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Établissement d’une cryobanque d’embryons pour la
conservation ex situ de la diversité génétique chez le
lapin : aspects pratiques
Thierry Joly, Hubert de Rochambeau, Jean-Paul Renard
To cite this version:
Article
original
Établissement
d’une
cryobanque
d’embryons
pour
la
conservation
ex
situ
de la
diversité
génétique
chez
le
lapin :
aspects
pratiques
Thierry Joly
a
Hubert
de
Rochambeau
Jean-Paul Renard
a
a
Inra, biologie
dudéveloppement,
78352Jouy-en-Josas,
France bIsara,
31place Bellecour,
69288Lyon
cedex 02, FranceC
Inra, Saga,
BP27,
31326 CastanetTolosan,
FranceAbstract - Cryobanking of embryos to preserve ex situ rabbit genetic resources:
practical aspects.
Embryo cryobanks
are a valuable tool formaintaining
thegenetic
variability
in domestic animalpopulations.
Such a bank was built for the rabbit(Oryctolagus cuniculv,s),
amultiple
purposespecies,
which is bred for its meat, wool and fur as well as biomedical research. Severalpopulations
were selected tosample
the wholegenetic diversity.
This paper aimsfirstly
atevaluating
the number of youngrabbits born from one batch of frozen
embryos. Forty
newborn rabbits were obtained from 100embryos.
This result varies from one to two betweenpopulations. However,
the number of bucks and does necessary toproduce
one batch ofembryos
varies from one to three betweenpopulations. Later,
we will have to address theproblem
of the size of thepopulation
that willproduce
theembryos
and whether to store one gene or to preserve thegenetic variability
of onepopulation. ©
Inra/Elsevier,
Pariscryobank
/
embryo/
rabbit/
sampling/
genetic resourcesRésumé - Les
cryobanques d’embryons
peuvent apporter une aideprécieuse
aumaintien de la diversité
génétique
despopulations
d’animauxdomestiques.
Nous avons mis enplace
une tellebanque
chez lelapin
(Oryctolagus
cuniculus),
espèce
d’intérêtzootechnique,
mais aussi modèle animal pour la recherche biomédicale.Après
avoirchoisi
plusieurs populations
delapins
pourreprésenter
au mieux la diversitégénétique
chez cetteespèce,
nous avons d’abord déterminéquel
était le nombre delapereaux
obtenus àpartir
d’un nombre donnéd’embryons congelés.
Nos résultats montrentqu’en
moyenne 40lapereaux
sontproduits après décongélation
de 100embryons.
Ce taux varie du
simple
au double d’unepopulation
à l’autre.Ensuite,
selon lapopulation considérée,
le nombre d’animaux nécessaire pourproduire
cesembryons
*
varie du
simple
autriple. À partir
de cesdonnées,
il estpossible
de définir pourchaque
population
delapin
retenue lescaractéristiques
de l’échantillon d’animaux à utilisercomme donneurs
d’embryons. ©
Inra/Elsevier,
Pariscryobanque
/
embryon/
lapin/
échantillonnage/
ressources génétiques1. INTRODUCTION
Les
cryobanques
d’embryons
peuvent apporter
une aideprécieuse
aumain-tien de la diversité
génétique
despopulations
d’animauxdomestiques.
Nousavons mis en
place
une tellebanque
chez lelapin
(
Oryctolagus
cuniculus),
espèce
d’intérêt
zootechnique,
mais aussi modèle animal pour la recherche biomédicale. Le butprioritaire
d’unecryobanque
est de conserver en l’état initial lespotentialités
évolutives d’unepopulation. Ainsi,
lacryobanque
doit constituerune structure
qui
rassemble et conserve un stockd’embryons
suffisant pourreprésenter
lapopulation
initiale à l’étatcongelé, pendant
unepériode qui
peut
s’étendre dequelques jours
àplusieurs
dizaines d’années. Eneffet,
il a étémontré
qu’à
unetempérature de -196 °C,
lesembryons
de sourispouvaient
être conservéspendant plus
de 20 ans sans modifier leuraptitude
à donnerdes descendants normalement fertiles
(Glenister
etal.,
1990;
Dulioust,
1995).
L’autre
but,
tout aussiimportant,
est lié à l’activitéd’échange,
consécutive à une utilisation des ressources dissociée dans letemps
et dansl’espace.
Lacryobanque
doitpermettre
d’échanger
du matérielbiologique
congelé
avecun maximum de
garantie
sur leplan
sanitaire. D’unefaçon générale,
la mise enplace
d’unecryobanque
inclut la mise en oeuvre de l’ensemble desmoyens nécessaires au maintien des
potentialités
évolutives despopulations.
