Nous utilisons pour les mesures de calcium un milieu HBSS composé, en mM, de NaCl (142), KCl (5), Na2HPO4 (0,3), K2HPO4 (0,5), glucose (5), NaHCO3 (4), HEPES (10). La solution standard de HBSS 2 mM de Ca2+ est obtenue par l’addition de 2 mM de CaCl2 et de 1 mM de MgCl2. Cette solution est utilisée à pH 7,3 et les enregistrements sont réalisés à température ambiante (20°C).
VII. Le patch-clamp. A. Généralités.
Les expériences électrophysiologiques sont réalisées à l’aide de la technique du « patch clamp ». Cette dernière consiste à isoler électriquement un fragment de membrane cellulaire (Patch en anglais) en apposant contre la cellule, à l’aide d’un micromanipulateur, une pipette de verre d’un diamètre de l’ordre du micromètre.
Une légère aspiration permet de créer une résistance entre la pipette et la membrane de l’ordre de 1Gohm : c’est le « gigaseal ». Ce protocole permet alors, de maintenir (Clamp en anglais) un potentiel en mesurant simultanément des fluctuations de courant de l’ordre du pico ampère (pA, 10-12 A) avec une fréquence très élevée (> 1 kHz). Une aspiration supplémentaire permet de rompre le morceau de membrane sous la pipette laissant diffuser dans la cellule la solution
Solution extra cellulaire NaCl : 120 mM KCl : 5 mM CaCl2 : 2 mM MgCl2 : 2 mM HEPES : 10 mM Glucose : 5 mM
pH ajusté à 7,3 avec NaOH Osmolarité : 310 mosm/L
Solution intra pipette SOC CsCl : 120 mM CaCl2 : 0 mM MgCl2 : 3,72 mM HEPES : 10 mM BAPTA : 10 mM Glucose : 5 mM
pH ajusté à 7,3 avec CsOH Osmolarité : 290 mosm/L
Solution intra pipette ARC CsCl : 120 mM CaCl2 : 3,5 mM MgCl2: 3,72 mM HEPES: 10 mM EGTA: 10 mM Glucose : 5 mM
pH ajusté à 7,3 avec CsOH Osmolarité : 290 mosm/L intra-pipette : c’est la configuration cellule entière. Cette configuration permet de mesurer les courants ioniques à travers la membrane plasmique, à l’aide d’un amplificateur EPC9 (HEKA Electronic, Allemagne). Les signaux sont visualisés sur un écran d’ordinateur, stockés directement sur le disque dur de l’ordinateur et analysés grâce au programme Origin 7.0 (Microcal, Northampton, MA). L’utilisation de milieux extracellulaire et intra-pipette adaptés permet l’enregistrement spécifique des canaux SOC. Le milieu intra-pipette diffère au niveau des concentrations en calcium quand il s’agit d’enregistrer le courant SOC ou ARC. Ainsi, la solution intracellulaire utilisée pour enregistrer le courant ARC ne permet pas d’enregistrer le courant SOC et vice et versa (Mignen and Shuttleworth, 2001).
B. Solutions utilisées.
Au cours de ma thèse, j’ai donc eu besoin de différents types de solutions. Nous appelons solution extracellulaire la solution où baignent les cellules lors de l’enregistrement électrophysiologique. Les enregistrements sont réalisés à température ambiante (20°C). La solution dite intracellulaire est celle qui remplit l’intérieur de la pipette et qui entrera en contact avec l’intérieur de la cellule. Leurs compositions respectives sont décrites dans les tableaux suivant :
Résumé Article 1
REMODELING OF CHANNEL-FORMING ORAI PROTEINS DETERMINES AN ONCOGENIC SWITCH IN PROSTATE CANCER.
Publié dans Cancer Cell. 2014;26(1):19-32.
Charlotte Dubois *, Fabien Vanden Abeele*, V’yacheslav Lehen'kyi, Dimitra Gkika, Basma Guarmit, Gilbert Lepage, Christian Slomianny, Anne Sophie Borowiec, Gabriel Bidaux, Mohamed Benahmed, Yaroslav Shuba and Natalia Prevarskaya
* Les auteurs ont contribué à part égale dans ce travail.
Les protéines ORAI1, ORAI2 et ORAI3 appartiennent à une famille de protéines capables de former des canaux calciques en s’associant sous la forme d’homomères ou d’hétéromères. Depuis quelques années, ces protéines sont apparues comme des acteurs importants dans la transformation maligne. Cependant, les mécanismes mis en jeu dans la reprogrammation des cellules cancéreuses restaient peu connus.
Dans cette étude, nous montrons que les niveaux d'expression relatifs des messagers codants pour les protéines ORAI sont différents dans les tissus cancéreux prostatiques comparés à des tissus sains. Nous observons une surexpression du transcrit codant pour la protéine ORAI3. En combinant les techniques de patch-clamp, d’imagerie calcique et d'interférence par ARN, nous avons montré que les canaux SOC des cellules tumorales prostatiques sont formés d’homomères ORAI1. Nous avons également caractérisé un canal hétéromérique formés des protéines ORAI1 et ORAI3. Ce canal ORAI1/3 est activé par l’AA et possède une action pro- proliférative via la voie de signalisation NFAT. De façon surprenante, nos résultats diffèrent en ce qui concerne le rôle des protéines STIM1 dans l’activation du canal formé par ORAI1 et ORAI3. En effet, des travaux réalisés en très grande partie par Mignen et Shuttleworth (Mignen et al., 2007) ont mis en évidence que le canal ARC est activé l’AA et cette activation est dépendante de la protéine réticulaire STIM1. Dans notre modèle nous n’avons pas retrouvé la présence de STIM1 membranaire qui est décrit dans d’autres études (Mignen et al., 2007; Zhang et al., 2014b). A ce jour nous n’avons pas d’explication quant à la
particularité du canal ORAI1/ORAI3 activé par de l’AA que nous avons identifié dans nos cellules cancéreuses prostatiques.
