Thesis
Reference
Etude de l'assemblage et du bourgeonnement du virus de Sendai
STRICKER, Reto
Abstract
Les paramyxovirus sont des virus à enveloppe lipidique dont l'ARN génomique, simple brin de polarité négative, est de type non segmenté. Le virus de Sendai est un paramyxovirus. Les travaux de cette thèse ont permis d'établir que le bourgeonnement viral ne nécessite pas toutes les fonctions virales. Ainsi, la glycoprotéine HN, qui est responsable de l'attachement du virus sur la cellule cible n'est pas indispensable. Ces travaux ont également permis de suggérer que contrairement à un modèle précédemment établi, l'assemblage du virus de Sendai n'a pas lieu à la membrane plasmique mais sur les membranes intérieures de la cellule infectée. La troisième partie du travail montre que le virus de Sendai défectif DIH4 bourgeonne sans l'aide du virus standard et certains résultats, à confirmer, suggèrent que ce bourgeonnement a lieu en l'absence de la protéine de matrix M.
STRICKER, Reto. Etude de l'assemblage et du bourgeonnement du virus de Sendai . Thèse de doctorat : Univ. Genève, 1993, no. Sc. 2640
DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:104842
Available at:
http://archive-ouverte.unige.ch/unige:104842
UNIVERSITE DE GENEVE Département de Biochimie
Département de Génétique et Microbiologie
FACULTE DES SCIENCES Professeur J. Gruenberg
FACULTE DE MEDECINE
Dr Privat Docent L. Roux Professeur D. Kolakofsky
ETUDE DE L'ASSEMBLAGE ET DU BOURGEONNEMENT
DU VIRUS DE SENDAI
THESE
présentée à la Faculté des Sciences de I'Université de Genève pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention biochimique
par
Reto STRICKER de Herisau (Appenzell R)
Thèse No 2640
Genève
La Faculté des Sciences, sur le préavis de Messieurs D. KOLAKOFSKY, professeur ordinaire et L. ROUX, docteur (Faculté de Médecine -
Départementde génétique et microbiologie) codirecreurs de thèse, J. GRUENBERG,
professeur ordinaire et répondant devant la Faculté des Sciences
(Département de biochimie) et Madame A. FLAMAND, professeur (CNRS X.aboratoire de Génétique des Virus, Gif-sur-Yvette), autorise I'impression
dela présente thèse, sans exprimer d'opinion sur les propositions qui y
sonténoncées.
Genève,
le 30
novembre 1993Le Doyen, Pierre
MOESCHLERThèse 2640
A Elle....
REMERCIEMENTS
J'aimerais
tout
d'abordremercier les
ProfesseursAnne Flamand, du
laboratoire de Génétique des virus àGif-sur-Yvette
(Paris), et Jean Gruenberg, en tant que répondant dela
Faculté des Sciences,d'avoir bien voulu
accepter d'être rnembres dujury
pour cette thèse. J'aimerais également remercier le ProfesseurKolakofsky
qui, en plus de saparticipation
aujury,
a sutout
aulong
de ces années mener ce groupe deVirologie
dudépartement de Microbiologie (notamment lors de nos réunions familiales
hebdomadaires) avec intelligence et humour" En plus de ses connaissances sans limites, Dan a toujours apporté ce regard très
critique
à nos travauxqui fait
que finalement la Science Fondamentale dans toute sa rigueur, est, malgré les pressions commerciales et les ambitions, encore possible.J'aimerais
faire
des remerciementsparticuliers
à mondirecteur
de thèse,le
Docteur Laurent Roux.Lantrent, sache que
je
souhaiteà
tous les doctorants de connaître les années quej'ai
passées
ici.
Scientffiquement, ta disponibilité, ta rigueur, tes idées de génieontfait
que,ce qui aurait pu être un naufrage total, se retrouve finalement sous
laforme
d'une petite brique qui n'a aucune honte ou complexeafiguré
parmi tant d'autres dans le grand murde la
Science"Mais
ce n'estpas tout" Ta
Connaissancede la vie en général,
ton Humanisme, mais également ton Pragmatisme,ontfait
que ces années passées dans tonInboratoire
n'ont pas été seulement enrichissantes du point de vue Scientffique, mais en ontfait
une véritable école de Ia Vie. Aujourd'hui,je
me sens adulte....Merci
à Philippe Calain pour son sens de I'honneur et son amitié dontje
me sens bienindigne. Philippe
a essayé d'enseignerla
langueet la philosophie
japonaise duranttoutes ces
annéesau mauvais, misérable élève
queje suis....Peine perdue!
Son incommensurable bonté faitqu'il
me parle encore aujourd'hui.A
part ça, sa compétence a toujours permis à nos dégust ...discussions scientifiques d'être enrichissantes.Remerciements également à tous les
fous du
département:Dominique G.,
Jean-Ba, Jean-Phi, Joe,Max,
Paolo, Ronald,Thierry pour
les plus proches(aucun
noms de femmesici
pour des raisons de sécurité, maisje
pense à elles également...).J'aimerais terminer par les
rernerciementsles plus importants. Ce sont ceux
que j'adresse à Geneviève Mottet,Fée, Perle, Soleil du labo sont des
qualificatifs
bien ternespour
Iadéfinir.... Pour la
premièrefois
dans ces remerciements,je
suisà court
de mots,et
tous ceuxqui
me viennent se révèIent bien indignespour qualifier
cette sublime personne...Geneviève.Nos routes
parallèles
pendant ces années ontfaît
de nos relations professionnelles quelque chose qai est peut-être Ie sentiment le plus précieux qui soit,l'Amitié.
Gene, tu as enmoi
unAmi qui
te sera éternellementfidèIe
etsur
lequel tupourcas toujours
compter!Ni
Ia distance etni
Ie temps ne pourrafaire faillir
ce qui melie
à toi.Merci
d'exister....
