Microscopie de fluoresence, non-linéaire - Nicolas Sandeau

(1)

La microscopie optique

Nicolas Sandeau

Maître de Conférences

(2)

A quoi ça sert?

Observer

un objet, un phénomène…

avec une bonne

résolution spatiale

(voire

temporelle

)

sans trop de perturbations (

innocuité

).

L’instrument doit être

sensible

et la mesure (l’image)

contrastée

.

Le plan

• Les contrastes

• Les microscopies de fluorescence

• La microscopie confocale

• Augmenter la résolution

(3)

Les 1

er

microscopes

Vers 1880, des détails aussi

petits que 0.2 µm sont déjà

accessibles.

(4)

Principe du microscope

Source en Epi-illumination Vers l’oeil Vers caméra Imageur Source en transmission Détection en forward

(5)

Principe du microscope

Image intermédiaire Oculaire 160 mm Plan image Oculaire Spécimen Objectif 160 mm Spécimen Lentille de Telan Objectif

(6)

Les contrastes en

microscopie

(7)

Contraste en microscopie

D’où vient le contraste?

⇒

Absorption, diffusion,

réfraction, réflexion.

Variations d’intensité,

de couleurs, de netteté

(8)

Contraste en microscopie

C a m é ra Lampe (incohérent) Condenseur

Filtre occultant ⇒ _{Fond noir}

(9)

Contraste en microscopie

(10)

Contraste en microscopie

Filtre déphasant ⇒ Contraste de phase

(11)

Microscopie sur fond noir

Objectif Rayons diffractés Rayons non-diffractés Spécimen Condenseur Filtre annulaire Lumière blanche http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/darkfieldgallery http://prn1.univ-lemans.fr/prn1/siteheberge/PublisCours-OPI/OPI_fr_M03_C04/co/Contenu_K22.html

(12)

Contraste de phase

Plan Image

Source

Lame de Phase Diaphragme annulaire

(Zernike prix Nobel 1953)

Source

Plan focal arrière de l’objectif

Ouverture du condenseur

(13)

Contraste de phase

(Zernike prix Nobel 1953)

Image de la phase

(14)

Microscope polarisant

P A

E sin (2µ) (e

i'

¡

1)

0 ¡

sin µ

1 Mesure de la biréfringence

0 cos µ 1

0 cos µ

1 _E

0

sin (2µ) (e

i'

¡

1)

2

0 @

¡

sin µ

cos µ

0

1 A

E

0

0 @

cos µ

sin µ

0

1 A

E

0

0 @

cos µ

sin µe

i'

0

1 A

I

₀

I

0

I

0

sin

2

_{(2µ) sin}

2

_('=2)

(15)

Microscope polarisant

P

Mesure du pléochroïsme

0 cos µ 1

0 cos µ

1 E

0

0 @

cos µ

sin µ

0

1 A

E

0

0 @

cos µ

sin µe

¡®

0

1 A

I

₀

I

0

¡cos

2

µ + sin

2

µe

¡2®

¢

(16)

Contraste par interférométrie

Image du relief

(17)

Microscope DIC

± < r¶esolution

Image du gradient de la phase

“Differential Interference Contrast”

I / 1 + cos(¢' + '

0

)

gradient de phase

(18)

DIC ou Contraste de phase?

Objets Images DIC _{Images de la phase}

http://www.microscopyu.com/galleries/dicphasecontrast/index.html Contraste de phase insensible aux pbs de polarisation ⇒ boite de Petri DIC utilisable avec des objectifs à forte NA ⇒ meilleur résolution

(19)

Contraste de fluorescence

Excitation Émission Diagramme énergétique de Jablonski Décalage de Stokes Jablonski https://www.omegafilters.com/curvo2/index.php?dyes=16&xmin=400 Intérêts de ce contraste

• Possibilité de filtrer simplement le faisceau d’excitation et ne détecter que l’émission

• Découplage de l’excitation et de l’émission

• Rendement de fluorescence • Marquage spécifique Défauts • Photobleaching • Toxicité Particularités • Temps de désexcitation • Transfert d’énergie

(20)

Les luminophores

• Fluorophores exogènes intercalables, greffables (spécifique)…

• Protéines chimériques (GFP…);

• Billes fluorescentes (plus lumineux mais plus gros);

• Fluorophores endogènes (moins lumineux);

• Nanocristaux de semi-conducteur (plus lumineux, moins de

photobleaching mais blinking! et pb de greffache et de phototoxicité.

