Centre de coopération internationale en recherche agronomique pour le développement Département des productions fruitières et horticoles
CIRAD-FLHOR
TA 50/PS4 - 34398 Montpellier cedex 5 - France
Compte rendu de mission
au Chili
Projet de mise en place d'un programme de création
variétale pour la filière agrumicole chilienne
du 9 au 17 décembre 2001
Avant propos
Cette m1ss1on fait suite à diverses rencontres avec nos collègues chiliens dans les congrès internationaux et à la visite en septembre 2001 du Pr Juan Enrique Ortuzar (professeur à 1 'Université Catholique du Chili) et de M Jorge Escobar (responsable technique du Consortium « Viveros del Valle de Aconcagua») à Montpellier.
Ces rencontres avaient permis de mettre en évidence un intérêt mutuel pour la mise en place d'un projet conjoint de création variétale pour la filière chilienne dont il convenait de préciser les objectifs spécifiques et les aspects opérationnels.
Outre les aspects techniques, cette mission avait pour objectif d'identifier et de contacter divers bailleurs de fond potentiels afin de construire ce projet de partenariat sur des bases pérennes. Cette mission a bénéficié d'un appui de la DRE du CIRAD et la totalité des frais sur place a été prise en charge par le consortium des pépiniéristes de l'Acongagua. Qu'ils en soient ici remerciés.
Je tiens à remercier l'ensemble des collègues chiliens rencontrés ainsi que l'attachée de coopération scientifique et technique de l 'Ambassade de France pour leur disponibilité durant les différentes visites et réunions. Je remercie tout particulièrement Doris Prehn, Juan Escobar, Jorge Ortuzar et Eduardo Gratacos pour leur accueil.
Sommaire
Avant propos ... 2
1. Résumé des points forts de la mission et perspectives de collaboration ... 4
2. Projet "Création variétale pour la filière chilienne" (voir également annexe 1 ) ... 5
2.1. Cadre général ... 5
2.2. Les partenaires ... 5
2.3. Objectifs ... 6
2.4. Les activités et la structuration du projet ... 6
2.5. Les sources de financement et la valorisation ... 8
3. La faculté d'agronomie de l'Université Catholique de Valparaiso (annexe 2) ... 11
3 .1. Activités et organisation ... 11
3.2. Possibilités de collaboration avec le programme arboriculture fruitière du CIRAD ... 13
LISTE DES ANNEXES ... 14
Annexe l ... 15
Annexe 2 ... 29
Annexe 3 ... 31
Annexe 4 ... 33
1. Résumé des points forts de la mission et perspectives de collaboration
L'objectif de cette mission était de définir les bases techniques et opérationnelles pour la mise en place d'un projet conjoint d'amélioration des plantes pour la filière agrumicole chilienne. Ce projet devrait impliquer:
. les équipes françaises de Montpellier et de la SRA . l'Université Catholique du Chili (PUC)
. le consortium des 'viveros del valle de Aconcagua' basé dans la région de Valparaiso Il intéresse le programme 'arboriculture fruitière' du Cirad à plusieurs titres
les zones de production chiliennes présentent des caractéristiques pédoclimatiques originales qui permettront d'accroître la connaissance sur le comportement de nos créations variétales,
le double partenariat Université/secteur privé doit permettre d'inscrire des activités amont dans une perspective très finalisée et déboucher sur la validation et la valorisation des innovations de la recherche au niveau de la filière,
les attentes des acteurs de la filière chilienne sont en parfaite adéquation avec les objectifs que poursuit le Cirad dans le cadre de sa programmation et ce projet nous permettra d'étendre significativement nos actions dans ce domaine, par la mise en place de synergies,
les activités de formation et de transfert méthodologique envisagées s'inscrivent tout à fait dans notre mandat.
Il s'inscrira, au niveau français, dans le cadre de la coopération Cirad/Inra sur les agrumes conduites à la SRA.
La principale attente manifestée par les partenaires chiliens concerne le développement de cultivars stériles produisant des fruits sans pépins dans le groupe des mandariniers et celui des citronniers. La synthèse et la sélection d'hybrides triploïdes constituent des objectifs spécifiques majeurs.
Afin d'apporter des résultats concrets valorisables à court, moyen et long terme, le projet prévoit les actions suivantes
. introduction de matériel pré sélectionné par les équipes françaises
. mutagenèse sur des cultivars connus pour induire des stérilités gamétiques
. transfert et développements méthodologiques (biotechnologies) et synthèse d'hybrides triploïdes
Les financements seront recherchés à travers différent projets : . DIPUC pour initier les activités en 2002,
. FONDEF pour les volets les plus appliqués,
. ECOS pour les volets amonts et les échanges scientifiques
Ce projet de coopération est bien perçu par l'attachée scientifique de !'Ambassade de France à Santiago et pourrait recevoir un appui à partir de 2003 (possibilités d'échanges scientifiques et de financement de thèse de chiliens en France)
Les équipes françaises doivent faire dans le courant du printemps 2002 une proposition concernant_ les aspects de propriété intellectuelle et de valorisation des produits de ce projet.
Par ailleurs l'équipe de technologie de l'Université Catholique de Valparaiso a manifesté de l'intérêt pour le développement de méthodes innovantes de production de jus de citrons.
2. Projet "Création variétale pour la filière chilienne" (voir également annexe 1)
2.1. Cadre général
Les agrumes couvrent environ 16 000 ha pour une production totale de 280 000 tonnes et ont connu un accroissement significatif ces 5 dernières années. Les orangers (7000 ha) et citronniers (7000ha) constituent les principales productions. Les mandarines sont en progression constante depuis 5 ans et représentent aujourd'hui environ 10% de la production. La quasi-totalité de la production est destinée au marché du fruit frais. Les exportations ont doublé depuis 1997 et atteignaient 26 000 tonnes en 2000. Les mandarines constituent une part croissante de ces exportations, favorisées par un contexte sanitaire exceptionnel des bassins de production chiliens (absence de mouche des fruits, de mineuse, et de chancre citrique entre autres). Au plan financier, les exportations de citrons sont passées de 10 millons US $ FOB en 1997 a 16 en 2001. De même, l'exportation des mandarines qui ne représentait que 1,5 millons US $ FOB en 1997 atteint 7 millons en 2001 (www.odepa.gob.cl).
Quatre régions très contrastées au niveau climatique assurent l'essentiel de la production et permettent un approvisionnement des marchés relativement étalé. Les principales contraintes de l'agrumiculture chilienne sont des contraintes abiotiques dans certaines régions (salinité, calcaire). Par ailleurs la diversité variétale très limitée (oranger: 2 variétés couvrent 95 % ; mandarinier : la clémentine Nules représente 95% des plantations ; la production de citron est assurée par 2 cultivars) constitue à moyen terme une faiblesse certaine de la filière chilienne, en particulier à l'export pour lequel il convient d'étendre les périodes de production et pour lequel les exigences de qualité sont maximales. L'élargissement de la gamme variétale et la sélection de porte-greffe adaptés constituent ainsi des objectifs prioritaires des acteurs de la filière.
Les recherches sur les agrumes au Chili sont menées principalement par les Universités. La faculté d'agronomie de l'Université Catholique de Valparaiso œuvre pour la mise en place d'un schéma de certification. L'Université du Chili (Santiago) travaille sur les citronniers (désordres physiologiques et sélection de variétés aspermes). L'Université Catholique du Chili travaille sur les volets agronomiques et dans le domaine de l'évaluation variétale en collaboration avec le consortium 'Viveros del Valle de Aconcagua'.