Reto
TABLE DES MATIERES
I INTRODUCTION Le virion
Les protéines de la membrane virale
La protéine HN
La protéine F
La protéine M La protéine NP
La protéine L La protéine
PLes protéines non-structurelles chez le virus de Sendai
Le génome viral
Virus de Sendai défectif interférent Cycle viral
Réplication virale
Assemblage et bourgeonnement viral
il ARTICLES:
La glycoprotéine majeure n'est pas
nécessaireà un bourgeonnement efficace du virus de
Sendai6 7 9 9
13
t6 t9
20 20
22 24 25 28 28 30
33
45
La protéine de matrix du virus de Sendai
sembleêtre recrutée dans le cytoplasme par la nucléocapside
virale lui permettant ainsi de jouer son rôle
dansI'assemblage et le bourgeonnement de la particule virale
III RECHERCHE D'UN SYSTEME D'ETUDE EFFICACE DU BOURGEONNEMENT DU VIRUS DE SENDAI
Etude du bourgeonnement de particules virales défectives dont les protéines ne sont pas fournies
par un virus non défectif (Mottet et al., 1990), mais issus de gènes transfectables exprimés transitoirement
Construction d'un vecteur viral
IV CONCLUSION
V REFERENCES VI ANNEXE
{ê****{ê****{€**
72
72
10L
106
113
137
I INTRODUCTION
PARAI\{N(OVIRIDAE
PARAMYXOVIRUS MORBILIVIRUS PNEUMOVIRUS
-Virus
de Sendai-Virus
parainfluenzahumain ( 1à4)
-Virus
de Newcastle-Virus
simien 5-Virus
des oreillons-Virus
dela rougeole
-Virus respiratoire syncytial -Virus de la maladie de Cané-Virus
de la peste des petits ruminants-Virus
de la peste bovinePARAMYXOVIRUS
Les paramyxovirus sont des
virus
àRNA
simplebrin
de polarité négative possédant une enveloppe lipidique. On divise les paramyxoviridae en 3 genres. [æ virus de Sendai dontil
est questionici,
appartient au premier groupe dit virus de type paramyxovirus.Il
est homologue à plus de 70Vo avec le virus humain
parainfluenza3.Le
virus de Sendai seraitun virus
de typemurin bien
qu'onI'ait
trouvé chez des enfants présentant destroubles
respiratoires graves.La première isolation eut lieu
au Japon.(Kuroya
et aI.,1953).LE VIRION
La taille des particules virales, pouvant contenir plusieurs capsides virales, varie de 100 à 500 nm. La nucléocapside est une structure souple en hélice (tournant à gauche), elle a deux
fonctions principales:
1) protégerle RNA
dela
dégradation (notamment des RNAses);2)
elle est lelieu
de synthèse duRNA viral.
La nucléocapside est composée detrois
protéines (en plus duRNA):
la protéineNP qui
constituele
corps protéique principal puisque on la retouve tout le long duRNA.
Dans le virus de Sendai, on penseque la protéine NP couvre exactement six
bases(le virus de Sendai est long
d'exactement 15384 nucléotides, la nucléocapside est donc constituée de 2564 protéinesNP
(Calain etRoux,
1993). On trouve également les protéines P(environ 300/RNA viral)
et la protéineL (40/RNA viral),
ces dernières constituant la polymérase qui sert àla transcription primaire (Hamaguchi et al., 1983; Goto et al., 1989).
Les nucléocapsidesont un coefficient
de sédimentationde
1000à
1100 S(Chopin
andCompans,l975).Le virus
est composé detrois
autres protéines principales dont deux glycoprotéines,HN
etF
insérées dans I'enveloppelipidique d'origine cellulaire. La
sixième protéine estla
protéine dite de"matrix" M qui
semblejouer
unrôle
dans le bourgeonnementdu virus et
queI'on trouve
associée aux membranescellulaire
ou virale. Levirion
est enveloppé lors de son bourgeonnement par la membranelipidique
de la cellule.FIGURE
1:LE VIRION
fr,o,u,n",
HN
T
ç
Protéines F
@Protéines
NP@
ProtéineM Protéinel I
ProtéinePTABLEAU
DES PROTEINESVIRALES (SENDAI)
Protéines
nombre acidesaminés PM(kD) PM(gel)*
L 2268 252
200P s68 61
7sHN 576 63,3
63F s65 6t
59NP 524 57
60M 349 38,5
34LES PROTEINES DE LA MEMBRANE VIRALE Les slycoprotéines
Deux types de structures sont observées à
la
surface duvirion
des paramyxovirus:la
première est composée de la protéine
HN
(pour hémagglutination et neuraminidase)qui
sert à I'attachement duvirus
surla cellule
(Scheidet
aL,l972), etla
deuxième dela
protéineF
(pour protéine de fusion),qui
est responsable dela
pénétration duvirus
àI'intérieur
de la cellule par fusion de la membranevirale
avec celle dela cellule cible
(Scheid etChopin,
1974,1977). Cette protéine est également responsable dela fusion entre les cellules
infectéeset
lescellules
adjacentes infectéesou non
menantà la
formation de syncitia.LA PROTEINE HN
Si la protéine d'attachement s'appelle
HN
chez les paramyxovirus, elle prend le nom deH pour les morbilivirus et G chez les pneumovirus. Seule la protéine HN
des paramxxovirus sera exposéeici.
Toutes les protéines
HN
sont des glycoprotéines de typeII,
c'est àdire
qu'elles sontancrées par leur côté amino-terminal (Schuy et al", 1984). Cette partie
intracytoplasmique ou"intravirion"
est suivie d'une série d'acides aminés hydrophobes (ou ancre) qui traversent la membrane (celle du virus ou celle de la cellule hôte), servant aussi de séquence signal. Puis on trouve enfin Ia partie exposée à I'extérieur (du virus ou de la cellule) qui est glycosylée(voir
figure 2).La séquence de HN est relativement conservée entre les virus de Sendai
etParainfluenzaIlI
(627o) ainsi qu'entre SV5 et le virus des oreillons (627o). De manière générale, I57o dela
séquence est conseruée chez tous lesHN, particulièrement
10glycines, 8 cystéines et 4 prolines très déterminantes pour la structure et
le fonctionnement de la molécule.On peut noter
qu'il
n'y a pas d'homologie particulière entre les séquences hydrophobes (traversant la membrane) des différents HN des Paramyxovirus"Les régions responsables de I'hémagglutination et de
I'activité
de neuraminidasen'ont
pas encore été exactement localisées, maisil y
a de fortes évidences montrant que ces activités sont situées sur deslieux
différents (Smith etHightower,
1980, 1982; Ray et Compans, 1986; Portner etal.,
1987b). Par homologie de séquences etprédiction
des structures,Blumberg et al.
(1986) prédisent queI'activité
de neuraminidase se situe entre la position en acides aminés 163 et 382. Jorgensen et al. (1937) sont plus précis,la situant
entre254 et
260. Grâce àun virus de
Sendai thermosensibledéfectif
à températurenon
permissivepour
I'hémaglutination,et
des anticorps monoclonaux inhibant cette activité, Thompson et Portner (1987) ont situé le site responsable proche, du côté carboxy-terminal, de la région de contrôle de I'activité neuraminindase.On soupçonne HN d'avoir un rôle également dans la fusion. Des traitement
biochimiques et immunologiques variés sur la protéineHN
ont provoqués la perte deI'activité
d'hémolyse sans affecterI'activité
d'hémagglutination(Miura et al., 1982;
Health et
a1.,1983; Portner,1984; Gutmanet Loyter, l9B4; portner et al., r9g7b;
Moscona
et al., l99l). En utilisant
des anticorps monoclonaux inhibantI'activité
de fusion, Thompsonet
Portner (1937)ont
sélectionnéun virus
de Sendaimutant qui
échappait àI'inhibition.
