambiante.
A partir du surnageant, les insnunoglobulines G ou IgG sont purifiées sur colonne de Sépharose 4B protéine A (Pharmacia Fine Chemicals). Les IgG ont, en effet, la propriété de rester fixées à la protéine A isolée de Staphylocoacus OUTSUS par leurs fragments Fc (deux molécules d'IgG par molécule de protéine A ) .
La protéine A est fixée par des liaisons covalentes sur une colonne de verre de Sépharose 4B dont l'embouchure a été obs- truée par de la laine de verre.
La Sépharose 4B protéine A est en suspension dans du tampon NET (Tris HCl 50 mM pH 7,4 ; NaCl 150 mM ; EDTA 50 m M ) . Le mélange est versé en haut de la colonne, puis stabilisé par lavage avec du tampon NET.
On dépose sur la colonne 10 ml de sérum. Une fois que l'échantillon est complètement absorbé par la colonne, celle-ci est rincée avec du tampon NET jusqu'à ce que la densité optique à 280 nm de l'êluat revienne à zéro. On élue alors la colonne avec du tampon Tris-Glycine afin de récupérer la fraction IgG qui est pré- cipitée par du sulfaté d'ammonium saturé à 50 % durant une demi- heure à 40C. On centrifuge ensuite le mélange 10 minutes à 10.000 rpm (centrifugeuse Beckman J2-21). Le culot est remis en suspension dans 6 ml de tampon PBS, puis dialyse contre du tampon PBS.
La densité optique de la solution d1immunoglobulines ainsi obtenue sera relevée à 280 nm sur un spectrophotomètre Beck- man, afin de connaître la concentration en mg de protéines/ml de PBS.
- 12 -
3) PREPARATION DU CONJUGUE IgG-PHOSPHATASE ALCALINE
Selon la méthode de CLARK et ADAMS (1977), le marquage des IgG par la phosphatase alcaline est réalisée de la manière suivante :
Deux mg de phosphatase alcaline (type SIGMA) sont centri- fugés à 10.000 g pendant 20 minutes à 40C (centrifugeuse Beckman J2-21). Le culot obtenu est remis en suspension dans 1 ml de la solution contenant les IgG purifiées à la concentration de 1 mg/ml.
La suspension réalisée est alors dialysée contre du tam- pon PBS, 3 fois deux heures dans un litre de PBS. On ajoute ensuite de la glutaraldéhyde q u i , commercialisée à 25 %, est ramenée à la concentration finale de 0,06 « ( U . V . ) .
On laisse incuber quatre heures à température ambiante, puis on dialyse trois fois contre 1 litre de tampon PBS à 40C dans le but d'éliminer la glutaraldéhyde non utilisée pour lier la phos- phatase alcaline aux IgG.
4) PREPARATION DES ANTIGENES
L'essai immunologique ELISA est pratiqué sur la suspen- sion de virus purifié ou de spiroplasme et sur les dilutions effec- tuées dans du tampon PBS-TWEEN.
5) REALISATION DU TEST
Le test est réalisé selon le protocole cité par Colette SAILLARD (1981).
a) Fixation des IgG sur le support plastique
Les inmunoglobulines sont diluées dans du tampon carbo- nate de sodium pH 9,6 (Naz 003 : 15 mM, Na HCOa : 340 mM, Na NS : 3 mM) à la concentration de 6 ug/ml (paramètre invariant dans l'en- semble des tests).
On met 150 ul de solution dans chaque puits d'une plaque de microtitration que l'on laisse incuber 3 heures à 320C. La pla- que est ensuite lavée à température ambiante avec du tampon PBS pH 7,4 contenant 0,5 ml de TWEEN 20 par litre (tampon PBS TWEEN).
b) Dépôt d'antiaène
On dépose 150 pi de solution antigène par puits de plaque de microtitration. On utilise 3 à 6 puits par dilution étudiée.