2.2. Les partenaires
Le projet devrait associer deux groupes de la PUC (agrumiculture et biotechnologie) le CIRAD/INRA et un partenaire du secteur privé ( consortium des pépiniéristes de l' Aconcagua).
Pontifica Universidad Catolica de Chile ; Departamiento de Fruticultura y Enologia et Departamento de Recursos Naturales; Facultad de Agronomia e lngeneria Forestal
. groupe agrumiculture (personne ressource : Juan Ortuzar)
. groupe biotechnologie (personne ressource : Doris Prehn)
Consortium 'Viveros del Valle de Aconcagua'; (personne ressource: George Escobar) Compte rendu de mission Chili- du 9 au 17 décembre 2001 -P. 0/litrault 5
C1RAD-FLHOR/INRA (personne ressource: Patrick Ollitrault) . C1RAD Montpellier
. SRA de Corse
2.3. Objectifs
Objectif général
Développer un projet d'amélioration variétale permettant de répondre aux contraintes de l'agrumiculture chilienne et aux attentes de son marché en s'appuyant sur les structures et sur les compétences en matière de recherche/développement existant chez les partenaires chiliens et français (recherche et secteur privé).
Objectifs spécifiques
Compte tenu de l'analyse du marché et des contraintes de l'agrumiculture chilienne, le projet visera plus spécifiquement à:
. développer une gamme variétale étendant la période de production des petits agrumes type 'Easy Peelers' sans pépins pour le marché du fruit frais
. obtenir des variétés de citronnier produisant des fruits aspermes
La formation de chercheurs chiliens et les transferts méthodologiques constitueront un objectif important du projet, devant permettre l'émergence d'une compétence chilienne dans le domaine de l'amélioration des espèces fruitières.
2.4. Les activités et la structuration du projet
La mise en place d'un projet de création variétale constitue un engagement sur le long terme, tout particulièrement pour des espèces fruitières comme les agrumes. Afin de pouvoir proposer des produits aux opérateurs de la filière à court, moyen et long terme trois approches seront engagées en parallèle (schémas 1 et 2):
court terme : introduction de matériel caractérisé et sélectionné par les équipes françaises ou des équipes étrangères (Espagne et Italie en particulier), afin d'effectuer des évaluations adaptatives au Chili
moyen terme : mutagenèse induite sur des cultivars au comportement connu au Chili afin de sélectionner des mutants stériles
long terme: création et sélection d'hybrides triploïdes
L'appui méthodologique des équipes françaises concernera principalement le troisième point : sauvetage et sélection d'hybrides triploïdes spontanés (2n gamètes), hybridation diploïdes par tétraploïdes, hybridation somatique, hybridation gamétosomatique.
Le choix des géniteurs et les procédures d'évaluations variétales seront raisonnés conjointement entre les organismes de recherche et les opérateurs privés dans un souci de plus grande efficacité et de transfert rapide des innovations variétales au niveau du développement.
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Certification - sanitaire (consortium) - variétale(PUC) Evaluation qualitative PUC Consortium Validation agronomique PUC Consortium Cultivars aspermes adaptés à la filière chilienne· - · - · --
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· -. DéYeloppements et transferts méthodologiques (CfRALJ/C\l<A. rL CJ - caractérisation moléculaire - sauvetage d 'embryons- embryogenèse somatique
- hybridation somatique - hybridation gametosomatique · -Poptùat-ions d'hybrides triploïdes (CIR,\D L'RA, PCC)
..
Protection Certification..
Multiplication
Valorisation
Collection de cals diploïdes (CTRAD1NRA, PllC) Consortium PUC CIRAD/INRASchéma 1 : Organisation globale du projet de coopération franco/chilien d'amélioration des
agrumes pour la filière chilienne
Pratiquement et pour ce qui implique directement les équipes françaises, les activités à réaliser durant la première phase du projet consisteront en:
1. l'évaluation et la sélection dans les conditions de production chilienne de variétés triploïdes et de porte-greffe tétraploïdes produits et d'ores et déjà présélectionnés par les équipes françaises.
+
le consortium des pépiniéristes est intéressé par une introduction rapide des triploïdes en cours d'évaluation à la SRA (choix sur la base d'une présélection qualitative sur les premières fructifications) afin d'éviter une perte de temps trop importante liée à la période de quarantaine. Certains hybrides diploïdes ('hybrides de Cassin') pourraient également intéresser le consortium.2. la synthèse sur le dispositif du Cirad/Inra et la sélection au Chili de nouvelles populations d'hybrides triploïdes et tétraploïdes répondant spécifiquement aux attentes de l'agrumiculture chilienne:
hybrides somatiques tétraploïdes . hybrides somatiques triploïdes
. hybrides sexués triploïdes (hybridation diploïde x diploïde et diploïde x tétraploïde)
+
la création de ces hybrides devrait être réalisée dans le cadre de séjours de longue durée de jeunes chercheurs chiliens en France. La mise en place d'une thèse en cotutelle sur le développement de l'hybridation gamétosomatique a été envisagée.3. la synthèse au Chili et la sélection d'hybrides triploïdes par hybridation sexuée entre cultivars diploïdes avec l'appui du Cirad/Inra pour certaines phases du programme pour lesquelles les équipements ne sont pas disponibles au Chili (analyse du génome en particulier ; cytométrie en flux et marquage moléculaire).
+
la PUC dispose de parcelles expérimentales associant Clémentinier et Mandarinier 'Fortune' 2 clones autoincompatibles mais interfertiles. Cette situation est très favorable à la production de quantités importantes de semences hybrides sans recours à la fécondation manuelle. Un maximum de petits pépins produits dans ces parcelles seront récoltés en 2003 afin de sauver les embryons in vitro et de sélectionner les hybrides triploïdes. Cette combinaison d'hybride est particulièrement intéressante compte tenu des caractères de 'tardivité' et de qualité de la variété « Fortune ».4. ces travaux s'accompagneront de formations et des transferts de méthodologies, en particulier dans les domaines des biotechnologies (sauvetage d'embryons, embryogenèse somatique, hybridation somatique) afin de permettre à terme aux partenaires chiliens de générer directement les populations d'hybrides répondant aux attentes de leur filière. Ces formations devraient s'effectuer dans le cadre de séjours de chercheurs chiliens dans les laboratoires français.
+
afin d'initier le partenariat, une bourse d'accueil de 2 mois pour Mme Doris Prehn sera sollicitée auprès du CIRAD (formation aux techniques d'embryogenèse somatique, d'hybridationsomatique et de marquage microsatellite ).
+
les laboratoires et l'équipement disponible à la PUC permettent de mener à bien les travaux desauvetage d'embryons et d'embryogenèse somatique. Un complément d'équipement sera en
revanche nécessaire pour aborder des travaux d'hybridation somatique.
2.5. Les sources de .financement et la valorisation
CORFO (Fundo de desarollo e innovation)
Financement de trois à quatre ans (maxi) pour des actions dont les produits s'intègrent directement dans les systèmes de production.
Nouvelles lignes de financement
. appui au transfert d'innovation au niveau des entreprises
. lignes prospectives pour favoriser relations entre participants et négocier la valorisation des produits
Un projet de sélection de nectarines en collaboration avec l'Italie est en cours.
L'évaluation des projets est basée sur les critères techniques et économiques et la participation du secteur privé est essentielle.
