Pépite | Identification de mécanismes moléculaires augmentant le potentiel thérapeutique des canaux calciques ORAI et des pompes SERCA

Texte intégral

(1)Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. Université Lille1 Sciences et Technologies N° d’ordre 41570. Année 2014 THESE Présentée pour obtenir le grade de. DOCTEUR DE L UNIVERSITE LILLE1 SCIENCES ET TECHNOLOGIES Discipline : Aspects moléculaires et cellulaires de la Biologie. IDENTIFICATION DE MECANISMES MOLECULAIRES AUGMENTANT LE POTENTIEL THERAPEUTIQUE DES CANAUX CALCIQUES ORAI ET DES POMPES SERCA. Thèse dirigée par le Docteur Fabien Vanden Abeele Présentée et soutenue publiquement par Charlotte Dubois Le jeudi 4 décembre 2014. Rapporteurs : Dr Thierry Capiod, Chargé de recherche INSERM, Université Paris V, FR Dr Geert Bultynck, Professeur Associé, Université KU Leuven, BEL Membres du Jury : Pr Natalia Prevarskaya, Professeur des Universités, Lille, FR Pr Robert Alain Toillon, Professeur des Universités, Lille, FR Pr Jesper Vuust Moller, Professeur émérite, Université d’Aarhus, Aarhus, DK Pr Bertrand Tombal, Professeur des Universités, Praticien Hospitalier (PU-PH), Louvain, BEL 1 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(2) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. Résumé Le développement tumoral requiert des « caractéristiques » moléculaires bien identifiées. En ce qui concerne le cancer de la prostate, il est bien connu qu’il se caractérise par une grande hétérogénéité avec en particulier un nombre important de cellules en quiescence ce qui se traduit notamment par une prolifération certes aberrante mais très lente (Denmeade et al., 2003). Ce cancer peut se développer pendant plusieurs décennies avant de provoquer des symptômes chez les patients. Ainsi, de nombreux traitements anti-cancéreux qui ciblent spécifiquement les cellules en prolifération s’avèrent peu efficaces et aujourd’hui les formes avancées de ce cancer sont donc incurables. Cette inefficacité des traitements chimiothérapeutiques est aussi une conséquence d’un phénomène de résistance à l’apoptose dont l’origine s’explique encore une fois en partie grâce à l’hétérogénéité de ce cancer. En conséquence, une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires à l’origine du phénomène de résistance à l’apoptose et de la dérégulation de la prolifération est nécessaire. En outre, l’identification de thérapeutiques permettant de cibler l’hétérogénéité tumorale est également une priorité. Dans ce contexte, nous avons mis en évidence le rôle déterminant des protéines ORAI1 et ORAI3 dans un remodelage de l’homéostasie calcique qui participe à l’émergence d’un phénotype cancéreux plus agressif. Nous avons découvert le mécanisme à l’origine de la formation d’un canal constitué des protéines ORAI1 et ORAI3 permis par : (1) la surexpression de la protéine ORAI3 et (2) des perturbations du microenvironnement tumoral au cours de la progression tumorale. Ce canal calcique hétéromérique ORAI1/ORAI3 est activé par l’acide arachidonique et la formation préférentielle de ces hétéromères au cours de la cancérogenèse se fait au détriment des canaux homomériques ORAI1 connus pour jouer un rôle crucial dans l’induction de la mort cellulaire des cellules cancéreuses. Ces résultats mettent en lumière un nouveau rôle du métabolisme perturbé de l’acide arachidonique connus depuis longtemps pour participer à la progression tumorale et le remodelage de l’homéostasie calcique via les protéines ORAI avec la formation des complexes hétéromérique pro-prolifératifs ORAI1/ORAI3 au détriment des canaux homomériques proapoptotiques ORAI1. En parallèle nous avons étudié les mécanismes d’action d’une nouvelle pro-drogue très prometteuse en cours d’évaluation clinique, le G-202® (Genspera, USA), et qui permet de cibler l’hétérogénéité tumorale. Le G-202® est capable d’induire un stress calcique réticulaire et la mort par apoptose des cellules cancéreuses quiescentes ou prolifératives. La molécule active de cette prodrogue est un analogue de la Thapsigargine (TG), un inhibiteur des pompes SERCA du réticulum endoplasmique, dont la forte action cytotoxique est connue depuis longtemps. Nous avons découvert un nouveau mécanisme d’action de la TG que son analogue le G-202® ne possède plus. Cette découverte nous a permis premièrement d’augmenter considérablement l’efficacité du G-202® utilisé seul in vitro et in vivo sur des modèles murins (Brevet en cours de dépôt) et deuxièmement d’élaborer un nouveau type de thérapies combinées et ciblées augmentant considérablement l’efficacité de nombreux traitements chimiothérapeutiques actuels sur des cellules résistantes. Enfin, d’un point de vue fondamental, le G-202® nous a permis de remettre en question les mécanismes de la signalisation calcique intracellulaire impliqués dans l’induction de l’apoptose. En conclusion, grâce à ces études nous avons identifié de nouveaux mécanismes moléculaires permettant d’augmenter le potentiel thérapeutique des canaux calciques ORAI et des pompes SERCA du réticulum endoplasmique.. 2 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(3) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. ABSTRACT Tumor development requires clearly identified molecular "features". With regard to prostate cancer, it is well known that it is characterized by its heterogeneity with a large number of cells in quiescence whom results are aberrant but certainly very slow proliferation (Denmeade et al. 2003). This cancer can grow for decades before causing symptoms in patients. So many anti-cancer treatments that specifically target proliferating cells are not very effective; it’s why advanced forms of prostate cancer are incurable. The ineffectiveness of chemotherapy treatments is also a consequence of the phenomenon of resistance to apoptosis whose origin is partly due to the heterogeneity of this cancer. Accordingly, a better understanding of the molecular mechanisms underlying resistance to the phenomenon of apoptosis and deregulation of proliferation is needed. Furthermore, the identification of therapeutic target for tumor heterogeneity is also a priority. In this context, we have highlighted the key role of protein ORAI1 and ORAI3 in remodeling of calcium homeostasis involved in the emergence of a more aggressive cancer phenotype. We have discovered the mechanism behind the formation of a channel consisting of proteins ORAI1 and ORAI3 permit by (1) the overexpression of ORAI3 protein and (2) perturbation of the tumor microenvironment during tumor progression. This heteromeric calcium channel ORAI1/ORAI3 is activated by arachidonic acid and the preferential formation of these heteromeric channels during carcinogenesis disfavoring ORAI1 homomeric channels known to play a crucial role in the induction of cell death in cells cancer. These results highlight a new role of disturbed arachidonic acid metabolism known to participate in tumor progression and remodeling of calcium homeostasis via ORAI proteins with the formation of pro-proliferative heteromeric complexes ORAI1/ORAI3 to expense of homomeric channels proapoptotic ORAI1. In parallel we studied the mechanisms of action of a very promising new pro-drug undergoing clinical evaluation, the G-202® (Genspera, USA), which allows the targeting of tumor heterogeneity. The G-202® is capable of inducing a stress reticular calcium and apoptotic death of resting and proliferating cancer cells. The active molecule of this prodrug is an analogue of thapsigargin (TG), an inhibitor of the endoplasmic reticulum SERCA pumps, whose strong cytotoxic effect has long been known. We discovered a novel mechanism of action of the TG that its analog G-202® no longer possesses. This discovery allowed us firstly to significantly increase the efficiency of the G-202® alone in vitro and in vivo mouse models (patent pending) and secondly to develop a new type of combination therapies and targeted increasing considerably the efficiency of many current chemotherapeutic treatments on resistant cells. Finally, from a fundamental point of view, the G-202® allowed us to question the mechanisms of intracellular calcium signaling involved in the induction of apoptosis. In conclusion, from these studies we have identified new molecular mechanisms to increase the therapeutic potential of calcium channels and pumps ORAI SERCA of the endoplasmic reticulum.. 