Chaque dilution est réalisée dans du tampon PBS TWEEN,
Une rangée de puits est remplie de tampon PBS TWEEN (150 ul/puits) constituant le témoin négatif du test. La plaque est incubée environ 16 heures à 40C.
c) Addition du conjugué
Après trois rinçages successifs de la plaque avec du tampon PBS TWEEN, on ajoute le conjugué IgG - phosphatase a l c a l i n e dilué au l/400è dans du tampon PBS TWEEN additionné à 2 " ( p / v ) de polyvinyl pyrollidone ( P V P ) (Fluka Kollidon 25) et de 0,2 % ( p / v ) d'ovalbumine (SIGMA Chemicals) toujours à raison de 150 M l par puits. L'incubation de la claque est de trois heures à 320C.
d) Addition du substrat
La plaque ayant été rincée, une solution de paranitrophê- nylphosphate (SIGMA Chemicals) à 1 mg/ml préparée dans un tampon pH 9,8 contenant 98 ml de diéthanolamine, 3 mM de Na H^ et dont le pH est ramené à 9,8 avec de THCl 10 N, est alors ajoutée à raison de 150 ul/puits. Le paranitrophénylphosphate incolore est hydrolyse en param'trophénol jaune par la phosphatase alcaline à température ambiante entre 20 et 60 minutes.
- 14 -
e) Lecture de la. densité optique
Elle est faite à 405 nm sur un spectrophotomètre adapté à l'utilisation des plaques de microtitration pour le -est ELISA.
C'est le lecteur de plaques dont la longueur d'onde est fixée à 405 nm. Il s'agit du TITCRTEK MULTISKAN décrit par F. CAILLAUD (1981). C'est un spectrophotomètre à 8 canaux capables de lire simultanément les D.O. de 8 cupules (une colonne) d'une plaque de microtitration. Une plaque de microtitratiot' est constituée de (8 x ItI) cupules. Le faisceau lumineux est vertical, traversant ainsi les cupules à la perpendiculaire.
"!ette modification a conduit à une correction de la loi de BEER :
Log Io/I = JL A M = Masse de solution absorbante A = Surface de la cupule
Pour une lecture donnée (M/A) est constant. La DO est proportionnelle à la masse de la solution. Comme le volume est contîu et constant dans toutes nos expériences, la concentration est aisément calculable. La source est une lampe halogène-tungstène.
Les rayons de faisceau lumineux sont rendus parallèles par un conducteur avant de traverser le filtre d1-interférence. Le faisceau est partagé en huit faisceaux identiques et parallèles, puis condensé avant de traverser les cupules de la plaque de microtitra- tion et d'arriver sur les analyseurs. L'impression sur rouleau enregistreur est immédiate. La plaque avance ensuite automatique- ment colonne par colonne-. "Il faut environ une minute pour lire les
96 cupules d'une plaque.
Lorsque la densité optique atteint 0,1 DO, on considère la réaction positive.
II - ETUDE DES PUQUES DE MICROTITRATIOM
A - l ' h e u r e actuelle, plusieurs fabricants offrent sur le marché une gamme étendue de plaques de microtitration spécifique- ment conçues pour le test immunoenzymatique ELISA.
La diversité de ces plaques a conduit I. SHEKARCHI et ses collaborateurs (1984) à realiser, une.-étude comparative de l e u r capacité de fixation, ce qui leur a permis de mettre en évidence des différences de DO pour un même anticorps. Ces résultats nous ont suggéré les études suivantes :
- Classement des plaques de microtitration les p l u s couramment employées dans les laboratoires de biologie (tableau II) ;
- Analyse physico-chimique des plaques de microtitration.
A - CLASSEMENT DES PLAQUES DE MICROTITRATION POUR LA DETECTION DE SPIROPLASMA CITRI
Le test ELISA permet d'établir un classement des plaques de microtitration en comparant les densités optiques relevées à 405 nm pour la détection d ' u n ant-'gène donné.
L'antigène utilisé dans cette étude est l'agent pathogène de la maladie du "Stubborn" des agrumes : Spiroplasma aitri R8A2.
Le tableau III donrie pour chaque plaque de microtitrô:tion étudiée la valeur de la densité optique ( D O ) pour une concentration de spiroplasme de 0,05 ug/ml. On constate que les plaques LINBRO et DYMATECH GREINER sont les moins performantes donnant respectivement les DO suivantes : 0,31 et 0,43.
L'ensemble des autres plaques : DYNATECH M129B et M129C, NUNC et COSTAR donne des résultats équivalents : DO variant de 0,82 à 0,96.
TABLEAU III
DO A 405 nm POUR LA DETECTION DE 0,05 ug/ml DE SPIROPLASMA CITRI
POUR DIFFERENTES PLAQUES DE MICROTITRATION
MARQUE
Dynstech Greiner.
Dynatech Immulon M129B.
Dynatech Immulon M129C.
Nunc.
Costar
DO à 450 nm
O 43 0,90 0,94 O 82 O 96 O 67 O 31
STERILISATION PAR LES FABRICANTS
NON OUI OUI OUI OUI NON NON
On obtient avec la plaque FALCON une valeur de DO inter- médiaire (DO = 0 , 6 7 ) .