Or, ce virus avait un mutation sur la protéineHN
(substitutiondu résidu 420) sur un site qui différait des lieux
responsablesdes activités
d'hémaglutination et de neuraminidase.Morphologiquement, aucune structure tri-dimentionnelle n'a pu être déterminée
pour
HN (par exemple par cristallographie aux rayons X). Par
analyse des propriétés biologiques et structurelles d'une forme deHN
généré,e au travers de digestions par des protéases (exemple: trypsine),HN
a été décrite comme une protéine comportant une partielinéaire
(sensible àla
trypsine) et une tête résistanteoù
se concentre les deux activitées importantes (hémagglutination et neuraminidase (Thompson et al., 1988)).Synthèse et transport à la surface
Les 91 premiers acides aminés de
HN
deNDV
sont suffisants pour ancrer et insérer la protéine correctement dans la membrane microsomale,in vitro
(système "sans cellule"(Wilson et al.,
1988).HN
de Sendaiarrive
àla
surface avecun Ttlz
de40
minutes(Blumberg
etal.,
1985b;Bowen
etLyles,
L982).HN
deNDV
arrive avec unTttz
de 78 minutes. Ce transport relativement lent pour une glycoprotéine virale est peut être dû à I'orientation typeII
deHN
ou reflète letait
que I'infectioninduit
une augmentation de la production de protéines de stress (Peluso etal.,
1978;Collins
etHightoweg
1982), notamment la protéineBip qui
est impliquée dans le processing des protéines du RER(Munro
et Pelham, 1986; Hendershot etal.,
1988; Getting etal",
1986).Bip
a été vue en associationtransitoire
avecHN du virus
de Sendai et HN1du virus SV5
(Roux, 1990;Ng et al,
1989)et la cinétique
de dissociationdu complexe
correspond àla
vitesse de maturation de la protéine.
CYTOPLASME
mRNA +
I
NH.
3
5'
mRNA
3
LUMEN RE
figure 2: synthèse des protéines de type II
Séquence ancre qui sert également de
signal
coo
)
I j
Glycosylations
Les protéines
HN
ne contiennent que des N-glycosylations (Nakamuraet al.,
1982;Stallcup et Fields,
1981;Morisson et al.,
1981).on ignore si tous les sites
de glycosylations sont toujours utilisés. Par exemple, chez SV5, trois sites sursix le
sonteffectivement
(Prehmet al.,
1979).L'addition
de polysaccharidesdoit aider à la formation
de la bonne conforrnation et à la stabilité de la protéine(Vidal
etal.,
1989).Les protéines non glycosylées ne sont pas vues à la surface des cellules infectées par le virus de Sendai (bien que celles-ci passent normalement du RER au
Golgi)
(Nakamura etal.,
1982).Oligomérisation et formation des ponts disulfures
On observe
la
formation d'oligomères tétramériques àla
surface dela cellule, fait
dedeux dimères
(composésde deux
protéinesHN
reliéespar
desponts disulfures),
associés par des interactions non covalentes. La forme non oligomérique est également observée à la surface de la cellule(Markwell
etFox,
1980; Smith etHightower,
1981;Yamada et al., 1988; Morrison et al., 1990).
Acylation par des acides gras
Cette modification n'a été jusqu'ici observée que pour le virus SV5
(Veit et
a1.,1979).LA PROTEINE
F:,F
est synthétysée sousla forme
d'un précurseurinactif
Foqui
est ensuite coupé par digestionprotéolytique
en deux sous-unités (Fr +Fz) reliées par des ponts disulfures (Homma etOhuchi,
1973: Scheid etChoppin,
L973,1974,I977;Hardwick
et Bussel,1978; Kohama et
al.,
1981; Hsu etal.,
1983).F est une protéine de type
I
(Wickner et Lodish,1985)(voir
figure 3). Elle possède une série d'acides aminés hydrophiles (côtéC{erminal)
se situant à I'intérieur duvirion
oudans le cytopolasme de la cellule hôte, suivie d'une vingtaine d'acides
aminéshydrophobes ou ancre qui traverse la membrane, et d'une partie "extérieure"
relativement hydrophyle.
La séquence de F est très conservée chez les paramyxoviridae.
Environ
IÙVo des acides aminés sont identiques dans toutes les protéines F, principalement dans la région dela
protéolyse de Foet
dansle
côté aminoterminal
de Froù
se trouvela
séquence très hydrophobe (dite peptide de fusion) qui entre en contact avec la membranelipidique
dela cellule cible (Norick et Hoekstra, 1988). On retouve
également des cystéines conservées(au nombre de
sept)qui
se concentrent dans unerégion de 65
acides aminés,portion de la
protéineimportante pour
sa structureet
son fonctionnement (Blumberg etal.,
1985; Portner etal.,
1987a1Togada etal.,
1988; Neyt etal.,
1989;K.
Coelinkingh,
1991)Site de cleavage
La région du cleavage de F" contient une série d'acides aminés basiques (arginine) dont
le nombre varie selon les virus: de un chez le virus de
Sendaià six chez
RSV.Apparemment, I'efficacité du "cleavage" de
F"
dépend du nombre de ces acides aminés basiques.On
observe également unerelation
directe entrela virulence
de certaine souche deNDV
etla
quantité d'acides aminés basiques de cette région(qui
varie de deux à quatre chez cevirus)
(Nagai etal.,
1976; Nagai etKlenk,
1977;Toyoda et al.,1987; Glikman et
al.,
1988).Cinétique et transnort
Glycoprotéine
detype I, F
possède une séquencesignal qui
est coupéelors
dela
synthèse de la protéine dansle
RER. La protéine est ensuite rapidement amenée à la surface avecun Trtz de 8-10
minutes (beaucoupplus court que HN
chez Sendai)(Blumberg et al.,
1985b),alors
queF
deNDV aurait la
mêmecinétique
queHN
(Morisson et al., 1988). Aucune explication n'a été avancée pour nous éclairer sur ces différences de cinétique.CYTOPLASME
1-
3
s
mRNA Séquence Signal coupée
Récepteur
NH+ J
LUMEN RE
figure 3: synthèse des glycoprotéines de type I
5
Séquence ancre
coo
NH
3
+
J
+ + 3
Glycosylations
Si des N-glycosylations ont été démontrées (Morisson et Simpson,1980; Nakamura et a1.,1982;'
Herrler et Compans, 1982; Lambert,
1988),il n'y pas d'évidence
d'O- glycosylation. Le rôle des chaînes latérales de polysaccharides dans le fonctionnement,le repliement et
transportde F
n'est pasbien compris. Il
sembleque les
sites de glycosylations ne soient pas tous utilisés.Formation des ponts disulfures
La
conservation des positions des cystéines nousindique
quecelles-ci doivent
