© Julie Anne Côté, 2017
Nouveaux aspects de la biologie adipocytaire
Thèse
Julie Anne Côté
Doctorat en nutrition
Philosophiæ doctor (Ph. D.)
Nouveaux aspects de la biologie adipocytaire
Thèse
Julie Anne Côté
Sous la direction de :
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Résumé
Le tissu adipeux a longtemps été considéré comme un tissu inerte servant uniquement à la mise en réserve et à la libération des acides gras, mais nous savons maintenant qu’il possède une fonction endocrine et inflammatoire, impliquant ainsi ce tissu dans la pathophysiologie de l’obésité. En ce sens, beaucoup d’efforts sont déployés afin de minimiser son expansion, favoriser sa mobilisation ou encore améliorer l’homéostasie de ses fonctions. Notre compréhension de la nature biologique et physiologique du tissu adipeux a grandement évolué au cours des dernières décennies. De nouveaux concepts ont récemment émergé sur le tissu adipeux, notamment en ce qui concerne : 1) sa densité; et 2) sa plasticité. Dans la présente thèse, nous avons abordé ces deux concepts. L’objectif général des travaux était de caractériser les phénomènes entourant la densité et la plasticité du tissu adipeux.
Afin de rencontrer cet objectif, nous avons développé une approche méthodologique nous permettant de mesurer l’accumulation des graisses et la densité radiologique du tissu adipeux, aussi appelée l’atténuation radiologique (la capacité du tissu adipeux à bloquer les rayons X) au niveau abdominal par tomographie axiale dans une cohorte de plus de 240 femmes. Nous avons démontré que l’atténuation radiologique des tissus adipeux sous-cutané et viscéral est significativement et négativement corrélée avec la taille adipocytaire dans le dépôt correspondant. De plus, nos résultats ont révélé que les femmes caractérisées par une hypertrophie des adipocytes viscéraux ont un profil lipidique altéré comparativement aux femmes ayant de plus petits adipocytes. Ces différences sont atténuées après un ajustement statistique pour la surface de tissu adipeux et éliminées après un ajustement statistique pour la surface et l’atténuation des tissus adipeux. Nous avons donc démontré que l’atténuation radiologique des tissus adipeux est un marqueur de la taille adipocytaire. Par le fait même, la taille adipocytaire est un intégrateur de la qualité et de la quantité du tissu adipeux.
Nous avons étudié la plasticité des cellules de la fraction stroma-vasculaire et des adipocytes du tissu adipeux. D’abord, nous avons utilisé la cytométrie en flux pour caractériser le phénotype des précurseurs adipocytaires de la fraction stroma-vasculaire. Nous avons démontré qu’une sous-population de précurseurs adipocytaires natifs CD45- CD31- CD34+ expriment le marqueur de surface CD38. Nous avons observé une expression plus élevée des gènes associés à l’adipogénèse dans les précurseurs CD38+ comparativement aux précurseurs CD38-. Nous avons également démontré que le développement de l’obésité par le biais d’une diète riche en gras est associé à une augmentation du nombre de précurseurs adipocytaires CD38+, particulièrement dans le dépôt intra-abdominal. Nos travaux suggèrent donc que le CD38 est un marqueur d’engagement vers la
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différenciation adipocytaire. Par ailleurs, nous avons étudié un exemple de la plasticité des adipocytes matures, soit la dédifférenciation. Nous avons utilisé des puces à ADN pour examiner les changements d’expression génique au cours du processus de dédifférenciation. Nous avons observé une diminution de l’expression des gènes associés aux fonctions de l’adipocyte mature et une augmentation de l’expression des gènes associés à la reprogrammation cellulaire, au cycle cellulaire et à la matrice extracellulaire. Par ailleurs, nous avons développé un modèle de culture cellulaire nous permettant de dédifférencier les adipocytes matures et de moduler certains aspects du processus de dédifférenciation. Cela nous a permis de démontrer un rôle pour le sentier métabolique du Transforming growth factor-β dans la modulation de l’expression des différents types de collagène au cours du processus de dédifférenciation des adipocytes matures. Finalement, nous avons effectué des expériences d’immunofluorescence et de microscopie en temps réel afin de caractériser le processus de dédifférenciation des adipocytes matures. Nous avons démontré que la dédifférenciation est complètement inhibée par l’ajout d’agents bloquant la division cellulaire. Nous avons observé la présence d’adipocytes binucléiques au cours du processus de dédifférenciation, ainsi que des marqueurs de mitose.
En conclusion, nos travaux ont permis de caractériser deux nouveaux aspects du tissu adipeux qui reflètent des processus biologiques précis qui ont leurs racines dans le cycle de vie de l’adipocyte, dont l’expansion hypertrophique, la prolifération et la différenciation cellulaire, ainsi que la dédifférenciation des adipocytes matures. Ces travaux proposent des avancées significatives dans notre compréhension de la nature dynamique de ce tissu.
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Abstract
Adipose tissue has been considered a passive reservoir for energy, but we now know that it is also a secretory and endocrine organ. Because of increasing obesity rates, a lot of ressources are being committed to prevent adipose tissue accumulation and associated biological effects. In the last years, our advance in the understanding of adipose tissue biology has greatly evolved. New paradigms on adipose tissue have emerged, especially regarding: 1) its radiologic density (or radiologic attenuation); and 2) its plasticity. In this thesis, we studied these two concepts. The
overall objective of this thesis was to characterize the phenomena surrounding adipose tissue
density and plasticity.
To achieve our objective, we have applied methodological approaches that allowed us to measure abdominal adipose tissue accumulation and attenuation using computed tomography in a cohort of 240 women. We showed that subcutaneous and visceral adipose tissue attenuation is negatively and significantly associated with adipocyte size in the corresponding depot. Our results also demonstrated that women with adipocyte hypertrophy are characterized by an altered lipid profile compared to women with smaller adipocytes. Satistical adjustment for visceral adipose tissue area minimized these differences while subsequent adjustment for adipose tissue attenuation eliminated all differences. Our results suggest that fat cell size is a marker of adipose tissue radiologic attenuation and area, and therefore, an integrator of adipose tissue quality and quantity.
We also studied the plasticity of the adipocyte precursors contained in the stromal-vascular fraction of adipose tissue and of mature adipocytes. To do so, we used flow cytometry analysis to characterize the phenotype of adipocyte precursors. We demonstrated that a subpopulation of CD45- CD31- CD34+ adipose progenitors express the cell surface protein CD38. These cells have higher levels of adipogenic genes compared to the CD45- CD31- CD34+ CD38- population. When cultivated, CD38+ cells show a greater adipogenic potential than the CD38- cells. We also found that obesity is associated with an increase in the number of CD38+ adipose progenitors, particularly in the intra-abdominal depot. Our results suggest that CD38 is a marker of commitment toward adipogenesis. Furtheremore, we studied the process of mature adipocyte dedifferentiation as a good example of adipose tissue plasticity. We examined changes in gene expression during the dedifferentiation process using microarray analysis. We found a decrease in the expression of genes associated with mature adipocyte functions and an increase in the expression of genes associated with cellular reprogramming, cell cycle and extra-cellular matrix. We have also developed a cellular
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culture system that allows us to dedifferentiate mature adipocytes and to modulate various aspects of the process. This allowed us to demonstrate a role for the Transforming growth factor β signaling in modulating collagen gene expression during dedifferentiation. Finally, we performed immunofluorescence and time-lapse microscopy experiments to characterize the process of mature adipocyte dedifferentiation. We demonstrated that adipocyte dedifferentiation is completely prevented by agents blocking cell division. We also observed binucleated adipocytes throughout the ceiling culture process and markers of mitosis.
In conclusion, our studies allowed us to characterize various novel aspects of adipose tissue related to specific biological process, which have their roots in the adipocyte life cycle. They include hypertrophic expansion, cellular proliferation and differentiation, and adipocyte dedifferentiation. This is of significant importance in our understanding of adipose tissue dynamics.