Ces premiers résultats permettent de tirer les conclu- sions suivantes :
1) les plaques de microtitration ne sont pas équivalentes pour la détection d ' u n antigène donné. L'écart maximum de DO est de 0,6 ; 2) nous pouvons classer les plaques de microtitration en 3 groupes
- LINBRO et DYNATECH GREINER groupe I - FALCON groupe II - DYNATECH M129B et M129C, NUNC et
COSTAR groupe III
II est intéressant de noter que les groupes I et II (DO faibles) correspondent aux supports qui n'ont pas subi de traite- ment par les fabricants alors que l'ensemble des plaques de micro- titration du groupe III (DO les plus élevées) a été stérilisé à l'aide d'un rayonnement gamma.
Aussi, avant d'aborder l'étude physico-chimique de ces mêmes plaques, nous a-t'il semblé intéressant d'envisager l'expé- rience suivante : irradier une plaque DYNATECH GREINER afin de la comparer aux plaques DYNATECH M129B et M129C préalablement irra- diées par le fabricant.
Le tableau IV montre que pour chacune des concentrations envisagées, les densités optiques sont équivalentes. Par consé- quent, nous venons de démontrer que dans le cas de la détection de Spiroplasma eitri R8A2 les p l a q u e s DYNATECH G R E I N E R i r r a - diées, DYNATECH M129B et M129C, donnent des résultats similaires, et, que leur seuil de sensibilité se situe vers 0,015 Hg par ml d'antigène.
La plaque DYMATECH GREIMER a donc acquis grâce au traite- ment ionisant une efficacité égale à celle des plaques DYNATECH M129 B et M129C.
T A B L E A U IV
DO A 405 nm P O U R LE TEST ELISA R E A L I S E
SUR D I F F E R E N T E S PLAQUES DYMATECH NON I R R A D I E E S ET I R R A D I E E S
Ag ug/ml
3laque DYNATECH 3RE I NER
OYNATECH ÎREIHER IRRADIEE DYNATECH M129B DYNATECH M129C
5
1,81
> 2
> 2
> 2
0,5
1,38
> 2
> 2
> 2
0,25
0,99
1,64
1,75
> 2
0,125
0,53
1,17
1,30 1,49
0,06
0,35
0,77
0,90 0,95
i 0,03
OJ9
0,47
0,47 0,53
0,U1b
0,1
0,21
0,37 0,27
0,007
""j
<0,1
0,12
<0,J U, 12
Nous reviendrons un peu plus l o i n sur l ' i n f l u e n c e des rayonnements ionisants sur les plaques de microtitration. Aupara- vant, nous allons examiner les résultats obtenus sur l ' é t u d e physico-chimique de ces plaques.
B - ETUDE PHYSICO-CHIMIQUE DES PLAQUES DE MICRQTITRATION
Nous avons tenté de différencier les plaques de microti- tration par une étude physico-chimique.
Plusieurs techniques ont servi à cette étude : spectro- mêtrie de masse, spectrométrie infra-rouge, microsonde Raman, mi- croscopic électronique à balayage.
1) SPECTROMETRIE m MASSE
La spectrométrie de masse (S.M.) est une technique bien adaptée à l'étude des matériaux macromoléculaires. E l l e permet, en effet, grâce à sa grande sensibilité, d ' i d e n t i f i e r tous les nom- breux ions formés par fragmentation et de donner ainsi !'"emprein- te" de la molécule.
La caractérisât!'on des plaques de microtitration par soectromëtrie de masse nécessite l'association de trois techniques physico-chimiques réunies sous forme de chaîne analytique, décrite par J.C. SARTHOU (1984).
Les éléments de cette chaîne sont :
- un pyrolyseur à filament (75-PY-I de la Société G I R D E L ) ,
- un chromatographe en phase vapeur ( I . G . C . 120 de la Société INTERSMAT),
- un spectromêtre de masse (CH5.DF de la Société FINNIGAN MAT).
- 18 -
L'ensemble est informatisé par un système d'acquisition et de traitement des données (S.S. 188 dez la Société FINNIGAN MAT}.
La chromatographie en phase vapeur ( C . P . V . ) et la spec- trométrie de masse (S.M.) sont deux méthodes analytiques complémen- taires. La ( C . P . V . ) permet de séparer les différents composés du pyrolysat gazeux et d'en déterminer les temps de rétention. La (S.M.) par fragmentation ionique, puis par séparation des ions formés, permet d'identifier les diverses molécules organiques ou minérales préalablement séparées.