être importantes pour le fonctionnement de F"Il
ne faut pas oublier que la forme mature de F, à savoir les sous unités Fr et Fz, sont reliées par des ponts disulfures"Mc
Ginness et al., (1985,1987) a pu montrer chezNDV
queF
subit un changement conformationnel drastique immédiatement après sa synthèse (sortie du RER). Les pont disulfures sontnotablement
réarrangés(Morrison et al., 1987) et ceci de manière tout à fait
indépendante de la digestion de Foen forme active Fr + Fz(Morisson et
al.,
1985).Acylation par des acides gras
Seule F du virus de
NDV
semble acylée (Chatis et Morrison,1982).Formation d'oligomères:
Sechoy et al. (1987) suggèrent que F de Sendai est sous forme tétramérique constituée de deux dimères.On peut noter que la séquence de F contient un
motif
de type "leucine zipper" qui serait responsable de cette dimérisation (Buckland etWild,
1989).LA PROTEINE M
M
est la troisième protéine membranaire du virus, mais contrairement à F et àHN
elle n'est pas transmembranaire, ni glycosylée. Lorsque le virus de Sendai est traité avec du détergent dans des conditions de bas sel,il
perd son enveloppelipidique
ansi que ses glycoprotéines, mais gardela
structure compacte de la particule (la nucléocapside est alors très repliée sur elle-même).L'addition
de sel provoque la perte de la protéineM
accompagnée
du dépliement de la nucléocapside (Shimizu et Ishida,1975). M
semblerait
donc occuper
uneposition intermédiaire entre la
nucléocapsideet
les glycoprotéines virales.A
un défaut dans la stabilité ou dans la synthèse de la protéineM
correspond toujours une chute importante de production de particules virales
(Yioshida
etal.,
1979: Machamer etal.,
1981; Roux etal., I98l;Tuffereau
etRoux,
1988).M
est basique, hydrophobe et est relativement conservée parmi les paramyxovirus
(Bellini et al , 1986; Galinski et al., 1987; spriggs et al., 1987;). Elle s'associe
très rapidemment aux membranes des cellules infectées (Bowen etLyles,
1982;Nagai
etal.,
1976).Association de M avec d'autres orotéines et lipides
Par microscopie éléctronique, Bâchi (1980) a
observé des structurescristallines
apparemment composées de protéinesM (mais
aucune preuve n'est apportée)qui
auraient pénétrées les parties intérieures hydrophobes des membranes des cellules infectées ainsi que les membranes des virions.M
deNDV
s'associe efficacement avec des liposomes, quelles que soient leur charges,ceci même en présence de sel (Nacl, 0,5M), nous indiquant la nature
non éléctrostatique de la liaison. Le cholesterol n'apparaît pas comme étant la cible deM,
car cetteprotéine
selie tout
aussibien à
des liposomes sanscholésterol
(Faaberg et Peeples, 1988). Plusieurs régions sont candidates en tant que site deliaison
avec la membranecellulaire: le
côté carboxy-terminalqui
est particulièrement hydrophobe(Galinski
etal., lgïl)
ou encore une région enfeuille
p flanquée de deux structure en cr-hélice, qui a un caractère également hydrophobe (région très similaire dans toutes les protéinesM
des paramyxoviruses(Bellini
et al., 1986)).Il y
a de fortes évidencesqui
montrent une association entreM
et les glycoprotéines virales. Par des expériences de co-cappingTynell
et Ehrnst (1979) ont pu montrer que le comportement deM
du virus de la rougeole estsimilaire
àcelui
des glycoprotéines virales, expériences confirmées par Yoshida etal.
(1979) avec un thermosensible duvirus
de Sendai.Le
blocage du transport des glycoprotéinespar la
monensine empêche égalementM
d'atteindrela
membraneplasmique
sanspour autant
s'accumulerdans le Golgi. M
semblerait nécessiter un certain contexte (maturation des glycoprotéines, composition lipidique des vésicules) pour reconnaître sacible, celle-ci
se situant dans des vésicules post-Golgi"Plus récemment Sanderson et al. (1993), mettent en évidenco,
pff
immunofluorescence et en procèdant à une série de test biochimique, le fait que la protéine F et la protéineM
semblent suivre les mêmes voies cytoplasmiques menant à la membrane plasmique.
In vitro, Yoshida et aL (1976)
remarquèrent quele virus de
Sendai se dissocie en présencede
détergentet de sel en trois fractions: les glycoprotéines,
unefraction
contenantla
protéineM et la fraction
dela
nucléocapsidequi était
incapable de seréassocier
aux glycoprotéines
sansla fraction contenant M, confirmant
sonrôle
ambivalent (àla fois liée aux
glycoprotéines et àNP
dela
nucléocapside). D'aprèsShimizu
et Ishida (1975),M interagirait
avecla
nucléocapside au travers de liaisons ioniques. NP est une protéine acide et négative à son côté carboxy-terminal (Morgan etal.,
1984),et
de plus phosphorylée (charges négatives ajoutées) (Hsuet
Kingsbury, 1982), cette partie de la protéine serait la région la plus favorable à I'interaction avecM
qui est une protéine de charge plutôt positive.Caldwell et Lyles (1936) ont montré qu'il existait deux populations de
M
associées aux membranes plasmiques de cellules infectées par le virus de Sendai: 657o est détachable aprèstraitement
avec4M KCI
alors quela population
deM
restanteainsi
que lesnucléocapsides sont insensibles. Les
auteurspostulent que la fraction
restantereprésente les protéines "liées" aux nucléocapsides. Deux populations ont également été
identifiées par De Melo et al.,(1992) en utilisant
desanticorps contre différents
conformères deM,
mettant ainsi en évidence une sous-population deM qui
"apparaît"plus tardivement que la majorité de
M
lors de sa synthèse (au travers d'une maturation conformationnelle). Malheureusement, les auteurs n'ont pas pu assigner unefonction
précise à cette sous population.M
semble également s'associerau cytoskelette (Bohn et al., 1986). L'actine
est régulièrement trouvée comme composant de beaucoup de virus enveloppés, parmi eux les Paramyxovirus (Lamb etal.,
1976;ôrvell, l97B;Tyrcll
andNorrby, l97g; Giuffre
etal.,
1982).Le
rôle joué par l'actine n'est pas clair.Il
est possible qu'ellejoue
un rôle"moteur" dans le bourgeonnement.