3 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(4) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. GLOSSAIRE AA (acide Arachidonique) ADN (acide désoxyribonucléique) AIF (apoptosis Inducing Factor) AMPK (AMP-activated protein kinase) ARC (Arachidonic acid Regulated calcium channels) ARNi (acide ribonucléique interférent) ARNm (acide ribonucléique messager) ATF6 (activating transcription factor 6) ATG5 (Autophagy protein 5) ATP (adénosine-5'-triphosphate) BCL-2 (B-cell lymphoma 2) BH3-only (BCL-2 Homology 3 only) CaM (calmodulin) CaMKK-bêta (Calcium/calmodulin-dependant protein kinase kinase beta) CD95 (cluster of differentiation 95) CDK4 (Cyclin-dependent kinase 4) CHOP (C/EBP protéine homologue) CHOP (C/EBP-homologous protein) CPA (acide indole cyclopiazonique alcaloïde) CRAC (Ca2+ release-activated Ca2+ Channels CREB1 (cAMP Responsive Element Binding protein 1) DAPK (Death-Associated Protein kinase) DFCP1 (Double FYVE-containing protein 1) DISC (death-inducing signaling complex) ECC (entrée capacitive de Ca2+ EDTA (Ethylène Diamine Tétra Acétique). 4 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(5) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. eIF2α (Eukaryotic Initiation Factor 2 α) ENCC (entrée non capacitative du calcium) ERAD (Endoplasmic-reticulum-associated protein degradation) FADD (Fas-associated death domain), FAK (Focal adhesion kinase) FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) GADD153 (Growth Arrest and DNA Damage inducible protein 153) HEK293 (Human Embryonic Kidney 293) HIF-1 (hypoxia inducible factor) HSC70 (Heat Shock Cognate protein70) HSP90 (Heat Shock Protein 90) IGF1/2 (Insulin-like Growth Factor-1/2) IP3 (Inositol 1,4,5 trisphosphate) IP3R (Inositol 1,4,5 trisphosphate receptor) IRE1 α (Inositol-requiring enzyme 1α) LAMP-2A (Lysosome-Associated Membrane Protein type 2A) LC3 (Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3) LCR4 (Leucotriènes C4) LH-RH (luteinizing hormone-releasing hormone) LNCaP (Lymph Node Carcinoma of the Prostate) MDR (Multi Drug Resistance) mTOR (mammalian Target Of Rapamycin) NFAT (Nuclear Factor of Activated T-cells) PDGF (Platelet-derived growth factor) PERK (protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase) PI3K (Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase) PKC (protein kinase C) 5 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(6) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. PLC (PhosphoLipase C ) PMCAs (Plasma Membrane Ca2+ATPase) PMSA (Prostate Membrane Specific Antigen) PSA (Prostate Specific Antigen) PTEN (Phosphatase and tensin homolog) PTP (Permeability Transition Pore) RB (Retino Blastoma) RE (Réticulum Endoplasmique) RIDD (regulated IRE1 dependent decay) ROC (Receptor-Operated Channels) ROS (Reactive Oxygen Species) RyR (Ryanodine Receptor) SERCA (sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase) SK3 (small conductance calcium-activated potassium channel 3) SMOC (Second Messenger-Operated Channels) SOAR (Stim1/Orai1 activating region) SOC (Store-Operated Channels) SOCE (Store Operated Ca2+ entry), SPCA (Secretory Pathway Calcium ATPase) STIM (Stromal Interacting Molecule 1) t-BHQ (2,5-Di-t-butyl-1,4-benzohydroquinone) TCR (T-cell receptor) TEM (Transition Epitéliale Mésenchymateuse) TG (Thapsigargine) TP53 (tumor protein p53) TRAF-2 (TNF receptor-associated factor 2) TRP (Transient Receptor Potential) 6 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(7) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. TRPC (Transient Receptor Potential Canonical) TRPML (Transient Receptor Potential mucolipin) TRPV (Transient Receptor Potential Vanilloid) TSC1 (tuberous sclerosis 1) TSC2 (tuberous sclerosis 2) UPR (Unfolded Protein Response) VOC (Voltage-Operated Channels). 7 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(8) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. REMERCIEMENTS Je tiens à exprimer mes sincères remerciements aux membres de mon jury de thèse Monsieur le Dr Thierry Capiod Je vous suis très reconnaissante d'avoir accepté d'être rapporteur de cette thèse et d'avoir consacré de votre temps à lire et à juger ce travail. Soyez assuré de mes profonds remerciements.. Monsieur le Dr Geert Bultynck I would like to thank you for being my reviewer and for the time you will dedicate to me for improving my manuscript. Your comments are of great value to me.. Monsieur le Dr Bertrand Tombal Je vous suis très reconnaissante d'avoir accepté d'être examinateur de cette thèse. Je suis honorée de vous présenter mes résultats et de pouvoir ainsi profiter de votre expertise. Soyez assuré de mes profonds remerciements.. Monsieur le Pr Robert Alain Toillon Je vous suis très reconnaissante d'avoir accepté d'être examinateur de cette thèse. Je suis honorée de pouvoir vous présenter l’ensemble de mes résultats et compter sur votre avis d’expert. Soyez assuré de mes profonds remerciements.. Monsieur le Pr Jesper Vuust Moller Dear Pr Vuust Moller, I would like to thank you for accepting to be part of my jury. I am honored to present the result of our collaboration in this thesis presentation.. 8 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(9) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. Mes premiers remerciements vont au Pr Natacha Prevarskaya pour m’avoir fait l’honneur de m’accueillir dans son laboratoire de recherche. Je vous suis extrêmement reconnaissante de m’avoir encadrée, conseillée et initiée au monde passionnant de la recherche. Je suis extrêmement chanceuse d’avoir eu une directrice aussi disponible que vous, et qui sait accorder autant de liberté. Merci de m’avoir donnée confiance en mes choix. Il y a des rencontres qui peuvent tout changer. En ce qui me concerne, la nôtre fait partie de celles là. Depuis mon master recherche sous ta direction, nous sommes devenus un binôme solide et d’une efficacité redoutable! Tu m’as guidée tout au long de ce parcours, non sans embuches, en m’accordant énormément de temps, de patience (oui les bretons ont leur petit caractère ! et non je ne suis pas autoritaire) ainsi que de liberté. Alors oui c’est épuisant de travailler avec toi, mais aujourd’hui grâce à toi j’ai toutes les armes pour continuer à avancer dans ce monde hostile mais passionnant qu’est la recherche. Alors merci Fabien de t’être tant investit et surtout d’avoir cru en moi dès le début ! Pendant plus de 3 années nous avons vécus ensemble … oui Slava en tant que colocataires de bureau ! Je voudrais te remercier pour tous ces bons moments, pour nos discussions scientifiques (ou non) et pour ta sincérité. Je te remercie également pour le soutien que tu m’as apporté tout au long de ces années. Nous étions quatre dans ce fameux bureau … Miss Maylis. Nous avons partagé ensemble le même périple qu’est la thèse dont notamment de superbes vacances… au labo ! Aujourd’hui ne sont pas nos jours (ni nos nuits) les plus sympas mais tout cela nous fera sourire dans quelques temps j’en suis sure ! Je tiens à remercier l’ensemble des membres actifs du laboratoire de physiologie cellulaire pour m’avoir aidé à réaliser ce travail de thèse. Toute fois, quelques remerciements particuliers s’imposent… Pour toutes ces « petites questions » parfois très matinales qui ont entrainées de petites réponses, je tiens à remercier Etienne (Je plains sincèrement les étudiants après votre départ ! et pas qu’eux en faite) ainsi que Christian pour leur immense aide technique et scientifique mais également pour leur bonne humeur permanente (ce qui n’est pas donné à tout le monde). J’ai énormément appris à vos côtés, tout un savoir que je vais garder précieusement ! Et non je ne serai pas de ceux qui partagent leurs protocoles ! Je remercie également Gilbert, dit Mr souris pour ses explications et son implication durant les séances d’expérimentations 9 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(10) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. animales ; et surtout pour son sens de l’humour ! (pour un public avertit). Merci également à Philippe