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Table des matières
Résumé ... iii
Abstract ... v
Table des matières ... vii
Liste des tableaux ... x
Liste des figures ... xi
Liste des abréviations ... xiii
Remerciements ... xviii Avant-propos ... xx Introduction ... 1 1. Le tissu adipeux ... 1 1.1 Origine et développement ... 1 1.2 Rôles ... 1 1.2.2 Tomographie axiale ... 3 1.3 Composantes cellulaires ... 6 1.3.1 Adipocytes matures ... 6 1.3.2 Fraction stroma-vasculaire ... 8 1.3.3 Matrice extracellulaire ... 12
2. Dédifférenciation de l’adipocyte mature ... 23
2.1 La culture inversée ... 23
2.2 Caractéristiques des cellules adipeuses dédifférenciées ... 26
2.2.1 Changements morphologiques ... 26
2.2.2 Capacité de prolifération ... 27
2.2.3 Signature génique ... 28
2.2.4 Antigènes de surface ... 29
2.2.5 Multipotence/pluripotence ... 31
2.2.6 Fonctionnalité des cellules ... 32
2.3 Hypothèses expliquant la dédifférenciation ... 33
2.4 Mécanismes cellulaires derrière la dédifférenciation ... 35
2.5 La dédifférenciation in vitro ... 37
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2.7 Applications ... 40
3. Problématique de recherche ... 43
Objectifs et hypothèses ... 45
Méthodologie ... 47
CHAPITRE 1: Les mesures d’atténuation radiologique et de surface des tissus adipeux obtenues par tomographie axiale prédisent la taille adipocytaire et le risque cardiométabolique chez la femme . 50 Résumé ... 51
Abstract ... 53
Introduction ... 54
Methods and procedures ... 56
Results ... 59
Discussion ... 61
References ... 65
CHAPITRE 2: Identification de l’ectoenzyme CD38 comment marqueur d’engagement des préadipocytes ... 72
Résumé ... 73
Abstract ... 75
Introduction ... 76
Material and Methods ... 78
Results ... 82
Discussion ... 85
References ... 87
CHAPITRE 3: Changements temporels du profil d’expression génique durant la dédifférenciation des adipocytes matures ... 100
Résumé ... 102
Abstract ... 104
Introduction ... 105
Materials and Methods ... 107
Results ... 111
Discussion ... 114
References ... 120
CHAPITRE 4: Rôle du sentier métabolique du TGF-β dans le processus de dédifférenciation des adipocytes matures humains ... 130
ix
Abstract ... 134
Introduction ... 135
Materials and Methods ... 137
Results ... 141
Discussion ... 143
References ... 147
CHAPITRE 5 : Caractérisation du processus de division cellulaire des adipocytes matures humains en culture cellulaire inversée ... 155
Résumé ... 156
Abstract ... 158
Introduction ... 159
Subjects and Methods ... 160
Results ... 163
Discussion ... 165
References ... 169
Conclusion ... 179
x
Liste des tableaux
Tableau 1. Comparaison entre les marqueurs de surface des cellules adipeuses dédifférenciées et des cellules souches de la fraction stroma-vasculaire humaine ... 30 Table 1.1 Adiposity, body fat distribution and metabolic characteristics of the women ... 67 Supplemental Table 1.1 Spearman correlation coefficients between cardiometabolic profile variables and SAT or VAT mean attenuation before and after statistical adjustment for VAT area. ... 71 Tableau 2.1 Conjugated rat anti-mouse antibodies for immunostaining ... 89 Tableau 2.2 List of primers ... 90
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Liste des figures
INTRODUCTION
Figure 1. Localisation anatomique des principaux dépôts adipeux au niveau abdominal chez l’humain ... 3 Figure 2. Représentation des aires de tissus adipeux sous-cutané et viscéral mesurées par tomographie axiale au niveau des vertèbres L4-L5 ... 4 Figure 3. Échelle de Hounsfield ... 5 Figure 4. Représentation schématique du tissu adipeux ... 7 Figure 5. Continuum de la différenciation adipogénique des cellules souches de la fraction
stroma-vasculaire ... 9 Figure 6. Représentation schématique générale de l’activation du TGF-β au sein de la matrice extracellulaire ... 16 Figure 7. Représentation schématique du sentier métabolique du TGF-β/SMAD ... 18 Figure 8. Représentation schématique de la première étape de la synthèse d’une molécule de collagène de type VI ... 21 Figure 9. Représentation schématique du modèle de culture cellulaire inversée ... 24 Figure 10. Microscopie confocale d’adipocytes matures humains à différents temps au cours du processus de dédifférenciation ... 27 Figure 1.1 Correlations between SAT (A) or VAT (B) attenuation values and adipose tissue areas in the corresponding depot; between SAT (C) or VAT (D) areas and adipocyte weight in the corresponding depot; and between SAT (E) or VAT (F) attenuation and adipocyte weight in the corresponding depot. ... 68 Figure 1.2 Cardiometabolic risk profile in subgroups of women defined on the basis of their VAT fat cell weight (low vs. high) using the median value of VAT fat cell weights as cutoff, before (Unadj) and after (Adj) statistical adjustments for adipose tissue area or adipose tissue area and attenuation. ... 69 Figure 1.3 Cardiometabolic risk profile in subgroups of women defined on the basis of their SAT fat cell weight (low vs. high) using the median value of SAT fat cell weights as cutoff, before (Unadj) and after (Adj) statistical adjustments for adipose tissue area or adipose tissue area and attenuation. ... 70
Figure 2.1 A subset of CD45- CD31- CD34+ cells from murine adipose stromal-vascular fraction
expresses CD38 ... 91
Figure 2.2 Gene expression in native CD38+ and CD38- adipose progenitors ... 92
Figure 2.3 Sorted CD38+ subset is more committed to adipogenesis compared to the more immature
and proliferative CD38- subpopulation. ... 93
Figure 2.4 CD38 expression increases during adipogenesis ... 94
Supplemental Figure S2.1 Dot plots representing purity of cell subsets following FACS sorting ... 95 Supplemental Figure S2.2 A subset of CD45- CD31- CD34+ cells from murine adipose
stromal-vascular fraction expresses CD38 ... 96
Supplemental Figure S2.3 CD38 expression in endothelial and haematopoietic cells of SVF derived from murine inguinal fat pad ... 97 Supplemental Figure S2.4 Adipogenic differentiation of CD38- and CD38+ subsets 7 days after
adipogenic induction ... 98 Supplemental Figure S2.5 Adipose tissue expansion is associated with concomitant changes in CD38 expressing adipose progenitors. ... 99 Supplemental Figure S2.6 Adipose tissue expansion is associated with concomitant changes in CD38 expressing adipose progenitors. ... 100 Figure 3.1 Phase contrast microscopy of human subcutaneous mature adipocytes undergoing dedifferentiation at various stages (4x) in ceiling culture at days 4, 7 and 12 ... 123
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Figure 3.2 2D snapshot of PCA analysis of sample distributions based on all genes ... 124 Figure 3.3 Cluster analysis according to changes in gene expression from day 4 to day 7 and from day 7 to day 12. ... 125 Figure 3.4 Fold change in expression of genes related to adipogenic and lipogenic functions during the dedifferentiation process ... 126 Figure 3.5 Fold change in expression of genes related to cell cycle during the dedifferentiation process ... 127 Figure 3.6 Fold change in expression of genes related to extracellular matrix remodeling during the dedifferentiation process ... 128 Figure 3.7 Differences in gene expression at day 7 and day 12 of the dedifferentiation process measured by quantitative RT-PCR ... 129 Figure 4.1 Representation of the 6-well plate ceiling culture model ... 149 Figure 4.2 Differences in expression levels of TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, COL1A1, COL1A2 and COL6A3 between whole adipose tissue, SVF, and DFAT cells (day 12) ... 150 Figure 4.3 Expression levels of TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, COL1A1, COL1A2 and COL6A3 at various time points during the dedifferentiation process ... 151 Figure 4.4 Expression levels of TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, COL1A1, COL1A2 and COL6A3 in dedifferentiating adipocytes incubated in media containing 5 % serum or 5% serum supplemented with TGF-β1 (5 ng/mL) ... 152 Figure 4.5 Expression of (A) TGF- β 1, (B) TGF-β2, (C) TGF- β3, (D) COL1A1, (E) COL1A2, (F) COL6A3 after treatment with SB431542 at day 4 of the dedifferentiation process ... 153
