Une meilleure caractérisation des mécanismes d’action toxique à partir de la structure moléculaire

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Texte intégral

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Une meilleure caractérisation des mécanismes d’action

toxique à partir de la structure moléculaire

Franklin Bauer

To cite this version:

Franklin Bauer. Une meilleure caractérisation des mécanismes d’action toxique à partir de la structure moléculaire. Autre. Université de Haute Alsace - Mulhouse, 2017. Français. �NNT : 2017MULH1360�. �tel-01823559�

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UNIVERSITE DE HAUTE-ALSACE

UNIVERSITE DE STRASBOURG

Thèse

Présentée pour l’obtention du grade de

Docteur de l’Université de Haute-Alsace

Ecole Doctorale : ED 222 - Sciences Chimiques

Discipline : Chimie, Physique et Matériaux

Présentée et soutenue publiquement

par

Franklin BAUER

Le 30 novembre 2017

Une meilleure caractérisation des mécanismes d’action

toxique à partir de la structure moléculaire.

Thèse CIFRE

Sous la Direction de : Directeur de thèse :

Prof. Serge NEUNLIST

Co-directeur de thèse :

Dr. Samuel FOUCHARD

Encadrée en entreprise par :

Dr. Paul THOMAS

Dr. Karine AUDOUZE, université Paris Diderot (Rapporteur)

Dr. Patrice GONZALEZ, université de Bordeaux (Rapporteur)

Prof. Jean-Philippe GODDARD, université de Haute-Alsace (Président)

Prof. Eric PINELLI, université de Toulouse III

Prof. Serge NEUNLIST, université de Haute-Alsace

Dr. Samuel FOUCHARD, université de Haute-Alsace

Dr. Paul THOMAS, KREATiS

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Table des matières

Table des figures ... 6

Table des tableaux ... 7

Liste des abréviations ... 8

Remerciements ... 10

Résumé de la thèse en anglais – Abstract ... 11

1) Context and State of the Art ... 11

2) Our contribution ... 12

3) Future prospects ... 14

Chapitre 1 : Introduction ... 16

1) QSARs et approches par analogie ... 17

a) Principe de ces méthodes ... 17

b) Contexte et raisons de leur utilisation ... 18

2) MechoAs vs MoAs ... 19

3) Différentes classifications et modèles de prédiction de MechoAs/MoAs ... 20

a) Classifications et modèles sur les composés organiques en général ... 20

b) Classifications et modèles sur des familles restreintes ... 21

4) Objectifs de la thèse ... 22

Chapitre 2 : Revue bibliographique des mécanismes d’action ... 24

1) Narcose ... 25

a) Narcose non-polaire ... 25

b) Narcose polaire... 28

2) Narcose des esters ou pronarcose ... 29

3) Toxicité par réactivité avec formation d’adduits ... 30

a) Electrophiles durs ... 31

b) Electrophiles mous ... 34

c) Générateurs de radicaux ... 35

4) Toxicité pro-active ... 35

a) Métabolisation réduisant la toxicité ... 36

b) Métabolisation vers un réactif électrophile ... 39

c) Utilisation d’un cycle RedOx ... 46

d) Métabolisation en perturbateur indirect d’enzyme ... 47

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3

5) Perturbation de l’environnement enzymatique... 49

a) Découplage de la phosphorylation oxydative par transport de protons ... 49

b) Acidification ou basification des cellules ... 51

6) Interaction directe dans un site de liaison ... 51

a) Inhibition de l’AcétylCholinEstérase ... 51

b) Ligands aux récepteurs de l’AcétylCholine ... 55

c) Perturbation du transport de la dopamine ... 56

d) Chélation des métaux ... 56

e) Inhibition du transport d’électrons du photosystème II ... 57

f) Modulation des canaux à ions ... 58

g) Autres mécanismes ... 61

Chapitre 3 : Organisation des mécanismes d’action et discussion de certains mécanismes ... 66

1) Une nouvelle classification en mécanismes d’action toxique ... 67

2) MechoA des amines aliphatiques et ammoniums ... 69

3) Discussion sur les modèles QSAR MechoA-spécifiques ... 69

4) Discussion sur l’excès de toxicité observé pour les esters ... 71

5) Réactivité des γ-dicétones en tant qu’électrophiles durs ... 74

6) Modélisation QSAR pour les découpleurs de la phosphorylation oxydative ... 74

7) Mécanisme responsable de la toxicité et corrosivité des acides et bases ... 75

Chapitre 4 : Développement d’un modèle de prédiction des MechoAs par approche quantique ... 78

1) Introduction ... 79

2) Publication ... 80

A New classification algorithm based on Mechanisms of Action. ... 80

Abstract ... 80

1. Introduction ... 80

1.1. MechoA definitions ... 82

2. Materials and Methods ... 84

2.1. Literature data ... 84

2.2. Computational methods ... 85

2.3. Classification algorithm ... 87

3. Results and discussion ... 90

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4

Acknowledgments ... 93

References ... 93

3) Conclusion ... 95

Chapitre 5 : Développement d’un modèle de prédiction des MechoAs par alertes structurales. ... 96

1) Introduction ... 97

2) Matériels et Méthodes ... 98

3) Résultats et discussion ... 101

a) Arbre de décision... 101

b) Validation statistique du modèle ... 105

4) Conclusion ... 107

Chapitre 6 : Expériences en laboratoire de validation et affinement des modèles. ... 110

1) Introduction ... 111

2) Mesures de coefficients de partage octanol-eau ... 111

a) Introduction ... 111

b) Protocole utilisé pour les tests ... 112

c) Substances testées ... 114

d) Résultats et discussion ... 116

3) Mesures de solubilités aqueuses... 119

a) Introduction ... 119

b) Protocole utilisé pour les tests ... 119

c) Substances testées ... 121

d) Résultats et discussion ... 121

4) Tests de toxicité aigüe pour les daphnies ... 122

a) Introduction ... 122

b) Matériel et méthodes ... 123

c) Substances testées ... 123

d) Résultats et discussion ... 125

5) Conclusion ... 127

Chapitre 7 : Discussion générale et conclusion. ... 128

Planche de structures moléculaires ... 133

Références bibliographiques ... 135

Annexes ... 144

A.1) Informations supplémentaires pour la publication « A New classification algorithm based on Mechanisms of Action. » ... 145

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5

A.2) Informations supplémentaires pour la méthode de prédiction des

MechoAs par alertes structurales ... 179 A.3) lignes directrices OCDE pour les tests en laboratoire ... 210

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6

Table des figures

Figure 1 : superposition de modèles QSARs pour la toxicité

environnementale. ... 26

Figure 2 : bactéries P. fluorescens vues au microscope électronique à transmission (colonne de gauche) et à balayage (colonne de droite) suite à l’exposition (a-b) contrôle sans carvacrol ni 1,8-cinéole, (c-d) avec carvacrol, (e-f) avec 1,8-cinéole. ... 27

Figure 3 : concentrations léthales médianes (CL50) pour le guppy et le tête de boule pour les narcotiques non polaires (carrés pleins) et polaires (carrés vides) en fonction de a) leur logP et b) leur logKDMPC. ... 29

Figure 4 : hydrolyse enzymatique des esters. ... 29

Figure 5 : formation d’adduits ou libération d’acide par les électrophiles durs. ... 31

Figure 6 : voie époxyde-diol pour éliminer une substance de l’organisme. ... 32

Figure 7 : mécanisme de réaction des électrophiles possédant un bon groupe partant, un état de transition et un groupe partant stabilisés. ... 33

Figure 8 : formation d’adduits avec les protéines par les électrophiles mous ... 35

Figure 9 : Voie de métabolisation chez le rat a) du méthacrylate de méthyle, b) de l’acrylate de méthyle ... 38