pour sa rapidité et sa précision face à l’urgence. Une rigueur qui est un bien précieux, malheureusement rare … Je voudrais remercier également Anne Sophie et Gabriel pour tous leurs conseils très avisés. Je tiens à remercie Artem, pour toutes les discussions que nous avons eu et toutes les bonnes idées qui en sont ressorties ! Enfin je voudrai remercier Super Eric pour sa bonne humeur et son humour à la Sheldon Cooper. Penses à prendre des notes pour toutes tes VDM improbables ! J’ai adoré passer du temps avec toi, tu as énormément à dire et beaucoup de gens devrait d’avantage t’écouter. Toute thèse à ses galères … heureusement j’ai pu compter sur des amis exceptionnels. Amélie, tu es nécessaire à mon équilibre. A chaque étape de cette aventure tu as su m’écouter, me rassurer et me permettre d’avancer. Je ne pourrai jamais assez te remercier. Alexandra, ton soutien et ces longues heures de discussion (souvent autour d’un verre !) ont été inestimables durant ces années pas si simple, tant sur le plan professionnel que personnel. Je voudrai également dire merci à Lya. Ton point de vue est toujours très juste et remet bien souvent les choses en perspectives. Je vais faire un remerciement groupé, à toutes les femmes médecins (psychiatre, anesthésiste, et chirurgienne ortho entre autre) qui ont partagé un verre avec moi, et pour la bonne humeur qu’elles ont su me communiquer. Je vais terminer mes remerciements par ceux qui me supportent (dans tous les sens du terme) depuis pas mal de temps : ma famille. Papa, Maman. Ces dernières années n’ont pas été les plus simples ni les plus relax mais heureusement j’ai pu comme toujours compter sur votre soutien sans faille. Je me suis beaucoup investit dans ce travail de thèse et c’est vrai que les moments en famille se sont donc faire rares. Sachez que votre participation dans cette thèse est bien plus grande que vous ne l’imaginez. Et la meilleure pour la fin ! Margaux. Merci de me soutenir, de m’écouter à chaque fois que j’en ai besoin et surtout de croire en moi. Toute les grandes sœurs n’ont pas la chance de recevoir des conseils de vie aussi juste de leur petite sœur … alors encore merci.. 10 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(11) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. Work it harder make it better. Do it faster makes us stronger. More than ever hour after. Our work is never over. DAFT PUNK. 11 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(12) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. SOMMAIRE INTRODUCTION ................................................................................................................................. 16 I. CARACTERISTIQUES MOLECULAIRES ET CELLULAIRES DES CANCERS. ...................... 17 A. Echappement des cellules tumorales face aux suppresseurs de tumeurs et maintien des signaux cellulaires de prolifération. ................................................................................................................ 18 B. Résistance à l’apoptose. ................................................................................................................ 19 C. Capacité d’invasion et stimulation de l’angiogenèse. ................................................................... 21 D. Capacité réplicative illimitée : immortalité cellulaire. ................................................................. 22 E. Inflammation tumorale et réponse immunitaire. ........................................................................... 22 F. Instabilité génomique. ................................................................................................................... 23 G. Dérégulation des besoins énergétiques. ........................................................................................ 23 II. ENJEUX ACTUELS EN CANCEROLOGIE. ................................................................................. 24 A.. Mécanismes à l’origine des échecs thérapeutiques. .................................................................. 25 1. Mécanismes Généraux : ............................................................................................................ 25 2. L’autophagie : rôle complexe dans l’échappement thérapeutique. ........................................... 27. B. Utilisation des caractéristiques moléculaires et cellulaires des cancers pour le développement de nouvelles thérapies combinées et ciblées. .................................................................................... 28 III. ROLE DU CALCIUM DANS LA PROGRESSION TUMORALE. .............................................. 29 A. Calcium et homéostasie calcique.................................................................................................. 29 B. Implication des perturbations de l’homéostasie calcique dans l’acquisition des caractéristiques moléculaires et cellulaires des cancers. ............................................................................................. 33 1. Perturbations de l’homéostasie calcique et prolifération ........................................................... 35 2. Perturbations de l’homéostasie calcique et résistance à l’apoptose ........................................... 35 3. Perturbations de l’homéostasie calcique et migration ............................................................... 36 4. Perturbations de l’homéostasie calcique et angiogenèse ........................................................... 37 5. Perturbations de l’homéostasie calcique et autophagie : ........................................................... 38 IV. IMPLICATION DES CANAUX CALCIQUES ORAI DANS DEUX CARACTERISTIQUES MAJEURES DU CANCER LIEES A L’ECHAPPEMENT THERAPEUTIQUE. .............................. 41 A. Canaux calciques ORAI. .............................................................................................................. 41 1. Définitions et caractéristiques des canaux calciques CRAC et SOC. ....................................... 41 2. La Famille des canaux calciques ORAI. ................................................................................... 42 3. Mécanisme d’activation des canaux calciques de type SOC : les protéines STIM (STromal Interacting Molecule). ................................................................................................................... 42 Structure moléculaire .................................................................................................................... 42 Activation de type SOC des canaux ORAI ..................................................................................... 43 Stœchiométrie des protéines ORAI1 et STIM1 .............................................................................. 45 12 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(13) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. Activation non SOC des canaux ORAI : les canaux de type ARC ................................................. 46 Caractéristiques biophysiques principales des SOC/ARC ............................................................ 47 Nature moléculaire des canaux ARC ............................................................................................ 47 Récapitulatifs des mécanismes d’activation SOC et non SOC des protéines ORAI ...................... 48 B. Résistance à l’apoptose et canaux calciques ORAI ...................................................................... 49 1. Calcium et apoptose .................................................................................................................. 49 2. Rôle des protéines ORAI dans la résistance à l’apoptose ......................................................... 52 C. Prolifération et canaux calciques ORAI. ...................................................................................... 52 1. Calcium et prolifération. ............................................................................................................ 52 2. Rôle des protéines ORAI dans la prolifération cellulaire. ......................................................... 