Les appels d'offre sortent en décembre pour des concours en mars/avril (début des financements l'année suivante)
� ces fonds paraissent plus adaptés pour soutenir les étapes 3 et 4 du programme d'amélioration ( cf. schéma 2).
� ils peuvent s'enchaîner avec un projet FONDEF afin d'assurer une plus grande pérennité aux financements.
FONDEF
Ces fonds apparaissent les plus adaptés pour engager le projet.
Des contacts ont été pris par nos partenaires chiliens et doivent être renoués durant le printemps afin d'élaborer un projet pour juin 2002.
� Un projet DIPUC doit être rédigé (Doris Prehn) durant le premier trimestre afin d'obtenir des fonds (1 an) pour initier le projet au Chili et formuler le projet FONDEF.
Le projet FONDEF sera présenté pour une durée de 48 mois.
Titre envisagé: 'Desarollo de nuevos cultivas de mandarinas y limoneros de alta cualidad' Mots clefs : Citricos, Mejojamiento Genetico, Biotechnologia
� Rédaction du projet : Doris Prehn et Patrick Ollitrault (pour état de la science en particulier)
Ambassade de France
L'attachée scientifique et technique a manifesté de l'intérêt pour le projet. Toutefois les budgets 2002 étant déjà engagés, un soutien sur 2002 ne peut être proposé pour l'instant. L'ambassade conseille de reprendre contact durant l'été au cas où certaines actions inscrites au budget n'aient pas été réalisées .
. bourses d'études en France FONDEF/ambassade de France - 1 mois tout niveau et tous frais couverts
- 1 an de formation 3eme cycle (coût inscription, assurance, 3000 FF/mois)
Ces bourses viennent en appui de projets FONDEF préexistants. � à solliciter en cas de succès du dossier FONDEF.
Str atégi e 1: Créa t io n et sé lection de c u ltiva rs triploïdes Germ oplasme initial: Synthèse de populations triplol'des PUC-Cirad/lnra Etape 1 Activités Croisements (8 mois) Sa uvetage d'em br yons Id entifica tion des triplo l'des Premier greffage Aclimatation Développement et transfert de nouvelles méthodologies Durée 2 ans Populations d'hybr ides ju véniles. Consortium Citrlculture PUC Biotec. PUC Etape 2 Act ivités: Second greffage (5 mois) Plan tation 1 zone (6 ans pou r 1 ere floraison) Essais sur la juvénilité Evaluation qualitative et présélection
Populations d'hybrides product
ifs Consortium Citriculture PUC Mise en place : bloc de 2-3 plantes Durée 6-8 ans Etape 3 Act ivités: troisième greffage Plan tation : 1 zo ne Cultiv ars triplo ïdes pre comm erciaux. Consortium Citric. PUC (2 ans pour 1 ere fructification) Eval. Stéril ité gamétique Eval. fructification Caractérisation et sélection Greffage Mise en place : bloc de 6 plantes Culti vars comm erciaux Consortium PUC Etape 4 Activités: Plantation : 2 zonas, blocs de 10 0 plantes/Jfgnée (2 ans pour fructifi cation) Evaluation 3 ans Essais mise en marché Sélection définitive Durée 6-8 ans
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oo.oo •r · i .. T t:!rOps a vant di ffusi on co mmerc,ale An née -18 : -24 An née -1 6 /-22 Str atégi e 2: Mut agenèse indu ite sur b ou r g e o n s de cu l t i vars comm erc iaux Activités : Irradiation 100 0 bagu ettes Surgreffage Evaluation floraisons et fructif ication Sélection (environ 2%) Biotec. y Cl tric. PUC-Consortium A11 née -10 / -1· , An née -6/ -8 Depuis Cirad/lnra Depuis Italie S t ra tégi e 3 : Eva l ua t ion de l'adaptat ion au cont exw ch ilien de cult ivars é t r a n g e rs Activités : Introductio n de variétés (France, Italie) Quarantaine, indexation, greffage Citric ultura PUC-Consortium Schéma 2: Activités et chronogramme du program me d' amélioration des agrumes au Chili. Compte rendu de mission Chili-du 9 au 17 décembre 2001 -P . 0/litrault 10 An née O. projets ECOS ( dépendant du CONICYf)
Financements sur trois ans de projets communs de recherche prenant en charge l'ensemble des échanges internationaux (+ frais d'accueil des chercheurs chiliens en France)
- possibilité de financement de thèse de Chilien en co-tutelle - possibilité de financement de post-doc français au Chili
Les projets ECOS peuvent être adossés à des projets FONDEF et permettent dans ce cadre le renforcement des activités amonts.
Pas de possibilité de financement avant 2003.
� projet à monter sur le volet biotechnologie du programme global d'amélioration des agrumes .
. Programme de bourses doctorales - pour des chiliens en France
- financements de 4 ans (DEA + thèse)
En conclusion la mise en œuvre d'un projet FONDEF paraît essentielle pour bâtir le projet sur des bases solides. Il pourra ensuite être renforcé d'une part par un projet ECOS ou/et une bourse doctorale sur les volets amont et d'autre part par un projet CORFO pour la validation et la valorisation des produits de la recherche. Il convient d'établir en parallèle du projet FONDEF une convention tripartite entre le CIRAD/INRA, la PUC et le consortium des pépiniéristes précisant les règles de propriété intélectuelle et de valorisation des différents produits de ce projet Il a été convenu que les équipes françaises feraient une proposition dans ce domaines avant la fin du premier semestre 2002.
3. La faculté d'agronomie de l'Université Catholique de Valparaiso (annexe 2) 3.1. Activités et organisation
La faculté d'agronomie accueille environ 650 élèves. Elle délivre le grade de licencié en agronomie et le titre d'ingénieur agronome. Elle est spécialisée dans le domaine de l'horticulture, de l'arboriculture fruitière et de l'élevage. Elle dispose d'un domaine expérimental de 60ha.
Les travaux réalisés à la Faculté d'agronomie sont structurés pour partie suivant une approche filière pour laquelle les expérimentations concernent essentiellement l'adaptation au contexte local:
département maraîchage
Pour filières légume frais et transformation .
. évaluation variétale (tomate industrielle en particulier)
. sélection conservatrice (production semencière ; piment, tomate, melon ... ) . culture hors sol
département arboriculture fruitière
Fruitiers tempérés et subtropicaux: essentiellement . problèmes de pollinisation (annonaceae en particulier) . taille de production (fruitiers subtropicaux)
. vergers haute densité (avocatier, agrumes, chirimoya, néflier)
. fruitiers tempérés : fatigue des sols, essai porte-greffe, adaptation climatique, phénologie (amandier, pommier, cerisier, kaki, kiwi et vigne)
département floriculture
. production hors sol (chrysanthème, œillets, roses, glaïeuls ... ) . fertilisation, taille, contrôle des problèmes sanitaires
département élevage et prairies
. études d'écosystèmes pastoraux de la zone méditerranéenne du Chili . analyse des systèmes caprins de la région méditerranéenne du Chili . classification des écorégions
. organisation ecologico-administrative du territoire
Par ailleurs trois départements ont un rôle transversal. département de phytopathologie
. contrôle intégré du chancre bactérien de la tomate . programme de certification des agrumes
. étude du phytophthora de l'avocatier
. maladies fongiques de l'ail
département d'entomologie . contrôle biologique
. traitement de quarantaine pour l'exportation des fruits (chirimoya, ra1sm de table, clémentine, tomates)
. insectes pollinisateurs des chirimoyas
département post-récolte et transformation
. détermination de l'indice de maturité des principaux cultivars (avocatiers, chirimoya) . influence des facteurs pré-récolte sur la conservation
. conditionnement, emballage et conservation des fruits et légumes . transformation ( citron, avocat, chirimoya ... )
Trois laboratoires assurent principalement des activités de routines laboratoire de phytopathologie
. diagnostique des maladies fongiques et bactériennes . essai de nouveaux produits chimiques
.Essai de nouveaux produits chimiques
. traitement contre le chancre bactérien (tomate)
. test ELISA et détection des viroïdes des agrumes (programme de certification)
Laboratoire de micropropagation
. multiplication de porte-greffe d,agrumes et d,espèces ornementales et florales . microgreffage de méristème d,agrumes (assainissement )
Laboratoire d'analyse de sols et d'analyse foliaire . caractéristiques physicochimiques et hydriques des sols . qualité de l'eau
. analyses de maturité des fruits . analyses foliaires
La faculté dispose par ailleurs d'un département de formation et vulgarisation à l'attention des opérateurs des différentes filières concernées.