Figure 4.6 Protein level of (A) SMAD 2, (B) phospho-SMAD 2, (C) SMAD 3, (D) phospho-SMAD 3 and (E) SMAD 4 measured in DFAT cells incubated with or without 5 ng/mL TGF-β1 .... 154 Figure 5.1 Representation of the ceiling culture approach in six-well plates ... 171 Figure 5.2 Treatment of mature adipocytes with Cytosine β-D-arabinofuranoside during ceiling culture ... 172
Figure 5.3 Treatment of mature adipocytes with Vincristine during ceiling culture ... 173 Figure 5.4 Treatment of fibroblasts from the stromal-vascular fraction with Cytosine
β-D-arabinofuranoside or Vincristine ... 174 Figure 5.5 Cell division events visualized by time-lapse microscopy experiment ... 175
Figure 5.6 Fluorescence microscopy labeling of phosphorylated histone 3 in mature adipocytes . 176
Figure 5.7 Fluorescence microscopy labeling of Cyclin B1 in mature adipocytes undergoing ceiling culture ... 177
Figure 5.8 Fluorescence microscopy imaging of binucleated mature adipocytes in ceiling cultures
... 178
Figure 11. Les phénomènes de densité et de plasticité du tissu adipeux reflètent des processus biologiques précis qui ont leurs racines dans le cycle de vie de l’adipocyte ... 180
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Liste des abréviations
ACE : angiotensin-converting-enzyme ADIPOQ : adiponectine
ADN : acide désoxyribonucléique
ALK5 : transforming growth factor beta receptor 1 APC : carcinome anaplasique
Apo : apolipoprotéine
ARNm : acide ribonucléique messager ASC : adipose-derived stem cell ATGL : adipose triglyceride lipase ATG7 : autophagy related 7 ATP5o : ATP synthase O subunit BAT : brown adipose tissue BMI: body mass index
BMP : bone morphogenetic protein BrdU : bromodésoxyuridine
cAMP: cyclic adenosine monophosphate CCNA2: cycline A2
CCNB1: cycline B1 CCNG1: cycline G1
CD: cluster of differentiation CDC73: cell division cycle 73
C/EBPα : CCAAT/enhancer binding protein α C/EBPβ: CCAAT/enhancer binding protein β C/EBPδ: CCAAT/enhancer binding protein δ CENPE: centromere protein E
CFU-F: colony-forming unit fibroblasts CKAP2: cytoskeleton associated protein 2
C-MYC : C-Myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog COL1A1 : collagène de type 1 alpha 1
COL2A1 : collagène de type 2 alpha1 COL6A3 : collagène de type 6 alpha 3 Co-SMAD: common SMAD
CSPi : cellules souches pluripotentes induites CT: computed tomography
CVD: cardiovascular diseases
DEXA : absorptiométrie aux rayons X DFAT : dedifferentiated fat
DGAT : diacylglycerol O-acyltransferase DPP4 : dipeptidyl peptidase 4
ECM : extracellular matrix
ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay
ESCO2 : establishment of sister chromatid cohesion N-acetyltransferase 2 ESID : electron microscopy imaging
E2F3 : E2F transcription factor 3 E2F7 : E2F transcription factor 7 FAP: fibroblast activation protein Alpha FABP4 : fatty acid binding protein 4 FAS : fatty acid synthase
xiv
FGF: fibroblast growth factor/ facteur de croissance des fibroblastes FIRKO : fat-specific insulin receptor knockout
FOXO1 : forkhead box O1 FSV : fraction stroma-vasculaire GAM : generalized additive model GATA2 : GATA binding protein 2 GATA3 : GATA binding protein 3 GATA4 : GATA binding protein 4
G-CSF : granulocyte-colony stimulating factor
GFP : green fluorescent protein/ protéine fluorescente verte GLUT2 : transporteur de glucose 2
GLUT4 : transporteur de glucose 4 GRCC1 : geranyl pyrophosphate synthase GUSB : glucuronidase beta
G6PD: glucose-6-phosphate déshydrogénase HDL : lipoprotéine de haute densité
HIF-1 : hypoxia-inducible factor-1 HK : house keeping
HLA-A : major histocompatibility complex, class I, A HLA-B : major histocompatibility complex, class I, B HLA-DR : major histocompatibility complex, class II, DR HOMA-IR : indice de résistance à l’insuline
HSL: lipase hormono-sensible
HSP90AB1: heat shock protein 90 alpha family class B member HUs: Hounsfield units/unités Hounsfield
IMC : indice de masse corporelle IFN-γ : interféron Gamma
IGFBP : insulin like growth factor binding protein IGF1 : insulin like growth factor 1
IRS-1 : substrat du récepteur de l’insuline KITGL : kit ligand
KLF4 : kruppel like factor 4 KLF5 : kruppel like factor 5 KLF15 : kruppel like factor 15 KRH : Krebs-Ringer-Henseleit L4-L5 : 4e et 5e vertèbres lombaires
LDL : lipoprotéine de faible densité LTGF-β : latent TGF-beta1
IGF1 : insulin like growth factor 1 IL : interleukine
ING : inguinal INS : insuline
IRS1 : insulin receptor substrate 1 IRS2 : insulin receptor substrate 2 LAP : latency-associated peptide LIPE : lipase E, hormone sensitive LPL : lipoprotéine lipase
LTBP : latent TGF-beta binding protein
LTGF-β : latent transforming growth factor beta MAP2K4 : mitogen-activated protein kinase 4 MCP-1 : monocyte chemoattractant protein-1
xv MEC : matrice extracellulaire
MMP : métalloprotéinase matricielle MSC : mesenchymal stem cell MSX1 : Msh homeobox 1 NANOG : nanog homeobox NFD : normal fat diet
NFKBIA : NFKB inhibitor alpha NPY5R : neuropeptide Y receptor type 5 NSC : newborn calf serum
OCT3 : octamer-binding transcription factor 3 OCT4 : octamer-binding transcription factor 4 OM : omental
PCSK1 : proprotein convertase subtilisin/kexin type 1 PDAC : pancreatic adenocarcinoma
PDGFR-β : platelet derived growth factor receptor β PGE2 : prostaglandine E2
PGES : prostaglandine E2 synthase PLIN1 : périlipine 1
PNPLA2 : patatin like phospholipase domain containing 2 PPARγ: peroxisome proliferator activated receptor γ RB1: RB transcriptional corepressor 1
RNF4: ring finger protein 4
R-SMAD: receptor-regulated SMAD RT: room temperature
RUNX2: runt related transcription factor 2 SAT : subcutaneous adipose tissue
SCA1 : spinocerebellar ataxia type 1 SC : sous-cutané
SCD : stearoyl-CoA desaturase SD : standard deviation
SEM : standard error of the mean shRNA : short hairpin RNA SIRT1 : sirtuin 1
SIRT2 : sirtuin 2
SL-TGF-β : small latent TGF-β SMAD2 : SMAD family member 2 SMAD3 : SMAD family member 3 SMAD4 : SMAD family member 4 SOX2 : SRY-box 2
SOX9 : SRY-box 9 SOX17 : SRY-box 17
SP7 : Sp7 transcription factor
SREBP1: sterol regulatory element-binding protein 1 SSEA-1 : fucosyltransferase 4
SVF : stromal-vascular fraction TA : tissu adipeux
TBX1 : T-box 1 TG : triglycerides
TIMP: tissue inhibitor of metalloproteinase TGF-β1: transforming growth factor-β 1 TGF-β2: transforming growth factor-β 2
xvi TGF-β3: transforming growth factor-β 3
TGFBRI: transforming growth factor beta receptor 1 TGFBRII: transforming growth factor beta receptor 2 TH3: thymidine radioactive tritiée
TNF-α : facteur de nécrose tumorale alpha UCP1 : uncoupling protein-1
VAT : visceral adipose tissue
VEGF : facteur de croissance de l’endothélium vasculaire VLDL : lipoprotéine de très faible densité
WAT : white adipose tissue WNT3A : WNT family member 3A WNT5b : WNT family member 5B WNT10b : WNT family member 10B
XRCC2 : X-ray repair cross complementing 2 α-SMA : alpha-smooth muscle actin
xvii
À Mommy, Diddy et Nanick pour leurs encouragements,
leur support et surtout, leur amour
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Remerciements
Réaliser une thèse de doctorat, c’est s’engager dans une aventure stimulante et palpitante, c’est accepter de relever des défis et c’est tenter de se dépasser sur le plan personnel et professionnel. Une aventure comme celle-ci nécessite la contribution scientifique, mais également la contribution personnelle de nombreuses personnes. J’aimerais prendre le temps de remercier sincèrement les gens qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation de mon doctorat.