Au senslarge,
cette structure doit être considérée comme un outil de lagestion
animale pour le maintien de la diversité
génétique
des animauxdomestiques.
Lacryobanque
estcomplémentaire
aux actions de conservation in situ etreprésente beaucoup plus qu’un
stockd’embryons, simple
support
pour desopérations
demuséologie
visantuniquement
àfiger
lesproduits
dupassé.
Le déroulement d’une telle action entraîne laprise
encompte
desaspects
génétiques,
physiologiques,
sanitaires, socio-économiques
etjuridiques.
Depuis plusieurs années,
de nombreux acteurs ontpris
encompte
laperte
dela diversité
génétique
animale et ont oeuvré pour lasauvegarder. Cependant,
la situation des ressourcesgénétiques
animales diffère considérablementsui-vant les
espèces
animales et les acteursimpliqués.
Eneffet,
des travaux sur lesespèces
d’animaux sauvages ont été mis en oeuvre, essentiellement à la demande des parcszoologiques
et concernentprincipalement
lesespèces exotiques
afri-caines(Wildt,
1992)
etquelques espèces européennes
(Loskutoff
etal.,
1993).
De
même,
la conservation des animaux modèles de recherche fontl’objet
d’ini-tiatives individuelles dans le domaine de la recherchebiologique
et médicale. Cesespèces
(murins, oncins,...)
sont maintenues enpetites
colonies vivantes pour la durée desexpériences
avant d’être éventuellement conservées à l’état de cellulescongelées
dans descryobanques privées
(Mobraaten,
1986 ;
Gershon,
1993).
Dans ces deuxsituations,
les ressourcesgénétiques
animales fontl’objet
deplans
de conservation bienstructurés,
sansproblème majeur
de financement des programmes. La situation est différente concernant les nombreuses popu-lations traditionnelles et les racesidentifiées,
pour laplupart
soumises auxoeuvré entre autres dans le domaine de la
conservation,
l’évaluation et l’utilisa-tion des ressourcesgénétiques
animales(Hodges, 1990).
Dernièrement,
la FAOa établi une infrastructure internationale
qui
regroupesept
banques
régionales
de
gènes
animauxrépartis
sur l’ensemble des continents. Cesbanques
ont pourmission de
stocker,
enpriorité,
la semence et lesembryons
des animaux issus depopulations
ou de races menacées dedisparition.
Notre travail a pour but de fournir une base
scientifique
ettechnique
pour établir une
cryobanque.
Le choix dulapin s’explique
pour des raisonséconomiques
(coûts
modérés desanimaux,...),
des raisonspratiques
(technique
decongélation d’embryons
maîtrisée...)
et des raisonsgénétiques.
Il existeune
grande
diversité depopulations
dans cetteespèce :
animaux sauvages,domestiques,
de laboratoire et decompagnie.
Les donnéesphysiologiques
obtenues surplusieurs populations
delapins
permettent
derépondre
à deuxquestions importantes
pour définir la taille de l’échantillon.-
Quel
est le nombre d’animauxreproducteurs
nécessaire pourproduire
un nombre donné
d’embryons congelés?
Nous avons utilisé deux modes deproduction d’embryons,
lasuperovulation
et lanon-stimulation,
pourdisposer
de références surl’apport
de ces méthodes à la constitution d’unecryobanque.
- Quel
est le nombre delapereaux
que l’onpeut
obtenir àpartir
d’un nombre donnéd’embryons congelés ?
2.
MATÉRIEL
Dans le cadre de notre
action,
plusieurs populations
ont été choisies afin dereprésenter
au mieux la diversité chez cetteespèce
et d’illustrer les différentesquestions
rencontrées lors de la mise enplace
des actions de cryoconserva-tion des ressourcesgénétiques
animales. Lescaractéristiques
de cespopula-tions et l’intérêt de leur
cryoconservation
sontprésentés
dans le tableau I. Le recours auxcryobanques
pour conserver ex situ cespopulations
s’expli-que
principalement
par des motifs desécurité,
face à uneperte
accidentelled’animaux
précieux,
des motifséconomiques,
lacryoconservation
desembryons
étant moins coûteuse que la conservation d’animauxvivants,
et des motifs socio-culturels.Au
total, près
de 610 animauxappartenant
àsept
populations
différentesont été échantillonnés pour notre travail
expérimental.