Figure 10 : métabolisme du benzo[a]pyrene (B[a]P) qui conduit à la formation d’adduits à l’ADN. ... 39

Figure 11 : formation de cancer par les anilines et nitrobenzènes. ... 40

Figure 12 : réticulation des protéines par l’hexan-2,5-dione. ... 41

Figure 13 : métabolisme des thiophènes et furanes aboutissant à des aldéhydes réactifs. a) métabolisme et réaction des thiophènes, b) des furanes. c) mécanismes de réaction des métabolites du thiophène avec un nucléophile. ... 42

Figure 14 : métabolisme des alkoxyvinyles en époxydes ... 43

Figure 15 : métabolisme générant des réactifs du a) tétrachlorure de carbone b) chloroforme c) trichloroéthylène. ... 44

Figure 16 : mécanisme des alcynes dégradant les CYP450. ... 45

Figure 17 : métabolisme du 3-méthoxyphénol vers une quinone. ... 46

Figure 18 : cycle RedOx des quinones. ... 46

Figure 19 : cycle RedOx du paraquat. ... 47

Figure 20 : Couplage de l’ATP synthase et de la chaîne de transport d’électrons par le gradient de protons. ... 49

Figure 21 : transport de protons à travers la membrane mitochondriale interne par les phénols acides. ... 51

Figure 22 : transmission nerveuse. ... 52

Figure 23 : mécanisme de l’hydrolyse de l’acétylcholine par l’acétylcholinestérase. ... 53

Figure 24 : inhibition de l’acétylcholinestérase. ... 54

Figure 25 : L’acétylcholine et quelques-uns de ses agonistes et antagonistes. ... 56

Figure 26 : photosystème II. ... 58

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7

Figure 28 : Structure des dérivés de DDT et de pyréthroïdes. ... 59

Figure 29 : Récepteur à GABA et ses sites de liaison. ... 60

Figure 30 : insecticides alicycliques chlorés et picrotoxinine. ... 60

Figure 31 : inhibition de la polymérisation de la tubuline par la trifluraline. ... 62

Figure 32 : Rôle central de l’acétyl-coenzyme A dans les plantes. ... 63

Figure 33 : Structure de l’estradiol. ... 64

Figure 34 : remplissage de la poche de liaison du récepteur aux estrogènes par différentes molécules actives. ... 65

Figure 35 : comparaison de la narcose non-polaire et polaire pour le poisson en fonction de la solubilité. ... 70

Figure 36 : toxicité des diesters par rapport aux monoesters pour a) le poisson, b) la daphnie, c) l’algue. ... 73

Figure 37 : Réactions favorisées par la stabilité de l’état de transition ou par la stabilité du produit final. ... 74

Figure 38 : toxicité des phénols acides pour le poisson en fonction de la solubilité et du pKa. ... 75

Figure 39 : acidification des cellules par les acides. ... 76

Figure 40 : ligands aux récepteurs de l’acétylcholine. A = acétylcholine. B = nicotine. C = muscarine. D = coniine. E = atropine. ... 99

Figure 41 : Un ester α,β-insaturé dont les électrons ne sont pas délocalisés à cause de l’encombrement stérique. ... 100

Figure 42 : planche de structures moléculaires ... 134

Table des tableaux

Tableau 1 : exemple d’approche par analogie ... 18

Tableau 2 : hydrophobie d’un ester et de ses produits d’hydrolyse. ... 30

Tableau 3 : groupes partants. ... 34

Tableau 4 : MechoAs généraux utilisés dans ce travail. ... 67

Tableau 5 : MechoAs détaillés. (Sous-catégories des MechoAs généraux) ... 68

Tableau 6 : Arbre de décision pour la prédiction des MechoAs. ... 104

Tableau 7 : Statistiques de notre arbre de décision. ... 105

Tableau 8 : comparaison des méthodes de classification. ... 106

Tableau 9 : cétones α,β-insaturées pour les tests de logP. ... 115

Tableau 10 : substances variées pour les tests de logP. ... 116

Tableau 11 : résultats des mesures de logP. ... 118

Tableau 12 : données de la substance de référence. ... 117

Tableau 13 : substances pour les tests de solubilité. ... 121

Tableau 14 : résultats de solubilité. ... 122

Tableau 15 : substances pour les tests de toxicité aigüe pour les daphnies. ... 125

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Liste des abréviations

2,4-D : acide 2,4-dichlorophénoxyacétique. ACh : AcétylCholine

AChE : AcétylCholinEstérase

AChR (nAChR et mAChR) : Récepteur à l’AcétylCholine (nicotinique et muscarinique) ADN : Acide DésoxyriboNucléique

AhR : Aryl hydrocarbon Receptor = récepteur des hydrocarbures aromatiques. AOP : Adverse Outcome Pathway = Voie à conséquences nocives

ATP, ADP : ATP = Adénosine TriPhosphate, ADP = Adénosine DiPhosphate. CE50 / CL50 : Concentration Effective / Léthale pour 50% des organismes testés

COB : Laboratoire de Chimie Organique et Bioorganique, EA 4566 Université de Haute Alsace COX : CycloOXygénase

CYP450 : Cytochrome P450

DDT : DichloroDiphénylTrichloroéthane DMPC : DiMyristoylPhosphatidylCholine OD : Oxygène Dissous

ECHA : European Chemical Agency GABA : Acide Gamma-AminoButyrique GC : chromatographie en phase gazeuse. GLP : Good Laboratory Practices

GPCR : G Protein-Coupled Receptor = récepteur couplé à une protéine G.

GSH, GSSG, GST, GPx : GSH = glutathion réduit sous sa forme thiol, GSSG = glutathion oxydé sous sa forme de disulfure, GST = Glutathion S-Transférase, GPx = Glutathion Peroxydase

HAP : Hydrocarbure Aromatique Polycyclique

HOMO : Highest Occupied Molecular Orbital = orbitale moléculaire la plus haute occupée HPLC : Chromatographie Liquide à Haute Performance

KREATiS : Knowledge & Research in Environment And Toxicity in Silico, entreprise basée à L’Isle d’Abeau, France, N° SIRET 798 935 656 00024.

logP : logarithme du coefficient de partage octanol-eau

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9 MechoA : Mechanism of Action (mécanisme d’action) MoA : Mode of Action (mode d’action)

NAD(P)H : Nicotinamide adénine dinucléotide (phosphate). NAD(P)H est la forme réduite, et NAD(P)+

est la forme oxydée.

OCDE : Organisation de Coopération et de Développement Economiques PCB : PolyChloroBiphényle.

(Q)SAR : (Quantitative) Structure-Activity Relationship = Relation structure-activité (quantitative) REACH : Registration, Evaluation, Authorisation and restriction of Chemicals. Réglementation européenne pour l’enregistrement, l’évaluation, l’autorisation et la restriction des produits chimiques. ROS : Reactive Oxygen Species = Espèces réactives de l’oxygène

TPA : Tonnes Par Année

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Remerciements

Avant toute chose, je remercie Dieu qui me dirige dans tous les domaines de ma vie.

Je remercie premièrement le Dr. Paul THOMAS pour m’avoir encadré dans l’entreprise, et avoir permis la mise en place de ce contrat CIFRE au sein de KREATiS. Je remercie également le Professeur Serge NEUNLIST et le Dr. Samuel FOUCHARD pour avoir ouvert les portes de la collaboration avec l’université de Haute-Alsace et pour m’avoir encadré au laboratoire.

Je remercie tout particulièrement ma fiancée Hoong Nee TAN ainsi que ma famille et mes amis pour leur soutien constant dans les moments faciles et les moments difficiles qui se sont succédés durant ces trois années.