J’aimerais tout d’abord remercier mon directeur de recherche, le Dr André Tchernof pour sa contribution importante à mon parcours scientifique des neuf dernières années. Les travaux scientifiques du Dr Tchernof et sa passion pour la science ont suscité mon intérêt dès le début de mes études universitaires et m’ont incitée à poursuivre des études graduées dans son laboratoire. Le Dr Tchernof a été un mentor exceptionnel pour moi sur le plan professionnel, mais également sur le plan personnel. Son enthousiasme, son savoir-faire, son positivisme, sa curiosité scientifique, sa gentillesse, son intelligence, sa générosité, ainsi que sa persévérance font de lui un chercheur exceptionnel, mais surtout, un individu exceptionnel. Le Dr Tchernof a toujours su me proposer des projets en lien avec mes intérêts scientifiques et il a toujours été à l’écoute de mes idées et de mes opinions. J’apprécie grandement la liberté et la confiance qu’il m’a vouées tout au long de mes études graduées. Le Dr Tchernof a toujours su faire ressortir mes forces. Son support et ses encouragements ont largement contribué à mon succès, mais également au plaisir que j’ai eu à réaliser mon doctorat. Grâce à lui, les moments de découragement et de déception ont toujours été de courte durée et ils m’ont aidée à me dépasser. Le Dr Tchernof a été un mentor parfait pour moi. Son côté humain fait de lui une personne avec qui il est encore plus plaisant de travailler. Je n’aurais pu souhaiter une aventure différente que celle que le Dr Tchernof m’a permis de vivre au cours des dernières années. Merci pour tout!
Je tiens également à remercier tous les membres qui font ou qui ont fait partie de l’équipe du Dr Tchernof pendant mes études graduées : Mélissa Pelletier, Mélanie Nadeau, Marie-Frédérique Gauthier, Sophie Morisset, Julie Lessard, Marc Lapointe, Thomas Grenier-Larouche, Anne-Marie Carreau, Sofia Laforest, Anne-Marie-Michèle Boulet, Alain Veilleux, Maude Caron-Jobin, Renée Drolet, Nathalie Paquet, Annick Ouellet, Judith Marcoux, Mohamed Mansour, Geneviève B. Marchand, Jennifer Labrecque, Mouna Zerradi et Jordanna Kapeluto. J’aimerais les remercier pour leur contribution scientifique à mes projets, mais également pour leur support, leur collaboration et leurs encouragements. J’aimerais remercier plus spécifiquement Mélissa Pelletier, Mélanie Nadeau,
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Alain Veilleux et Julie Lessard qui m’ont initiée au travail de laboratoire à mes débuts dans l’équipe. Les années passées dans le laboratoire du Dr Tchernof ont fait naître des amitiés précieuses. J’aimerais remercier Andréanne Michaud, Anne-Sophie Morisset, Julie Lessard et Mélissa Pelletier pour leur précieuse amitié. Merci de m’avoir supportée dans mes études doctorales, mais surtout, merci d’avoir embelli ma vie chacune à votre façon.
Au cours de ma troisième année de doctorat, j’ai eu la chance d’effectuer un stage à l’étranger dans le laboratoire du Dr Louis Casteilla à Toulouse. Cette expérience a été possible grâce à une bourse offerte par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG). Je tiens à remercier le Dr Louis Casteilla et la Dre Audrey Carrière-Pazat pour leur accueil chaleureux, leur support et leur contribution scientifique à mon parcours. J’aimerais également remercier Jérémy Kagan, Élodie Labit et Vincent Cuminetti, des collègues devenus des amis précieux que je n’oublierai jamais. Je remercie également tous les autres membres de l’équipe du Dr Casteilla qui ont contribué à faire de mon séjour en France une expérience inoubliable. Cette expérience a été enrichissante sur le plan professionnel et personnel. Je remercie le Dr Tchernof de m’avoir encouragée à réaliser ce projet.
J’aimerais remercier le CRSNG pour leur soutien financier. Je remercie également les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) pour m’avoir permis de participer à de nombreux congrès internationaux au cours de mon doctorat.
En terminant, je tiens à remercier mes parents, ma sœur, mon beau-frère et mon copain pour leur support et leur amour inconditionnel. Merci de m’avoir encouragée à toutes les étapes de mon parcours académique. Merci de croire en moi et de me supporter dans les moments les plus difficiles. Vous êtes si précieux à mes yeux et j’espère toujours vous rendre aussi fiers. Je sais que vous serez toujours là pour me supporter, peu importe la voie que j’emprunterai. Je vous aime. Je remercie également Brad, mon amoureux, pour ses encouragements, son support et surtout, son amour.
xx
Avant-propos
Cette thèse de doctorat réalisée sous la supervision du Dr André Tchernof, professeur titulaire à l’École de Nutrition de l’Université Laval, regroupe l’ensemble des travaux que j’ai effectués dans le cadre de mon doctorat en nutrition à l’Université Laval. Ces travaux portent sur deux aspects du tissu adipeux, soit sa densité radiologique et sa plasticité. La première partie de l’introduction décrit brièvement le tissu adipeux, c’est-à-dire son origine, son développement et sa composition cellulaire avec une emphase sur la matrice extracellulaire. La deuxième partie de l’introduction présente le phénomène de dédifférenciation, soit 1) le modèle de culture cellulaire utilisé ; 2) les caractéristiques des cellules dédifférenciées; 3) les hypothèses et mécanismes de la dédifférenciation proposés; 4) les évidences de dédifférenciation in vitro et in vivo et 5) les applications thérapeutiques potentielles des cellules dédifférenciées. Les Chapitres 1 à 5 regroupent les principaux travaux que j’ai effectués dans le cadre de ce doctorat sous la forme de manuscrits originaux rédigés en anglais. Le format des manuscrits insérés dans cette thèse correspond à celui des revues scientifiques avec révision par les pairs dans lesquelles ils sont ou seront publiés. La présente thèse se termine par une discussion et une conclusion générale qui ont pour objectif de remettre en contexte les travaux présentés et de discuter de leur contribution à l’avancement de la recherche scientifique entourant le tissu adipeux.
La réalisation des travaux présentés dans cette thèse a été possible grâce à la participation de plusieurs personnes. Ces projets n’auraient pu être achevés sans la contribution exceptionnelle de mon directeur de doctorat. Le Dr André Tchernof est le chercheur principal des études des
Chapitres 1, 3, 4 et 5. Il a veillé au financement de ces projets, à leur conception, à leur
élaboration, à leur réalisation, ainsi qu’à leur supervision. Le Dr André Tchernof a également participé à toutes les étapes de la rédaction des articles scientifiques. L’étude contenue dans le
Chapitre 2 a été réalisée sous la supervision du Dr Louis Casteilla et du Dr Audrey Carrière-Pazat
de l'Unité STROMALab (Université de Toulouse, EFS, ENVT, Inserm U1031, ERL CNRS 5311). Le financement de ce projet, sa conception, sa réalisation, ainsi que l'écriture du manuscrit qui y est relié ont été réalisés sous leur contribution.
Ma contribution, ainsi que celle des co-auteurs de chacun des articles sont décrites dans les prochains paragraphes :
xxi
Chapitre 1: Côté JA, Nazare JA, Nadeau M, Leboeuf M, Blackburn L, Després JP, Tchernof A.