(21)

Contraste de fluorescence (spectral)

Cellules de foie www.zeiss.de

2 (fausses)couleurs

_{Filtre DAPI}Dichroïque Filtre rouge

Excitation à 360nm _Émission Miroir dichroïque Excitation détection d é te ct io n

filtres _{Noyau (DAPI)}

(22)

Contraste de fluorescence (temps de vie)

FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy)

Deux méthodes (Cf F. Sureau):

• Time domain

• Frequency domain

Permet de différencier 2 fluorophores qui ont même spectre d’émission

(23)

Contraste en microscopies cohérentes

• Génération de Second Harmonique (SHG)

⇒

uniquement sur des matériaux non-centrosymétriques!

~

P

2!

= Â

(2)

E

~

!

: ~

E

! ω ω ω ω 2ω 2ω2ω 2ω SHG ω ωω ω _ω_ω_ω_ω_f 2PF

Artère de rein fibrotique Rouge:2PEF Vert: SHG=>collagène http://www.lob.polytechnique.fr 30000 I nt e ns it y (c ou nt s) THG

Image d’embryon de drosophile W. Supatto et al., PNAS (2005)

• Génération de Troisième Harmonique (THG)

⇒

efficace sur les interfaces!

SHG _2PF ω ω ω ω 3ω3ω3ω3ω THG

~

P

3!

= Â

(3)

E

~

!

: ~

E

!

: ~

E

! 350 400 450 550 600 650 0 200 400 600 800 20000 30000 wavelength (nm) I nt e ns it y (c ou nt s) SHG THG TPF

(24)

Les microscopies de

fluorescence

(25)

Microscopies de fluorescence

Échantillons spatialement incohérents!

Deux modes d’imagerie :

C a m é ra Lampe Condenseur

Imagerie en

champ large

Lampe (incohérent) Miroir dichroïque Faisceau pompe (cohérent) Photodiode Trou confocal x z y

Imagerie en

mode confocal

(26)

Microscopies de fluorescence

Échantillons spatialement incohérents!

Deux modes d’imagerie :

d

_z

=

n¸

NA

2

(27)

Microscopies de fluorescence

Résolution vs Localisation

La localisation latérale est limitée par le bruit

⇒

de l’ordre du nm avec 1 émetteur!

⇒

Single Particule Tracking (SPT)

New directions in single-molecule imaging and analysis, W. E. Moerner, PNAS 104, 12596–12602, 2007

La résolution latérale est limitée par la diffraction

⇒

de l’ordre de .

_¸=2

µ J1(k N A M r)

k NA M r

(28)

Microscopies de fluorescence

Résolution vs Grandissement

Image grandie 4 fois

Le grandissement

M =

f

t

f

o

M =

f

t

f

o La résolution

1:22¸

2N A

1:22¸

2N A

Image à faible grandissement

Image grandie 4 fois et 2 fois plus résolue

Le grandissement est important

mais l’ouverture numérique de

l’objectif l’est beaucoup plus!

2N A

(29)

Microscopies de fluorescence

Résolution vs Grandissement

résolution de l’objectif résolution de l’objectif

Attention à la taille du pixel!

M

1; 22¸

2N A

Il faut adapter le grandissement

à la taille du détecteur!

(30)

emission excitation camera x z

Microscopies de fluorescence

Mesure de l’orientation 3D

λ=525 nm NA=1,3 n=1.518 m=40 emission excitation camera Conservation de l’information

(31)

emission excitation camera dipole Image du dipole focal plane Conservation de l’information

sur l’orientation de l’émetteur à travers le microscope

x z

Imagerie défocalisée

-40 -20 0 20 40 Y ( µm ) -40 -20 0 20 40 X (µm) 60 40 20 0 (A .U .) Image du dipole sur l’orientation de l’émetteur à travers le microscope

emission excitation camera -40 -20 0 20 40 Y ( µm ) -40 -20 0 20 40 X (µm) 30 20 10 0 (U .A .) dipole Image du dipole focal plane

Mais information difficile à lire!

x z

(32)

150 100 50 0 -50 -100 -150 Y ( µm ) 100 0 -100 X (µm) 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 (A .U .)

Imagerie défocalisée

emission excitation camera

L’imagerie défocalisée pour lire cette information! emission excitation camera focal plane « image défocalisée» du dipole 10 mm x z

M. Böhmer & J. Enderlein, JOSA B 20 (2003)

150 100 50 0 -50 -100 -150 Y ( µ m ) 100 0 -100 X (µm) 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 (A .U .)