Je remercie chaleureusement Nicolas DELPIT du laboratoire LPL pour m’avoir envoyé gratuitement des algues et daphnies de son laboratoire afin de démarrer la culture et l’élevage dans notre laboratoire. Tous mes remerciements aussi à Pascal BICHEREL, Dr. Faizan SAHIGARA, Dr. Nathalie MAYER, Dr. Carole CHARMEAU pour leur soutien scientifique et amical. Un grand merci également à Sarah TERRADOT pour s’occuper des tâches administratives et également pour son amitié. Je suis aussi très reconnaissant envers le Dr. Cécile JOYEUX pour sa patience et son dévouement, pour m’avoir préparé les machines d’analyse au laboratoire, pour m’avoir expliqué leur fonctionnement, pour les avoir maintes fois dépannées et réparées, pour m’avoir conseillé sur les méthodes d’analyse. Je remercie aussi le Professeur Céline TARNUS pour l’accueil dans son laboratoire en tant que directrice, et aussi les doctorants du laboratoire pour m’avoir intégré, montré le fonctionnement de choses diverses. Enfin, je remercie les stagiaires que j’ai encadrés au laboratoire, et qui ont effectué avec moi les tests de logP et de toxicité sur les daphnies : Igor AGAPI, Xu WANG, Geoffrey BERREZ, Maxime PYPEC.

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Résumé de la thèse en anglais – Abstract

1) Context and State of the Art

To protect human health and environment, it is important to assess and control the toxicity of chemical substances to which we are exposed. The usual way to do toxicological risk assessment is to perform toxicity studies on animals. Particularly up until REACH (Parlement Européen and Conseil de l’Union Européenne, 2006), the European regulation for chemical substances, either imported of manufactured in Europe, animal testing has been difficult to avoid. However, this new regulation provides opportunities to avoid animal testing by use of alternative methods. ECHA (European Chemicals Agency) is asking the chemical industry to give health and safety information on their products with a tonnage ≥ 1 ton per year. Depending on tonnage (tons of manufactured/imported substance per year) an increasing number of physicochemical and (eco)toxicological endpoints are required. Despite the availability of currently accepted alternatives this set of toxicity tests is expensive and is still posing ethical problems (animal suffering, …). As a consequence, industry is encouraged to use alternative methods, such as in vitro approaches, Read-Across, Weight-of-Evidence, and QSARs (Structure-Activity Relationships), which enable the use of existing data on similar substances, to generate a prediction for the target substance.

QSARs are in silico models establishing a relationship between substance properties and a given activity, i.e. a biological effect. The activity, also known as response or output variable, is often a dose of substance leading to a toxicity for organisms, such as an EC50 (the concentration causing the effect for 50% of organisms used in the test). Substance properties which are correlated with activity are named descriptors. The toxicity of most substances being strongly led by their hydrophobicity, the logP (octanol-water partition coefficient) is generally chosen as a descriptor. Conversely, a Read-Across does not aim to establish a mathematical model between input and output variables, but compares two or more substances and evaluates the similarity between their structures, properties and their known activities. If the substances are judged similar enough in all these aspects, the known activity value of one analogue (or the mean of the activities of several analogues) can then be used for the target substance for which activity is unknown.

Mechanisms of Action (MechoAs) describe how substances are toxic for living organisms, and particularly what molecular event will be responsible for their toxicity. When in silico methods are used, it is important to ensure that the target substance is behaving with the same mechanism of action as the other substances used to generate the toxicity prediction. Indeed, it has been demonstrated that toxicity to fish requires different regression coefficients, or even different descriptors to be predicted by QSAR modelling when different MechoAs are playing. Hence, if the MechoA of a given substance is not well known, an inappropriate QSAR may be used, resulting in a wrong toxicity prediction. This has led us to create a classification method, sorting substances by categories which may or may not be classed by structure, allowing the choice of the right QSAR, i.e. a classification with well-defined MechoAs. The knowledge of MechoAs predictions based only on the molecular structure can also be useful in medicinal chemistry, in order to develop new hit substances for therapeutic use.

While MechoAs look at the molecular interaction leading to the toxic response, Modes of Action (MoAs) refer to the pathological effects that can be seen at the whole organism level in terms of behaviour or death i.e. at the other end of the Adverse Outcome Pathway (AOP). MechoAs and MoAs

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are linked by AOPs. But one MoA can be the result of very different MechoAs. Conversely, the same MechoA but different MoAs can happen mainly when comparing the AOPs across different species. Several MoA classifications can already be found in the literature, together with predictive models. Relatively few models are built in order to be applicable to the whole organic chemicals family. A review of existing models covering a wide range of chemical groups is presented below:

The most widely known method used in ecotoxicology and to some extent in mammalian toxicology today is the Verhaar scheme, published in 1992 (Verhaar et al., 1992) and last updated in 2008 (Enoch

et al., 2008). Today, this method can be used via several interfaces (ToxTree, OECD QSAR Toolbox).

This scheme classifies compounds into 4 modes of action: non-polar narcosis or baseline toxicity, polar narcosis or less inert compounds, unspecific reactivity, and specifically-acting compounds. The Verhaar scheme, despite updates, still includes notable errors and a quite restricted applicability domain, with many substances being assigned to the so-called class 5, which corresponds to the unclassified compounds. This method is freely available, and built as a decision tree with simple structural alert rules (topological alerts), which makes it attractive to a broad section of the toxicological community. Another classification method applied to most organic compounds is that of Russom et al. (Russom et

al., 1997), which predicts modes of action for fish, solely based on fish toxicity studies. This method

classifies compounds into 8 categories: Baseline narcosis or narcosis I, polar narcosis or narcosis II, ester narcosis or narcosis III, oxidative phosphorylation uncoupling, respiratory inhibition, electrophile/proélectrophile reactivity, acetylcholinesterase (AChE) inhibition and central nervous system seizure.

More recently, a more advanced classification into MechoAs was published by Barron et al. (Barron et

al., 2015), regrouping a wide variety of substances: metals, organometals, pesticides and other organic

molecules. Compounds are classified into 6 general MechoAs and 31 specific MechoAs thanks to toxicity studies on fish and aquatic invertebrates, QSARs, and other literature data. The 6 general MechoAs are as follows: narcosis, AChE inhibition, electron transport inhibition, iono/osmoregulatory/circulatory impairment, reactivity, neurotoxicity. A prediction method for MechoAs of the same research group was published 2 years before this classification, using only a part of the above-mentioned classes (Martin et al., 2013). This method is built with all kinds of descriptors (experimental, topological, electronic) and predicts MechoAs for fish toxicity, using statistical methods difficult to follow and reproduce.

The goal of this thesis was to better characterise modes/mechanisms of toxic action than the Verhaar scheme, the most widely used method by ecotoxicologists, and to define a single classification system that can be used by toxicologists and ecotoxicologists alike. We were also aiming to get more accurate classifications than other general prediction methods and to cover the widest range possible of organic substances.

2) Our contribution

The first step for this work was to form a database with information on mechanisms of action. We gathered a dataset of 794 molecules with known biological interactions and/or effects, and classified them into MechoAs organised in 6 general categories and 23 sub-categories, as we wanted to keep a limited number of general categories, but to increase sub-categories number as much as needed. This classification scheme will of course be continued after this thesis to characterise more and more molecules and mechanisms.