Computed tomography-measured adipose tissue attenuation and area both predict adipocyte size and cardiometabolic risk in women. Adipocyte, 2015 Dec 8;5(1):35-42.
Dans le cadre de ce projet, nous avons examiné comment les mesures de surface et d’atténuation radiologique des tissus adipeux sous-cutané et omental obtenues par tomographie axiale peuvent prédire l’hypertrophie des adipocytes et le risque cardiométabolique associé. J’ai participé à l’analyse et à l’interprétation des données et j’ai pris la charge de la rédaction et de la révision du manuscrit. Julie-Anne Nazare, qui était étudiante au doctorat sous la supervision du Dr
Jean-Pierre Després au moment de la réalisation de ce projet a participé à l’analyse et à l’interprétation
des données, ainsi qu’à la révision du manuscrit. Mélanie Nadeau, professionnelle de recherche dans le laboratoire du Dr André Tchernof a participé à l’interprétation et à l’analyse des données, ainsi qu’à la révision du manuscrit. Le Dr Mathieu Leboeuf et la Dre Line Blackburn ont supervisé les aspects cliniques du projet et ils ont recueilli, en partie, les échantillons de tissus adipeux. Le Dr Jean-Pierre Després, chercheur à l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec a contribué à l’analyse et à l’interprétation des données, à la rédaction du manuscrit et à sa révision.
Chapitre 2: Carrière A, Jeanson Y, Côté JA, Dromard C, Galinier A, Menzel S, Barreau C,
Dupuis-Coronas S, Arnaud E, Girousse A, Cousin B, Sengenes C, Nolte F, Tchernof A, Casteilla L. Identification of the ectoenzyme CD38 as a marker of committed preadipocytes. International Journal of Obesity (Accepté, 2017).
Dans le cadre de ce projet, nous avons étudié le rôle de l’antigène de surface CD38 dans le processus d’engagement des préadipocytes vers la lignée adipogénique. J’ai participé aux expériences en laboratoire, à l’analyse et à l’interprétation des données, à la création des figures de la section résultats, ainsi qu’à la révision du manuscrit. Yannick Jeanson, étudiant au doctorat sous la supervision du Dr Audrey Carrière-Pazat (STROMALab) au moment de la réalisation de ce projet a contribué à la collecte et à l’analyse des données, ainsi qu’à la rédaction et à la révision du manuscrit. Marion Ducos, Marie-Laure Renoud, Pauline Achard, Clément de Vecchi et
xxii
Chapitre 3: Julie Anne Côté, Frédéric Guénard, Julie Lessard, Marc Lapointe, Simon Biron,
Marie-Claude Vohl, André Tchernof. Temporal changes in gene expression profile during mature adipocyte dedifferentiation. Int J Genomics, 2017 Volume 2017 (2017), Article ID 5149362, 11 pages.
Ce projet a été réalisé dans le cadre d’une étude subventionnée par le CRSNG qui visait à étudier le processus de dédifférenciation. Nous avons examiné les changements dans l’expression des gènes à différents temps au cours du processus de dédifférenciation des adipocytes matures humains. Ce projet a été réalisé en collaboration avec l’équipe du Dr Marie-Claude Vohl, chercheure à l’Institut sur la nutrition et les aliments fonctionnels (INAF, Université Laval). J’ai participé à l’analyse et à l’interprétation des données, à la rédaction du manuscrit, ainsi qu’à sa révision. Le Dr Frédéric
Guénard, étudiant au post-doctorat sous la supervision du Dr Vohl a participé à l’analyse et à
l’interprétation des données, ainsi qu’à la rédaction et à la révision du manuscrit. Le Dr Julie
Lessard, étudiante au post-doctorat sous la supervision du Dr André Tchernof au moment de la
réalisation de ce projet a participé à la cueillette des échantillons en laboratoire, à l’analyse et à l’interprétation des données, ainsi qu’à la révision du manuscrit. Marc Lapointe, professionnel de recherche dans le laboratoire du Dr André Tchernof au moment de la réalisation de ce projet a participé à l’analyse et à l’interprétation des données, ainsi qu’à la révision du manuscrit. Le Dr
Simon Biron, chirurgien bariatrique à l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de
Québec a assuré la supervision de tous les aspects médicaux de l’étude. Nathalie Paquet, responsable de la plateforme d’expression génique (RT-qPCR) au Centre de recherche du CHU de Québec a procédé à la quantification des gènes.
Chapitre 4:
Côté JA, Lessard J, Pelletier M, Marceau S, Lescelleur O, Fradette J, Tchernof A.Relevance of the TGF-β pathway in human mature adipocyte dedifferentiation. FEBS Open Bio (Accepté, 2017).
Cette étude a également été réalisée dans le cadre d’un projet subventionné par le CRSNG visant à étudier le processus de dédifférenciation des adipocytes matures humains. Le but de cette étude était d’examiner le rôle du sentier métabolique du Transforming growth factor β dans le processus de dédifférenciation et de moduler ce processus en utilisant un nouveau modèle de culture cellulaire développé dans notre laboratoire. J’ai participé aux expériences en laboratoire, à la collecte et à l’analyse des données, à la rédaction entière du manuscrit, ainsi qu’à la révision de celui-ci. Le Dr
xxiii
Julie Lessard, étudiante au post-doctorat sous la supervision du Dr André Tchernof au moment
de la réalisation de ce projet a participé aux expériences en laboratoire, à l’analyse et à l’interprétation des données, ainsi qu’à la révision du manuscrit. Mélissa Pelletier, professionnelle de recherche dans le laboratoire du Dr André Tchernof a participé à l’analyse et à l’interprétation des données, ainsi qu’à la révision du manuscrit. Les Dr Simon Marceau et Odette Lescelleur, chirurgiens bariatriques à l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec ont assuré la supervision de tous les aspects médicaux de l’étude. Finalement, la Dr Julie Fradette a participé à l’interprétation des données et à la révision du manuscrit.
Chapitre 5: Julie Anne Côté, Marie-Frédérique Gauthier, Dannick Brochu, Kerstin Bellmann,
André Marette, François Julien, Stéfane Lebel, André Tchernof. Characterization of the cell division process taking place during ceiling culture of human mature adipocytes. Sera soumis sous peu pour publication.
Cette étude a également été réalisée dans le cadre d’un projet subventionné par le CRSNG visant à étudier le processus de dédifférenciation des adipocytes matures humains en ayant recours à la microscopie en temps réel. Le but de cette étude était d’étudier les mécanismes cellulaires de la dédifférenciation. J’ai participé aux expériences en laboratoire, à la collecte et à l’analyse des données, à la rédaction du manuscrit, ainsi qu’à la révision de celui-ci. Marie-Frédérique
Gauthier, technicienne en laboratoire dans l’équipe du Dr André Tchernof a grandement participé
aux expériences en laboratoire, ainsi qu’à l’analyse et à l’interprétation des données. Dannick
Brochu, stagiaire dans le laboratoire du Dr André Tchernof a participé aux expériences en
laboratoire, ainsi qu’à l’analyse et à l’interprétation des données. La Dre Kerstin Bellmann, professionnelle de recherche dans le laboratoire du Dr André Marette a grandement participé aux expériences de microscopie en temps réel. Le Dr André Marette, chercheur à l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec a participé à l’analyse et à l’interprétation des résultats, ainsi qu’à la révision du manuscrit. Le Dr François Julien et le Dr Stéfane Lebel, chirurgiens bariatriques à l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec, ont assuré la supervision de tous les aspects médicaux de l’étude.
Je termine en remerciant tous les patients ayant accepté de participer à nos projets. Leur contribution à la recherche est précieuse et a rendu possible la réalisation de ces projets. Finalement,
xxiv
j’aimerais remercier le personnel du centre hospitalier du CHU de Québec et de l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec pour leur précieuse collaboration.