Chaque échantillon (morceau de plaque de microtitration) placé sur Is tête du pyrolyseur est pyrolyse à 70O0C pendant 5 se- condes. Une colonne APIEZON L, très performante pour la séparation des polymères, permet de séparer par ( C . P . V . ) les différents pro- duits du pyrolysat. A la sortie de la colonne, la (S.M.) va permet- tre l'identification de chacun des constituants de l ' é c h a n t i l l o n selon le mécanisme suivant :
- fragmentation du constituant sous forme ionique par une source à bombardement ionique,
- tri des ions suivant leur rapport masse sur charge ( m / e ) ,
- détection grâce à un collecteur d'ions du type multiplicateur d'électrons.
A l'exception de la plaque FALCON, toutes les autres plaques étudiées, c'est-à-dire DYNATECH GREIMER, DYNATECH M129B, DYNATECH M129C, NUNC, COSTAR et LINBRO, présentent le spectre de masse du polystyrène (figure 2, a et b). La plaque FALCON, quant à elle, présente un spectre différent (figure 3, a et b) montrant qu'elle est réalisée à partir d ' u n mélange ABS/PMMA-copolymere acrylonitrile-butadiène-styrène d'une part et polyméthyl méthacry- late d'autre part.
CmnJ
(b)
(mn) Figure 2 - (a) Pyrogramme du polystyrène.
(b) Pyrogramme des plaques DYNATECH, NUNC, COSTAR et LINBRO
(a)
3'«
- 19 -
17-46 3 4'02
(mn)
(b)
(mn)
Figure 3 - (a) Pyrogramme de l'acrylonitrile-butadiène-styrène et du pnlymé- thylméthacrylate
(b) Pyrogramme de la plaque FALCON.
Figure 4 - SPECTRES INFRA-ROUGE
(a) DE LA PLAQUE DYNATECH GREINER (b) DE LA PLAQUE DYNATECH M129B
- 20 -
2) SPECTROMETRIE INFRA-ROUGE
La spectrométn'e infra-rouge sert, comme le signale J.A.
MOORE (1975) à contrôler et identifier des substances organiques et inorganiques pures ou en mélange.
Le spectre infra-rouge d ' u n composé apporte des informa- tions sur les mouvements des atomes et des liaisons. Il est donc constitué de pics d'absorption relatifs à deux types de vibrations atomiques, les vibrations de valence ou d'êlongation et celles de déformation angulaire.
Le principal intérêt des spectres infra-rouge, pour la détermination de structure est de mettre en évidence la présence de groupes spécifiques tels que OH, C = O, C = C, C - C . Le spectre infra-rouge constitue une "empreinte digitale" du composé.
Nous avons donc comparé deux plaques de microtitration en polystyrène, de sensibilité différente au test ELISA, afin de met- tre en évidence l'apparition d'une ou plusieurs liaisons supplémen- taires sur Tune d'elles. Les plaques utilisées sont : DYNATECH GREINER et DYNATECH IMMULON M129B. Les échantillons étant trop épais pour permettre une analyse directe en infra-rouge, on réduit leur surface en poudre assez fine pour effectuer une dispersion dans du KBr. On obtient ainsi des pastilles transparentes.
La figure 4 (a et b) présente les spectres infra-rouge réalisés sur appareil PERKIN ELMER 580/B assisté par un calculateur I.R. DATA STATION. Les résultats montrent q u ' i l n'y a pas de dif- férence entre les deux types de plaque. La meilleure qualité de la plaque DYNATECH M129B ne peut donc pas s'expliquer par l'addition d'une espèce chimique supplémentaire.
3} MICEOSONDE RAMAN
En diffusion Raman (SZYMANSKI, 1967), les émissions ob- servées reflètent les polarisations induites par le faisceau élec- tromagnétique excitateur sur une substance. En effet, les mouve- ments de rotation et de vibration entraînent une perturbation du nuage électronique et, par suite, une variation de polarisabilité moléculaire.
Par excitation d'une substance homogène par une onde monochromatique, on obtient deux familles de raies Raman encadrant une raie de diffusion sans changement de fréquence (Raie Rayleigh):
l ' u n e décalée vers le rouge (vO-va) appelée raie Stokes, et l'autre décalée vers le violet (vO+va) appelée raie anti-Stokes.
L'intensité relative des deux raies Stokes et anti-Stokes correspondent au mode de vibration. A température ambiante, on observe >es raies Stokes. La position des raies Raman est caracté- ristique d'une vibration et, par conséquent, le spectre Raman est caractéristique d'une molécule.