3.2. Possibilités de collaboration avec le programme arboriculture fruitière du CIRAD
La faculté développe des approches très pragmatiques. L'essentiel de ses expérimentations a pour objet l'adaptation au contexte chilien d'espèces ou de techniques exogènes.
Dans le domaine de l'arboriculture fruitière l'essentiel des travaux porte sur des espèces tempérées ou subtropicales sur lesquels le programme ARF du Cirad est très peu présent. Pour ce qui concerne les agrumes, la faculté d'agronomie joue un rôle important pour la mise en place d'un schéma de certification au Chili (laboratoire de phytopathologie et laboratoire de micropropagation) et est en relation avec le consortium des pépiniéristes de l' Aconcagua pour la quarantaine à l'introduction de nouveaux cultivars (sous-traitance). Elle pourrait dans ce cadre être associée de manière indirecte (via le consortium) au projet de création/sélection variétale.
Par ailleurs, le département 'Post récolte et transformation, a manifesté de l'intérêt pour les nouvelles méthodologies de production de jus qu,il souhaiterait pouvoir expérimenter pour le citron.
LISTE DES ANNEXES
ANNEXE 1 : Diagnostique pour la mise en œuvre d'un programme de
sélection variétal d'agrumes ; document rédigé par
D. Prehn et L. Ortuzar suite à la mission de P. Ollitrault.
ANNEXE 2 : Plaquette de présentation de la faculté d'agronomie de
l'Université catholique de Valparaiso (Universidad catolica
de valparaiso - Facultad de Agronomia).
ANNEXE 3 : Organismes visités et personnes rencontrées.
ANNEXE 4 : Calendrier de la mission.
ANNEXE l
Diagnostique pour la mise en œuvre d'un programme de sélection variétal d'agrumes ; document rédigé par D. Prehn et L. Ortuzar suite à la mission de P. Ollitrault.Diagnostico para la lmplementacion
de un Programa de Desarrollo Varietal de Citricos
1. Introduccion
La formulacion de un programa para el mejoramiento genético de citricos responde a la necesidad por comenzar el desarrollo varietal en Chile con el fin de incrementar la competitividad del sector fruticola y cumplir con las demandas de un mercado en franca expansion. Asi por ejemplo, el valor exportado de limones aumento de 10 millones US $ FOB en 1997 a 16 en 2001, al igual que el de mandarinas que de 1,5 millones US $ FOB en 1997 llego a 7 millones en 2001 (www.odepa.gob.cl).
Los criterios de mejora varietal en citricos varian dependiendo de los objetivos de produccion. El procesamiento industrial requiere cultivares altamente productivos con un buen porcentaje de jugo y contenido de azucar en la fruta. La industria de fruta fresca promueve las cualidades organolépticas como aroma, sabor, acidez y caracteristicas pomologicas. Estas se refieren a facilidad de pelar los frutos, ausencia de sernillas, color, apariencia de la corteza y otras. El desafio del fitomejoramiento consiste en desarrollar un amplio rango de variedades capaces de ajustarse a las diversas necesidades. Agronomicamente, la extension del periodo de produccion es una prioridad en todos los programas de mejoramiento, siendo también importante la resistencia a enfermedades. La ausencia de semillas es un criterio principal para el mercado fresco de citricos por lo que la generacion de plantas estériles tiene un potencial interesante. La condicion triploïde (presencia de tres complementos cromosomicos) genera esterilidad debido a la presencia de gametos disfuncionales producto de irregularidades en la meiosis. En citricos existen varias estrategias para producir individuos triploïdes, una estrategia consiste en la investigacion de triploïdes espontaneos por medio del cultivo de embriones presentes en semillas pequefias de fruta madura. Otra se basa en la irradiaci6n de brotes y en la generacion de esterilidad por mutagénesis inducida por radiacion gamma.
La implementacion de un programa de mejoramiento genético de citricos es un proyecto de largo plazo que requiere de la colaboracion de los diferentes agentes involucrados en el desarrollo de la citricultura. Se ha coordinado la visita a Chile del Sr. Patrick Ollitrault, investigador del el centro de investigacion francés Cirad, con el proposito de establecer colaboraciones para la formulacion de proyectos de investigacion y transferencia tecnologica que abordan el programa de mejoramiento en sus diferentes etapas. En el
presente informe se entrega un diagn6stico para la implementaci6n de un programa de desarrollo varietal de citricos.
2. ldentificacion del Problema
Pese a que Chile es el principal productor de frutas del hemisferio sur, carece de selecciones 6 variedades vegetales propias, lo que implica que hasta ahora se realiza la adquisici6n, evaluaci6n y posterior multiplicaci6n de materiales forâ.neos, con un costo por concepto de propiedad intelectual que debe ser cancelado al obtentor de la variedad. Esta situaci6n es desfavorable no tan solo por el costo adicional sino porque genera una dependencia de fitomejoradores y genetistas extranjeros, siendo las selecciones importadas no necesariamente las mas adecuadas para nuestro pais. Al mismo tiempo, se esta haciendo un pobre uso del material genético que ya se encuentra aclimatado a las condiciones nacionales.
La gran posibilidad de desarrollo de los frutos citricos en el mundo y principalmente para satisfacer los exigentes mercados asiâ.ticos y norteamericanos obliga a los productores chilenos a contar con variedades y selecciones de alta calidad en términos productivos, organolépticos y que satisfagan los gustos del publico demandante. Ademas, se vislumbra una necesidad por tipos de frutos ex6ticos, con diferencias en apariencia ( coloraci6n extema, forma) y calidad interna superior (alto contenido vitaminico, sabor diferente a lo comun).
Hoy, gracias a la existencia de nuevas herramientas biotecnol6gicas es posible realizar cruzamientos dirigidos, hibridaciones somâ.ticas y otro tipo de manejos genéticos, para la obtenci6n de nuevas variedades, a partir de material local y/6 importado, con objetivos claros y definidos, ya que es posible lograr la selecci6n e identificaci6n de genes que confieren caracteristicas especificas. En el presente informe se estudian las diferentes altemativas disponibles para implementar un sistema de producci6n varietal eficiente.
3. Objetivos
Objetivo General: evaluar la factibilidad de establecer un programa de mejoramiento genético para citricos en Chile.