La découverte de ce canal hétéromérique ORAI1/3 activé par l’AA dans les cellules cancéreuses prostatiques LNCaP et PC-3 est une découverte importante car il est bien connu que la progression tumorale prostatique s’accompagne d’une perturbation du métabolisme de l’AA (Nakanishi and Rosenberg, 2006 ; Patel et al., 2008; Phinney et al., 1996). De plus, nos données montrent une surexpression du transcrit codant pour la protéine ORAI3 dans les cancers et pas dans les tissus sains. Ainsi, deux mécanismes impliqués dans la progression tumorale pouvaient être mis en relation avec la protéine ORAI3. Nous avons donc émis l’hypothèse que le canal hétéromérique ORAI1/3 activé par l’AA pouvait jouer un rôle crucial à déterminer. Nous avons donc reproduit in vitro ces perturbations afin d’identifier le rôle de la protéine ORAI3 dans la progression tumorale prostatique.
Par des analyses immunohistochimiques et de co-immunoprécipitations des protéines ORAI1 et ORAI3 nous montrons in vitro qu’une telle surexpression d’ORAI3 favorise la formation des canaux hétéromériques ORAI1/ORAI3 au détriment des canaux homomériques ORAI1 formant les SOC. En réponse à cette surexpression, nous avons montré par imagerie calcique une inhibition fonctionnelle de l’entrée de calcium médié par les canaux SOC formés des canaux homomériques ORAI1. Ces canaux homomériques étant connus pour jouer un rôle critique dans l’induction de l’apoptose. Ainsi, la surexpression d’ORAI3 permet un switch oncogénique favorisant l’émergence d’un phénotype cancéreux agressif caractérisé par l’apparition de canaux ORAI1/3 pro-prolifératifs, au détriment des canaux ORAI pro- apoptotiques.
Nos résultats montrent également que ce « switch » oncogénique ne résulte pas seulement d’une modification de l’expression des protéines ORAI d’un point de vue génique, mais peut également être provoqué par des stimuli externes tels que l’AA ou des molécules aboutissant à sa synthèse (Oxotrémorine). Nous montrons que l’AA rompt l’équilibre dynamique qui existe entre les canaux ORAI1 et ORAI3 et favorise l’association de canaux ORAI1/ORAI3. Finalement, nous avons confirmé l’intérêt thérapeutique de ce switch oncogénique en réalisant des xénogreffes sous-cutanées sur souris-nude. Nous avons utilisé une approche en deux temps. Premièrement, nous avons voulu tester si la protéine ORAI3 pouvait constituer une bonne cible thérapeutique en utilisant une stratégie antisens avec des siRNA. Pour cela,
nous avons injecté à des souris nude par voie intra-péritonéale des siRNA ciblant ORAI3 (deux séquences de siRNA ont été utilisées). Ces traitements réalisés sur quinze jours ont permis de réduire significativement la croissance tumorale sur une série de xénogreffes sous cutanées de cellules PC-3. Ce blocage de la croissance tumorale est associé à une inhibition de l’expression de la cycline D1 que nous avons montrée pour être impliqué in vitro dans le mécanisme permettant l’inhibition de la prolifération en réponse aux traitements siRNA. Ainsi, les résultats in vivo et in vitro mettent ne jeux les mêmes mécanismes moléculaires. Une seconde série d’expérimentation in vivo a permis d’évaluer les conséquences d’une surexpression de protéine ORAI3 au niveau de l’agressivité des tumeurs formées. En effet, nos résultats obtenus in vitro sur ces clones ont montrés qu’ils possédaient une prolifération accrue et une résistance à l’apotpose plus importante. Ces résultats se sont confirmés in vivo puisque les deux clones PC-3 surexprimant ORAI3 ont formés des tumeurs plus importantes et invasives. Ces résultats confirment également qu’ORAI3 participe activement à la progression tumorale prostatique.
Ce travail apporte des éléments de réponse à la controverse qui existe dans la littérature concernant l’implication de l’isoforme ORAI3 dans la constitution des canaux SOC et le rôle d’ORAI3 dans la progression tumorale. En effet, nous montrons qu’au moins deux facteurs contrôlent la formation des canaux ORAI homomériques ou hétéromériques à savoir le ratio ORAI1/ORAI3 et le métabolisme de l’AA. En fonction des structures formées (ORAI1/ORAI1, ORAI1/ORAI3, ORAI1/ORAI2, ORAI1/ORAI3/ORAI2 …) ces canaux ORAI peuvent fonctionner comme : un canal SOC (Store Operated Channel); un canal constitutivement ouvert (quand ORAI2 est surexprimé) ou un canal activé par l’AA.
En conclusion, ces résultats suggèrent qu’ORAI3 puisse être une nouvelle cible thérapeutique prometteuse car son inhibition permettra d’agir simultanément sur deux caractéristiques clés impliquées dans la progression tumorale: la prolifération et l'apoptose.
ARTICLE 1: REMODELING OF CHANNEL-FORMING ORAI PROTEINS