(33)

A

Imagerie défocalisée

A D. Patra, I. Gregor, J. Enderlein, J. Phys. Chem. A 108 (33) p. 6836-6841 (2004)

(34)

Les microscopies de

fluorescence à balayage

(35)

Microscopie confocale de fluorescence

Dichroic mirror Laser beam Photodetector NA n φ f_l f_obj Main parameters Main parameters

• of the microscope : NA and the ratio φφφφ/M…

• of the excitation : mode, wavelength, polarization, shape of the beam… • of the emission : wavelength…

3D-Resolution is defined by a volumetric function depending on

(36)

Volumes d’excitation (EEF)

Excitation Efficiency Function (EEF)

LASER beam

EEF = Carte 3D de l’intensité focalisée (1PF)

= Carte 3D de I

2

_(2PF)

NA=1,4 n=1,518

λ1=400nm

E. Guiot, PhD Orsay Univ. (2001)

(37)

Volumes de collection (CEF)

Collection Efficiency Function (CEF)

600 400 200 0 -200 z (n m ) 100 80 60 40

CEF = Image 3D du trou confocal

=

-400 -600 -400 -200 0 200 400 r (nm) 20 Fluorescence objective Tube lens pinhole

Carte 3D de l’intensité détectée en

fonction de la position 3D de l’émetteur

individuel uniformément éclairé

(38)

Volumes de collection (CEF)

Collection Efficiency Function (CEF)

600 400 200 0 -200 z (n m ) 100 80 60 40

CEF = Image 3D du trou confocal

=

Carte 3D de l’intensité détectée en

fonction de la position 3D de l’émetteur

individuel uniformément éclairé

(39)

Volumes de collection (CEF)

Collection Efficiency Function (CEF)

600 400 200 0 -200 z (n m ) 100 80 60 40

CEF = Image 3D du trou confocal

=

Carte 3D de l’intensité détectée en

fonction de la position 3D de l’émetteur

individuel uniformément éclairé

(40)

Volumes de collection (CEF)

Collection Efficiency Function (CEF)

600 400 200 0 -200 z (n m ) 100 80 60 40

CEF = Image 3D du trou confocal

=

Carte 3D de l’intensité détectée en

fonction de la position 3D de l’émetteur

individuel uniformément éclairé

(41)

Volumes de détection (DEF)

Detection Efficiency Function (DEF)

600 400 200 0 -200 z (n m ) 100 80 60 40

Focusing

Excitation

Emission

Collection

Fluorescent sample LASER beam Fluorescence

DEF=

EEF

X

CEF

Focused beam Image of the

pinhole -400 -600 -400 -200 0 200 400 r (nm) 20

Detection

Resolution

EEF

CEF

(42)

Augmenter la résolution?

100 80 60 40 20 0 -2 -1 0 1 2 EEF CEF DEF 100 80 60 40 20 0 -2 -1 0 1 2 EEF CEF DEF NA=0,6 φφφφ/M=1µµµµm λp=488nm λf=525nm -2 -1 0 1 2 Axe X ( µm) -2 -1 0 1 2 Axe X ( µm) NA=0,6 φφφφ/M=0,3µµµµm λp=488nm λf=525nm

Le trou confocal

doit être adapter à

la fonction d’Airy

R = M

1; 22¸

(43)

Augmenter la résolution?

100 80 60 40 20 0 -2 -1 0 1 2 EEF CEF DEF 100 80 60 40 20 0 -2 -1 0 1 2 EEF CEF DEF NA=0,6 φφφφ/M=1µµµµm λp=488nm λf=525nm -2 -1 0 1 2 Axe X ( µm) NA=0,6 φφφφ/M=0,3µµµµm λp=488nm λf=525nm -2 -1 0 1 2 Axe X ( µm)

Le trou confocal

doit être adapter à

la fonction d’Airy

R = M

1; 22¸

(44)

Augmenter la résolution des

microscopes confocaux

(45)

Résolution axiale

TIRF microscopy

(Total Internal Reflection Fluorescence)

I(z) = I

0

e

¡z=d

d =

¸

4¼

p

n

2

_sin

2

_{µ ¡ n}

2

4¼

p

n

12

sin

2

µ ¡ n

22

(46)

Résolution axiale

TIRF microscopy

(Total Internal Reflection Fluorescence)

(47)