The MechoAs defined in this work are organised as follows. General MechoAs are given in the list below, with detailed MechoAs included in brackets:

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• Membrane destabilisation (non-polar narcosis, polar narcosis, cationic narcosis) • Hydrolysis pro-destabilisation (hydrolysis to narcotics, hydrolysis to other MechoAs)

• Reactivity (hard electrophile reactivity, soft electrophile reactivity, homolytic cleavage of a bond generating radicals)

• Pro-activity (metabolisation to less toxic compounds, metabolisation to electrophiles, RedOx cycling, metabolisation to indirect enzyme disruptors, metabolisation to direct docking disruptors)

• Indirect enzyme disruption (oxidative phosphorylation uncoupling, acidification or basification of cells, other indirect mechanisms)

• Direct docking site interaction (AChE inhibition, AChR binding, dopamine transport disruption in synapses, metal chelation, photosystem II electron transport inhibition, ion channel activation/inactivation, other direct mechanisms).

The intention was to completely map the possible Molecular Initiating Events (MIEs) within these six general titles so no chemical substances, regardless of their impact on flora or fauna, would fall under a category “unknown” regardless of its chemical interaction. After gathering a maximum of mechanisms of action for a wide range of chemical families, we started to develop a preliminary prediction method. We chose to use a method based on quantic descriptors, obtained after 3D geometry optimisation, in order to extend the applicability domain of the method further than with structural alerts on two-dimensional structures. Some molecules contain the same moiety which can be a structural alert deemed responsible for a given MechoA. However, these molecules can differ in the molecular environment of this moiety, so that the electronic properties of thes substances can very dramatically, thus leading to a different MechoA in fact. Building a decision tree based on simple structural alerts may thus lead to errors, and a method based on quantic descriptors should not get these errors. In fact, the initial idea was that the error rate (14% as a mean) and the non-classification rate (35% as a mean) obtained using the Verhaar scheme was mostly due to the use of identified structural alerts to classify compounds, implying errors or non-classifications for all the structural alerts that were not identified. This limitation could, in theory, be circumvented thanks to electronic descriptors generated by quantum calculations. This quantic method was developed and has resulted in a publication submitted in the journal Computational Toxicology. We obtained with this method 86% of correct classifications for the training set, but only 69% for the validation set. We obtained 13% of classifications slightly different from literature classification (see publication for the definition of slightly different), 17% of misclassifications and 1% outside the applicability domain for the validation set. These results for the validation set have been compared to those of the Verhaar scheme, which obtained 45% of correct classifications, 18% of misclassifications and 37% outside of the applicability domain. So, this method proved to perform better than the Verhaar scheme. However, its success rate still remains inadequate to provide sufficient confidence in predictions, even if calculation means used to obtain these results are relatively high compared to the Verhaar scheme.

Following this first prediction method we tried to develop a second method using structural alerts, i.e. the identification of molecule moieties responsible for a toxic activity, in the hopes that this would improve MechoA predictive hit-rate. Further goals were to obtain faster results, able to be implemented in a software tool that could be run automatically and therefore easily exploitable by anyone. Structure-activity analyses coupled with an expert judgment finally allowed us to develop a decision tree composed of 62 decision rules. This classifies molecules with high accuracy into the 23 detailed MechoAs, with a much reduced calculation time, because geometry optimisation is needed only for a few questions in the scheme, and a basic calculation level appears appropriate enough for this purpose. This geometric optimisation is only used to measure interatomic distances. Comparing the two methods this new method was found not only to be simpler and faster, as expected, but also

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obtained much better correlations than the previous one, with 92% of correct classifications, 4% of slightly different classifications, 4% of misclassifications and 0% outside the applicability domain for the validation set. Therefore, we wrote a manuscript to report this method which will soon be submitted to the journal Computational Toxicology. Our results were subsequently compared with the Russom method results using MOA classification by the OASIS profiler which is implemented in OECD QSAR Toolbox. In the Russom prediction method, for compounds outside the applicability domain, a baseline mode of action is assigned by default. Consequently, with our validation set, the Russom method obtained 83% correct classifications, 6% of slightly different classifications and 11% of misclassifications. If we separate out the baseline classifications that were assigned because the compound was outside applicability domain, it becomes 70% correct classifications, 6% slightly different, 10% misclassifications and 14% outside the applicability domain. Overall, these are quite good results, better than our quantic method, but not as good as our second structural alerts method. In addition to the MechoA work outlined above, a shorter experimental part was performed in the scope of this thesis, where we measured partition coefficients (logP), water solubilities and acute toxicity to daphnia for some chosen substances. These experiments enabled a better characterisation of some families of substances for which little or nothing is known in the literature, or with inconsistent data between physico-chemical parameters and aquatic toxicity. For certain substances, we managed to elucidate the experimental issues which prevented accurate experimental values being obtained. For other substances, we were able to obtain new reliable experimental values, which were used to help develop KREATiS models or to validate existing models.

3) Future prospects

The final prediction method is judged satisfying and meets our requirements in terms of completeness accuracy and precision. Furthermore, its simplicity of use enables it to be integrated at least partially in a fully automated software interface. This task is on-going.

Further comparisons with other MechoA prediction methods may be undertaken in the future. This kind of comparative work for other MoA prediction methods has already been done by other groups and published recently (Kienzler et al., 2017). We also think about extending this work to inorganics, metals and organometals. A lot of these compounds indeed exert specific MechoAs. Moreover, further work will be carried out on endocrine disruptors in order to characterise the different active structures and corresponding precise mechanisms.

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1) QSARs et approches par analogie

a) Principe de ces méthodes

Les QSARs (Relations Quantitatives Structure-Activité) sont des modèles informatiques qui lient des propriétés des substances à une activité, ou un effet au niveau biologique (Madden, 2010). Les propriétés qui sont utilisées pour modéliser l’activité sont appelées descripteurs (ou variable indépendante, ou variable d’entrée). Ces descripteurs peuvent être liés directement à la structure moléculaire (par exemple, le nombre de groupements donneurs de liaison hydrogène), ou bien quantifier les propriétés électroniques des molécules, grâce à des calculs de chimie quantique (par exemple, E(HOMO), l’énergie de l’orbitale moléculaire la plus haute occupée), ou encore des propriétés physicochimiques telles que la solubilité dans l’eau ou le logP (coefficient de partage octanol-eau), qui peuvent être mesurés expérimentalement ou être eux-mêmes prédits par un autre QSAR (Madden, 2010). L’activité, appelée variable dépendante ou variable de réponse ou de sortie, est souvent une concentration qui entraîne une toxicité sur les organismes, comme une CE50, la concentration qui cause l’effet mesuré pour 50% des organismes utilisés dans le test. L’effet mesuré peut être la mortalité, l’inhibition de la croissance, l’immobilisation, l’inhibition d’une activité enzymatique, etc. (Madden, 2010)

Pour construire un modèle QSAR, on s’appuie sur un set de données, renseignant les valeurs des descripteurs et de l’effet qu’on cherche à modéliser pour une série de substances. Ce set de données est classiquement séparé en un set d’entraînement, c’est-à-dire les données qui vont servir à construire le modèle, et un set de validation (ou set de test), c’est-à-dire des données qui seront utilisées pour vérifier que le modèle fonctionne, et qui n’ont de préférence pas été utilisées pour générer le modèle. Une relation est établie entre les valeurs des descripteurs et les valeurs de l’effet. La relation qui lie les variables d’entrée et de sortie peut prendre différentes formes plus ou moins complexes, allant de la simple régression linéaire aux régressions multilinéaires, polynomiales ou non-linéaires (Madden, 2010).