Los Objetivos Especificos son los siguientes:
1. Evaluaci6n de las metodologias disponibles actualrnente para la obtenci6n de nuevas variedades de citricos.
2. Desarrollo de un protocolo para la implementaci6n de un programa de mejoramiento genético en Citricos.
3. Adiestrarniento en cultivo in vitro de citricos e implementaci6n de la técnica de rescate de embriones triploïdes en el Laboratorio de Biotecnologia de la Facultad de Agronomia e Ingenieria Foresta} de la PUC.
4. Metodologia
Para lograr los objetivos se emple6 la siguiente metodologia de trabajo:
Recopilaci6n y estudio de antecedentes bibliograficos existentes sobre la meJora genética de citricos.
- Organizaci6n de un Seminario presentado por el Dr. Patrick Ollitrault en el cual se expusieron las nuevas biotecnologias utilizadas por el Cirad para la mejora genética de citricos.
- Se sostuvieron reuniones de trabajo con el especialista Sr. Patrick Ollitrault de Cirad Flohr (Francia), el profesor de Citricultura de la Facultad de Agronomia e Ing. Foresta! de la PUC, Sr. Juan Ortuzar, el gerente del Consorcio de Viveros Aconcagua, Sr. Jorge Escobar, y quien escribe, con el fin de establecer las bases de una cooperaci6n para el desarrollo de un programa de mejorarniento genético de citricos en Chile.
- Se sostuvo una reuni6n con el Sr. Javier Herreros, ejecutivo de proyectos del Fondo de Desarrollo e Innovaci6n (CORFO) para estudiar una fuente de financiamiento para un proyecto de mejoramiento genético. Adicionalmente, se estudiaron las bases de los fondos de financiamiento FONDEF y ECOS.
- Se visitaron las instalaciones de laboratorio de biotecnologia e invemaderos de la PUC y se evalu6 su adaptaci6n para la implementaci6n de las nuevas tecnologias utilizadas en el mejoramiento de citricos.
- Se efectuaron reuniones y talleres de laboratorio para demostrar la técnica de rescate de embriones, identificaci6n de semilla con potencial triploïde y cultivo de 6vulos para establecimiento de un sistema de clonamiento por embriogénesis somatica.
En forma adicional el Dr. Ollitrault participé en actividades organizadas por el Consorcio de Viveros Aconcagua que consistieron en:
- Salidas a terreno con el fin de observar huertos y condiciones de producci6n de citricos en la zona central de Chile.
- Visita de las instalaciones del Programa de Certificaci6n de Citricos de La Facultad de Agronomia de la Universidad Cat6lica de Valparaiso en Quillota.
- Reuniones de trabajo con los socios del Consorcio para explicar los objetivos del proyecto.
5. Desarrollo y Resultados
A continuaci6n se presentan los diferentes temas desarrollados para cada uno de los objetivos especificos.
5.1. Objetivo 1: Evaluacion de las metodologias disponibles actualmente para la obtencion de nuevas variedades de citricos.
5.1.1 Estrategias de mejoramiento desarrolladas por CIRAD
La ausencia de semillas es un criterio principal para el mercado fresco de citricos por lo que la generacion de plantas triploïdes tiene un potencial interesante. Actualmente existen tres estrategias para el desarrollo de individuos triploïdes desarrolladas por Cirad-flohr e Inra (Francia). Estas estrategias requieren del apoyo de herramientas biotecnologicas. La primera estrategia consiste en la investigacion de triploïdes espont:aneos en variedades de mandarina (Clementina) por medio de rescate de embriones presentes en semillas pequefias de fruta madura. La segunda estrategia emplea la hibidacion somatica de alotetraploides para una posterior hibridacion con diploïdes, y, en la tercera estrategia se generan triploides por medio de la fusion de protoplastos haploïdes y diploïdes. Las plantas regeneradas, los embriones y el callo son estudiados por citometria de flujo y mediante analisis isoenzimatico para establecer el nivel de ploidia y el origen de los genomas nucleares.
5.1.2 Antecedentes bibliograficos sobre metodologias de mejora varietal
Las restricciones en el sistema de propagacion, la duracion de la fase juvenil, el tamafio de las poblaciones segregantes y el escaso conocimiento sobre el control genético de la mayoria de las caracteristicas que determinan el valor agronomico, son aspectas que limitan el desarrollo de un esquema de mejoramiento basado en el avance generacional. Por este motivo los fitomejoradores de citricos utilizan la propagacion vegetativa y se limitan a la seleccion de clones promisorios. De esta manera, los esfuerzos de mejoramiento se concentran en técnicas que permiten investigar o inducir variabilidad genética dentro de un ciclo de propagacion.
El mejoramiento de citricos se basa en la seleccion de mutantes o quimeras, espontaneas o inducidas por mutagénesis, o en la identificacion de genotipos promisorios obtenidos mediante hibridacion o procesos biotecnologicos.
5.1.2.1 Seleccion de clones mutantes y quimeras
La seleccion de mutaciones espontaneas es el método de mejoramiento mas antiguo. En Espafia, Marruecos y Corcega se han tenido buenos resultados en Clementina al extender el periodo de produccion y aumentando el tamafio de la fruta o su color. En Japon se han obtenido resultados similares para la mandarina Satsuma. En una escala de tiempo mayor, las mutaciones espontaneas también son responsables de la diversificacion de naranjas, limones y pomelos.
Mutaciones presentes en las células meristematicas apicales pueden llevar a la formacion de quimeras. Algunos pomelos rosados y rojos, la naranja Shamouti y algunas naranjas no acidas corresponden a quimeras periclinales. Las quimeras variegadas son de interés para el mercado de plantas ornamentales.
A contar de 1935 se ha efectuado una gran cantidad de experimentos con mutagénesis inducida por irradiaciones. Esta técnica ha permitido obtener cultivares sin semilla y una serie de mutantes coloreados tales como el pomelo rojo Ruby Star.
Algunos estudios han investigado variaci6n somaclonal. La investigaci6n se refiere principalmente a tolerancia a la salinidad mediante selecci6n in vitro ejercida sobre callo nucelar.
5.1.2.2 Hibridaciém sexual
Los programas mas importantes de mejoramiento varietal por medio de hibridaci6n se efectuaron por el USDA en Florida. Sus objetivos fueron investigar la resistencia a enfermedades y frio. El uso de P. Trifoliata como fuente de resistencia al füo no result6 en cultivares comestibles porque estas especies producen hibridos con un alto contenido de aceites esenciales. Algunos hibridos de Poncirus x Citrus desarrollaron buenos portainjertos, algunos citrumelos (Poncirus x pomelos) y sobre todo las citranges Troyer y Carrizo (Poncirus x orange).
Se ha obtenido buenos cultivares como resultado de la selecci6n entre hibridos de pomelo y mandarina (tangelos). Algunos hibridos de mandarina también han sido interesantes (Fairchild, Fremont, Fortune, Wilkin, Honey y otros).
5.1.2.3 Poliploidizaci6n
Casi todos los Citrus y géneros relacionados son diploides. Desde 1950, los estudios de poliploidizaci6n se han empleado para el mejoramiento de Citrus. El objetivo es obtener cultivares triploïdes tales como la lima Tahiti, que es un triploide natural. Estos triploides fueron buscados entre diploïdes y autotetraploides espontâ.neos sin embargo, el estrecho espectro de padres tetraploides ha reducido la eficacia de estos estudios. Los triploides también han sido investigados en la descendencia proveniente de cruces triploides o regenerados in vitro a partir de endosperma. Algunos cultivares triploïdes comerciales han resultado de estos programas. Los principales son los hibridos de pomelo Melogold y Oroblanco. En 1994 se seleccionaron tangors con interés comercial. Esta estrategia es promisoria para la diversificaci6n de los citricos faciles de pelar y del tipo mandarina.