L'appareil utilisé pour cette étude est une microsonde à effet Raman (JOBIN-YVON type Mole) qui se compose d ' u n microscope adapté à un double monochromateur muni des syternes de détection monocanal et multicanal.
lumière dHTuiée fiiieeau hier
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objectif de microscope ktalillon
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Figure 5 - SPECTRES RAMAN
(a) de Ia plaque DYNATECH GREINER (b) de la plaque DYNATECH M129B
Afin de compléter les résultats obtenus en infra-rouge, nous avons repris les mêmes échantillons, à savoir : la DYNATECH GREINER M129A et la plaque DYNATECH M129B. Comme pour 1'infra-rouge, nous n'avons pas pu déceler des différences notables entre les deux échantillons, les spectres obtenus étant tous les deux similaires (figure 5, a et b).
4) MICROSCOPIE ELECTRONIQUE A BALAYAGE
La microscopie électronique à balayage permet de caracté- riser l'état de surface d ' u n solide.
En microscopie électronique, on peut directement utiliser les électrons réfléchis pour former l'image. On peut également travailler avec les électrons secondaires qui sont éjectés de l'é- chantillon par le faisceau incident et récupérés par un scintilla- teur qui les transforme en photons eux-mêmes repris par un photo- multiplicateur. La limite de résolution est de Tordre de 40 nm. On
*utilise un faisceau de particules électroniques accélérées par une tension très élevée de Tordre de 25 K volts. Ce faisceau incident focalisé balaye le champ d'observation.
L'échantillon observé est un fond de cupule de plaque de microtitration ^ue Ton prépare de la façon suivante :
- fixation sur Tune des faces du fond d'un support conducteur en aluminium,
- dépôt par pulvérisation cathodique, sur l'autre face du fond, d'une fine couche conductrice d'or qui permet le transfert des électrons au support conducteur.
L'observation des échantillons a été réalisée avec un STEREOSCAN 600 de la Société Cambridge Instrument. Les supports étudiés sur une profondeur de 4 à 10 um ne présentent pas de diffé- rences spécifiques entre eux et ont tous un aspect lisse. La micro- géométrie des plaques ne semble donc pas révéler d'aspects particu- liers de surface.
- 23 -
Les techniques spectroscopiques ne nous ont pas permis de trouver de différences de structure entre les plaques. En effet, toutes, à l'exception de la plaque FALCON, sont en polystyrène. De plus, l'hypothèse d'un traitement de surface doit, elle aussi, être rejetée, puisque la microscopie électronique à balayage n'a pas décelé de variations d'état de surface.
Comme les plaques de microtitration les plus performantes ont été stérilisées sous rayonnement ionisant (25 kGy), nous avons donc examiné l'influence des irradiations sur ces plaques.
III - .INFUjEKE £ES MYONNEf€MTS_GA^_I£M^ANTS_S]IR_LK_PLAQUK_DE MKROTITRATI]MJ)ANS 1'Fl1I5A1!0!! 2U_T§.SI
ELISA
A) RAPPEL DE L'ACTION DES RAYONNEMENTS IONISANTS SUR LES POLY- MERES : APPLICATION AU POLYSTYRENE
Les effets des rayonnements sur les polymères ont été mis en évidence par CHARLESBY (1960) et CKAPIRO (1962). Par la suite, de nombreux chercheurs tels que SWALLOW (1960), DOLE (1973) et WILSON (1974) ont poursuivi des recherches dans le domaine de la chimie sous rayonnements des polymères.
1) ACTIOfl DU RAIOMEMENT SUR LA MATIERE
On groupe sous le nom de rayonnements ionisants, des rayonnements de nature physique ayant pour effet de créer des ions dans le milieu qu'ils traversent. On distingue essentiellement : - les rayonnements électromagnétiques de très courte longueur d'on-
de : rayons X durs, rayons du Cobalt 60, du césium 137, etc.., - les particules chargées : électrons.
est dissipée (en réagissant avec les électrons et les noyaux du milieu traversé) va dépendre essentiellement de la nature du rayon- nement utilisé, c'est-à-dire en grande partie de l'énergie des photons ou des particules constituant ces rayonnements.