Une approche par analogie ne cherche pas à créer un modèle mathématique entre des variables d’entrée et de sortie, mais à comparer deux substances ou plus, et de juger la similarité entre leurs structures, leurs propriétés, leurs activités biologiques connues. Si les substances sont jugées suffisamment similaires à tous ces égards, on peut alors utiliser la valeur d’activité connue d’une substance (ou la moyenne de l’activité de plusieurs substances éventuellement) pour une autre substance dont on ne connaît pas l’activité (Madden, 2010). Un exemple d’une approche par analogie est donné dans le tableau suivant :

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18 Substance Masse moléculaire (g/mol) Coefficient de partage logP Solubilité aqueuse (mg/L) Toxicité aigüe pour le poisson (mortalité) : 96h-CL50 (mg/L)

Toxicité aigüe pour l’algue (croissance) : 72h-CE50 (mg/L) 2- propylheptan-1-ol 158.29 4.17a 44c 1.9e 5.01g décan-1-ol 158.29 4.57b 39.5d 2.4f ND

Tableau 1 : exemple d’approche par analogie

a : base de données de l’ECHA, 1995, ligne directrice EU Method A.8, méthode agitation de flacon, 25°C, score Klimisch K2. b : ECHA, Hansch et al., 1995, K2 / ECHA, Doucette & Andren, 1988, méthode colonne génératrice, K2 / ECHA, Lide, CRC Handbook, 2008, K2

c : ECHA, 1959, procédure équivalente à la ligne directrice OCDE 105, méthode agitation de flacon, 25°C, K2 (pur à 90%) / ECHA, 2001, procédure équivalente à la ligne directrice OCDE 105, méthode agitation de flacon, 25°C, K2 (pur à 87%) d : ECHA, Yalkowsky & Valvani, 1980, 25°C, K2

e : ECHA, 1995, ligne directrice OCDE 203, GLP, étude statique, espèce Danio rerio, concentration mesurée (moyenne géométrique), aération, durée de 96h, 22°C, K1

f : ECHA, Veith et al., 1983, ligne directrice OCDE 203, étude dynamique, Pimephales promelas, concentration mesurée, 96h, 25°C, K2

g : ECHA, 2009, ligne directrice OCDE 201, GLP, étude statique, Desmodesmus subspicatus, en flacon fermé, avec espace d’air, concentration mesurée (moyenne géométrique), basée sur le taux de croissance, 72h, 21-23°C, K1

Compte tenu des propriétés similaires entre les deux substances de l’exemple, et sachant que leurs structures sont très proches (l’une est ramifiée et l’autre linéaire, mais ce sont tous les deux des alcools primaires), on peut conclure que le décan-1-ol aura une toxicité sur les algues très proche de celle du 2-propylheptan-1-ol, et ainsi, il est possible d’utiliser la valeur de ce dernier pour le décan-1-ol. Dans le cadre d’une approche par analogie pour une évaluation de risque, on préfère en revanche adopter une approche conservatrice, c’est-à-dire choisir un analogue dont on pense qu’il sera légèrement plus toxique que la substance qu’on cherche à caractériser.

b) Contexte et raisons de leur utilisation

Pour protéger la santé de l’humanité et de notre environnement, il est important de caractériser la toxicité de toutes les substances chimiques que nous produisons, utilisons, ou simplement auxquelles nous sommes exposées, même les substances naturelles. Pour ce faire, on réalise normalement des études de toxicité sur les rongeurs (pour modéliser la toxicité sur les humains), et sur d’autres animaux pour évaluer la toxicité des substances pour l’environnement. Cependant, en particulier depuis la mise en place de REACH (Parlement Européen and Conseil de l’Union Européenne, 2006), la réglementation européenne sur les substances chimiques importées ou fabriquées en Europe, l’utilisation de méthodes alternatives est encouragée afin de réduire au maximum l’expérimentation animale. Dans le cadre de cette réglementation, l’ECHA (European Chemicals Agency) demande que les industriels fournissent des informations sur leurs produits. Selon le tonnage (tonnes de substance par an importée/produite), un nombre croissant d’ « endpoints » sont requis. Voici la liste des études requises en fonction du tonnage (TPA = Tonne Par Année) pour la toxicité et l’écotoxicité. Des études pour les propriétés physico-chimiques et de devenir dans l’environnement sont également demandées dans ces annexes, mais nous nous concentrons ici uniquement sur les aspects (éco)toxicologiques.

- De 1 à 10 TPA, annexe VII : toxicité aigüe orale, irritation oculaire et cutanée, sensibilisation

cutanée, test de mutagénicité in vitro (test AMES), toxicité aigüe pour les invertébrés et pour les algues.

- De 10 à 100 TPA, annexe VIII : toxicité aigüe +1 autre voie (cutanée ou inhalation au choix),

toxicité par administration répétée et toxicité pour la reproduction (sauf si les approches par analogie, QSARs ou méthodes in vitro indiquent que la substance est toxique pour le

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développement) (ces deux endpoints peuvent être complétés en une seule étude), toxicité aigüe sur les poissons, inhibition respiratoire sur boue activée.

- De 100 à 1000 TPA, annexe IX : toxicité subchronique, toxicité sur le développement prénatal,

toxicité pour la reproduction, toxicité chronique sur invertébrés et poissons, bioaccumulation dans une espèce aquatique, toxicité aigüe pour les invertébrés terrestres, les micro-organismes du sol et les plantes terrestres.

- Plus de 1000 TPA, annexe X : étude sur cellule somatique in vivo si résultat positif d’une étude

de génotoxicité in vitro, Toxicité pour le développement, toxicité pour la reproduction sur une génération, étude de carcinogénicité, toxicité à long terme pour les invertébrés terrestres et pour les plantes, toxicité à long terme pour les organismes vivant dans les sédiments, toxicité à long terme ou toxicité pour la reproduction chez les oiseaux.

Toute cette batterie de tests de toxicité et d’écotoxicité fait souffrir des animaux vertébrés, protégés sous le règlement REACH, c’est pourquoi, les industriels sont encouragés à utiliser des méthodes alternatives (NC3Rs, n.d.), telles que les méthodes in vitro. Cependant, ces alternatives, qui ne remplacent pas directement les études sur animal, coûtent souvent très cher et ceci explique pourquoi les industriels recherchent d’autres méthodes qui n’utilisent pas les modèles animaux ou impliquent des expériences en laboratoire. Des méthodes telles que les approches par analogie et les (Q)SARs, ou les approches par analogie (read-across), qui permettent de se servir des données déjà existantes sur des substances similaires, ou appartenant à une même catégorie, pour générer une prédiction pour la substance d’intérêt.

Dans le cas de l’utilisation des méthodes in silico, les (Q)SARs et les approches par analogie, il convient de s’assurer que la substance d’intérêt est toxique par le même processus que la ou les substances qui servent à générer la prédiction de toxicité. En effet, il a été montré que la toxicité sur les poissons par exemple nécessitait différents coefficients de régression, voire différents descripteurs pour prédire la toxicité par un modèle QSAR (Russom et al., 1997). Cela implique que pour une même valeur de logP (coefficient de partage octanol-eau), la valeur de la toxicité est différente pour deux substances qui exercent leur toxicité par un processus biologique différent. Ainsi, si ce processus pour une molécule test est mal connu, un modèle QSAR inapproprié pourra être utilisé, qui donnera finalement une valeur de toxicité erronée.

2) MechoAs vs MoAs

Dans ce travail, nous allons distinguer deux appellations très proches, dont la signification n’est pas toujours différente, ou pas définie de la même manière dans la littérature. Ces deux termes sont mode d’action (MoA, pour « Mode of Action » en anglais) et mécanisme d’action (MechoA pour « Mechanism of Action » en anglais).

Pour expliquer la différence entre ces deux termes, il est nécessaire d’expliquer préalablement le concept d’AOP (European Commission - DG Joint Reseach Centre and U.S. Environmental Protection Agency, n.d.) (« Adverse Outcome Pathway »). Cela désigne une séquence d’évènements au sein de l’organisme qui vont aboutir à un effet nocif pour l’organisme ou la population. On distingue notamment l’évènement moléculaire déclencheur (« molecular initiating event » en anglais) qui est le premier évènement clef qui va entraîner toute la cascade d’évènements aboutissant à l’effet nocif, et qui décrit le mécanisme au niveau moléculaire. Quelques exemples d’évènements moléculaires déclencheurs suivent :

- Accumulation des molécules dans les membranes cellulaires (pour l’AOP narcose)

- Inhibition de l’acétylcholinestérase (pour l’AOP inhibition de l’AChE conduisant à la mortalité

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- Liaison covalente aux protéines (pour l’AOP sensibilisation cutanée).