54 V. POMPES DE TYPE SERCA ET STRESS CALCIQUE : UNE NOUVELLE STRATEGIE THERAPEUTIQUE. ............................................................................................................................. 57 A. Enjeux actuelles : développer des stratégies thérapeutiques ciblant l’hétérogénéité tumorale. ... 57 B. Les pompes calciques de type SERCA. ........................................................................................ 57 1. Rôles des pompes SERCAs. ...................................................................................................... 57 2. Mécanismes moléculaires des pompes SERCAs....................................................................... 58 3. Modulateurs endogènes des pompes SERCAs. ......................................................................... 59 4. Les pompes SERCA dans le cancer. ......................................................................................... 59 5. Inhibiteurs des pompes SERCAs............................................................................................... 60 a. La Thapsigargine. ...................................................................................................................... 60 b. t-BHQ et CPA. .......................................................................................................................... 61 c. Saikosaponin-d. ......................................................................................................................... 61 C. Intérêts thérapeutiques de l’inhibition des pompes calciques de type SERCA par la Thapsigargine. ................................................................................................................................... 62 1. Inhibition des pompes SERCA et Stress calcique réticulaire. ................................................... 62 2. Inhibition des pompes SERCA et autophagie. .......................................................................... 65 D. La thapsigargine et ses analogues : un traitement en phase d’essais cliniques............................. 65 PROBLEMATIQUES ET OBJECTIFS ................................................................................................ 68 MATERIEL ET METHODES .............................................................................................................. 74 I. Culture cellulaire :.......................................................................................................................... 75 A. Conditions de culture. ............................................................................................................... 75 B. Création de modèles d’étude : .................................................................................................. 76 1. Lipofection des SiARN. ............................................................................................................ 76 2. Transfection cellulaire et création de lignées stables. ............................................................... 77 II. Viabilité cellulaire. ....................................................................................................................... 77 13 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(14) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. A. Dosage colorimétrique : test MTS. ........................................................................................... 77 B. Comptage cellulaire et quantification de la nécrose (coloration au bleu trypan). ..................... 78 C. Cycle cellulaire. ........................................................................................................................ 78 D. Activité du facteur de transcription NFAT (Nuclear factor of activated T-cells)..................... 79 III. Quantification de la mort cellulaire. ............................................................................................ 79 A. Coloration au Hoescht. ............................................................................................................. 79 B. Marquage de l’Annexin V : détection de l’apoptose précose. .................................................. 80 C. Potentiel mitochondrial : DIOC6 cytométrie en flux. ............................................................... 80 IV. Expérimentation animale. ............................................................................................................ 81 V. Analyse des échantillons. ............................................................................................................ 81 A. Etude de l’expression des ARNm. ............................................................................................ 81 1. Extraction d’ARNm. ................................................................................................................. 81 2. Traitement DNAse I (Desoxyribonucléase 1) et rétro-transcription. ........................................ 82 3. La PCR en temps réel (Q-PCR)................................................................................................. 82 B. Immunodétection. ..................................................................................................................... 82 1. Extraction des protéines. ........................................................................................................... 82 2. Biotynilation. ............................................................................................................................. 83 3. Western-Blot. ............................................................................................................................ 83 4. Immunohistochimie. .................................................................................................................. 84 C. Analyse par microscopie électronique. ......................................................................................... 85 VI. Mesure par imagerie calcique du calcium intracellulaire. ........................................................... 85 A. Caractéristiques de la sonde Fura-2. ......................................................................................... 86 B. Les systèmes de mesure. ........................................................................................................... 86 C. Charge des cellules en Fura-2/AM. .......................................................................................... 87 D. Le milieu d’enregistrement. ...................................................................................................... 87 VII. Le patch-clamp. .......................................................................................................................... 87 A. Généralités. ............................................................................................................................... 87 B. Solutions utilisées. .................................................................................................................... 88 RESULTATS ........................................................................................................................................ 89 Résumé Article 1 ................................................................................................................................... 90 ARTICLE 1: REMODELING OF CHANNEL-FORMING ORAI PROTEINS DETERMINES AN ONCOGENIC SWITCH IN PROSTATE CANCER............................................................................ 93 Résumé Article 2 ................................................................................................................................. 129. 14 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(15) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. ARTICLE 2: DIFFERENTIAL EFFECTS OF THAPSIGARGIN ANALOGUES ON APOPTOSIS OF PROSTATE CANCER CELLS: COMPLEX REGULATION BY INTRACELLULAR CALCIUM. ......................................................................................................................................... 132 Résumé Article 3 ................................................................................................................................. 