L'affinité
deM pour
elle-mêmene fait
aucun doute. Parcross-link chimique,
des formes dimères, trimères voire multimères ont été obtenues (Nagai etal., IgTg),ce
qui pourrait expliquer les structures en réseaux observées par Bâchi et Buechi (1982) dans les membranes des cellules infectées.Hewitt
(1977) a décritM
comme s'associant en dimère,formant
des anneaux de6 nm
avec untrou
de 1,5nm
au centre(Hewitt
etNermut,
1977). Lorsqu'onpurifie
les protéinesM
devirion
par la méthode de Sheid et Choppin (1973), on observela formation
de bâtons composé d'une surface crystaline faite de lignes parralèles qui semblent tournées en hélices (Heggeness et a1.,1982).Structure de la protéine M
Par dichroisme circulaire,
Giuffre
et al (1982) ont pu mettre en évidence les structures secondaires générales des protéinesM
des paramyxoviriade(sauf RSV): ll7o a-
hélice,
l9%oen feuille B,
70Vode spirales
aléatoiresavec un poids moléculaire
d'environ 40kD. Les positions des cystéines sont très conservées parmi
les paramyxovirus. Toutes les protéinesM
sont fortement basiques, ces résidus basiques setrouvant le plus
souventpar
paires.M subit
plusieursmodifications lors de
sa synthèse dans les cellules infectées, à savoir des phosphorylations(Lamb, I975;Hsu
etKingsbury,1982;
Naruse et al., 1981; Smith etHightower,
1981), une activité kinase a été découverte également dansle virion in vitro (Lamb,
1975, Roux etKolakofsky,
1974). On observe également que I'acide aminé méthionine
initial
est enlevé,suivit
de I'acétylation de I'acide aminé suivant,l'alanine (Blumberg etal.,
1984).La protéine M et le noyau
Jusqu'ici seule
M
deNDV
a été observée en masse dans le noyau (Faaberg et Peeples, 1988b;Hamaguchi,
1985; Peeples, 1988a). Cependanto d'autresprotéines ont
été retrouvées dans le noyau en petites quantités, commeM
de Sendai, ce qui n'est pas une grande surprise car les protéinesM
des paramyxoviridae sont de relativement petites tailles (<42Kd)
et peuvent donc pénétrer plus ou moins librement dans le noyau par les pores nucléaires (Yoshida et al., 1976)"La nucléocapside est composée d'ARN et des protéines:
C'est une protéine associée de facon
étroite
avecI'ARN,
on compte exactement uneprotéine NP pour six
basesd'ARN
chez Sendai.Les
protéinesNP doivent couvrir
toute la longueur deI'ARN,
un excès ou un manque d'une base semble empêcher une réplication efficace du virus (Calain etRoux,
1993)" La nucléocapside sous cette forme résisteà un
traitementpar la
ribonucléaseA (Lynch et Kolakofsky,
1978)ou à la nucléase micrococcale (Calain et al., L992), NP jouant le rôle de bouclier. La
comparaison des séquences des différentes NP des pamyxoviridae (excepté RSV) nous révèle trois régions au centre de la protéine qui sont conservées (Rozenblatt et al., 1985;
Galinski et al.,
1986a). Par contre, les côtés aminoet
carboxy sont peu conservés.Néanmoins, le côté N-terminal est chargé plutôt positivement, ce qui nous suggère que c'est cette partie de la molécule qui entre en contact avec le
RNA
(Morgan etal.,
1984;NE
Sanchez et
al.,
1986).Il y
a d'autres évidencesqui
nous montrent quela partie C-terminale
deNp
serait exposéeà
I'environnement, donc candidat àla liaison
avecla
protéineL, p ou M
(Deshpande et
Portner,l984; Gill
et al ,1988; Buckland etal
1989). Cette partie dela protéine n'est pas
nécessaireà Ia conservation de la structure générale de la
nucléocapside (Heggeness et al.,
l98l).
LA PROTEINE L
La
protéineL
des paramyxovirirdae estmultifonctionnelle:
ARN-dépendanteARN
polymérase capable de générer les mRNA viraux, les intermédiaires de replication ainsi que les
RNA
génomiques de la nouvelle génération de virus. De plus,L
est responsable de la synthèse des séquences leaders (+) ou(-),
du "capping", de la méthylation et dela polyadénylation
des messagersviraux (Choppin et Compans,
1975; Mastumoto,1982). Toutes ces
fonctions
expliquent sans doutepourquoi L
est une aussi grosse protéine :252Y'D. Avec ses 6900 nucléotides et sa situation en extrémité 5' du génome,les
messagersde L sont les moins
abondants destranscrits viraux, ce qui reflète
certainement le
fait
qu'une quantité catalytique de cette protéine est suffisante pourla
survie et la
multiplication
du virus. Les protéinesL
des différents paramyxoviridae sont très semblables avec jusqu'à 62Vo de conservation en acides aminés entrele virus
de Sendai et levirus
HPF3.L
est également très similaire aux protéines coffespondantes (également appeléesL
) d'autres virus qui utilisent la même stratégie de replication , telle virus
dela
stomatite vésiculaire(VSV,
Rabdoviridae) (Shubert etal.,
1984) et le virus de la Rage (Tordo et al., 19S8).LA PROTEINE P
La protéine P est la protéine la plus divergente des protéines des Paramyxoviridae (elle varie de 241 acides aminés (RSV) à 602 acides aminés). Par exemple,
pIV3
et Ie virusde Sendai partagent plus de 5O7o d'identité pour les protéines
L
et NP, mais n'ont que I97o de conservation pour P. Les protéines P sont en général acides etgrand nombre d'acides aminés
tels
les serines ou thréoninesqui
sont extensivement phosphorylées (dans la partie amino-terminale de la protéine (HSu et Kingsbury, 1982;Vidat et
a1.,1988), cequi
augmente encore la charge négative de cette molécule. Les expériences suggèrent que la partie carboxy-terminale de P, qui est plus conservée queles autres régions et plus hydrophobe que le côté amino, est en contact
avecla
nucléocapside et contient les sites qui participent à la transcription (Chinchar et Portner, 1981a). Ryan etKingsbury
(1988) situentle
site deliaison
à la nucléocapside au 224 residus C-terminaux" Chezle virus
de Sendai (pas chez HPF3), on trouve souvent Psous forme de trimères (Markwell and Fox, 1980, Curran J., communication
personnelle), ce qui semble uniquejusqu'ici.
LES PROTEINES NON STRUCTURELLBS CHBZ LE VIRUS DE SENDAI
Le
gèneP
de Sendai code pour plusieurs protéines non-structurelles(voir figure
4)(Giorgi
etal.,
1983; Shioda et al., 1983; Gupta etKingsbury,
1985b), telle la protéinec qui
est un polypeptide de 22kD(Lamb
et a1.,l9i6).
LesARN
messagersqui
unefois
traduit donneront les protéines P et C sont issus du même gène P par deux cadresde lecture ouvert qui
se chevauchent(Portner et al.,
19S6);Curran et al.,
1986).Contrairement à P, C qui n'est pas phosphorylé et est très basique
(Giorgi
etal.,
1983;Shioda et al, 1983), ne se retrouve qu'en très petite quantité dans le virion,
apparemment
liée
àla
nucléocapside (Yamada etal.,
1990; Lamb et Paterson, 1991;Kolakofsky et al.,
1991).C
neco-localise
pas avecP
dans lescellules ou
avecla
nucléocapside (Portner et al., 1986), maisin vitro
semble inhiber la transcription sans influencer la réplication (Curran etal.,
1992). C semble être responsable deI'induction
de production d'interféron dans les cellules infectées par le virus de Sendai (Taira et al., 1987).Le
gène P codepour
une autreprotéine, C', qui
est dansle
même cadre de lecture que C mais dont la synthèse commence sur un ACG en amont duAUG
de C.(Curran et
Kolakofsky,
1988a). On connaît encore deux autres protéines issues de ce cadre de lecture,Y
et Y'. Le cadre de lecture de P donne encore trois autres protéines: la protéineX
qui correspond aux 95 derniers acides aminés de P (Curran etKolakofsky,
1988b),
W
composée de la partie N-terminale de P etV
qui représente la même région fusionnée avec un domaine riche en cystéines. Ces deux dernières protéines sont issuespar editing du
message deP. V et \M ne
sont pas requispour la réplication,
mais auraient plutôt un effet inhibiteur-régulateur (Curran, communication personnelle).5',
r04
81'
11.4
'
rg3
-
201
t04
104
t523
1255
1808
5'
1053
+lG
\
1053+2G
\
10615
fîgure 4: les protéines non-structurelles du virus de
SendaiSl
ttaallr1"/ltfttfla\\\\\\ \\\\\\
ttlltff
\\\\\a\
;Yi
GENOME VIRAL
L'ARN
négatif de 15384 nucléotides du virus de Sendai est composé de six unités de transcriptions(NP,P/G,M,F,HN,L)
séparées par des régions intergéniques courtesI
(=GAA
ou GGG)(voir figure
5). On trouve unARN
leaderLe
à I'extrémité 3' et unARN
Leader potentielLe'
du côté 5' (shioda etal., l9g3,19g6; Morgan
etal.,
19g4;Giorgi
et al., 1983; Blumberg et al., 1984, 1985;Morgan et Rakestraw, 19g6; Gupta etKingsbury, 1984). LE et LE' sont
complémentairespour les douze
nucléotides terminaux. Les messagers viraux sont polyadénylés et ont unecoiffe.