Dans le cadre de ces AOPs, les mécanismes d’action se concentrent sur le début de la séquence, alors que les modes d’action se concentrent sur la fin de la séquence. Plus précisément, le mode d’action regroupe les substances en fonction des effets nocifs qu’elles induisent, mais aussi la relation entre la valeur de toxicité et un descripteur de l’hydrophobie de la substance (en général le logP). En effet, certaines substances auront le même type d’effets, mais se positionneront sur une droite (un modèle QSAR) différente lorsqu’on trace leur toxicité en fonction de leur logP. Par exemple, le mode d’action de la narcose non-polaire regroupe les substances qui ont un effet (sur les poissons) d’activité locomotrice réduite, une coloration plus sombre, et une mort rapide en 24h (sauf pour les substances très hydrophobes pour lesquelles l’équilibre thermodynamique est plus long à atteindre), et dont la toxicité est bien décrite par les modèles QSAR de la narcose non-polaire (Russom et al., 1997). En revanche, le mécanisme d’action regroupe les substances en fonction de l’évènement moléculaire déclencheur qu’elles exercent.

C’est donc pour une bonne utilisation des modèles QSARs et approches par analogies que la connaissance des mécanismes ou modes d’action sont importants. Cepdendant, la connaissance des MechoAs par une prédiction basée uniquement sur la structure moléculaire trouve aussi une application dans une approche de chimie médicinale, afin de développer de nouvelles molécules candidates à visée thérapeutique. En effet, même si dans ce travail nous visons principalement les mécanismes d’action toxique, il faut souligner que ce qui est toxique dans les conditions extrêmes des tests de toxicité, peut être salvateur dans des conditions de maladie ou d’empoisonnement par un mécanisme complémentaire, avec des doses ajustées afin de profiter de l’action thérapeutique sans subir des effets toxiques prononcés. Par exemple, un anticholinergique, un antagoniste de l’acétylcholine (structure en Figure 25) au niveau des récepteurs des terminaisons nerveuses, est un médicament d’urgence pour contrecarrer l’effet des agents innervants, qui inhibent l’acétylcholinestérase. En effet, l’acétylcholinestérase étant bloquée, il y a un excédent d’acétylcholine qui apparait au niveau de la fente synaptique, entraînant une surstimulation des neurones. Un anticholinergique va empêcher cette acétylcholine excédentaire d’agir sur les récepteurs et ainsi bloquer l’effet de l’agent innervant le temps que celui-ci soit éliminé par l’organisme (IPCS Inchem, 2002).

3) Différentes classifications et modèles de prédiction de

MechoAs/MoAs

Il existe dans la littérature plusieurs classifications en MoAs ou MechoAs, et des modèles pour les prédire. Relativement peu de modèles sont construits de manière à être applicables à l’ensemble des substances organiques. La plupart des méthodes sont développées pour une famille réduite de composés, comme par exemple celle des phénols. Une revue des modèles existant est présentée ci-après. Cette liste est bien sûr non exhaustive, mais couvre les classifications et modèles les plus connus ainsi que quelques autres exemples.

a) Classifications et modèles sur les composés organiques en général

Tout d’abord, le schéma de Verhaar (Verhaar et al., 1992), est la méthode utilisée par les écotoxicologues de manière générale. Ce modèle a été publié en 1992, puis a subi des mises à jour (Enoch et al., 2008). Aujourd’hui, cette méthode peut être utilisée via plusieurs interfaces (ToxTree (Patlewicz et al., 2014, 2008), OECD QSAR Toolbox (OECD and ECHA, 2017)) soit sous sa forme originale,

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soit le schéma mis à jour en 2008 (Enoch et al., 2008). Ce schéma classifie les substances en 4 modes d’action :

- MoA 1 : narcose non-polaire ou toxicité de base

- MoA 2 : narcose polaire ou composés moins inertes

- MoA 3 : réactivité non spécifique

- MoA 4 : composés agissant spécifiquement

Il faut noter que lorsque ce modèle est utilisé via les interfaces des logiciels cités ci-dessus, il y a une cinquième catégorie définie comme suit : MoA 5 : impossible à classer avec ces règles.

Une autre méthode de classification qui s’applique aux composés organiques en général est la méthode de Russom et al., 1997, qui prédit les modes d’action sur le poisson, basé uniquement sur des études sur le poisson tête de boule (Pimephales promelas, Rafinesque, 1820). Cette méthode classifie les composés en 8 catégories :

- Narcose de base ou narcose I

- Narcose polaire ou narcose II

- Narcose des ester ou narcose III

- Découplage de la phosphorylation oxydative

- Inhibition de la respiration

- Réactivité électrophile/proélectrophile

- Inhibition de l’AChE

- Crise du système nerveux central

Plus récemment, une classification en MechoAs plus poussée a été publiée (Barron et al., 2015), qui regroupe une grande variété de substances : des métaux, organométalliques, pesticides et autres molécules organiques. Les composés sont classés en 6 MoAs généraux et 31 MoAs spécifiques grâce à des études sur poissons et invertébrés aquatiques, des QSARs, et d’autres données de la littérature.

- Narcose (non-polaire, polaire, ester)

- Inhibition de l’AChE (carbamate, organophosphate)

- Inhibition du transport d’électrons (découplage de la phosphorylation oxydative, inhibition de

la phosphorylation oxydative, inhibition de la respiration de l’arsenic)

- Détérioration de l’iono/osmorégulation/circulation (anticoagulation, méthémoglobinémie,

détérioration de l’iono/osmorégulation des métaux, autre osmorégulation)

- Réactivité (acrylate, alkylation, carbonyle, chromate, cyanure/nitrile, di/trinitroaromatique,

hydrazine, phosphure, autre)

- Neurotoxicité (antagonisme GABA acyclique, antagonisme GABA des pyrazoles, modulation

des canaux à sodium du diphényle, modulation des canaux à sodium des pyréthroïdes, agonisme du GABA, agonisme du nAChR, blocage des canaux à sodium, strychnine, autre) Une méthode de prédiction des MechoAs du même groupe de recherche a été publiée 2 ans avant cette classification (Martin et al., 2013), en utilisant uniquement une partie des MechoAs présentés ci-dessus. Cette méthode est construite à partir de descripteurs de tout type (expérimental, topologique, électronique), et prédit les MechoAs dans le poisson.

b) Classifications et modèles sur des familles restreintes

Karabunarliev et al. ont publié en 1996 (Karabunarliev et al., 1996) une méthode de prédiction des MoAs grâce à des descripteurs quantiques. Cette méthode est limitée aux dérivés du benzène, basée sur les MoAs de Russom et al. (même équipe, article de Russom et al., 1997 déjà soumis mais non

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encore publié), pour deux espèces de poisson, le tête de boule (Pimephales promelas) et le guppy (Poecilia reticulata, Peters, 1859).

Bearden et Schultz ont publié en 1997(Bearden and Schultz, 1997) une méthode de prédiction des MoAs avec un mélange de descripteurs expérimentaux et quantiques, aussi limitée aux dérivés du benzène, à partir de données sur un poisson (Pimephales promelas) et un protozoaire cilié (Tetrahymena pyriformis, Ehrenberg, 1830). Cette méthode classifie les composés en 6 catégories :

- Narcotiques non-polaires

- Phénols narcotiques polaires

- Electrophiles mous

- Acides faibles découpleurs de la respiration

- Proélectrophiles

- Anilines narcotiques polaires

Une méthode de prédiction des MoAs des phénols a été publiée par Ren en 2003 (Ren, 2003), basée sur des études de toxicité sur le protozoaire Tetrahymena pyriformis, et utilisant des descripteurs expérimentaux, topologiques et électroniques.