155 ARTICLE 3: TARGETING APOPTOSIS BY THE REMODELING OF CALCIUM TRANSPORTING PROTEIN IN CANCEROGENESIS. .................................................................. 156 Résumé Article 4 ................................................................................................................................. 175 ARTICLE 4: MITOCHONDRIAL DEPOLARIZATION AND FISSION IN RESPONSE TO CALCIUM OVERLOAD ARE UNDER CONTROL OF AUTOPHAGY REVEALING A PRIMING MECHANISM OF CANCER CELLS TO CHEMOTHERAPY ........................................................ 178 DISCUSSIONS & CONCLUSIONS .................................................................................................. 199 I. ROLE DES PROTEINES ORAI DANS L’ACQUISITION D’UN PHENOTYPE CANCEREUX AGRESSIF. ......................................................................................................................................... 200 A. Nouveaux concepts en cancérogenèse. ....................................................................................... 200 B. ORAI1, ORAI3 et prolifération cellulaire. ................................................................................. 201 C. ORAI3 et microenvironnement tumoral ..................................................................................... 202 D. Rôle des protéines ORAI dans les caractéristiques (« Hallmarks ») du cancer de la prostate ... 203 E. Formation des canaux ORAI et rôle de la protéine STIM1. ....................................................... 203 II. STRESS CALCIQUE RETICULAIRE, AUTOPHAGIE & RESISTANCES AUX CHIMIOTHERAPIES. ........................................................................................................................ 204 A. Surcharge en calcium mitochondriale et voie intrinsèque d’induction de l’apoptose : mise en évidence du rôle crucial de l’autophagie. ........................................................................................ 204 B. Stress calcique et inhibition de l’autophagie : un nouveau mécanisme pour augmenter l’efficacité des chimiothérapies. ........................................................................................................................ 205 PERSPECTIVES ................................................................................................................................. 206 BIBLIOGRAPHIE .............................................................................................................................. 213 PUBLICATIONS, POSTERS & VALORISATION SCIENTIFIQUE .............................................. 230 1. Publications ................................................................................................................................. 231 2. Communications : Posters ........................................................................................................... 231 3. Valorisation des travaux .............................................................................................................. 233 4. Animation Scientifique................................................................................................................ 233. 15 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(16) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. INTRODUCTION. 16 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(17) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. I. CARACTERISTIQUES MOLECULAIRES ET CELLULAIRES DES CANCERS.. Les thérapies d’aujourd’hui ciblent des processus ou des caractéristiques bien définies du cancer. Des cibles potentielles que les Pr Hanahan et Pr Weinberg ont décrit en 2000 (Hanahan and Weinberg, 2000). Grâce à une revue approfondie de la littérature, ils ont défini les 6 caractéristiques du cancer (Hallmarks of cancer), des capacités distinctives et caractéristiques qui permettent le développement tumoral et la dissémination via le processus de métastase. Dix ans plus tard grâce à l’intensification de la recherche en cancérologie, ces mêmes auteurs ont ajouté à leur caractérisation initiale du cancer, de nouvelles caractéristiques émergeantes, des capacités pouvant être également utilisées comme cibles thérapeutiques (Schéma 1).. Schéma 1 : Caractéristiques de la cellule cancéreuse : Les cellules cancéreuses peuvent acquérir jusqu'à dix caractéristiques néfastes pour le fonctionnement normal de la cellule et qui vont ainsi promouvoir la progression tumoral. Ces nouvelles capacités sont autant de cibles potentielles dans le traitement du cancer indiquées par les symboles de couleurs. Schéma adapté d’après (Hanahan, 2014).. 17 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(18) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. A. Echappement des cellules tumorales face aux suppresseurs de tumeurs et maintien des signaux cellulaires de prolifération. Il s’agit là du trait le plus fondamental des cellules cancéreuses qui implique leur capacité à se maintenir dans un état de prolifération. En effet, les tissus sains/normaux contrôlent très finement la production et la libération des signaux de stimulation de croissance cellulaire, assurant ainsi une homéostasie du nombre de cellules et donc le maintien de l'architecture et la fonctionnalité tissulaire. Dans le cas d’une cellule cancéreuse, ces signaux sont dérégulés et conduisent à une prolifération anarchique. Les cellules cancéreuses peuvent acquérir un phénotype hyper-prolifératif non contrôlé via plusieurs mécanismes cellulaires. Elles peuvent synthétiser des ligands de facteurs de croissance auxquels elles répondent via la synthèse de récepteurs correspondant, stimulant une prolifération de type autocrine. Les cellules cancéreuses peuvent également grâce au support de l’environnement tumoral « envoyer » des signaux aux cellules normales qui peuvent en retour secréter d’autres facteurs de croissance vers les cellules cancéreuses (Bhowmick et al., 2004; Cheng et al., 2008). En plus d’une dérégulation de la secrétion de facteurs de croissance, on peut également observer dans des cellules cancéreuses une augmentation de l’expression ou de l’activité de ces récepteurs régulant les voies de la prolifération cellulaire. Des analyses de séquençage du génome à haut débit des cellules cancéreuses ont révélé des mutations somatiques fréquentes aboutissant à une activation constitutive des voies de signalisation habituellement déclenchées par l’activation de récepteurs de facteurs de croissance (Tomas et al., 2014). D’autres résultats ont également mis en évidence l'importance des mécanismes de rétrocontrôle. Dans les cellules normales, des boucles de rétroaction permettent de réguler les signaux cellulaires et ainsi réguler l’homéostasie de la cellule. Ainsi, des altérations de ces mécanismes de rétroaction sont également capables de renforcer la prolifération cellulaire. Un exemple très représentatif de cette régulation concerne la protéine oncogène Ras. Les effets oncogéniques de Ras ne résultent pas d’une hyper activation de cette protéine et donc d’une augmentation de sa voie de signalisation. Au contraire les mutations de Ras entrainement des perturbations de son activité GTPase qui fonctionne en condition normal comme un régulateur négatif de la prolifération cellulaire. En effet, en plus de leur capacité à stimuler et à maintenir un état de prolifération, les cellules cancéreuses doivent en parallèle contourner de puissants mécanismes cellulaires régulant négativement la prolifération. La majorité de ces mécanismes cellulaires dépendent de gènes appelés suppresseurs de tumeurs. Il existe des dizaines de suppresseurs de tumeurs qui opèrent de diverses manières afin de limiter la croissance et la prolifération cellulaire. Ces gènes ont été identifiés et validés comme de véritables 18 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(19) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. suppresseurs de tumeurs à travers des expériences de perte ou de gain de fonction dans des modèles de souris. Les deux suppresseurs de tumeurs les mieux caractérisés codent pour les protéines RB (retinoblastoma-associated) et TP53 (tumor protein p53). Ce sont des acteurs clé, complémentaires qui régulent les voies cellulaires conduisant les cellules vers la prolifération, mais