1
Introduction
1. Le tissu adipeux
1.1 Origine et développement
Chez l’humain, lors du développement embryonnaire, les tissus adipeux blanc et brun, tout comme les muscles et les os, tirent leur origine du mésoderme. Le mésoderme est le feuillet cellulaire intermédiaire de l’embryon qui prend naissance au moment de la gastrulation. La formation du mésoderme débute par la migration d’une couche de cellules entre l’endoderme et l’ectoderme. Cette couche de cellules s’étend ensuite le long de l’axe antéro-postérieur et dorso-ventral de l’embryon, donnant ainsi naissance aux mésodermes axial, intermédiaire, paraxial et latéral. Les ostéocytes et les chondrocytes, les cellules spécialisées de l’os et du cartilage respectivement, partagent une origine commune avec les adipocytes, puisqu’ils sont tous issus du feuillet somatique du mésoderme latéral (1, 2). Le mésoderme latéral est constitué de deux feuillets, soit la couche splanchnique et la couche somatique. Une étude récente a suggéré que le tissu adipeux viscéral soit issu de la couche splanchnique et que le tissu sous-cutané soit dérivé du feuillet somatique (3, 4). À l’état non différencié, les cellules issues du mésoderme sont communément appelées cellules souches mésenchymateuses (MSCs). Le mésenchyme est un tissu de soutien qui est dérivé du mésoderme embryonnaire. Comme elles sont issues du mésoderme, certains auteurs utilisent le terme cellules souches mésodermales pour désigner ces cellules non différenciées (5). À ce jour, nous n’en savons que très peu sur les étapes intermédiaires menant à la formation des adipocytes matures à partir des MSCs. Il a toutefois été suggéré que les MSCs donnent naissance à des cellules précurseurs appelées adipoblastes, qui à leur tour, acquièrent le phénotype de préadipocytes. Ce sont ces préadipocytes qui, dans des conditions appropriées, donneraient naissance aux adipocytes matures (1).
1.2 Rôles
Le tissu adipeux joue un rôle important dans la régulation de l’homéostasie énergétique. Dans un contexte de bilan énergétique positif, l’énergie est mise en réserve sous forme de triacylglycérols (TG) dans les vacuoles lipidiques des adipocytes. Lors d’un déficit énergétique, elle est libérée sous forme d’acides gras et de glycérol par le processus de lipolyse (6). Par ailleurs, le tissu adipeux forme une couche isolante contre le froid et il offre une protection mécanique contre les chocs. Nous savons maintenant que le tissu adipeux n’est pas seulement un lieu d’entreposage des lipides, puisqu’il sécrète une quantité importante d’hormones et de cytokines qui possèdent des fonctions
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endocrine, inflammatoire et immunitaire. Ces molécules sont communément appelées adipokines ou adipocytokines. C’est la découverte de la leptine par le groupe de Friedman en 1994 qui a modifié la perception que nous avions du tissu adipeux et qui lui a valu d’être considéré comme un organe endocrinien (7, 8). Par ailleurs, le tissu adipeux exprime un nombre important de récepteurs qui lui permettent de communiquer avec les autres organes et ainsi, de coordonner une multitude de processus biologiques (9).
Chez l’humain, le tissu adipeux est réparti dans tout le corps, mais il se retrouve principalement dans les dépôts intra-abdominaux (c’est-à-dire autour de l’intestin, du grand omentum et des reins) et dans les dépôts sous-cutanés (c’est-à-dire au niveau des cuisses, de l’abdomen et du fessier)(10, 11) (Figure 1). Ces différentes localisations confèrent au tissu adipeux des propriétés métaboliques, anatomiques et fonctionnelles distinctes. Chez l’humain, différentes méthodes de mesure ont été mises au point afin de quantifier le tissu adipeux et d’examiner sa distribution. Parmi celles-ci nous retrouvons l’absorptiométrie aux rayons X, la pléthysmographie et la tomographie axiale (12, 13). La tomographie axiale, aussi appelée la tomodensitométrie, est une technique d’imagerie basée sur les propriétés d’absorption des rayons X par les différents tissus corporels. Cette technique permet d’observer et de quantifier l’accumulation de tissu adipeux au niveau abdominal et, plus spécifiquement, au niveau viscéral (14, 15). Il est maintenant reconnu que l’accumulation préférentielle de graisse au niveau des viscères est un facteur de risque des altérations cardiométaboliques (16-18), dont la résistance à l’insuline (19, 20), la dyslipidémie athérogène (21, 22), l’hypertension artérielle (23-25) et les maladies cardiovasculaires (26, 27). Plus récemment, de nouveaux dépôts adipeux non classiques tels que les dépots épicardiques et périvasculaires ont été caractérisés (28, 29). Dans notre laboratoire, nous nous intéressons principalement aux différences fonctionnelles et métaboliques entre les tissus adipeux abdominaux sous-cutané et omental, ce dernier étant localisé au niveau du grand omentum. La tomographie axiale est une technique que nous utilisons couramment. Celle-ci est décrite dans la prochaine section de cette thèse.
3
Figure 1. Localisation anatomique des principaux dépôts adipeux au niveau abdominal chez l’humain
Tirée de Tchernof et Després 2013 (16)
1.2.1 Tomographie axiale
Tokunaga et al. ont été les premiers à utiliser la tomographie axiale pour à la fois visualiser et quantifier l’accumulation de graisse dans les compartiments adipeux abdominaux sous-cutané et viscéral (15). La tomographie axiale permet d’obtenir des images radiologiques transversales de l’abdomen (Figure 2). Cette technique est basée sur la capacité des différents tissus corporels à bloquer les rayons X, ce qui permet, entre autres, de les distinguer (14).
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Figure 2. Représentation des aires de tissus adipeux sous-cutané et viscéral mesurées par tomographie axiale au niveau des vertèbres L4-L5
Cette figure permet de visualiser les compartiments adipeux abdominaux sous-cutané et viscéral chez quatre individus présentant des variations interindividuelles importantes dans l’accumulation de tissu adipeux au niveau viscéral pour une même catégorie d’indice de masse corporelle (embonpoint) et une masse grasse identique- Tirée de Tchernof et al. 2017 Comprehensive Physiology, En révision
La mesure de l’atténuation (aussi appelée la densité radiologique du tissu) des rayons X est exprimée selon l’échelle de Hounsfield (Figure 3). Cette unité de mesure a été nommée en l’honneur de l’ingénieur britannique ayant inventé le premier scanner de tomographie axiale. Selon cette échelle, la densité de l’eau est fixée à zéro, celle de l’air contenu dans l’intestin et dans les poumons à -1000 et celle des os compacts à + 3095 unités Hounsfield (HUs). Selon cette échelle, la densité de l’eau est fixée à zéro, celle de l’air à -1000 unités Hounsfield (HUs). L’atténuation en HU est obtenue par une transformation du coefficient d’attéuation linéare mesuré en fonction de ces deux valeurs de référence. Ainsi, les os compacts ont une valeur de + 3095 HU alors que les valeurs de densité radiologique de la plupart des tissus mous du corps humain se situent entre -100 et +100 sur l’échelle de Hounsfield. Les valeurs d’atténuation du tissu adipeux se situent en-dessous de zéro. La plupart des tissus contenant de la graisse ont des valeurs d’atténuation oscillant entre -50 et -100 HUs. En ce qui concerne le tissu adipeux blanc, ses valeurs d’atténuation se situent généralement entre -90 et -130 HUs (30, 31). La densité des tissus adipeux des différents dépôts anatomiques peut varier. En effet, il a été démontré que la densité radiologique du tissu adipeux mésentérique est significativement plus élevée que celle du tissu adipeux sous-cutané (31). Une différence au niveau de la densité radiologique a également été observée entre les tissus adipeux brun et blanc, celle du tissu adipeux brun étant supérieure (c’est-à-dire plus près de zéro) (32). Ces études démontrent que la tomodensitométrie permet non seulement de mesurer la surface des tissus adipeux, mais également d’en mesurer la densité radiologique.