Chaque messager se termine au niveau des 5U
deRl
amorçant ainsi la synthèse dela
queue depoly A
(Gupta et Kingsbury,1982). Les messagers commencent au premier nucléotide de
Rl.
Les 56 nucléotides suivant le leader
Le'ne
sont pas transcrits enARN+.
3'
Figure
5: Ie génomeviral.
(Shioda et al., 19S6)Le:
leader (+), 51 nucléotidesLe':
leader (-)potentiel, 53 nucléotidesI: GAA
ou GGGJ: AAA
Rl: UCCCACUUUC
ouUCCCAGUUUC R2: AUUCUUUUU
5'
VIRUS DE SENDAI DEFECTIF INTERFERENT
Les virus défectifs sont un élément important dans I'infection virale des cellules, car
ils
sont présents chez pratiquement tous les virus. Ils interviennent en modulant I'infection de Ia cellule par le virus non-défectif en interférent dans plusieurs étapes essentielles à lavie et la multiplication du virus non-défectif (tels la réplication,
I'assemblage et Ie bourgeonnement)" C'est enutilisant
les propriétés spécifiques de cesvirus
défectifs qu'une bonne partie du travail de cette thèse a été possible.Propriétés des particules défectives interférentes (DI)
Les virus
DI
apparaissent après multiplications successives du virus à hautemultiplicité d'infection
en culture de cellules ou d'oeufs embryonnés pour levirus
de Sendai (voie normale de culture duvirus) (Kolakofsky
1976:1979). Elles contiennentun
génome tronqué auquel manque une bonne partie de I'information génétique.Vu
la déletion du génome, ces particules sont incapablesde
serépliquer
seules,elles utilisent
alors I'appareil à répliquer du virus non défectif(dit
standard) pour leur propre compte.-
De plus, dufait
de lataille
plus courte de leurARN
ou en raison d'autres propriétés non élucidées, elles sont répliquées préférentiellement par rapport au virus standard. Ondit
qu'elles interfèrent avec la réplication du virus non-défectif (Huang, T973; Huang etBaltimore,
1977; Holland etal.,
1980; Perrault,I9&l;Lazzarini
etal.,
1981)"On distingue deux types de génomes défectifs:(voir figure 6A)
l)
Les défectifs de déletion qui ont conservés les deux extrémités du génome standard"2) Les défectifs appelés"copy back" (Leppert et a1.,I977). Ceux-ci ont I'extrémité 3' de I'antigénome et I'extrémité 5' du génome (ces extrémités étant complémentaires, elles ont la propriété de former des
ARN
dits "en manche de poêle" par appariement des 110 nucléotides situés aux extrémités (Re etal.,
1983).Lors de la réplication, la
polymérase se décrocherait dela matrice pour réinitier
lasynthèse soit plus
loin
dans le génome pour les défectif de déletion, soit elle revient en arrièrepour réinitier
près de I'extrémité5'
deI'ARN
nouvellement synthétisé(voir figure 68),
créant ainsi les deux bouts complémentaires caractéristiques des défectifs copy-back.Leur
avantage sélectif parrapport
auvirus
standards'expliquerait
d'unepart, par leur petite taille, environ
10fois plus petites, ce qui leur permet
d'être répliqués plus rapidement, et d'autre part , les génomes desDI
"copy back" possèdent à leur extrémité 3' le promoteur de I'antigénome qui semble être un promoteurplus fort
que
celui
de I'extrémité3'du
génome.Ayant
les extrémités complémentaires, lesDI
"copy back"
possèdentainsi un promoteur fort aux extrémités des génomes
et antigénomes,alors
que ce mêmepromoteur ne
seretrouve
qu'àI'extrémité 3'
des antigénomes standards et des défectifs par déletion.Les virus défectifs ont également une grande influence sur le processus d'assemblage et sur le bourgeonnement qui sont décrits au chapître suivant.
3'
5'
FIGURE 6A: STRUCTURE DE L'ARN
DESVIRUS DE SENDAI NON DEFECTIFS ET DEFECTIFS
G)
(+)
(+)
IR
G)3'
IR = inverted
repeats(+) 5
(+) +
IR
G)ARN viraux non défectifs
ARN viraux
défectifs de
déletion
ARN viraux défectifs
copyback
5' 3'
5
'ay'
5'
3'
5r-
5'
3'
G)3
5' 3'
IR
FIGURE6B: GENERATION
DESARN VIRAUX DE TYPE COPY BACK (Leppert
etal..