On peut aussi citer des méthodes de prédiction plus restreintes dans leur domaine d’étude, mais aussi plus poussées dans ce domaine spécifique : celle de Benigni et al. (Benigni et al., 2013, 2007) pour prédire le risque de cancérogénicité et mutagénicité (modèle utilisant des informations provenant de tests sur animaux, tests sur cellules de bactérie, et QSARs), celle de Kazius et al. (Kazius et al., 2005) pour prédire la mutagénicité (à partir du test d’Ames, effectué sur des cellules de bactérie), celle de LoPachin et Gavin (LoPachin and Gavin, 2014) pour déterminer le MechoA des aldéhydes, celle de Spycher et al. (Spycher et al., 2008) pour déterminer si les composés sont des découpleurs de la phosphorylation oxydative.

4) Objectifs de la thèse

Un objectif principal de cette thèse était de développer la première méthode fiable de classification globale qui pourrait être utilisée pour n’importe quelle molécule organique (et plus dans un second temps), aussi bien pour l’écotoxicologie que pour la toxicologie. Nous voulions principalement montrer la valeur ajoutée par rapport au schéma de Verhaar, qui, malgré les mises à jour, présente un taux d’erreur encore élevé et un domaine d’applicabilité assez restreint. En effet, c’est la méthode de prédiction utilisée par la majorité des écotoxicologues, qui est disponible gratuitement, et construite sous forme d’arbre de décision avec des règles de type alertes structurales (topologiques) simples, ce qui le rend attractif pour le plus grand nombre. Nous voulions aussi créer une classification qui organise les substances dans des catégories qui permettent de choisir le modèle QSAR adapté et spécifique à un MechoA (sous-catégories de MechoA). Cette thèse se concentre principalement sur les mécanismes d’action qui induisent des effets significatifs lors des tests de toxicité aigüe (4 jours pour les poissons, 14 jours pour les rats en toxicité orale, 2 jours pour les daphnies, etc.), car ils sont plus facilement observables et attribuables à une exposition donnée que pour les effets chroniques, et surtout les données de toxicité aigüe sont plus abondantes. Quelques données chroniques ont néanmoins été incluses dans ce travail.

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Chapitre 2 : Revue bibliographique des

mécanismes d’action

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Un des travaux les plus importants dans cette thèse fut de collecter des informations sur les mécanismes d’action des substances dans divers organismes de manière la plus complète possible. Il est difficile d’en faire l’état de manière structurée sans en faire une liste fastidieuse à suivre. Nous avons fait le choix ici de classer ces informations en mécanismes d’action généraux regroupant plusieurs mécanismes d’action spécifiques similaires. L’identifications de tous ces mécanismes le plus précisément possible était primordiale pour attribuer une classification correcte aux diverses substances. Les mécanismes bien reconnus qui ont été identifiés dans ce travail seront bien détaillés dans ce chapitre, alors que les mécanismes mal connus seront simplement évoqués.

Les molécules non triviales citées dans ce document sont associées à un numéro (en gras dans le texte), et les structures de ces molécules, référencées par numéro, sont représentées en Figure 42 : planche de structures moléculaires.

1) Narcose

La narcose est un processus non spécifique, non réactif, que chaque molécule organique peut exercer, avec un potentiel différent (Verhaar et al., 1992). Le principe de ce MechoA est une simple accumulation de molécules xénobiotiques dans les membranes cellulaires, qui sont des bicouches lipidiques. Du fait de l’accumulation de ces molécules xénobiotiques dans la membrane, celle-ci est perturbée jusqu’à un point où elle ne remplit plus son rôle (maintien du contenu de la cellule, contrôle du flux de molécules vers et depuis la cellule) correctement. Cela peut se manifester par une perte d’intégrité physique, et donc une rupture de l’enveloppe cellulaire qui maintient le cytosol. Cela peut aussi être le fait que certaines protéines membranaires essentielles (comme les canaux à ions ou les protéines de type GPCR) ne fonctionnent plus correctement, car un environnement perturbé modifie leur structure tridimensionnelle et ainsi leur fonctionnalité (Sikkema et al., 1995). Etant donné que les membranes cellulaires sont des compartiments hydrophobes, la propriété principale qui dirige la toxicité par ce mécanisme est l’hydrophobie des molécules, qui permet d’évaluer la proportion de molécules qui vont rester dans les compartiments aqueux (milieu extérieur pour les organismes aquatiques, liquide extracellulaire, cytosol) et la proportion qui vont s’accumuler dans les compartiments hydrophobes (membranes, tissus adipeux, vésicules lipidiques). L’hydrophobie est quantifiée en général par un coefficient de partage, principalement le coefficient de partage octanol-eau (logP), ou des coefficients de partage membrane-octanol-eau ou DMPC-octanol-eau. La DMPC 1 (DiMyristoylPhosphatidylCholine) est un des composants majoritaires des membranes cellulaires (Gobas et al., 1988). On peut aussi utiliser la solubilité aqueuse qui est bien corrélée au logP (Thomas

et al., 2015).

Le terme de narcose utilisé dans ce contexte est bien le même que lorsqu’on parle des substances narcotiques qui provoquent une anesthésie rapide et réversible. Et en effet, il a été montré que le pouvoir anesthétique des molécules était directement corrélé avec l’hydrophobie des substances, d’après la corrélation de Meyer-Overton (Lugli et al., 2009). Cela semblait indiquer que le mécanisme de cette narcose pourrait être simplement l’accumulation des molécules dans les membranes des cellules du cerveau. Ceci est possible avec les substances volatiles qui sont des petites molécules neutres et légèrement polaires telles que l’éther diéthylique ou le chloroforme. Malgré tout, aujourd’hui plusieurs études sur les mécanismes de l’anesthésie semblent montrer que les narcotiques ciblent au contraire des protéines spécifiques (telles que des canaux à ions), grâce à une poche de liaison peu spécifique (Lugli et al., 2009).

a) Narcose non-polaire

La narcose non-polaire, ou toxicité de base, est le mécanisme d’action qui génère la plus faible toxicité, au moins pour les substances les moins hydrophobes (Verhaar et al., 1992). En effet, à même solubilité,

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ou même coefficient de partage logP, c’est le mécanisme qui cause la toxicité la plus faible (i.e. log (1/CE50) le plus faible). C’est ce qu’on observe sur la Figure 1 qui présente différents modèles QSARs superposés, extraite d’une revue des QSARs pour la toxicité environnementale (Dearden, 2002).

Figure 1 : superposition de modèles QSARs pour la toxicité environnementale. LC50 dans cette figure = CL50 pour le poisson à 96h. Figure tirée de (Dearden, 2002).