Ces animauxâgés
de4,5
mois à 5 ans sontplacés
dans des conditions d’environnement et dessystèmes d’élevage
différents. Leslapins
de race Brun Marron de Lorraine etles
lapins
sauteurs d’Alfort sont élevés dans desélevages traditionnels,
enclapier
sur litièrepaillée.
Leslignées
commerciales(A1077,
Deutsch PetitRusse,
néo-zélandaise)
et les animaux modèle de recherche(lignées
allotypées
deBâle,
A1029)
sont élevés en batterie dans des unités hors sol aux conditions detempérature
etd’hygrométrie
contrôlées. 3.MÉTHODES
3.1. Production des
embryons
France)
encinq injections
à 12 h d’intervalle. Les femelles sont fécondées soit par inséminationartificielle,
soit paraccouplement
et l’ovulation est renforcéeou induite par une
injection
d’unanalogue
de GnRH(0,3
mL debuséréline;
Réceptal,
Distrivet,
France).
L’un desprincipaux
avantages
du traitement desuperovulation
est depermettre
lasynchronisation
d’un groupe de femelles pour une mêmeexpérience
de collected’embryons,
et ce,quel
que soit leurétat de
réceptivité.
Enrevanche,
laproduction
d’embryons
sanssuperovulation
concerneuniquement
leslapines
sexuellementréceptives.
Immédiatementaprès
la fécondation des
femelles,
une dose de0,2
mL de buséréline(Réceptal)
estinjectée.
Les
embryons
sont collectés au stade morulacompactée,
65 à 72 hpost-coïtum
après abattage
des femelles etperfusion
du tractusgénital
à l’aide d’une solution salinetamponnée
auphosphate
(PBS).
3.2.
Congélation
desembryons
La méthode de
congélation
retenueimplique l’emploi
d’uncongélateur
programmable
(Cryocell 1 200 ;
IMV,
L’Aigle,
France)
et son maniementsimple,
en fait un
appareil
bienadapté
pour intervenir directement dans lesélevages
(Joly
etal.,
1994).
La méthodeemployée comprend
troisétapes :
lapremière
consiste àplonger
lesembryons
dans trois bains successifs de PBS contenantrespectivement 0,5 M, 1,0
M et1,5
M de DMSOpendant
5 min àtempérature
ambiante,
avant de les monter dans unepaillette plastique
identifiée(0,25
mL,
IMV) ;
dans un deuxièmetemps,
lespaillettes
sontéquilibrées
à -7 °Cpendant
5 min avant l’induction de la
cristallisation ;
la troisièmeétape
consiste à abaisser lentement latempérature
à une vitesse de0,5 °C
par minjusqu’à
- 30 °Cpuis immerger
lespaillettes
directement dans l’azoteliquide
à -196 °C.3.3.
Décongélation
et transfert desembryons
Après
décongélation
dans un bain-marie à 20 °Cpendant
30 s, lesembryons
sont
plongés
successivementpendant
5 min dans deux bains de PBS contenantrespectivement 1,0
M et0,5
M de DMSOpuis
ensuite rincés dans trois bains dePBS. Les
embryons dégénérés
sontéliminés,
alors que ceux considérés viablesaprès
observation de leurmorphologie
(sans
dommages
cellulairesapparents)
sont transférés dans des receveusessynchronisées
par uneinjection
de0,2
mL de buséréline(Receptal).
Lesembryons
(huit
à douzeembryons
parreceveuse)
sont
déposés
par voiechirurgicale
directement dans les cornesutérines,
65 haprès
l’induction de l’ovulation(Techakumphu
etal.,
1987).
La viabilité desembryons
est évaluée par leurcapacité
à devenir deslapereaux
vivants à la mise bas. Les femelles utilisées comme receveuseappartiennent
à deslignées
commerciales avec des
performances
dereproduction
similaires(A1077,
A1029,
NZ)
et sontplacées
dans des conditionsd’élevage
hors sol standard.4.
RÉSULTATS
4.1. Production des
embryons congelés
(tableau 77)
Dans
l’ensemble,
462 femelles ont été traitées(320
superovulées
et 142 nonpopulations,
cesopérations
se sont déroulées dans deslaboratoires,
dans des stationsexpérimentales
ou directement dans des fermesd’élevage.
L’efficacitédes méthodes de
production d’embryons
est définie àpartir
dupourcentage
de femelles donneuses(une
femelle donneuse est une femelle traitéeayant
desembryons
congelés)
et du nombred’embryons congelés
par donneuse.Quelle
que soit la méthode deproduction
desembryons
(avec
ou sans traitementde
superovulation),
70%
des femelles traitées ont desembryons congelés,
mais un écart trèsimportant
variant de 50%
à 90%
est observé suivant lespopulations.