5
Figure 3. Échelle de Hounsfield
Les valeurs de densité radiologique de la plupart des tissus contenant de la graisse se situent entre -50 et -100 unités Hounsfield alors que pour le tissu adipeux blanc celles-ci se situent entre -90 et -130 unités Hounsfield. Tirée de Tyrrel et al. et Cochard et al. (30, 31)
Au cours des dernières années, l’utilisation de cette technique comme mesure de la densité radiologique du tissu adipeux a fait l’objet de quelques études. Le groupe de Fox s’est particulièrement intéressé aux associations entre les valeurs d’atténuation des tissus adipeux sous-cutané et viscéral et certains facteurs de risque cardiométabolique. Dans un article paru en 2013, ils ont démontré que plus les valeurs d’atténuation du tissu adipeux viscéral sont faibles, plus le profil métabolique est altéré et ce, indépendamment du volume de tissu adipeux dans la cavité viscérale. Ils ont démontré que les associations sont de moindre amplitude dans le dépôt sous-cutané. Cette étude a été effectuée dans une cohorte de plus de 3 000 participants (Framingham Heart Study) (33). Des résultats similaires ont été obtenus dans une étude effectuée ultérieurement par le même groupe (34). D’autre part, le groupe de Fox a également suggéré une association entre les valeurs d’atténuation, particulièrement dans le dépôt sous-cutané et les concentrations de certaines adipokines. Plus précisément, ils ont démontré que de faibles valeurs d’atténuation sont associées à de faibles concentrations d’adiponectine et à de hautes concentrations de leptine et de Fatty Acid
binding protein 4 (FABP4). Ils ont toutefois observé que lorsque ces associations sont ajustées pour
la quantité totale de tissu adipeux, seule celle entre l’atténuation radiologique et les concentrations
Échelle de Hounsfield
Air Eau Os Os compact
-1000 0 +1000 +3095 +100 -100 Tissus mous 0 Tissus gras -50 +50
Tissu adipeux blanc -150
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d’adiponectine demeure significative dans le dépôt viscéral (35). À la lumière de ces études, le groupe de Fox a suggéré que la densité radiologique du tissu adipeux soit une mesure de la qualité du tissu adipeux. Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes intéressés à la signification biologique de la densité radiologique. Les résultats de nos travaux démontrent que la densité radiologique du tissu adipeux représente un marqueur de la taille adipocytaire. Les résultats de cette étude sont présentés dans le Chapitre 1 de cette thèse.
1.3 Composantes cellulaires
1.3.1 Adipocytes matures
Le tissu adipeux est un tissu conjonctif mou vascularisé et innervé (36). D’un point de vue cellulaire, nous pouvons le qualifier d’hétérogène, puisqu’il est composé principalement d’adipocytes, mais également d’une fraction stroma-vasculaire (FSV) (37). Les adipocytes sont métaboliquement actifs, car ils participent à différents processus métaboliques tels que la lipolyse et la lipogénèse (38). Le cytoplasme de l’adipocyte est occupé, en majeure partie, par une gouttelette lipidique composée de triacylglycérols. Ces derniers représentent 90% du volume de la cellule adipeuse. C’est cette vacuole lipidique qui confère aux adipocytes leur forme sphérique lorsqu’ils sont en suspension et qui détermine leur taille. Les adipocytes matures sont donc des cellules uniloculaires (39). Par ailleurs, la gouttelette lipidique est entourée d’une membrane de phospholipides dans laquelle se trouve également des protéines d’adhésion telle la périlipine 1 (PLIN1). Ces protéines d’adhésion jouent un rôle dans la dégradation de la gouttelette lipidique et dans la mobilisation des lipides (40, 41). En raison du volume important de la vacuole lipidique, la plupart des organelles des adipocytes, principalement le noyau, sont entassées en périphérie de la membrane plasmique. L’adipocyte contient des mitochondries qui sont généralement de forme allongée, un réticulum endoplasmique, ainsi qu’un appareil de Golgi (39, 42). Dans le tissu adipeux, les adipocytes sont entourés d’une matrice extracellulaire (MEC) qui contribue à l’architecture du tissu et à ses fonctions biologiques (Figure 4). Les caractéristiques, ainsi que les rôles physiologiques de la FSV et de la MEC seront décrits respectivement dans les sections 1.3.2 et
7
Figure 4. Représentation schématique du tissu adipeux
Les adipocytes sont les cellules principales du tissu adipeux. Les autres types cellulaires tels que les préadipocytes, les fibroblastes, les cellules immunitaires et les cellules endothéliales font partie de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux. Le tissu adipeux contient des vaisseaux sanguins qui permettent aux adipocytes d’obtenir les nutriments essentiels à leur survie, ainsi qu’un apport en oxygène. La matrice extracellulaire est composée majoritairement de collagène, mais elle contient également des protéines d’adhésion, ainsi que des protéoglycanes. La matrice extracellulaire offre un support mécanique au tissu, en plus de participer à plusieurs phénomènes biologiques tels que la prolifération et la différenciation cellulaire. Figure adaptée de Ouchi et al. (43)
Chez l’humain, il existe une variabilité interindividuelle importante dans la taille des adipocytes. Celle-ci est influencée par différents facteurs tels que le sexe, le dépôt anatomique et l’adiposité (17). En présence d’un bilan énergétique positif, l’expansion du tissu adipeux s’effectue par hypertrophie des adipocytes (augmentation de la taille des adipocytes matures) et/ou par hyperplasie des adipocytes (augmentation du nombre d’adipocytes matures à partir des préadipocytes) (44). L’hyperplasie est associée à une accumulation préférentielle de graisse dans le dépôt sous-cutané. Cette capacité à recruter des nouveaux adipocytes offrirait une protection contre les anomalies cardiométaboliques. Par ailleurs, l’accumulation de tissu adipeux au niveau viscéral est plus étroitement liée à l’hypertrophie des adipocytes viscéraux (45, 46). Plusieurs études ont démontré que plus la taille des adipoytes abdominaux est élevée, plus le profil lipidique est détérioré et ce, indépendamment de la masse grasse totale. Qui plus est, le volume des adipocytes sous-cutanés et viscéraux est corrélé positivement avec les niveaux d’insuline et les valeurs de pression artérielle (46-48). Dans notre laboratoire, nous mesurons la taille des adipocytes de manière courante. Nos
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travaux suggèrent que la taille adipocytaire est un déterminant important des complications métaboliques et de la dysfonction des tissus adipeux (17, 49, 50).
1.3.2 Fraction stroma-vasculaire
La FSV du tissu adipeux contient divers types cellulaires dont des cellules endothéliales et mésothéliales, des fibroblastes, des préadipocytes et des cellules immunitaires telles que des macrophages, des lymphocytes, des mastocytes et des cellules dendritiques (9, 51). Les études de dissociation du tissu adipeux ont permis de désigner la FSV comme étant le site d’origine des cellules souches du tissu adipeux. En plus des préadipocytes, la FSV contient une quantité importante de MSCs appelées adipose-derived stromal cells (ASCs) en raison de leur provenance (52-54). Contrairement aux préadipocytes qui sont destinés à rejoindre la lignée adipogénique, les ASCs se situent en amont sur le continuum de la différenciation adipocytaire (53, 55, 56). En effet, les ASCs peuvent être différenciées en myoblastes, en ostéoblastes et en chondrocytes, contrairement aux préadipocytes qui ne peuvent acquérir un autre phénotype que celui d’adipocyte (55). La cytométrie en flux est couramment utilisée pour caractériser le phénotype des ASCs de la FSV. Cette population cellulaire est CD34+, CD45- et CD31-. Le CD45 et le CD31 sont respectivement des marqueurs de cellules hématopoïétiques et endothéliales (57, 58). Le groupe de Friedman a identifié au sein de cette population un sous-groupe de cellules exprimant le CD24 et capables de régénérer un dépôt de tissu adipeux fonctionnel lorsque transplantées dans des souris lipodystrophiques (59). En 2013, Berry et al. ont proposé un modèle représentant l’engagement des précurseurs adipocytaires dans l’adipogénèse. Selon ce modèle, la perte de l’expression du marqueur de surface CD24 est associée à la transition des précurseurs immatures n’exprimant pas le
Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) en préadipocytes exprimant PPARγ2.
Cela suggère que le marqueur CD24 reflète le stade de maturité des cellules (60). D’autres marqueurs pourraient être utilisés pour refléter le stade de maturité des cellules souches. Tel est le cas du CD38. En effet, dans les populations de cellules souches, les cellules Cd34+ exprimant le CD38 sont plus matures que les cellules CD34+ CD38- (Figure 5) (61).