aussi la sénescence et même l’apoptose. La protéine RB intègre divers signaux extracellulaires et intracellulaires qui vont permettre à la cellule d’entrer ou non dans son cycle de croissance et de division cellulaire (Burkhart et Sage, 2008; Deshpande et al., 2005. ; Sherr et McCormick, 2002) . Les cellules cancéreuses, dont les protéines RB sont défectueuses, ne sont plus contrôlées pour entrer dans le cycle cellulaire ce qui permet la persistance de la prolifération. Cette protéine RB intègre en majorité des signaux extracellulaires alors que TP53 reçoit des signaux de stress intracellulaires concernant l’endommagement du génome, l’état d’oxygénation, et des réserves énergétique (glucose, nucléotides) qui vont déterminer la progression ou l’arrêt du cycle cellulaire. Si les conditions ne sont plus favorables TP53 peut conduire la cellule vers l’apoptose. Les effets de TP53 sont donc extrêmement dépendants du contexte cellulaire et varient selon le type cellulaire, ainsi que par la gravité, la persistance des conditions de stress cellulaire et les dommages génomiques.. B. Résistance à l’apoptose. Le concept selon lequel la mort cellulaire programmée par apoptose est une barrière au développement du cancer a été établi par de nombreuses études fonctionnelles menées au cours des deux dernières décennies (Adams and Cory, 2007; Lowe et al., 2004). Ces études ont mis en évidence les différents signaux physiologiques pouvant conduire la cellule vers son entrée en apoptose. Parmi ces signaux on retrouve des niveaux élevés en oncogènes, des dommages à l’ADN, le tout souvent associé à une hyper-prolifération. De nombreuses études ont également mis en évidence une diminution de la capacité des cellules tumorales à entrer en apoptose dans les tumeurs de haut grade et celles qui résistaient aux chimiothérapies. La machinerie apoptotique est composée des plusieurs acteurs moléculaires qui interviennent à différentes phases du processus. Il existe deux grandes voies d’activation de l’apoptose : la voie extrinsèque qui reçoit et traite les signaux extracellulaires (Fas ligand/Fas receptor) et la voie intrinsèque qui intègre les différents signaux intracellulaires (Galluzzi et al., 2012). Une fois initiée, l’apoptose fait intervenir des protéases (les caspases) qui passent du stade latent 19 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(20) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. (pro-caspases) au stade activé via un clivage protéolytique. Une première vague de clivage va activer les caspases initiatrices (caspases 8 et 9) qui vont à leur tour activer les caspases 3 et 6 effectrices impliquées dans la phase d’exécution de l’apoptose. Durant cette phase, la cellule est progressivement « désassemblée » avec notamment la dégradation des protéines par le protéasome. Plusieurs « senseurs » d'anomalies jouant un rôle clé dans le développement de la tumeur ont déjà été identifiés (Adams and Cory, 2007; Lowe et al., 2004). Le plus remarquable est un senseur de dommages à l’ADN, le suppresseur de tumeur TP53 (Junttila and Evan, 2009). TP53 induit l'apoptose en favorisant l'expression de protéines proapoptotiques BH3-only (BCL-2 Homology) (NOXA et PUMA) en réponse à des cassures de l'ADN et autres anomalies chromosomiques. Ainsi, les cellules tumorales utilisent une grande variété de stratégies pour limiter ou contourner l'apoptose. La plus commune est la perte de fonction du suppresseur de tumeur TP53. La résistance à l’apoptose des cellules tumorales peut également se faire via une augmentation de l’expression des facteurs anti-apoptotiques (BCL-2 (B-cell lymphoma 2), BCL-XL) ou des signaux de survie (IGF1/2 (Insulin-like Growth Factor-1/2)), régulant négativement les facteurs pro-apoptotiques (BAX, BIM, PUMA). La protéine BCL-2 est le prototype d'une famille de gènes qui ont une action soit pro-apoptotiques (BAX, BAK, BOK, BAD, BID et BIM) ou soit anti-apoptotiques (BCL-2, BCL-XL, BCL-W) (Chi et al., 2014). BCL-2 est composée de quatre domaines d’homologie (BH1-4) qui sont aussi présents chez d’autres protéines de la même famille. Ce sont ces domaines, ainsi que son domaine transmembranaire qui lui permettent d’avoir une action sur l’apoptose. BCL-2 est notamment localisée dans la membrane mitochondriale où elle empêche l'homodimérisation de BAX, de BAK et de certaines autres protéines proapoptotiques. BAX sous la forme homodimère se fixe à la membrane externe mitochondriale entraînant le relargage de cytochrome c dans le cytosol qui en se liant à Apaf-1 crée le complexe nommé apoptosome. Ce complexe permet l’assemblage et l’activation de la procaspase-9 en caspase-9. Il s'ensuit l'hydrolyse de l'ADN et la protéolyse de nombreuses protéines (dont la caspase-3). La perméabilité mitochondriale et l’activité du PTP sont notamment régulées par les membres de la famille des protéines BCL-2 (Forte and Bernardi, 2006). BCL-2 peut être inhibée par la protéine BAD (type BH3 seulement) l’empêchant de se lier aux protéines pro-apoptotiques telles BAX et BAK. Dans ces conditions, BCL-2 n'empêche plus l'homodimérisation de BAX ou de BAK. La multiplicité des mécanismes d’échappement à l’apoptose que développent les cellules cancéreuses reflètent ainsi la grande diversité des stimuli pro apoptotiques à laquelle les cellules cancéreuses sont confrontées durant la progression du cancer. 20 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(21) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. C. Capacité d’invasion et stimulation de l’angiogenèse. Les mécanismes impliqués dans l’invasion et le processus de métastase sont également extrêmement complexes et pas complètement connus. De nombreuses études ont été menées et ont mis en évidence comment les cellules cancéreuses peuvent acquérir de manière concomitante de multiples attributs qui vont leur permettre d’envahir les tissus et de générer des métastases (Baeriswyl and Christofori, 2009). Il a ainsi été montré que les cellules cancéreuses pouvaient détourner de leur fonction primaire des mécanismes cellulaires tels que la transition épithéliale mésenchymateuse (TEM) afin de stimuler l’invasion et le processus métastatique (Shen et al., 2014). La TEM désigne le passage d'un groupe de cellules épithéliales à un phénotype de cellule mésenchymateuse. Les cellules perdent alors leur adhésion de type cellule-cellule (par une diminution de l'expression des cadhérines) et acquièrent des propriétés adhésives nouvelles vis-à-vis de la matrice extracellulaire (par l'expression d'un nouveau répertoire d'intégrines). Les cellules dégradent également la lame basale qui borde l'épithélium grâce à la sécrétion de métalloprotéinases. Cette transition TEM est un programme cellulaire aux multiples facettes que la cellule cancéreuse peut activer de manière transitoire mais également permanente. Bien que les preuves soient encore incomplètes il semble que les facteurs de transcriptions induisant la TEM soient capables d’orchestrer la plus part des étapes de l’invasion et de la métastase (Davis et al., 2014; Steinestel et al., 2014). Par exemple une étude récente montre que la TEM via la voie cellulaire NOTCH1 est impliquée dans le processus de métastase du cancer endométrial (Liao et al., 2014). De plus, il apparait de plus en plus évident que les échanges entre les cellules cancéreuses et les cellules du stroma entourant la tumeur participent à l’acquisition du potentiel d’invasion et de métastase (Taddei et al., 2014). Les cellules saines peuvent induire une sécrétion de type paracrine en réponse à un signal envoyé par les cellules cancéreuses. Cette sécrétion va ensuite agir au niveau des cellules cancéreuses et stimuler l’invasion. Mais le rôle de cet échange reste encore à confirmer car il s’avère que dans certains types de cancer, le stroma aurait un rôle protecteur face au cancer. En effet, deux récentes étude publiées dans Cancer Cell, montrent que le stroma joue un rôle protecteur face à la progression tumorale et que l’utilisation d’agents thérapeutiques ciblant les cellules stromales avoisinant la tumeur rend les cellules tumorales plus résistantes à l’apoptose en diminuant l’effet bénéfique du système immunitaire (Özdemir et al., 2014; Rhim et al., 2014). 