Dans le cas qui nous intéresse (onde électromagnétique), on peut distinguer trois phénomènes principaux, à savoir :
- l'effet photoélectrique : absorption du photon dans le cortège électronique d'un atome et émission d'un électron éjecté ; il est prépondérant lors d'irradiations de milieux à numéro atomique élevé par des photons de faible énergie ( < 0,5 MeV),
- l'effet Compton : la diffusion Compton provient des collisions élastiques entre le photon incident et les électrons du milieu traversé. Il intervient lors de l'irradiation de milieux à numéro atomique faible avec des photons d'énergie moyenne,
- la formation de paires, qui n'a lieu que pour les énergies supé- rieures à 1,02 MeV et revient à la production d'un électron et d'une position par action d'un photon. Cet effet est prépondérant avec des énergies de photons de 10 MeV.
L'effet prédominant au cours de l'irradiation des plaques de polystyrène et de protéines est l'effet Compton. Ces interac- tions ont pour effet d'ioniser et exciter les molécules organiques.
L'ionisation est provoquée par la perte d'un électron lors de la collision entre une molécule et une particule de haute énergie.
RX+ + e- (1)
molécule cation électron
le signe -Assert à distinguer le changement qui suit l'irradia- tion. Pour obtenir la réaction (1), il faut environ 12 à 15 eV.
- 25 _
Dans le cas de l'excitation, un électron reçoit l'énergie par^collission et passe à une orbite supérieure.
RX J^~ RX* (2)
Molécule excitée
Les électrons de haute énergie produits par ionisation entrent en collision avec d'autres molécules jusqu'à ce que leur énergie soit consommée. L'électron thermique sera ensuite absorbé par un ion, suivant la réaction :
RX+ + e- — RX* (3)
électron molécule thermique excitée
L'énergie communiquée à la molécule RX est égale à l'é- nergie nécessaire à son ionisation. La molécule excitée RX* produi- te, soit dans la réaction ( 3 ) , soit directement dans la réaction (2), est portée à un état énergétique suffisant pour que s'ensuive la rupture d'une ou plusieurs liaisons homopolaires au sein de la molécule entraînant la formation de radicaux libres selon la réac- tion.
RX* — R- + X' radicaux libres
Ces radicaux libres sont très actifs et peuvent réagir entre eux ou avec les molécules environnantes, en provoquant des modifications chimiques irréversibles.
2) ACTION DES RAYONNEMENTS SUR LES POLYMERES
La plupart des processus chimiques observés dans les polymères irradiés sont en relation étroite avec des réactions se produisant lors de l'irradiation de substances à faible poids molé- culaire. Cependant, du fait de leurs masses moléculaires élevées,
les polymères présentent des changements considérables de leur propriété pour seulement un nombre restreint de modifications structurales.
a) Changements chimiques
Les principaux phénomènes observés lors de l'irradiation des polymères sont :
. la reticulation et la dégradation, . le dégagement gazeux,
. la modification du taux d1 insaturation.
- La reticulation et la dégradation
Ce sont les deux effets les plus remarquables de l'irra- diation des polymères linéaires.
. La reticulation est la formation de nouvelles liaisons transver- sales entre les molécules du polymère. Elle se traduit par une augmentation d-j poids moléculaire moyen avec la dose d'irradia- tion.
. La dégradation est au contraire le processus au cours duquel le polymère irradié subit de façon aléatoire des scissions dans sa chaîne principale, ce qui entraîne une décroissance continuelle de son poids moléculaire moyen avec la dose d'irradiation.
Ces deux phénomènes peuvent se produire simultanément dans le même polymère. Cependant, pour certains (groupe I : les caoutchoucs, le polyethylene, le polystyrène, les polyamides), la reticulation est prépondérante, alors que pour d'autres (groupe II:
la cellulose, le téflon), la dégradation l'emporte.
- 27 -
Plusieurs théories ont été élaborées pour tenter d'expli- quer cette différence de comportement des polymères sous irradia- tion. Dans le cas des polymères vinyliques seulement, on admet la règle empirique suivante :
"Si la structure d'un polymère vinylique est telle que chaque atome de carbone de la chaîne principale porte au moins un atome d'hydrogène, le polymère réticule, alors que si un atome de carbone têtrasubstitué est présent dans l'unité monomère, le polymère se dégrade".
- Dégagement gazeux
Les gaz de radiolyse peuvent fournir des indications sur les changements chimiques produits sous irradiation puisque ces gaz sont le résultat de fragments de faible poids moléculaire extraits de la molécule du polymère. La radiolyse des polymères provoque surtout un dégagement d'hydrogène.