5.1.2.4 Métodos Biotecnol6gicos
El desarrollo de técnicas de biologia molecular y celular mejora la efectividad de los programas convencionales de mejoramiento y permite explotar nuevas vias de mejoramiento.
Marcadores bioquimicos y moleculares
Los primeros marcadores genéticos estudiados en citricos fueron las isoenzimas ( o isozimas ). Quince sistemas enzimâ.ticos, representando veinte loci pueden son actualmente analizados en forma rutinaria utilizando hojas o corteza. Mas recientemente, se han desarrollado las técnicas RFLP, RAPD y microsatélites. En el contexte de mejoramiento varietal estos marcadores tienen aplicaci6n en la investigaci6n del origen de plantas obtenidas mediante hibridaci6n somâ.tica o sexual, como también en la caracterizaci6n
varietal, el mapeo de genomas para la identificaci6n de genes utiles y la selecci6n de caracteristicas asistida por marcadores.
Las isoezimas son usadas comunmente para diferenciar plantas de origen cig6tico y nucelar. Esta técnica es particularmente eficiente para genotipos con un alto grado de heterocigosidad. También ha sido beneficioso para el analisis de la tasa de apomixis en diferentes portainjertos y para la selecci6n de plantas cig6ticas en los programas de hibridaci6n que involucran cultivares de semillas poli-embri6nicas. La aplicaci6n de PCR con partidores mini o microsatélites permite identificar genotipos de baja heterocigosidad. El polimorfismo enzimatico es util en programas de biologia celular para determinar el origen del callo embriogénico obtenido por cultivo de 6vulos o para verificar el origen de plantas regeneradas mediante fusiones somaticas. La técnica RFLP ha sido aplicada también para este prop6sito. Resulta particularmente util en programas que practican fusiones asimétricas y para identificar cibridos con la ayuda de sondas citoplasmaticas.
Varios mapas de genomas de citricos basados en isozimas, RFLP y RAPD han sido publicados. Estos estudios permitieron la localizaci6n del gen de inmunidad a tristeza en el genoma de Poncirus y del gen de enanismo en el Poncirus Flying Dragon. En el largo plazo, los genes localizados mediante marcadores podran ser aislados y utilizados en ensayos de transformaci6n genética.
Citometria de Flujo
La técnica de citometria de flujo fue desarrollada en citricos para evaluar el tamafio de los genomas nucleares y el nivel de ploidia. Su principal aplicaci6n se refiere al estudio de los niveles de ploidia en plantas que se generan de semillas o de fusiones somaticas. Corno esta técnica puede ser implementada en forma expedita, realmente facilita el estudio de eventos de poliploidizaci6n espontaneos o inducidos. La citometria de flujo es una técnica complementaria a las isozimas y al RFLP que, por su parte, son excelentes marcadores de recombinaci6n sexual.
Rescate de Embriones
Ocasionalmente se usa esta técnica para la obtenci6n de plantas hibridas desde una madre poliembri6nica y también se emplea para el rescate de plantas poliploides. Plantas triploïdes se obtienen por fertilizaci6n de cultivares mono-embri6nicos diploïdes con polen de tetraploides. También se obtienen triploïdes cultivando embriones inmaduros aislados tres a cuatro meses después de la floraci6n o a partir de embriones provenientes de semillas mal desarrolladas en frutos maduros. Por otro lado, se generan tetraploides espontaneos por doblamiento del complemento cromos6rnico somatico de embriones de semillas pequefias presentes en frutos de cultivares poliembri6nicos. Similarrnente, es posible encontrar triploïdes espontaneos en semillas pequefias de cultivares monoembri6nicos.
Embriogénesis Somatica
La embriogénesis somatica de los genotipos poliembri6nicos en citricos ha sido estandarizada desde 1970. Los ejemplos de embriogénesis somatica son raros en especies monoembri6nicas y las plantas regeneradas muchas veces presentan caracteristicas aberrantes. Se ha observado algunos casos de variaci6n somaclonal en plantas regeneradas Compte rendu de mission Chili-du 9 au 17 décembre 2001 -P. Ollitrault 20
desde callo embriogénico de callos poliembri6nicos. Las lineas de callo embriogénico son subcultivados cada mes o preservados en nitrogeno liquido y constituyen el material de base para el desarrollo varietal. El callo embriogénico ha sido usado en programas de mutagénesis para disminuir la formaci6n de quimeras. La aplicaci6n de presiones de selecci6n sobre callo irradiado ha permitido la regeneraci6n de plantas con una mayor tolerancia salina y para la toxina del Mal Secco.
Haploidizaci6n
Existen pocos estudios en este tema. Puede ser de interés generar fusiones entre protoplastos haploïdes y diploïdes o para generar familias de dobles haploïdes para cartografia gen6mica. La haploidizaci6n parece ser dificultosa, sin embargo se ha reportado éxito en el cultivo de anteras.
5.1.2.5 Literatura Consultada
Cottin R. SRA INRA-CIRAD. 1997. Citrus of the World: A Citrus directory. SRA INRA-CIRAD. Centre de Corse, France. 64 pp.
Grosser, J; Ollitrault, P. Y O. Olivares-Fuster. 2000. Invited review: Somatic hybridazation in citrus: An effctive tool to facilitate variety improvement In vitro Cell. Dev. Bio.-Plant 36:434-449.
Luro, F., F. Laigret, J:M: Bové y P. Ollitrault. 1995. DNA amplified Fingerprinting, a useful tool for determination of genetic origin and diversity analysis in Citrus. HortScience 30(5): 1063-1067.
Ollitrault, P. 1992. Research of seedless "Willow Leaf Mandarin" (Citrus deliciosa) by in vitro gamma
irradiation ofnucellar calli. Proc. Int. Soc. Citriculture. V l : l l3-l l6.
Ollitrault, P y N. Michaux-Feriere. 1 992. Application of flow cytometry for citrus genetic and breeding. VII International Citrus Congress. Italy, v. l
Ollitrault, P y F. Luro. 1 995. Amélioration des agrumes et biotechnologie. Fruits, 50:267-279.
Ollitrault, P; Dambier, C. Jacquemond, V. Allent y F. Luro. 1996. In vitro rescue and selection of spontaneous triploids by flow cytometry for easy peeler citrus breeding. Proc. Int. Soc. Citriculture, v 1 :254-258.
Ollitrault, P y F. Luro. 1996. Production of haploid plants and embryogenic calli of Clementine (Citrus reticulata Blanco) after in situ parthenogenesis induced by irradiated polen. Porc. Int. Soc. Citriculture. 2:913-917.
Ollitrault, P; Dambier, D.; Sudahono; F. Mademba-Sy; Vanel, F.; Luro, F. y B. Aubert. 1998. Biotechnology for triploid mandarin breeding. Fruits, 5 3 :307-3 17.
Ollitrault, P; Dambier, D.; Y. Froelicher, F. Bakry y B. Aubert. 1998. Rootstock breeding strategies for the mediterraneum citrus industry; the somatic hybridization potential. Fruits, 53 :335-3344.