Le nombred’embryons congelés
par donneuse est en moyenne de18,5
pour les femellessuperovulées
et de7,9
pour les femelles nonsuperovulées.
Ces résultats sont variables suivant les
populations
([10,9-30,4]
pour les femellessuperovulées;
[7,5-8,2]
pour les femelles nonsuperovulées)
mais aussisuivant les individus traités
(!1N75!
pour les femellessuperovulées;
[1-17]
pour les femelles non
superovulées).
Quel
que soit le traitement deproduction
d’embryons,
ces résultatspeuvent
s’expliquer
enpartie
par les variations du taux de collecte[écart :
60%-93
%]
et dupourcentage
d’embryons
congelés
[56
%-90
%].
Néanmoins,
malgré
uneplus grande
variabilité,
les femellessuperovulées
fournissent en moyenne deux foisplus
d’embryons congelés
pardonneuse que les femelles non
superovulées.
La distribution du nombre
d’embryons congelés
et depaillettes
par femelleest
présentée
dans lafigure
1. Pour les deuxtraitements,
près
de 30%
des femelles échantillonnées ne donnent aucunembryon congelé
pour les raisonssuivantes : absence d’ovulation
(CJ
=0),
ovocytes
nonfécondés, embryons
dégénérés,
tractusgénital
infecté, problèmes
au moment de la collecte desembryons,...
La distribution montre que 56%
des femellessuperovulées
et 42%
congelés
(soit
huitembryons)
et queplus
du tiers des femellessuperovulées
enont fourni au moins deux
(soit
seizeembryons).
Ainsi,
lasuperovulation
est la méthode laplus
intéressante et efficace pouraugmenter
laproduction
d’embryons congelés
par femelle lorsd’opérations
decryoconservation
depopulations
delapins.
4.2. Viabilité des
embryons après
décongélation
et transfert(tableau 777)
Sur un total de 1357
embryons
décongelés,
1306embryons
(96
%)
ontété transférés sur 144 receveuses élevées dans deux stations
expérimentales
distinctes. Dans
l’ensemble,
80 %
(115/144)
des receveusesayant
reçu desembryons
décongelés
donne naissance à deslapereaux
vivants. Le taux de mise bas varie de 59%
à 92%
suivant legénotype
des receveuses. Ce taux tientcompte
des femellespalpées
vides à J12(12
%)
mais aussi des accidents divers(chocs
opératoires,
avortements,
mortalité enélevage...).
L’efficacitéglobale
dutransfert
embryonnaire
est définie par le taux dedéveloppement
à terme desembryons
congelés
(nombre
delapereaux
nésvivants/embryons décongelés) :
556lapereaux
sont nés vivants àpartir
de 1357embryons
congelés,
soit 41%.
Ce rendement varie du
simple
au double[23,5
%!51,3
%]
suivant legénotype
des
embryons
et des receveuses et semble être étroitement lié au taux de mise bas des receveuses. Dansl’ensemble,
pour 100embryons
stockés dansla
cryobanque,
nous pouvonsprévoir
d’obtenir 40lapereaux
vivantsaprès
La distribution des donneuses
d’embryons
en fonction du nombre de leursdescendants est
présentée
dans lafigure
2. Autotal,
556lapereaux
nés vivants sont les descendants de 83 donneuses(femelles
ayant
donné au moins huitembryons
congelés),
soit un nombre moyen de descendants par donneuse de6,7
(556/83).
La distribution montre que84,3
%
des donneuses(70/83)
onteu au moins un descendant vivant et
49,4
%
(41/83)
plus
de sixlapereaux.
Endéfinitive,
ces différents éléments nouspermettent
de déduirequ’après
congélation
d’au moins huitembryons, près
de la moitié desaccouplements
donnent six descendants viables ouplus.
Compte
tenu dusex-ratio,
de lamortalité entre la naissance et la
puberté,
et des critères de sélection desjeunes
reproducteurs
en fonction de leur standard ou de leur ardeursexuelle,
cettevaleur de six
lapereaux
nés vivants estcompatible
avec l’obtention d’uncouple
de
reproducteurs
adultes.5. DISCUSSION
Nos résultats montrent que la variabilité observée entre les
populations
esttrès élevée : du
simple
autriple
pour les critères deproduction
desembryons
(pourcentage
de donneuses et nombred’embryons
pardonneuse)
et dusimple
au double pour les critères de reconstitution desembryons
(taux
de mise basdes receveuses et taux de
développement
à terme desembryons
décongelés).