Le mécanisme de la narcose non-polaire a pu être compris et caractérisé grâce au développement de modèles QSAR et mis en évidence par quelques expériences. Le principe fondamental qui est lié au fonctionnement de la narcose non-polaire est celui de l’activité chimique. L’activité chimique correspond à la dose réelle qui sera présente au niveau du site d’action (membrane des cellules dans le cas de la narcose non-polaire). En effet, en convertissant la dose d’exposition des organismes en activité chimique, on constate que l’effet toxique dû à ce mécanisme intervient à une même valeur d’activité quelle que soit la substance testée (Ferguson, 1939; Mackay et al., 2009). Du côté plus expérimental, De Sousa et al. (de Sousa et al., 2012) ont exposé des bactéries fluorescentes

(Pseudomonas fluorescens, Migula, 1985) dans des milieux contenant du carvacrol 2 (

2-méthyl-5-(propan-2-yl)phénol) et du 1,8-cinéole 3 (1,3,3-triméthyl-2-oxabicyclo[2,2,2]octane) seuls ou en mélange. Ils ont observé les cellules ainsi exposées avec un microscope électronique à transmission et à balayage. Ils ont pu constater que les deux substances perturbaient l’intégrité de la membrane, et des trous apparaissaient, laissant s’échapper le cytosol hors de la cellule. Le 1,8-cinéole est un éther simple, exerçant a priori la narcose non-polaire (Enoch et al., 2008), et le carvacrol est un phénol simple, exerçant a priori la narcose polaire comme tous les autres phénols qui ne sont substitués que par des chaînes alkyles (Enoch et al., 2008). Ces images de microscopie sont donc vraisemblablement une visualisation de l’effet de la narcose non-polaire et polaire. Elles sont présentées en Figure 2.

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Figure 2 : bactéries P. fluorescens vues au microscope électronique à transmission (colonne de gauche) et à balayage (colonne de droite) suite à l’exposition (a-b) contrôle sans carvacrol ni 1,8-cinéole, (c-d) avec carvacrol, (e-f) avec 1,8-cinéole.

Figure tirée de de (de Sousa et al., 2012).

Ainsi, comme la narcose est un mécanisme non spécifique, que toutes les molécules peuvent exercer avec un potentiel différent, ce mécanisme est celui qui dirige la toxicité des substances dites inertes, c’est-à-dire celles qui n’agissent pas par un autre mécanisme d’action toxique. Le terme de substances inertes est un abus de langage car elles sont quand-même toxiques, et on lui préférera le terme narcose ou toxicité de base. C’est le cas pour les familles chimiques suivantes (avec des exceptions) : les hydrocarbures, les cétones, les alcools, les éthers et les versions halogénées de ces types de molécules principalement (Ellison et al., 2015).

D’autres auteurs ont compilé une excellente revue des différentes hypothèses pour expliquer le fonctionnement de la narcose non-polaire ou anesthésie générale (Franks and Lieb, 1982). Selon ces auteurs, l’hypothèse de la perte d’intégrité des membranes par accumulation des molécules

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xénobiotiques dans celle-ci n’est pas la plus cohérente en fonction des résultats d’études mécanistiques expérimentales. Ces auteurs expliquent qu’une hypothèse plus prometteuse est que les molécules de narcotique se partitionnent dans des sites de liaison amphiphiles (possédant une partie hydrophobe et une partie hydrophile) de certaines protéines spécifiques, perturbant légèrement leur organisation spatiale, empêchant leur activité normale. Ces sites de liaisons peuvent être les interfaces entre les sous-unités d’une même protéine par exemple, comme il a pu être mis en évidence avec l’hémoglobine. Une protéine dont l’activité est perturbée par des faibles concentrations de substance, et pour une gamme assez diverse de narcotiques est la luciférase (Franks and Lieb, 1982).

b) Narcose polaire

Le mécanisme de la narcose polaire est considéré comme étant très similaire à celui de la narcose non-polaire – d’où le partage du terme narcose – bien qu’une différence de toxicité significative soit observée à même hydrophobie (Figure 1) (Escher and Hermens, 2002; Verhaar et al., 1992). Ce mécanisme est exercé principalement par les phénols et anilines simples, mais aussi certaines amines et des hétéroaromatiques azotés (Ellison et al., 2015).

On peut constater que les effets du carvacrol 2, narcotique polaire, étaient similaires à ceux du 1,8-cinéole 3, narcotique non-polaire, sur la Figure 2, si ce n’est qu’une concentration plus faible était nécessaire pour observer ces effets (de Sousa et al., 2012).

La séparation entre narcose non-polaire et polaire reste en fait assez floue. En effet, on peut constater que des familles de molécules polaires sont incluses dans les narcotiques non-polaires, telles que les alcools, les cétones et certaines amines, alors que les phénols et anilines simples constituent la majorité des narcotiques polaires. Certaines pyridines semblent être dans la première catégorie, et d’autres dans la deuxième (Ellison et al., 2015). Certains auteurs considèrent que la séparation entre les deux est liée à la polarisabilité des molécules ou encore à leur capacité à former des liaisons hydrogène fortes (Roberts et al., 2013).

D’autres auteurs (Vaes et al., 1998) ont aussi suggéré que la différence entre les deux catégories était simplement liée au fait qu’on utilise le logP comme modèle pour quantifier l’équilibre de partition des molécules entre les liquides aqueux et les membranes cellulaires. En effet, le logP assimile l’octanol aux lipides membranaires. Des expériences ont été menées en remplaçant l’octanol par la DMPC 1 (phosphatidylcholine de dimyristoyle), un composant majoritaire des membranes cellulaires. En traçant (Figure 3) la toxicité pour les poissons (logCL50) en fonction du coefficient de partage

octanol-eau, noté ici logKow, puis en fonction du coefficient de partage DMPC-eau, logKDMPC, les droites de la

narcose non-polaire et de la narcose polaires se sont rejointes en une seule et même droite (Vaes et

al., 1998). Enfin, d’autres auteurs (Endo et al., 2013; Escher and Hermens, 2002) ont modélisé les

organismes en plusieurs compartiments (lipides de stockage, membranes cellulaires, albumine, protéines musculaires, eau) et expliquent que la différence entre la narcose non-polaire et polaire vient d’une répartition différente dans ces compartiments variés qui n’est pas prise en compte par le logP.

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Figure 3 : concentrations léthales médianes (CL50) pour le guppy et le tête de boule pour les narcotiques non polaires (carrés

pleins) et polaires (carrés vides) en fonction de a) leur logP et b) leur logKDMPC. Figure tirée de (Vaes et al., 1998).

2) Narcose des esters ou pronarcose

Veith et ses collaborateurs(Veith and Broderius, 1987) ont pu identifier que les esters simples (voir la structure d’un ester à gauche de la Figure 4) provoquaient un symptôme comportemental similaire à la narcose. De plus, ces composés sont peu réactifs en milieu aqueux neutre. Cependant, lorsque leur toxicité a été tracée en fonction de leur logP, ils se sont révélés être plus toxiques que les narcotiques non-polaires et polaires de même logP. Tout cela a conduit ces auteurs à décrire le MoA des esters comme un troisième type de narcose : la narcose des esters. Cette classe a été reprise dans la classification de Russom (Russom et al., 1997).

Par ailleurs, Jaworska et al. (Jaworska et al., 1995) ont montré, grâce à des études sur protozoaire (Tetrahymena pyriformis) et sur poisson (Pimephales promelas) et des analyses QSAR, que les esters se comportaient comme des narcotiques non-polaires pour le protozoaire, alors qu’ils étaient significativement plus toxiques que la narcose de base pour le poisson. Cette observation a été expliquée avec l’hypothèse que ces protozoaires ne métabolisent pas, ou trop lentement, les esters, alors que les poissons ont des estérases bien actives qui vont hydrolyser les esters (Figure 4). Cette hydrolyse déplace l’équilibre de concentrations en ester entre le milieu externe et le poisson, puisque l’ester est consommé au fur et à mesure par l’hydrolyse. En conséquence, une quantité plus importante que si l’ester était inerte va pénétrer dans le poisson, entraînant une plus forte toxicité.

Figure 4 : hydrolyse enzymatique des esters. R1=H ou Alkyle, R2=Alkyle.

Il peut être intéressant de préciser que suite à l’hydrolyse, on obtient des composés moins hydrophobes que l’ester parent, tel que mis en évidence avec l’exemple montré dans le Tableau 2 :

Figure

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Références

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