1977)+ 5'
5'
5'
G)
3'
3'
3' (+) +
1fr
1fr
3'
+1
G)
G)
3'
5'CYCLE VIRAL (figure
7)L'attachement du
virus
sefait
grâce àla
protéineHN qui
selie
àun
des récepteursglycosylés contenant un acide neuraminique terminal (1) (Markwell et
al., 1981;1984;1986). Les protéines F1 et F2 provoquent la fusion de I'enveloppe (2) virale(d'origine cellulaire) et de la
membranede la cellule (pH neutre et
température dépendante). Dans certain cas, la protéineF suffit
àelle
seule pourfaire
fusionner le virus avec la membrane de la cellule(Markwell
et al., 1985), maisil y
a des évidences qui montrent queHN
semble participer au processus(Miura
etal.,
1982; Heath et al., 1983;Portner,
1984;Gitman et Loyter,
1984; Portneret al., r987b; Thompson
et Portner, 1987).Il y
a polémique à ce sujet.Le
cycleviral
alieu
dans le cytoplasme. La transcriptionprimaire
(3) s'effectue grâce aux fonctions enzymatiques présentes dans la nucléocapside et des protéines cellulairestelle
quela tubuline (Moyer et al.,
1986;Hill
etal.,
1986). Tous les messagers sont synthétisés à ce moment. La transcription commence par I'extrémité3'et produit
aufur
et à mesure tous les messagers, de façon individuelles (Glazier et
al., I97l; Collins
etal.,
1980; Kolakofsky etRoux,
1987; Galinsky et Wechsler, 1991).LA REPLICATION VIRALE
A la
suite de cette transcription primaire, les protéines virales sont produites (4) et la réplication du génomeviral
a lieu. Cette fois-ci, la polymérase semble ignorer les arrêts servant à la production des messages individuels. Une copie + du génome (antigénome) est synthétisée (5) et va servir de matrice à la synthèse du génome. Ce génome sert à laproduction de
nouveaux messagers(transcription
secondaire),de matrice pour
la synthèse de nouveaux antigénomes ou alors est enveloppé dans de nouvelles particulesvirales. Les
génomeset
antigénomes seretrouvent tous les deux
encapsidés. Le processusd'amplification
dela multiplication virale
se poursuit ainsi jusqu'à Ia mort cellulaire.(1)
LE CYCLE VIRAL (figure 7)
(2)
(3)
oo I
I 1l (7)
a oo
o h
o.o (4)
lo oo 0
L
I
o
Oao 0 oo
P3 h I
(s)
I
F
l1l
1l fl I
(4b) I
B (6)
{
0 s
ASSEMBLAGE ET BOURGEONNEMENT VIRAL
Le bourgeonnement
viral
tel qu'il est exposéici
sert de base de travail pour cette thèse.C'est dans le but de clarifier, de confirmer certains points de ce modèle qui reste encore obscure dans presque toutes ses étapes, que ces études ont été entreprises.
NP est produite par des ribosomes libres et enveloppe
I'ARN. Il
faut 2564 protéines parARN, donc 6
nucléotides exactement sont couvertes par uneNP (Calain et
al.,t993).300
P et 30L
s'associent à ce système pour former les nucléocapsidesqui
sont transportées versla
membrane cellulaire (on ignore comment).La
nucléocapside est relativementflexible,
étant constituée de disques protéiques.HN
et F sont synthétisées dans leréticulum
endoplasmique (figure7 (4b)) et sont transportées à la surface dela cellule par la voie d'excrétion non régulée. Les protéines M
seplacent sous la
membrane externe où elles s'organisent enfeuillets
(ou réseaux) (Bâchi, 1980;Biiechi
etBâchi,
1982).M
est censée reconnaître les régions membranaires modifiées par la présence des glycoprotéinesHN
etF (6) (Shimizu
etIshida, I975i Lohmeyer et
al, 1979). Elleinduit
I'organisation des glycoprotéines en interagissant vraisemblablement avec leur partie cytoplasmique et s'associe aux nucléocapsides formant ainsi la structure de prébourgeonnement(7). Si le
nombre d'interactions entre les nucléocapsides, les protéinesM
et les glycoprotéines sont suffisants,il y
a stabilisation de cette structure et bourgeonnement(8). En cas de défection des
nucléocapsides sousla
membrane plasmique si nous avons affaire à des génomes défectifs trop petits comme c'est le caslors d'infection dite "mixte", ou
lorsqu'on est en présence decellules
infectées de manière persistante(voir
les paragraphes consacrés au virus défectifs ),il
a y instabilitédu complexe formé par un
manqued'interactions. M est alors
dégradéeet HN
réinternalisée puis également dégradée (Tuffereau et
al.,
1988).Il
en résulte alors un bourgeonnementréduit. La stabilité
ducomplexe formé pourrait
dépendre:i)
d'un nombrecritique
d'interactions entre Ia nucléocapsideet la
protéineM ou ii)
d'une première interaction entre I'extrémité3'du
génome, constituant un site à hauteaffinité
de la reconnaissance de la nucléocapside et de
M.
Comme lesprincipaux
défectifs ne possèdent pas cetteextrémité 3' (voir
chapître consacréaux défectifs),
cela pourrait expliquer leur peu d'efficacité de bourgeonnement (Tuffereau et Roux,1988). Selon le système decellules
infectées,les
nucléocapsidesd'ARN
génomique bourgeonnentpréférentiellement aux
nucléocapsidesd'ARN antigénomique
(mêmepour le virus
standard),les différentes extrémités
deleur ARN impliqueraient cette
différence d'efficacité (Kolakofsky etBruschi,l975).Il
semble que I'actine joue un rôle également en s'associantin vitro
àM (Giuffre
eta1,t982; Bohn et aI,1986). Ceci est démontré entout cas pour
d'autresparamyxovirus que le virus de Sendai (NDV, virus de la
rougeole).
Différents types d'infections avec le virus de Send4
A)
Infections aiguesCe type d'infection a
lieu
quand on infecte les cellules avec levirus
standard. Tout ce qui conceme la pénétration, la replication et le bourgeonnement de ce type de virus a été exposé ci-dessus. Les cellules infectées meurent une trentaine d'heures après une telleinfection
.B)
Infections mixtes et persistantesAlors
queI'infection
de cellules par le virus de Sendai standard provoque la mort des cellules après une trentaine d'heures, I'infection par un mélange devirus
standards et défectifs (infection mixte) permet aux cellules de survivre et de développer une infection persistante (Roux etHolland,lgTg).
Ces cellules infectées en permanence peuvent êtrecultivées
pendantde
longues périodes.Au
momentde I'infection mixte initiale,
lamajorité
des cellules contiennent des antigènes viraux en quantité équivalente ou plus grande que des cellules infectées par le virus standard (Roux etWalvogel,
1981).La
survie des cellules n'est pas donc due à unediminution
de Ia production de protéines virales. Lors de I'infection mixteinitiale,la
protéine HN est présente en quantité réduiteà la surface
descellules (Roux et Waldvogel,
1983),ou,
dansle cas d'infection
persistante,elle n'y
est même pas détectée(Roux et Waldvogel, 1985). on
peut expliquer son absence par une réinternalisation et une dégradation deHN,
donc à son instabilité dans la membrane. Dans ces infections mixtes et comme dans les infections persistantes,M
est instable dans les cellulesBHK:
elle disparaît au coursdu
temps.Cette instabilité proviendrait du fait que bien que la structure de prébourgeonnement soit accomplie, les nucléocapsides défectives sont incapables de
la
stabiliser (dufait
peut être de leurtaille
trop courte). Cetteinstabilité
de la structure de prébourgeonnement sous la membrane plasmique deviendrait le facteur limitant la production de particules virales (Dubois - Dalq et al, 1984) qui est en effet observée dans les infections mixtes et persistantes et permettrait ainsi la survie de la cellule (menant à la persistance).L'instabilité
des protéines HN etM
dans les infections mixtes nous ont conduits à nous intéresserplus particulièrement à leur rôle
dansle
bourgeonnement.Nous
nous sornmes intéressés tout d'abord à la protéineHN
pour laquelle existait unvirus
mutant thermosensible qui pouvait nous aider à élucider le problème de la présence obligatoireou
non dela
protéineHN pour
quele
bourgeonnement duvirus
de Sendaiait lieu.