Cette variabilitépeut
s’expliquer
par la diversité despopulations
conservéesqui
sont toutes de constitutionsgénétiques
très différentes. Eneffet,
certainespopulations
sont issues d’unlong
schéma de sélectionrigoureux
sur desper-formances de
reproduction,
d’autrespopulations
maintenues enpetit
effectifsont
consanguines
et ont des difficultés dereproduction
en conditions natu-relles... Une variabilité encoreplus grande
que celle que nous avons observée chez lelapin
a été montrée lors de la mise enplace
d’unecryobanque
d’em-bryons
de souris à l’Institut national de la santé américaine(National
Institutof
Health,
Animal GeneticResource) :
lepourcentage
de souris donneuseset le nombre moyen
d’embryons congelés
par donneuse varie dans unrapport
de 1 à 4
(moyenne
= 12;
écart= 4,7
à20,9), (Schmidt
etal.,
1996).
Cepen-dant,
cette variabilité n’est pastoujours
observée chez d’autresespèces.
Lorsd’opérations
decryoconservation
dequatre
populations
ovines,
les résultats deproduction d’embryons
(nombre
d’embryons
congelables/collecte)
et derecons-titution
(taux
dedéveloppement
embryonnaire)
n’ont montré aucune différencesignificative
entre les différentespopulations. Toutefois,
il est àsignaler
que cesquatre
lignées
sont toutes issues de schéma de sélection surl’aptitude
à lareproduction
et lesperformances
de croissance(Sakul
etal.,
1993).
Dans toutes
opérations
decryoconservation,
deux effets sont àprendre
enconsidération : l’effet donneur et l’effet receveuse. L’effet
donneur,
relatif àl’étape
de constitution du stockd’embryons congelés
dans lacryobanque,
peut
se définir par une forte variabilité des critères de
production d’embryons
sui-vant le
génotype
des donneuses. Cette variabilité nepeut
pas être maîtrisée apriori
car elle est directement liée à laréponse
individuelle de chacun des in-dividus traités et à la constitutiongénétique
particulière
dechaque population
à conserver.Seule, l’organisation
desopérations
de récoltepermet
depallier
partiellement
cet inconvénient. L’effet receveuse intervient au moment de l’uti-lisation du stockd’embryons
de lacryobanque.
Ilpeut
se définir par l’influenceprédominante
dugénotype
de la femelle receveuse sur laproduction
delape-reaux vivants
(Vicente
etal.,
1993).
Afin de maîtriser ou atténuerpartiellement
cette
variabilité,
nous proposons d’utiliser unepopulation
génétiquement
biencaractérisée,
la souche A1077 comme receveuse universelle.La connaissance de la variabilité de ces résultats
permet
de définir le nombred’embryons
àcongeler
et l’effectif minimal de mâles utilisés et de femelles collectées dans laperspectives
de recouvriraprès
décongélation
desembryons,
une
proportion
déterminée à l’avance de la variabilitégénétique présente
dansla
population.
Les calculs que nous avons effectués(Joly, 1997)
indiquent
que, d’une
population
àl’autre,
les effectifs minimaux sont de l’ordre de 120embryons
sil’objectif
est la conservation d’un allèleparticulier
à un locusdonné et de 330
embryons
issus de 15 mâles et 30 femelles sil’objectif
estla conservation de combinaisons
génétiques
impliquant plusieurs
locus.6.
CONCLUSIONS,
PERSPECTIVESNos
techniques
deproduction
et decongélation d’embryons
peuvent
être utilisées en routine pour conserver les ressourcesgénétiques
chez lelapin
bien que les variabilités individuelles et entrepopulations
observées sur nos résultatsde
production d’embryons
ne soient pas maîtrisables.La
cryobanque d’embryons
estaujourd’hui
une réalité chez lelapin qui
contient
plus
de 5 000embryons
provenant
deplus
de 20populations
et lagestion
informatisée d’une telle collection est actuellement en cours. Dansle cadre du programme
européen
de caractérisation et de conservation desressources
génétiques
chez lelapin
(RESGEN1-CT95-0060)
nous sommes entrain de définir avec nos
collègues
des autres pays une méthode communed’identification ainsi
qu’une
stratégie
degestion.
Il est maintenanturgent
depréciser
le cadrejuridique
defaçon
àpouvoir
accueillir dès 1998 desembryons
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