21 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(22) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. Comme les tissus normaux, les tumeurs ont besoin pour survivre et croître de nutriments et d'oxygène et d’évacuer les déchets métaboliques et le dioxyde de carbone toxiques. Cette fonction est assurée par la néovascularisation de la tumeur grâce au processus d’angiogenèse. Au cours de l'embryogenèse, le développement de la vascularisation implique la synthèse de nouvelles cellules endothéliales et leur assemblage dans des tubes (vasculogenèse) associée à la germination (angiogenèse) de nouveaux vaisseaux à partir de ceux déjà existants. Suite à cette morphogenèse, la vascularisation normale devient largement quiescente. En revanche, au cours de la progression tumorale, l’activité angiogénique est très fortement stimulée ce qui conduit à la dissémination de nouveaux vaisseaux favorisant la propagation tumorale à distance et la formation de « niches » cellulaires ou métastases (Folkman, 2002; Bu et al., 2014). D. Capacité réplicative illimitée : immortalité cellulaire. La majorité des cellules sont capables de faire face à un nombre limité de cycle de division cellulaire. Cette limitation de la prolifération a été associée à deux phénomènes: la sénescence qui correspond à l’entrée dans un état irréversible de non-prolifération mais viable et l’induction de l’apoptose dans des conditions de stress. Dans de rares occasions, des cellules peuvent émerger à partir d’une population soumise à un stress et entrer dans une phase de réplication illimitée. Cette transition est appelé immortalisation (Leal et al., 2013).. E. Inflammation tumorale et réponse immunitaire. Depuis longtemps, certains indices montraient que la réponse inflammatoire associée à la tumeur pouvait exercer un effet paradoxal et imprévu en favorisant la progression tumorale. Récemment, plusieurs études ont permis de mieux comprendre ce rôle de l’inflammation qui permet aux néoplasies naissantes de se doter des capacités spécifiques des cellules malignes. La recherche sur les relations entre inflammation et cancer s’est intensifiée et a montré des implications fonctionnelles importantes sur la tumorigenèse en permettant par exemple l’échappement face au système immunitaire (Shiao et al., 2011). L'inflammation contribue ainsi à plusieurs caractéristiques du cancer en fournissant des molécules bioactives pour le microenvironnement de la tumeur, y compris des facteurs de croissance qui stimulent la prolifération et la TEM, des facteurs de survie qui limitent la mort cellulaire, des facteurs proangiogéniques, des enzymes de la matrice extracellulaire qui facilitent l'angiogenèse, l'invasion et la métastase (Shiao et al., 2011). De plus, le processus inflammatoire peut libérer des substances chimiques, telles que des espèces réactives de l'oxygène (ROS), qui sont de 22 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(23) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. puissants mutagènes pour les cellules cancéreuses voisines, et vont accélérer leur évolution génétique vers des états de malignité accrue (Grivennikov et al., 2010). En tant que tel, l'inflammation peut être considérée comme une caractéristique favorable pour l’acquisition du phénotype cancéreux dans certains types de cancers. Des résultats qui sont aujourd’hui remis en question par deux récentes études qui montrent que le stroma joue un rôle protecteur face à la progression tumorale et que l’utilisation d’agents thérapeutiques ciblant les cellules stromales avoisinant la tumeur, diminuent l’effet bénéfique de l’immunité et rend les cellules tumorales plus résistantes à l’apoptose (Özdemir et al., 2014; Rhim et al., 2014).. F. Instabilité génomique. L’acquisition des multiples caractéristiques énumérées précédemment dépend en grande partie d’une succession de modifications génomiques des cellules néoplasiques. Certains génotypes mutants confèrent un avantage sélectif permettant l’envahissement pour un environnement tissulaire donné. Par conséquent, la progression de la tumeur peut être décrite comme une succession d'expansions clonales, chacune d'elle étant déclenchée par l'acquisition d’un nouveau génotype mutant. Les phénotypes héréditaires, par exemple, l'inactivation de gènes suppresseurs de tumeur, peuvent également être acquis par des mécanismes épigénétiques telles que la méthylation de l'ADN et des modifications des histones (Berdasco and Esteller, 2010). Ainsi, des expansions clonales peuvent être déclenchées par des modifications affectant la régulation de l'expression des gènes. Les progrès de l'analyse moléculaire des génomes des cellules cancéreuses ont fourni les démonstrations les plus convaincantes des rôles néfastes de l'instabilité génomique lors de la progression tumorale. On retrouve souvent des aberrations spécifiques (amplifications et délétions) dans des sites particuliers du génome indiquant que ces sites sont susceptibles d'abriter des gènes dont l'altération favorise la progression néoplasique (Korkola and Gray, 2010).. G. Dérégulation des besoins énergétiques. La prolifération chronique et souvent incontrôlée des cellules cancéreuses nécessite également des ajustements concernant le métabolisme énergétique de la cellule afin d’alimenter la croissance cellulaire et la division. Dès 1924, Otto Warburg observe que le métabolisme glucidique des cellules tumorales diffère de celui des tissus normaux (Warburg, 1956a, b; Warburg and Posener, 1924). En effet, la plupart des cellules cancéreuses augmentent leur 23 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(24) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. consommation de glucose et, indépendamment de la présence d’oxygène, diminuent leur phosphorylation oxydative tout en produisant une grande quantité de lactate (caractéristique d’une glycolyse anaérobie) : c’est l’effet Warburg. Il a été montré que les mécanismes moléculaires, qui en sont à l’origine, impliquent directement l’activité du complexe HIF1(Hypoxia-Inducing Factor 1), surexprimé dans de nombreux cancers. Les intérêts pour les cellules tumorales de favoriser la glycolyse sont multiples. En effet, elles sont ainsi capables de produire de l’énergie quel que soit la pression en oxygène dans la tumeur et de participer à l’acidification de leur microenvironnement facilitant ainsi l’invasion. En effet il a déjà été montré que l’acidification de l’environnement cellulaire induit une production de ROS (Riemann et al., 2011) qui est connue pour promouvoir le processus de dissémination et de métastase (Nishikawa, 2008). Pour finir, le lactate produit lors de la glycolyse anaérobie ou aérobie des cellules tumorales peut être métabolisé par les cellules stromales dans le cycle de Krebs. Ceci génère un micro-écosystème où cohabite des systèmes anaérobie et aérobie, présentant des voies métaboliques complémentaires, afin de faciliter la survie et la croissance tumorale (Kroemer and Pouyssegur, 2008).. II. ENJEUX ACTUELS EN CANCEROLOGIE.. Nous avons abordé dans le chapitre précédent les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le cancer. Ces connaissances cruciales sont l’aboutissement de plus de 40 années de travail qui ont réuni scientifiques, médecins, et compagnies pharmaceutiques. Ainsi, depuis une décennie ce socle de connaissance concernant le cancer a permis de mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques. En effet, grâce à l’indentification d’acteurs majeurs du processus de cancérogénèse, des thérapies ciblées ont ainsi vu le jour. Malheureusement, aucune thérapie ciblée à ce jour n’est totalement curative en raison des propriétés d’adaptation et d’échappement que développe le cancer face à ces attaques. Ainsi, malgré toutes ces impressionnantes avancées le cancer reste une cause majeure de mortalité dans le monde : 8,2 millions de décès en 2012 (GLOBOCAN 2012, IARC). L’OMS estime que le nombre de cas de cancer par an devrait augmenter de 14 millions en 2012 à 22 millions au cours des deux prochaines décennies. Afin de combattre le cancer, des changements dans notre stratégie de soins et de recherche sont à mettre en place (Vineis and Wild, 2014). De nouvelles thérapies sont donc nécessaires mais leur développement doit tenir compte des échecs de celles utilisées actuellement. 