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Ollitrault, P; Dambier, D.; Y. Froelicher, F. Carreel, A. D'Hont, F. Luro S. Bruyere, C. Cabasson, S. Lofty, A. Joumaa, F. Vanel, F. Maddi, K. Treanton y M. Gtisoni. 2000. Apport de l'hybridation somatique por l'exploitation des ressources génétiques des agrumes. Ressources génétiques. Cahiers Agricultures. 9:223-36. Compte rendu de mission Chili- du 9 au 17 décembre 2001 -P. Ollitrault 21
Reuter W., Batchelor, L.D. y H.J. Webber. 1968. The Citrus Industry; Volume II. University of California, Division of Agricultural Science. 398 pp.
5.2 Objetivo 2: Desarrollo de un protocolo para la implementacion de un programa de mejoramiento genético en citricos.
Un programa que permita la producci6n de nuevas variedades de citricos adaptadas a las condiciones chilenas de producci6n es una iniciativa compleja que requiere de una estrecha colaboraci6n entre centres de investigaci6n y el sector productive. En el Cuadro 1 se presenta un esquema que relaciona el Centro de Investigaci6n francés CJRAD con la P. Universidad Cat6lica y, a su vez, con el Consorcio Viveros A.. En el Cuadro 2 se resumen las actividades a realizar dentro del marco de un convenio. El esquema establece una pauta de referencia para el intercambio de material vegetativo, el derecho de propiedad intelectual, la generaci6n de patentes y la participaci6n relativa de cada uno de los integrantes.
Dado que un programa de mejoramiento necesariamente se proyecta en el largo plazo, su desarrollo debe abordarse por etapas, con objetivos de corto y mediano plazo, y mediante diferentes estrategias de mejoramiento. En el Cuadro 3 se exponen tres estrategias para la obtenci6n de variedades comerciales mejoradas y adaptadas a las condiciones chilenas. La estructura del programa se basa en el desarrollo de poblaciones triploïdes estériles para la generaci6n de variedades sin semilla (Estrategia 1). Esta estrategia permite sentar las bases para el desarrollo de investigaci6n pertinente en Chile y la transferencia tanto de tecnologia como de germoplasma inicial desde Francia. La generaci6n de nuevas variedades mediante esta via tiene una duraci6n de 16 a 20 afi.os, siendo una de las principales limitantes el largo periodo de juvenilidad de los citricos (6 afios). En el flujo de actividades se reconocen cuatro etapas, siendo la primera etapa de investigaci6n basica y las consecutivas de evaluaci6n y selecci6n de plantas de interés. Los criterios de selecci6n para las distintas etapas son: presencia de fruta sin semilla y facilidad de pelar (Etapa 2); Calidad de fruta, producci6n, época de maduraci6n y esterilidad gamética (Etapa 3); Evaluaci6n agron6mica, salida de postcosecha y mercado (Etapa 4).
La Estratégia 2 persigue inducir esterilidad gamética en cultivares comerciales mediante mutagénesis por irradiaci6n. Esta via perrnite ingresar el material vegetativo al final de la Etapa 2 lo cual significa un ahorro de tiempo cercano a 6 afi.os (ver el flujo en el Cuadro 3). Esta altemativa requiere evaluar una gran cantidad de brotes (minimo 1000 por variedad) para lograr material de interés dado que las mutaciones inducidas son aleatorias. Es necesario ademas, contar con plantaciones preestablecidas de portainjertos en una superficie que se estima en varias hectareas, que serian destinadas unicamente a la evaluaci6n de plantas.
La Estrategia 3 consiste en introducir variedades desde el extranjero que se encuentran en distintas etapas de desarrollo (Francia e Italia) y estudiar su adaptaci6n a las Compte rendu de mission Chili- du 9 a11 17 décembre 2001 -P. Ollitrault 22
condiciones locales de producciôn. Esta via es la mas rapida, permitiendo la obtenciôn de variedades adaptadas en un periodo de 6 a 8 afios.
El financiamiento de las diferentes etapas requiere de la formulaciôn de proyectos, tanto de concursos publicos como de aportes privados e institucionales.
la inducci6n de mutagénesis mediande irradiaci6n de brotes (tiempo de generacién 10-14 afios) y la introduccién de variedades comerciales seguidas de estudios de adaptacién (tiempo de generaci6n 6afios). Técnicamente, las limitantes mayores del programa son el largo periodo de juvenilidad de los citricos (6 afios) que posterga las primeras evaluaciones de frutos y la necesidad de efectuar sucesivos injertos para evaluar el material genético. Otra limitante es la inmovilizaci6n del terreno destinada a los ensayos, que en caso contrario seria destinado a producci6n. En el aspecto financiero, las limitantes se concentran en el corto periodo (3-4 afios) de duraci6n de los proyectos concursables y en la dificultad de acceso a los fondos nacionales dada la naturaleza del programa y la importancia relativa de los citricos dentro de la fruticultura nacional, at'.m cuando las exportaciones se encuentran en fuerte expansion. El acceso a las distintas altemativas de financiamiento se veria fortalecido con la existencia de un Convenio de Colaboracién entre el sector productivo y de investigaci6n que, por un lado regula y estructura el programa, asegura continuidad en el tiempo y es testimonio de la seriedad del compromiso de las instituciones participantes.
Una vez resuelto el financiamiento y contando con el apoyo de CJRAD, los productores nacionales y la Universidad es altamente factible desarrollar un Programa de Mejora Varietal de Citricos que sea exitoso y eficiente. Este diagn6stico se basa en la capacidad de organizaci6n que se advierte en el Consorcio Viveros del Valle del Aconcagua, en un expedito acceso a tecnologia genética de punta y en la capacidad e infraestructura biotecnol6gica disponible. Del mismo modo, la vasta experiencia, el especial interés y apoyo de los productores citricolas nacionales se presentan como garantes indispensables del proceso.
Cuadro 1: Proyecto Marco de Colaboracion.
/
Facultad de Agronomfa e lngenierfa Foresta!, Pontificia Universidad Cat61ica de Chile. Coordinadores:Doris Prehn, Biotecnologfa Juan Ortuzar, Citricultura Cirad/lnra
Estaci6n SRA. Research Agronomique, San Guiliano C6rcega. Coordinador: Patrick Ollitrault, lnvestigador
Consorcio de Viveros Aconcagua
Coordinador:
Jorge Escobar, Gerente
Cuadro 2: Estructura de la colaboraci6n y actividades de las instituciones
pa,rticipantes. Material vegetal chileno Certificaci6n: Sanitaria (Consorcio) Varietal (PUC) Mutagénesis (PUC)
Evaluaci6n cualitativa (PUC, Consorcio) Validaci6n agron6m ica (Consorcio)
Cultivares sin semilla adaptados a la industria chilena
Callo, semillas, hlbridos
Desarrollo y transferencia de metodologfas (Ci rad, PUC):
Caracterizaci6n molecular Rescate de Embriones Embriogénesis somatica Hibridaci6n somâtica Hibridaci6n gametosomâtica Poblaci6n de triploïdes (PUC,Cirad Consorcio) Protecci6n Certificaciôn
Compte rendu de mission Chili- du 9 au 17 décembre 2001 -P. 01/itrault
Material vegetal francés Colecci6n de diploïdes, tetraploides y callos (Cirad/PUC) Multiplicaci6n Valorizaci6n Propiedad intelectual 24
Cuadro 3: Propuesta para un Programa de Mejoramiento Genético de Ci tricos en Chile. Est ra tegia 1: Mejora ge nética de ci tr icos a través de la generaci6n de poblaciones t ri p l oïdes estér iles. Germ oplasma inicial: Generaci6n de poblaciones triploides Biot ecnologia PUC -Cirad Etapa 1 Ac tlvidades: Cruzami entos (8 meses) Rescate embriones ldentificaci6n triploides lnjertaci6n 1 Aclima taci6n Desarr . nue vas técnicas de investig . y diag n6stico Duraci6n 2 alios Poblaci6n hibrido s juvenile s. Consorcio Citr icultura PUC Bio tec. PUC Etapa 2 Ac tividades: lnje rtaci6n 2 (5 meses) Plantaci6n 1 zo na (6 alios para floracl6n) Ensayos juvenilidad Evaluaci6n pres elecci6n Establec . Banco 2-3 plantas Duraci6n 6-8 alios Poblaci6n de hlbridos de pro ducci6n. Consorcio Citr icul tura PUC Cul tiv ares triploides pre
comerciales. Consorcio Citric.