LA GLYCOPROTEINE MAJEURE N'EST PAS NECESSAIRE A UN BOURGEONNEMENT EFFICACE DU VIRUS DE SENDAI
Résumé
Jusqu'ici,
il
est généralement admis que I'assemblage duvirus
de Sendai alieu
àla
membrane plasmique de la cellule où prend place le bourgeonnement. Les composantsviraux qui participent
au processus d'assemblage sont: la protéine de"matrix" M,
les deux glycoprotéinesHN
et F, et la nucléocapside. La protéineM
apparaîtjouer
un rôlecentral,
servantde "pont"
entre les queues cytoplasmiques des glycoprotéineset la
nucléocapside"
Une question importante est de savoir quels sont les composants minimums nécessaires au bourgeonnement. Par exemple, les deux glycoprotéines sont-elles indispensables?
Dans les
infections mixtes (virus
standardplus virus défectif)
et dans lesinfections
persistantes, une réduction importante du bourgeonnement corrèle avec une très grande instabitité des protéinesHN
etM,
suggérant qu'au moins une de ces deux protéines est indispensable au bourgeonnement.Il était à cet
époque(1990)
impossible de testerI'importance
deM. Pour HN,
en revanche,il existe un virus de
Sendaithermosensible (TSZZt) qui
bourgeonne normalement à température non-permissive avec visiblement une absence totale de la glycoprotéineHN
àla
surface des cellules et des particules virales produites"Il
existe égalementun virus
thermosensible deVSV (Rabdoviridae) qui
possède une seule glycoprotéineG,
absente apparemment àla
surface des particules virales produites à température non-permissive (Schnitzer et al,1979). Mais ces particules contiennent en fait la partie transmembranaire et cytoplasmique de G, démontrant ainsi que la protéine G est indispensable au bourgeonnement duvirus VSV
(Metsikkô et Simons,1986)"Il
était important
d'analyser les particulesvirales
deTS27l
poury
exclureou non
la présence dela partie
transmembranaire deHN. En effet,
commele virus
de Sendaicomporte deux glycoprotéines de surface contrairement à
VSV
qui n'en a qu'une seule, la situation entre les deux virus pourrait être différente. Pour répondre à cette question, nous avonsutilisé un
anticorps anti-peptide dela partie
cytoplasmique deHN.
Cet anticoqps n'a mis en évidence aucune partie deHN
tronquée dans les particules virales dans des conditions oùil
a immunoprécipité la partie cytoplasmique deHN
dans desparticules virales
"rasées"de la partie
extérieur desglycoprotéines par
digestionprotéolytique. Il n'y
a donc pastout
ou partie deHN
dans les particulesvirales
de TSZI l, (dans les limites de détection par la technique du western blot). La protéineHN
ne semble pas être indispensable au bourgeonnement du virus de Sendai.
THE MAJOR GLYCOPROTEIN OF SENDAI VIRUS IS DISPENSABLE FOR EFFICIENT VIRAL PARTICLE BUDDING
Reto Stricker and Laurent Roux*
Department of
Microbiology, University of
Geneva, Medical School,C.M.U.,9
Avenue deChampeI,l,2Il
Geneva 4Summary
The
temperature sensitive mutantof
Sendaivirus
ts271, whengrown
atrestrictive
temperature, produces virions lacking integralHN
(Portner etal.,
1974;Portner et al., 1975; Tuffereau et al., 1985). In the present study,it
is shown that the transmembrane- cytoplasmictail
ofHN
is not detected as well. This apparent complete lackof HN
does not affect budding efficiency.Assembly
of
Sendai virus, a member of the paramyxoviridaetamily,
takes place at thecell
plasma membrane. The newvirion is
produced afterformation of
abud which
pinchesoff
the membrane, resultingin
the releaseof
a particle. Participatingin this
assembly process are: i)
theviral
glycoproteins,which
are insertedin the
plasma membrane,with
their ectodomain exposed at the cell surface,ii)
the matrixM
protein, which is partly embeddedin
the lipid bilayer on the cytoplasmic side and organized as a leaflet structure, andiii)
the nucleocapsid, composed of theviral RNA
associatedwith
NP, P and
L
proteins. According to the currently accepted model which is based both on experimental data (for recent reviews seePeeples,lggl;
Ray et al., 1991) aswell
ason
rationale thinking,
theM protein
plays a centralrole in
theorganization of
the budding complex. The glycoproteins would be anchoredin
patchesin
the membranethrough
contacts betweentheir
transmembraneor
cytoplasmic domains andthe M
leaflet.This M
leafletwould in
turn be recognized,from
the cytoplasmic side,by
the nucleocapsid.At
present, noneof
these various contact points have beenidentified,
thereforethe real
partnersin this overall
structure remain uncertain.For
instance, althoughit
is reasonable to assume that the nucleocapsidwill
make contactwith
theM
protein through NP, a contact between
M
and theRNA
cannot be excluded.Another
point
under questionis
theminimal
necessary components neededfor
virusassembly' From study of
Sendaivirus mixed
(standardplus defective interfering
particles)
and persistentinfections,
thereduction of viral particle budding
has been correlatedwith
an increasedM
andHN turn
over, suggesting that both these proteins represent partners neededfor efficient budding (Tuffereau
andRoux,
1988; Roux etal.,
1985;Roux
andWaldvogel,
1982). Onthe other
hand,a
temperature sensitivemutant, ts27t, was shown to
assembleinto virus particles at the non
permissivetemperature in the
absenceof detectable HN, thereby indicating that HN
was dispensable (Portner etal., I975;
Portner etal.,
1974;Markwell
et al., 1985; Tuffereau etal.,
1985).A
vesicular stomatitisvirus (VSV)
mutant, ts045, was also shown to produce, at the non permissive temperature,virions
lacking Gprotein
(Schnitzer etal.,
1979). These spikeless particles \ryere, however, shown to contain the G protein membrane anchors, indicating that the G protein was indispensable for virus particle budding (Metsikkô and Simons, 1986).It
was therefore relevant toverify
whetherin
the caseof
Sendai virusts2Jl,
a remnantportion of HN,
i.e. its transmembrane cytoplasmic portion, could be found in the virions produced at the restrictive temperature"Ts27l virion was first
described ascontaining non functional heamagglutinin
and reduced neuraminidase activities when grown at non permissive temperature (Portner et a1.,1974; Portner etal.,
1975).HN
was not detected under restrictive conditions eitherby iodination of
theinfected cell
surface proteins(Tuffereau et al.,
1985),or in
the virus particles after 35S-methionine labelling(Markwell
etal.,
1985). This latterpoint
is emphasizedin figure I
andTable
1.Figure
1 panelA,
shows a comparisonof
the35s-methionine labelled viral
polypeptidesfound in wild type (wt) or mutant
(ts)virions,
grown under permissive (31 oC) or non permissive (39 oC) conditions.At 3l
oC, the amount
of
HN1r271 incorporatedin
the virus particlesis
abouttwofold lower
than that of HNye1, when the amounts ofHN
are normalized to the amounts of the other membraneviral protein M (for clarity
seeHN
andM in
the trackslx,31
oC,figure
1panel