24 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(25) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. A. Mécanismes à l’origine des échecs thérapeutiques. Nous savons aujourd’hui grâce aux très nombreuses études menées à travers le monde, que le cancer se manifeste par des centaines de types et sous-types, affectant la plupart des organes et tissus. Voici les principales causes identifiées à l’origine de la résistance tumorale aux traitements thérapeutiques.. 1. Mécanismes Généraux : L’hétérogénéité tumorale. Les tissus normaux se caractérisent par une structure tissulaire bien organisée et sont constitués de différents types cellulaires (Meacham and Morrison, 2013). Dans le cas du développement d'une tumeur solide, la structure sur le plan morphologique du tissu est désorganisée et comprend un microenvironnement inflammatoire soutenant la tumeur, ellemême composée de cellules épithéliales malignes, de fibroblastes, de cellules endothéliales anormales et de différentes cellules immunitaires infiltrées. A côté de cette hétérogénéité structurale, il existe également une hétérogénéité d’un point de vue génétique et phénotypique des cellules tumorales. Certaines de ces cellules possèdent des aptitudes ou des caractéristiques intrinsèques bien particulières qui sont à l’origine des résistances aux traitements anti-cancéreux. En effet, la plupart des traitements ne peuvent cibler, en général, qu’un seul type cellulaire. Les tumeurs régressent donc dans un premier temps puis la maladie progresse à nouveau grâce à l’expansion clonale de nouvelles cellules tumorales généralement plus résistantes. Le phénotype « cellule souche cancéreuse». De nombreuses évidences suggèrent que la dormance tumorale représente un mécanisme important dans l’échec des thérapies actuelles. En plus de son rôle dans le maintien de la maladie, la dormance tumorale semble contribuer de manière critique aux premiers stades du développement de la tumeur et à la formation de foyers micro-métastatiques cliniquement indétectables (Ghajar et al., 2013; Meng et al., 2004). Dans le cas du cancer du sein il a été montré que sur une cohorte de femmes ayant subit une mastectomie, que des cellules cancéreuses circulantes étaient toujours présentes jusqu’à 22 ans après l’ablation de la tumeur principale. Les auteurs concluent que ces résultats peuvent expliquer le phénomène de récidive lié à la dormance tumorale (Meng et al., 2004). Aujourd’hui, des parallèles sont faits 25 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(26) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. entre dormance tumorale et la théorie des cellules souches cancéreuses (CSC). Les CSC peuvent reproduire à elles seules l’hétérogénéité de la tumeur initiale. Les CSC représentent une petite population de cellules quiescentes (1 à 15%) qui se caractérisent par un autorenouvèlement, une totipotence associée à un fort potentiel prolifératif ce qui leur confèrent la capacité de former de novo un tissu hétérogène complexe (Kreso and Dick, 2014; Richardson et al., 2004). Ainsi de nombreuses études menées sur les CSC de différents types de cancer s’accordent sur le fait que ces niches de cellules survivent aux traitements chimiothérapeutiques et sont responsables, en partie, de la récidive du cancer (Vincent et al., 2014). Le mécanisme MDR (Multi Drug Resistance). L’une des formes de résistance acquise est liée à des gènes appartenant à la famille des gènes de multi-résistances aux drogues (multidrug-resitance MDR). Ces gènes codent pour les pompes ATP (adénosine-5'-triphosphate)-dépendantes impliquées dans le transport de composants organiques. Le gène impliqué dans la résistance aux chimiothérapies anticancéreuses le plus étudié est le gène mdr-1. L’exposition répétée à certaines drogues utilisées en chimiothérapie est corrélée à la surexpression de mdr-1 et à une augmentation de l’élimination des agents anti-tumoraux dès leur entrée dans la cellule (Brambila-Tapia, 2013; Krishna and Mayer, 2000). Face à ces résultats des essais pré cliniques sont réalisés afin de cibler le mdr en utilisant des ARNi injectés grâce à des sytèmes de nanovecteurs et ainsi resensibiliser les cellules aux traitements chimio-thérapeutiques (Misra et al., 2014). Le gène suppresseur de tumeur p53. Les lésions de l’ADN, induites par certaines chimiothérapies et la radiothérapie déclenchent l’activation de la P53, un facteur de transcription tétramérique qui élimine complètement les cellules endommagées en activant l’apoptose. Les effets de P53 sont régulés par P21, un inhibiteur de CDK4 (Cyclin-dependent kinase 4). L’activation de P53 stoppe le cycle cellulaire en phase G1, permettant à la cellule de réparer les lésions de l’ADN avant de passer en phase S. Des mutations du gène p53 sont observées dans 50% des cancers (Olivier et al., 2010) et sont impliqués dans les processus de la progression tumorale tels que la métastase (Yeudall, 2014). La perte de l’expression de p53 par mutation autosomique dominante est responsable d’un phénotype de cancer multiple appelé syndrome de Li-Fraumeni. Le gène p53 est ainsi classé comme un suppresseur de tumeur. L’inactivation de l’expression de p53 est observée dans les cellules cancéreuses humaines et les études cliniques suggèrent que. 26 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.

(27) Thèse de Charlotte Dubois, Lille 1, 2014. l’inactivation de l’expression de p53 est corrélée à la résistance aux chimiothérapies (Muller and Vousden, 2013). 2. L’autophagie : rôle complexe dans l’échappement thérapeutique. Des défauts dans le processus d’autophagie ont été identifiés dans de nombreuses pathologies dont notamment le cancer (Salminen et al., 2013; Kawakami et al., 2014; Zhu and He, 2014; Ding and Choi, 2015). Il est maintenant clair que la modulation de l'autophagie puisse être d’un grand potentiel dans le traitement du cancer mais son rôle reste encore à définir plus précisément. En effet, le rôle de d’autophagie est très différent selon les types de cancer et le stade du cancer. D'un côté, l’autophagie semble inhiber la transformation maligne, en est la preuve sa capacité à limiter l'accumulation d’acteurs potentiellement oncongéniques tel que les mitochondries aux membranes dépolarisés qui vont alors libérer des substances potentiellement génotoxiques telles que les ROS (Lisanti et al., 2010; Scherz-Shouval and Elazar, 2011). D'autre part, l'autophagie soutient la progression métastatique et dissémination des tumeurs déjà établies, en permettant aux cellules cancéreuses de s’adapter aux conditions micro-environnementales défavorables comme la privation en élément nutritif et l'hypoxie (deux dénominateurs communs à la croissance rapide des tumeurs solides (Manic et al., 2014). De plus en plus de preuves corroborent l'idée que l'autophagie favorise la progression du cancer établit. En effet, plusieurs suppresseurs de tumeur tels que PTEN (Phosphatase and TENsin homolog), TSC1 (tuberous sclerosis 1), TSC2 (tuberous sclerosis 2) et P53, interviennent dans l’inhibition de la voie mTOR (mammalian Target Of Rapamycin) et stimulent l’autophagie. Inversement, des oncogènes tels que les PI3K (Phosphatidylinositol4,5-bisphosphate 3-kinase) de classe I, AKT activant mTOR, et BCL-2 inhibent l’autophagie (Levine and Kroemer, 2008). Dans l’un des premiers travaux qui a mis en évidence l’implication des gènes de l’autophagie dans la suppression tumorale, il a été montré que, dans un pourcentage élevé de cancers humains du sein, des ovaires et de la prostate, l’expression du gène Beclin-1 est mono-allélique et que l’expression de la protéine Beclin-1 est diminuée dans des tumeurs humaines du sein, des ovaires et du cerveau (Liang et al., 1999). De plus, l’haplo-insuffisance du gène Beclin-1 favorise la tumorigenèse dans divers tissus de souris transgéniques (Qu et al., 2003). Cependant, l’autophagie peut avoir une fonction de survie pour les cellules tumorales. C’est le cas notamment pendant les stades précoces de la croissance de certaines tumeurs solides, 27 © 2014 Tous droits réservés.. doc.univ-lille1.fr.