- Changement du taux d'tnsaturation
Dans les polymères contenant beaucoup d1insaturation (copolymère de butadiene, par exemple), on observe une forte dé- croissance du nombre de doubles liaisons. Le phénomène inverse, mais moins important, se produit dans les polymères saturés.
b) Changement des prorrm-etes physiques
L'influence des rayons -y sur les propriétés mécaniques des polymères diffère selon que ces derniers appartiennent au grou- pe des radïodëgradables ou des radioréticulables.
Dans le premier cas, on observe une dégradation constante des propriétés mécaniques. Dans le second cas, certains changements sont bénéfiques (croissance du module d'YOUNG, de la charge maxi- mum, décroissance du fluage). Mais à un très haut degré de reticu- lation, la plupart des polymères deviennent durs et cassants.
La conductivité électrique de nombreux polymères croit notablement pendant l'irradiation. Après irradiation, cette conduc- tivité décroît exponent!ellement jusqu'à sa valeur initiale sur une période de plusieurs jours et même de plusieurs mois. Pour des doses d'irradiation élevées, un changement permanent de la conduc- tivité peut même se produire.
Une modification de la coloration peut aussi apparaître après radiolyse de certains polymères.
a) Effet des rayonnements gamma ionisants sur* '. e polystyrène
Le polystyrène est l ' u n des polymères les plus stables sous l'effet des rayonnements gamma ionisants. Sa structure molécu- laire est la suivante
F 1CH2 - C H _ CH2
I ^ v N y . ! „
- n
Le polystyrène^-eomporte de nombreux noyaux benzéniques, ce qui le protège de nombreux processus radiochimiques. En effet, des études radiochimiques ont montré que le nombre total de trans- formations chimiques produites est très petit comparé au nombre d'ionisations (rapport 1/50), ce qui signifie qu'une grande partie de l'énergie absorbée par le système a été dissipée sans produire d'effets chimiques. Il a été démontré que cette protection provient de la résonance de l'anneau benzénique (le benzène étant un hybride de deux structures de KUKULE). De plus, la présence d ' u n noyau benzénique dans la molécule ne protège pas seulement la molécule, mais peut aussi agir efficacement sur les molécules voisines.
- ?9 -
Sous irradiation et sous vide, son poids moléculaire augmente. Dans le cas d'une irradiation dans l ' a i r , il donne des hydropéroxydes.
|CH2 - CH - CH2
i
H+
C H2- C - CH2
i
B - MATERIEL ET METHODE
O2 p - OH
C H2- C - CH2
1) SOURCE UTILISEE (figure S)
. Source GAMMACELL : 60Co . Période : 5,26 ans
. EY : 1,25 MeV environ . Activité : 20.000 Ci
. Débit de dose au temps t = O : 11,4 kGy/h . Volume d'irradiation : 0 : 150 mm
H : 200 mm
2) TRAITEMENT PgS PLAQUES DE MICROTITEATION
Rappelons que dans cette étude, nous nous sommes limités à travailler avec la plaque DYNATECH GREINER qui présente les avan- tages suivants :
. utilisation courante au laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire de TlNRA,
. prix d'achat avantageux,
. représentative de l'ensemble des plaques de micro- titration de part sa structure en polystyrène, . pas de traitement aux rayonnements gamma.
- 30 -
Chaque plaque étudiée est coupée en deux ou plusieurs parties afin d'avoir sur une râie plaque une partie non traitée servant de référence et une ou plusieurs parties irradiées.
Le débit de dose est fixé à 11,4 kGy/h. La température en cours d'irradiation atteint 5O0C au bout d'une demi-heure et reste pratiquement constante ensuite.
Les conditions d'irradiation, dose et atmosphère, sont deux paramètres que Ton fait varier dans les expériences.
C - ACTION DES RAYONNEMENTS IONISANTS GAMMA SUR LA SENSIBILITE DU TEST ELISA DANS LA DETECTION DE SPIROPLASMA CITRI R8A2
1) DEFINITION DU FACTEUR k
Pour cette étude, nous définissons le coefficient k comme étant le rapport obtenu, pour une concentration donnée d'antigène, de la densité optique à 405 nm pour la plaque irradiée sur la den- sité optique à la même longueur d'onde pour la plaque non irra- diée.
k (x) - nm
1 ' ~ DO 405 nn UJ plaque non irradiée (x) = concentration d'antigène.
Ce coefficient k permet d'évaluer l'amélioration apportée au test par l'irradiation des plaques étudiées.
Légende : 0 0,5 y g R 8 A 2 / m l
• A 0,05 jtg R 8 A 2 / m l
* 0,025 jig R 8 A 2 / m l
Figure 7: Influence de la dose d'irradiation sur la
valeur du facteur K .