Résolution axiale

Le

θθθθ

-microscope

EEF _CEF DEF

X =

(48)

Résolution axiale: le

θθθθ

-microscope

EEF DEF CEF Photodetector Laser beam

(49)

Résolution axiale: 4

ππππ

-microscopie

Filtre Notch Sténopé Photodetecteur Fluorescence Lame semi-réfléchissante L M LA S E R Objectifs L L Sténopé Miroir dichroïque Fluorescence LASER

(a) S. W. Hell, EP0491289 (24-06-1992)

(b) C. J. R. Sheppard et al. Optik 87(3) (1991)

M M Objectifs (a) L dichroïque (b)

(50)

Résolution axiale: 4

ππππ

-microscopie

Filtre Notch Sténopé Photodetecteur Fluorescence Lame semi-réfléchissante L M LA S E R Objectifs L L Sténopé Miroir dichroïque Fluorescence LASER

(a) S. W. Hell, EP0491289 (24-06-1992)

M M Objectifs (a) L dichroïque (b)

(51)

Résolution axiale : 4

ππππ

-microscopie

Filtre Notch Sténopé Photodetecteur Fluorescence Lame semi-réfléchissante L

(a) S. W. Hell, EP0491289 (24-06-1992)

(c) A. Egner et al. Trends in Cell Biology 15(4) 2005

M M

Objectifs

(a)

(52)

CEF d’un 4

ππππ

-microscope

Axe optique (z) Fluorophore dipolaire Foyers λ=525 nm NA=1,3 n=1.518 m=40 φ=20 µm

(53)

CEF d’un 4

ππππ

-microscope

Axe optique (z) Fluorophore dipolaire Dipôle fictif cohérent Foyers λ=525 nm NA=1,3 n=1.518 m=40 φ=20 µm

(54)

Résolution axiale: le 4

ππππ

-microscope

Lobes secondaires trop intenses

Pas de gain sur la résolution latérale

Images of a pair of actin fibers

(55)

EEF=

Carte 3D du carré de l’intensité

du faisceau

pompe focalisé

Excitation Émission

Régime d’absorption à 2 photons

λ

=488 nm

4 ππππ

-microscopie et excitation 2PE

λ

pompe1

=488 nm

λ

pompe2

=2x488 nm

λ

fluo

=525 nm

β

=0.1

Polarisation selon X

NA=1,3 n=1.518

Φ

=20

µ

m m=40

(56)

EEF=

Carte 3D du carré de l’intensité

du faisceau

pompe focalisé

λ

=488 nm

4 ππππ

-microscopie et excitation 2PE

λ

pompe1

=488 nm

λ

pompe2

=2x488 nm

λ

fluo

=525 nm

β

=0.1

Polarisation selon X

NA=1,3 n=1.518

Φ

=20

µ

m m=40

(57)

λ

=488 nm

Lobes secondaires moins intenses

4 ππππ

-microscopie et excitation 2PE

λ

pompe1

=488 nm

λ

pompe2

=2x488 nm

λ

fluo

=525 nm

β

=0.1

Polarisation selon X

NA=1,3 n=1.518

Φ

=20

µ

m m=40

Perte sur la résolution latérale

(58)

optical axis (z) Fluorophore Focus

Résolution latérale: le 4

ππππ

’

λ=525 nm φ=20 µm NA=1,3 n=1.518 m=40

S. Hell, “Double-confocal scanning microscope,”

(59)

optical axis (z) Fluorophore Coherent dipole Focus

Résolution latérale: le 4

ππππ

’

λ=525 nm φ=20 µm NA=1,3 n=1.518 m=40

S. Hell, “Double-confocal scanning microscope,”

(60)

optical axis (z) Fluorophore Focus Coherent dipole

Résolution latérale: le 4

ππππ

’

λ=525 nm φ=20 µm

(61)

Résolution 3D: le STED

Stimulation

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(15): 8206-8210 (2000).

