cellules infectées par VTFT-3 et transfectées

Colonnes L et

2: ARN viraux

présents dans les surnageants des cellules transfectées avec les 3 gènes: P, NP,

L;

colonnes 3 et 4:

ARN

viraux présents dans les surnageants des

cellules

transfectées avec

les 6

gènes

P, NP, L, HN, F, M;

colonnes

5 et

6:

surnageants des cellules transfectées par 5 gènes P, NP,

L, HN, F

^(sans

M);

colonnes 7 et 8: surnageants des cellules où aucun ^gène n'a été transfecté"

DISCUSSION

Les expériences qui permettent d'effectuer un bourgeonnement de particules virales de Sendai dans des conditions où les diverses fonctions impliquées dans ce processus sont décorticables ne sont pas faciles à réaliser. Pourtant ce système est

le

seul

qui

puisse donner les renseignements adéquats, et ceci jusqu'à ce qu'on soit en mesure de générer

un virus à partir d'un clone complet, ce qui

n'est pas encore acquis.

Nous

étions confronté aux difficultés suivantes:

A) La

co-transfection de

six

gènes dans une même

cellule

n'est pas

efficace. On

a estimé par immunoflorescence que I'efficacité de transfection de

pGem-F

était de 75Vo

(7

à

8 cellules sur

10 sont transfectées), alors que pour

le

plasmide

pGem-M

_cette

efficacité était

au plus _de 30Vo.II est possible d'imaginer que certaines constructions

soient moins aptes à pénétrer les cellules (comme pGem-M) que d'autres,

ou interagissent

moins facilement

avec

la

transfectace,

diminuant ainsi I'efficacité

de transfection. Les chances d'avoir les six gènes exprimés ensemble dans la même cellule sont donc plutôt _faibles (l0vo?),c'est un facteur limitant indéniable.

B)

La durée de la transfection, plus de 40 heures, qui est nécessaire pour supporter une réplication efficace des génomes défectifs et pour accumuler les protéines impliquées dans le bourgeonnement,laisse au

virus

de la Vaccine le temps de détruire un certain nombre de cellules, déversant ainsi leur contenu de nucléocapsides dans le surnageant.

Le

bruit

de fond s'en trouve augmenté et noie le signal des quelques particules virales produites.

C) Il

a été impossible de séparer les nucléocapsides des particules

virales

produites dans le surnageant par les différentes méthodes utilisées. Pratiquement, cette séparation est réalisable

par

sédimentation gradients de tartrate-glycérol lorsque les particules

virales

sont issues d'infection naturelle (pas montré). Mais, on

trouve

dans ce casJà

une proportion bien plus grande de particules virales, comparée à celle

des nucléocapsides présentes. Dans notre cas, les particules virales représentant peut-être l%a

de la

masse de nucléocaspides

sont donc

noyées dans

la trace

laissée

par

les

nucléocapsides qui se positionnent au-dessous des particules virales dans le gradient.

D) La matrice

inerte répliquée et

qui

ensuite

suit le

processus d'assemblage

puis

du bourgeonnement grâce aux protéines fournies par les plasmides-vecteurs transfectés, est

le

génome du

virus

défectif

DIH4. Or,

nous savons que ce virus

défectif,

comme

tous les virus défectifs,

bourgeonne

avec très peu d'efficacité

dans

une infection naturelle,

malgré les quantités normales de protéines présentes (Tuffereau

et

Roux, 1988). Cet emploi d'un génome défectif ne peut

jouer

qu'en défaveur de notre système, car

outre

son peu d'efficacité,

il

peut même nous conduire à I'erreur: aucune donnée

existante ne démontre que le virus DIH4 suit un

processus

de

bourgeonnement identique à celui du virus non défectif.

E) Enfin, I'utilisation

du

virus

de la Vaccine dans l'étude de la

multiplicaton

du

virus

de Sendai peut s'avérer dérengeante. Le virus de la Vaccine est un virus à

ADN

dont le génome

contient

près de 200 gènes de

loin

pas tous identifés. On a

vu

que ce

virus

réprime la réplication du virus de Sendai. Mais quelles sont

ses

influences

sur I'encapsidation, I'assemblage et bien entendu le bourgeonnement du virus?

Contient-il

des protéines

qui

interfèrent avec le

virus

de Sendai, capables peut-être de remplacer une ou plusieurs protéines membranaires du virus de Sendai? Par immunoprécipitation, on a observé que la protéine

M

semble s'associer plus ou moins spécifiquement avec deux protéines tardives du virus de la Vaccine (non montré). Ces deux protéines ont-elles une action sur la protéine

M

transfectée? Ces questions montrent que

le

système dépend de beaucoup d'inconnues et donc les résultats

qu'il

génère sont à interpréter avec précaution.

Malgré toutes ces réserves:

i) il

ne

fait

aucun doute que des particules

virales

infectieuses _contenant un génome défectif semblable en taille à celui répliqué dans un premier temps ont pu être produites

au travers de ce

système. Ces

particules virales ne

contiennent

pas de

génomes standard,

montrant ainsi

que des particules

virales

défectives peuvent bourgeonner toutes seules sans I'aide de génomes standards, ce qui n'a jamais _{été montré}

jusqu'ici.

ii)

Certaines expériences tendent à

montrer

que

la protéine M

ne semble pas être indispensable au bourgeonnement. Ce résultat semble surprenant en regard du

rôle central qu'est censé jouer M ^dans tous les modèles d'assemblage et

de

bourgeonnement, non

seulernent

pour les Paramyxovirdae mais aussi pour

les

Rabdoviridae. Une ^protéine virale du virus de la Vaccine remplace-t-elle

fonctionnellement M? Cela met-il en lumière un processus de bourgeonnement différent pour les virus défectifs?

Il

existe des données (communication _{de R.} Ruigrok, _Congrès de

virologie, Glasgow (1993)) qui

semblent

montrer

que

la

protéine de

matrix

des Rabdovirus (qui

jusqu'ici

_semblait remplir le même rôle que la protéine de

matrix

du virus de Sendai) se trouve non pas à I'extérieur de la nucléocapside faisant contact entre

Dans le document Etude de l'assemblage et du bourgeonnement du virus de Sendai (Page 104-107)