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Figure 5. Continuum de la différenciation adipogénique des cellules souches de la fraction stroma-vasculaire
La cytométrie en flux permet de caractériser les marqueurs de surface exprimés par les cellules souches de la fraction stroma-vasculaire. Celles-ci sont négatives pour les marqueurs CD45 et CD31. Le phénotype de ces cellules varie en fonction de leur degré d’engagement vers la différenciation adipogénique. Certains antigènes de surface tel que le CD24 peuvent être utilisés pour caractériser ces cellules. Des études supplémentaires sont nécessaires afin de vérifier si le CD38 permet d’identifier les préadipocytes davantage engagés vers la différenciation adipocytaire.
L’utilisation de marqueurs de surface est nécessaire pour caractériser les précurseurs adipocytaires de la FSV. Par ailleurs, ces marqueurs sont des outils indispensables, car ils permettent d’étudier le degré d’engagement des cellules vers une lignée donnée. Pour des raisons techniques, peu d’études se sont intéressées à l’origine des ASCs et des préadipocytes de la FSV. L’une de ces raisons est l’absence d’un marqueur unique et universel pour identifier et distinguer les ASCs et les préadipocytes. Certaines études suggèrent toutefois que ces cellules aient une origine vasculaire. Tang et al. ont localisé une population de cellules souches CD34+, Sca1+, CD45- et CD31- au niveau des structures tubulaires des vaisseaux sanguins du tissu adipeux. Ces cellules exprimaient PPARγ, ainsi que des marqueurs de péricytes (des cellules localisées au niveau de l’endothélium des capillaires) tels que le α-smooth muscle actin (α-SMA) et le Platelet derived growth factor
receptor beta (PDGFR-β) (62). Ces résultats ont également été confirmés par Zannettino et al. (63)
10
souches issues des différents tissus présentent des caractéristiques de péricytes (64-67). Dans le cadre de cette thèse, nous avons utilisé la cytométrie en flux pour caractériser les populations de cellules souches contenues dans la FSV. Les résultats de cette étude sont présentés au Chapitre 2 de cette thèse. Les ASCs ont reçu beaucoup d’attention dans le domaine de la médecine régénératrice au cours des dernières décennies. Les informations concernant la nature cellulaire et le degré d’engagement de ces cellules demeurent toutefois nébuleuses. Leur potentiel de prolifération, d’auto-renouvellement et de différenciation adipogénique a été confirmé à maintes reprises (62, 68-70). Nous savons qu’à l’âge adulte, la génération de nouveaux adipocytes est possible grâce à la présence de cette niche de précurseurs adipocytaires résidents du tissu adipeux (71, 72). L’adipogénèse est le processus par lequel les cellules non différenciées deviennent des adipocytes. L’adipogénèse se déroule en deux phases, soit : 1) la détermination et 2) la différenciation terminale. La détermination désigne l’engagement des ASCs vers la lignée adipocytaire, c’est-à-dire la conversion des cellules souches en préadipocytes. Au cours de la deuxième phase, les préadipocytes acquièrent la machinerie nécessaire pour devenir des adipocytes matures capables de synthétiser et d’entreposer les lipides, ainsi que de sécréter des protéines (55). La différenciation des ASCs en adipocytes matures est complexe et elle nécessite la coordination et l’intégration de multiples facteurs de transcription et de sentiers métaboliques. Les sections suivantes offrent un aperçu général du processus d’adipogénèse et des facteurs qui le modulent.
Régulation transcriptionnelle de l’adipogenèse- Au cours de la première phase de l’adipogénèse, soit celle de la détermination, les cellules entrent à nouveau dans le cycle cellulaire et traversent minimalement deux phases de division cellulaire. Cet évènement est communément appelé l’expansion clonale. Au cours de ce processus, les cellules expriment des facteurs de transcription adipogéniques, ainsi que des régulateurs du cycle cellulaire qui, conjointement, facilitent l’expression de PPARγ et du CCAAT-enhancer-binding protein alpha (C/EBPα) (73). PPARγ est une protéine appartenant à la famille des récepteurs nucléaires liant les lipides. Il agit comme un facteur de transcription majeur dans le processus d’adipogénèse, puisqu’il coordonne l’expression d’un nombre important de gènes. La différenciation adipogénique, ainsi que le maintien du phénotype de l’adipocyte mature requièrent sa présence (74, 75). Deux isoformes de PPARγ ont été identifiés, soit PPARγ1 et PPARγ2. L’expression de PPARγ2 se limite au tissu adipeux, alors que PPARγ1 est exprimé dans plusieurs tissus incluant l’intestin, les tissus adipeux brun et blanc, le foie, le pancréas et les reins. L’activité de PPARγ est régulée, en partie, via son association avec des ligands qui facilitent le recrutement de co-activateurs. Les acides gras, ainsi que plusieurs de leurs
11
dérivés sont les ligands endogènes de PPARγ les mieux connus (76-78). Plusieurs facteurs pro-adipogéniques tels que le binding protein beta (C/EBPβ) et le
CCAAT-enhancer-binding protein delta (C/EBPδ) promeuvent également l’activation de PPARγ. C/EBPβ et C/EBPδ
sont exprimés en amont de C/EBPα et de PPARγ dans la cascade adipogénique et ils régulent leur expression (55, 79-81). D’autres facteurs de transcription de la famille des Krüppel-like family (KLF) agissent de concert avec les C/EBPs pour promouvoir l’adipogénèse. À titre d’exemple, C/EBPβ et C/EBPδ induisent l’expression du Kruppel like factor 5 (KLF5) qui, à son tour, se lie au promoteur de PPARγ et l’active (82). Le Sterol regulatory element-binding proteins 1c (SREBP1c) induit également l’expression de PPARγ (83, 84), tout comme le Kruppel like factor 15 (KLF15) qui induit l’expression du Glucose transporter type 4 (GLUT4) (85). En réponse aux différents signaux biologiques, C/EBPα et PPARγ régulent l’expression des gènes impliqués dans les fonctions de l’adipocyte mature telles que la réponse à l’insuline, la lipolyse et la lipogénèse. Par ailleurs, certains facteurs de transcription tels que GATA binding protein 2 (GATA) 2, GATA
binding protein 3 (GATA3), Forkhead box protein O1 (FOXO1), Sirtuin 1 (SIRT) 1 et Sirtuin 2
(SIRT2) régulent négativement l’expression de PPARγ. L’expression de ces facteurs de transcription est régulée à la baisse durant la différenciation adipocytaire (55, 86).
Facteurs extracellulaires régulant l’adipogénèse- Tel que mentionné ci-haut, le processus d’adipogénèse est régulé via l’activation coordonnée de différents facteurs de transcription. Ces derniers agissent en tant qu’intermédiaires dans les sentiers métaboliques impliqués dans l’adipogénèse en recueillant des informations sur les conditions intra- et extra-cellulaires. Ils agissent à titre de senseurs, puisqu’ils peuvent activer ou réprimer la transcription de gènes cibles en réponse aux différents signaux environnementaux. Ces signaux peuvent être des cytokines, des facteurs de croissance ou encore, des signaux de nature hormonale. Les Wnt sont une famille de glycoprotéines sécrétées, entre autres par les préadipocytes, dans le milieu extracellulaire qui influencent le devenir des cellules via des mécanismes autocrine et paracrine. In vitro, le sentier métabolique Wnt/β-catenine maintient les cellules souches dans un état indifférencié et inhibe la différenciation adipocytaire en bloquant l’expression de C/EBPα et de PPARγ (87). De plus, il semble promouvoir la différenciation ostéogénique des MSCs (88, 89). In vivo, le groupe de MacDougald a démontré que les souris transgéniques surexprimant le WNT family member 10B (WNT10b) au niveau des adipocytes étaient caractérisées par une réduction d’environ 50% de la masse adipeuse (90). Par ailleurs, le WNT family member 5B (WNT5b) est exprimé temporairement durant l’adipogénèse, suggérant des effets distincts des différentes protéines Wnt (91). L’insuline,