(62)

Principe des microscopies

non linéaires et/ou

cohérentes

(63)

ω ω ω ω₁₁₁₁ ωωωωf Fluorescence excitée à 1 ph. 1PF ω ω ω ω₂₂₂₂ ω ω ω ωf Fluorescence excitée à 2 ph. 2PF ω ω ω ω₂₂₂₂ ω ω ω ω₃₃₃₃ ω ω ω ωf Fluorescence excitée à 3 ph. 3PF ω ω ω ω₃₃₃₃ ω ω ω ω₃₃₃₃ ω ω ω ω 2ω 2ω 2ω 2ω Génération 2nd Harmonique. ω ω ω ω 3ω 3ω 3ω 3ω

Fluorescence _{Signaux cohérents}

ω ω ω ω ω ω ω ω ω ωω ω

Signaux non linéaires

1PF _2PF _3PF 350 400 450 550 600 650 0 200 400 600 800 20000 30000 Longueur d’onde(nm) I nt e ns it é ( U .A .) SHG THG Fluo Harmonique. SHG _{Génération 3}ème Harmonique. THG Uniquement sur les

objets non centro-symétriques (Collagène)

Efficace sur les interfaces (membranes)

(64)

ω ω ω ω₁₁₁₁ ωωωωf 1PF ω ω ω ω₂₂₂₂ ω ωω ωf 2PF ω ω ω ω₂₂₂₂ Avantages: • confocalité

• pénétration dans les tissus (- de

diffusion)

Signaux non linéaires

400nm continu 800nm impul-sionnel diffusion)

• + grand écart entre excitation et émission

Inconvénients:

• sources à impulsions courtes (Prix, spectre…)

1 photon 2 photons

sionnel

(65)

diffusion)

Signaux non linéaires

diffusion)

Inconvénients:

Rein de singe profondeur 60 µm exc 750nm, NA 1.2

(66)

diffusion)

Signaux non linéaires

2PE 1PE

95 nm 305 nm

diffusion)

Inconvénients:

95 nm

Spectre 2PE sur tissu pulmonaire non marqué Excitation à 800 nm

(67)

diffusion)

Signaux non linéaires

diffusion)

Inconvénients:

(68)

ω ω ω ω 2ω 2ω 2ω 2ω SHG ω ω ω ω (signal cohérent) Sur objet non centro-symétrique

Signaux Cohérents

Sensible à l’ordre et à l’orientation des molécules

Spectre 2PE sur tissu pulmonaire non marqué Excitation à 830 nm

SHG image of fibroblast cell labeled by Di8

LPQM Collaboration with The Ben-Gurion University (L. Amire, R. Marx)

(69)

Microscopies cohérentes : ex la SHG

Coherent induced dipoles

Local excitation field E_ω(x,y,z)

(x y z) P2NLω , ,

(

x

y

z

)

E

(

x

y

z

) (

E

x

y

z

)

P

₂NL_ω

,

χ

₂(2_ω)

:

_ω

,

:

_ω

,

=

(70)

(

x

y

z

)

E

(

x

y

z

) (

E

x

y

z

)

P

₂NL_ω

,

χ

₂(2_ω)

:

_ω

,

:

_ω

,

=

V pm V pm V pm V pm V pm / 9 . 16 / 4 . 4 / 5 . 2 / 6 . 3 / 9 . 1 ) 2 ( 33 ) 2 ( 32 ) 2 ( 31 ) 2 ( 24 ) 2 ( 15 ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ χ χ χ χ χ

Potassium Titanyl Phosphase -KTiOPO4

Microscopies cohérentes : ex la SHG

V pm / 9 . 16 33 ≈ χ We define the KTP orientation by the Euler

angles (θ, ϕ, ψ)(θ, ϕ, ψ)(θ, ϕ, ψ)(θ, ϕ, ψ)

ψ

θ

ϕ

1111

2222

X Y Z

x

y

z

3333

χχχχ (2)_{of massive KTP}

Le signal de SHG dépend du champ

d’excitation et de l’objet (orientation,

taille…)!

(71)

-40 -20 0 20 40 x n m -40 -20 0 20 40 z nm 250 200 150 100 50 0 -20 0 20 40 y n m 250 200 150 100 50 0 200 100 0 -100 -200 x n m 200 0 -200 z nm 600 400 200 0 x10 3 200 100 0 -100 y n m 600 500 400 300 200 100 0 x10 3 -200 -100 0 100 200 x n m -200 0 200 z nm 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 x10 6 200 100 0 -100 y n m 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 x10 6

Microscopies cohérentes : ex la SHG

10 nm long side 70 nm long side

100 nm long side -40 -40 -20 0 20 40 z nm 0 _-200 200 0 -200 z nm 100 0 -200 200 0 -200 z nm 0.0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 In te n si ty ( A .U .) 400 300 200 100 sides length (nm) Forward Epi x 100 Epi/Forward KTP along X axis Euler angles: θθθθ=90°°°°, ϕ, ϕ, ϕ, ϕ=0°, ψψψψ=0°