PUC Etapa 3 Ac tividades : lnjertaci6n 3 Plan taci6n 1 zo na (2 aiios para fr uctificaci6n) Eval. esteri lidad gamé tica Eval. fructif icaci6n Caracterizac i6n y Selecci6n lnjertaci6n Establec. Banco 6 plantas Duraci6n 4-6 aiios Cu ltiv ares de alto im pacte
comercial. Consorcio PUC
Etapa 4 Acti vidades: Plan taci6n 2 zon as,, uerto 10 0 plantas c/l fnea (2 alios para fructificac i6n) Evaluaci6n 3 aiios Selecci6n de finitiva Duraci6n 6-8 aiios
l
l
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i
� Tiempo Ano 2 Ano 6-8 Est rat eg1 a 2: Mejora genét ica de ci tricos a trav és de mutagénesis in ducida en cu l t i var e s comerc i al e s Actlvldades: lrradlaci6n 100 0 broies lnjertaci6n plantaciones existentes Evaluaci6n flo racl6n y fruc tificacl6n Selecci6n 2% Blotec . y Ci tri c.PUC -Consorcio Comp te rendu de mission Chili -du 9 au 17 dé cembre 2001 -P . Ollitrau/t Ano 10 -14 Af io 16 -20 desde Cirad desde ltalia Estr ateg 1a 3 : Mejora genética de c î t ri c o s a travès d in t roducci6n de material y estudio de adapt aci 6n varietal Act ivldades: lntrod ucci6n varietal (Francia 5 plantas, ltalia 80-10 0 plantas) Cuarentena, indexaje, reinjertaci6n Citric ultur a PUC-Consorclo 255.3 Objetivo 3: Demostraci6n y desarrollo practico de una técnica para el rescate de embriones triploïdes en el Laboratorio de Biotecnologia de la Facultad de Agronomia e Ingenieria Forestal de la PUC
En el laboratorio de Biotecnologia de se efectuaron dos sesiones de trabajo, durante las cuales el Dr. Ollitrault demostr6 y ensefl6 una metodologia para establecer un protocolo para el cultivo in vitro de plantas triploides y un protocolo para establecer callo embriogénico. A continuacion se describen los diferentes pasos y los materiales requeridos para estas actividades:
5. 3. 1 Protocolo para rescate de embriones y la produccion de plantas triploides Cosechar semillas de frutos maduros, luego lavar y guardar secas en un envase al vacio a 6°C.
Previo al cultivo es necesario seleccionar las semillas pequefias que presentan embriones bien formados y desinfectarlas de la siguiente manera:
Sumergir las semillas por 5 min. en etanol 70%. Usar una malla para traspasar las semillas de un envase a otro.
Traspasar a una soluci6n de hipoclorito de sodio 4% durante 5 min.
Enjuagar tres veces con agua estéril. Separar las semillas que flotan y trabajar en forma separada ya que estan mas propensas a la contaminaci6n.
Depositar una semilla sobre una placa petri y afirmar con pinza. Con bistruri retirar cuidadosamente la testa.
Depositar semilla sin testa en tubo de vidrio con 30 mL de medio de cultivo. El embri6n debe estar en contacta con el medio.
Cubrir la tapa con alusa plast para reducir la evaporaci6n en ambientes con baja humedad relativa.
Cultivar por tres meses en camara de cultivo con 16 hrs. luz y alta intensidad luminica y 25-28°C.
Materiales
Etanol 70%
Hipoclorito de sodio 4% Agua destilada estéril
Frascos estériles para la desinfecci6n Toalla Nova estéril
Placas petri estériles
Material quirurgico estéril: pinzas, bisturi
Tubos de vidrio de l .5x 1 5 cm con tapas de plastico Parafilm
Medio de Cultivo
Macroelementos, microelementos, vitaminas, Fe y mioinositol correspondientes al medio MS.
Glicina 10 ml ( de stock 20 mg Glicina por 100 ml de H20 estéril)
Extracto de Malta 500 mg/L
Acido Giberélico (GA3) 1 mg/L
Sacarosa 30 g/L
PH 5.7
Agar Sigma 6,5 g/L para tubos, 8 g/ para placas
Autoclavar tubos 20 min. a 120 °C
5.3.2 Protocolo para la induccion de callo embriogénico
Seleccionar frutos 3-4 semanas después de la floraci6n (1 cm diametro). Desinfectar de frutos inmaduros cosechados dentro del mismo dia en soluci6n Captan Benlate (2.5 y 0.5 g/L, respectivamente). Luego aplicar tratamiento de desinfecci6n descrito para el rescate de embriones, reduciendo el tiempo de exposici6n a alcohol 2 min y usando hipoclorito de sodio 2% por 5 min.
Para la extracci6n de los 6vulos tomar el fruto por el pedunculo y cortar lateralmente con bisturi, removiendo la câscara hasta que aparezca el tejido blanco medular. Afirmar el fruto con pinzas y extraer 6vulos individualmente. Poner todos los 6vulos de un fruto en una placa petri (1 5-30 6vulos por fruto). Sellar placas petri con parafilm o paraplast. Cultivar en oscuridad por 6 meses en medio de cultivo con kinetina, efectuando traspasos cada mes
a medio fresco. Temperatura de cultivo 26-28°C. Luego traspasar a luz, eliminar kinetina
del medio, agregar 1 5 M galactosa, reducir sacarosa a 25 g/L e incrementar agar a 1 0 g/L.
Materiales
Etanol 70%
Hipoclorito de sodio 2% Agua destilada estéril
Frascos estériles para la desinfecci6n Toalla Nova estéril
Placas petri estériles
Material quirurgico estéril: pinzas, bisturi Parafilm
Medio de Cultivo
Macroelementos, microelementos, vitaminas, Fe y mioinositol correspondientes al medio MS.
Glicina 10 ml ( de stock 20 mg Glicina por 100 ml de H20 estéril)
Extracto de Malta 500 mg/L
Kinetina 1 mg/L
Sacarosa 50 g/L
PH 5.7
Agar Sigma 8 g/L para placas
6. Discusion y Conclusiones
La visita del Dr. Ollitrault result6 ser altamente provechosa al permitir conocer las nuevas estrategias de mejoramiento genético desarrolladas para citricos por el Cirad. El trabajo en conjunto, tanto de reuniones de trabajo como de laboratorio y terreno facilit6 la formulaci6n de un diagn6stico para la implementaci6n de un programa de desarrollo varietal de citricos en Chile. Dado que se trata de una iniciativa de largo plazo se estima conveniente utilizar estrategias que abordan el programa de mejoramiento en diferentes etapas de avance, a modo de reducir el tiempo de generaci6n de las nuevas variedades. Dentro de las estrategias propuestas figuran la generaci6n de poblaciones triploïdes (tiempo de generaci6n 16-20 afios),