- 31 -
2 ) INFLUENCE DE LA DOSE D '!ERADIATION SUR LA VALEUR DU FACTEUR k
La figure 7 rend compte de la variation du facteur k:
obtenueen fonction de la dose d'irradiation apportée aux plaques de microtitration et de la concentration d'antigène. Nous avons fait varier la dose de 1 à 50 kGy et les expériences ont ëïê réalisées pour chacune des concentrations suivantes d'antigène . 0,5 - 0,05 - 0,025 ug R8A2/ml PBS.
Nous constatons que les trois courbes obtenues pour cha- cune des concentrations d'antigène étudiées présentent une allure
identique : obtention d'un plateau à partir de 6-10 kGy.
Ce palier représente le coefficient maximum susceptible d'être obtenu pour une concentration donnée d'antigène. D'autre part, il est à noter des différentes entre les coefficients k des trois courbes. En effet, la courbe obtenue pour une concentration de 0,5 ug R8A2/ml PBS TWEEN présente un coefficient k maximum de Tordre de 1,5 à 1,6, celle obtenue pour la concentration de 0,05 ug R8A2/ml PBS TWEEN donne un coefficient k de valeur 2,5, enfin pour 0,025 ug R8A2/ml PBS TWEEN la valeur de k atteint 2,7.
Ces résultats nous ont amenés à étudier l ' i n f l u e n c e de la concentration d'antigène sur la valeur du coefficient k.
3) INFLUENCE DE LA CONCENTRATION D'ANTIGENE SUR LA VALEUR DU COEFFICIENT k
On remarque, tableau Va, que pour les concentrations 5 et 0,5 ug R8A2 par ml de PBS TWEEN, le calcul du k est impossible puisque les densités optiques, obtenues sur les parties irradiées des plaques sont supérieures à 2.
DE SPIROPLASMA CITBI R8A2 PURIFIE
(Ag) ug/ml
5 0,5 0,25 0,125 0,061 0,03
DO PLAQUE NON IRRADIEE
1,81 1,38 0,99 0,52 0,35 0,18
DO PLAQUE IRRADIEE
> 2
> 2 1,64 1,17 0,77 0,47
DO PLAQUE IRRADIEE K —
DO PLAQUE NON IRRADIEE --
1,64 2,22 2,21 2,55
B - COMPARAISON DES OBSERVATIONS A L'OEIL NU
(Ag) Lig/ml
5 0,5 0,25 0,125 0,061 0,03 0,015 0,007
DO PLAQUE NON IRRADIEE
1,81 1,38 0,99 0,52 0,35 0,18
<0,1
<0,1
DO PLAQUE IRRADIEE
> 2
> 2 1,54 1,17 0,77 0,47 0,21 0,12
OBSERVATION A L1OEIL MU
+ + + + + + -
OBSERVATION A L1OEIL NU APRES
IRRADIATION
+ + +
•f + + + +
- 32 -
De la même manière, au dessous de 0,03 Mg d'antigène par ml de tampon, le calcul du k devient également irréalisable, la densité optique de la partie non irradiée de la plaque étant infé- rieure à 0,1.
Cependant, pour des concentrations comprises entre 0,25 et 0,03 ug R8A2 par ml de tampon, le coefficient k prend des va- leurs comprises respectivement entre 1,6 et 2,5 : plus la concen- tration diminue, plus le facteur k augmente.
4) SEUIL DE SENSIBILITE
En irradiant, avant son utilisation pour le test immuno- enzymatique, la plaque de microtitration, on abaisse la limite de détection de l'antigène tant par la mesure de la densité optique que par l'observation de la plaque à l'oeil nu. En effet, on cons- tate, tableau Vb, que les concentrations suivantes d'antigène, c'est-à-dire 0,015 et 0,007 ug/ml, sont détectées sur la partie de la plaque qui a été irradiée alors qu'elles ne le sont pas sur la partie de la plaque non irradiée.
5) CONCLUSION
Dans un premier temps, nous avons constaté qu'au-delà d'une dose de 6 kGy, l'amélioration apportée au test immunoenzyma- tique par l'effet des rayonnements gamma sur les plaques de micro- titration GREINER, était toujours sensiblement la même, quelle que soit la dose étudiée.
Le deuxième point important à souligner est l'améliora- tion plus importante de la sensibilité au test pour des concentra- tions très faibles d'antigène. Une seule explication semble cohé- rente pour ce dernier phénomène : lorsque la concentration d'anti- gène étudiée est élevée, la probabilité de rencontre antigène -
